Luận án tiến sĩ: Sản xuất oligochitosan và ứng dụng trong bảo quản tôm nguyên liệu sau thu hoạch

Luận án tiến sĩ phân tích nghiên cứu sản xuất oligochitosan và ứng dụng trong bảo quản tôm nguyên liệu sau thu hoạch, xây dựng cơ sở lý luận, kiểm chứng thực nghiệm, đóng góp tri

• Tác giả: Vũ Thị Hoan
• Người hướng dẫn: GS. Trần Thị Luyến
• Trường học: Trường Đại học Nha Trang
• Chuyên ngành: Công nghệ chế biến thủy sản
• Đề tài: Nghiên cứu sản xuất oligochitosan và ứng dụng trong bảo quản tôm nguyên liệu sau thu hoạch
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Khánh Hòa

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.2. CƠ SỞ LÝ THUYẾT VỀ SẢN XUẤT CHITOSAN VÀ OLIGOCHITOSAN
• 1.2.1. Giới thiệu về chitin, chitosan và oligochitosan
• 1.2.2. Chitin và chitosan
• 1.2.3. Phương pháp sản xuất chitin và chitosan
• 1.2.4. Phương pháp sản xuất oligochitosan
• 1.3. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG OLIGOCHITOSAN
• 1.4. CƠ SỞ LÝ THUYẾT VỀ BIẾN ĐỔI VÀ PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN TÔM SAU THU HOẠCH
• 1.4.1. Cơ sở lý thuyết về biến đổi của tôm sau thu hoạch
• 1.4.2. Phương pháp bảo quản tôm sau thu hoạch
• 1.5. GIỚI THIỆU VỀ KỸ THUẬT BỨC XẠ
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU
• 2.1.1. Đầu vỏ tôm dùng sản xuất oligochitosan
• 2.1.2. Tôm bạc biển
• 2.1.3. Nguyên vật liệu để xác định độc chất học
• 2.1.4. Giống vi khuẩn
• 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.2.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm
• 2.2.2. Các phương pháp phân tích hóa học
• 2.2.3. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme protease
• 2.2.4. Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn
• 2.2.5. Phương pháp thu sinh khối vi khuẩn lactic
• 2.2.6. Phương pháp phân tích vi sinh vật
• 2.2.7. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của chế phẩm oligochitosan
• 2.2.8. Phương pháp xác định độc chất học
• 2.3. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ CHỦ YẾU SỬ DỤNG TRONG LUẬN ÁN
• 2.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CƠ BẢN CỦA PHẾ LIỆU ĐẦU VỎ TÔM
• 3.2. NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC ĐỂ KHỬ PROTEIN VÀ TẠP CHẤT Ở ĐẦU VỎ TÔM THẺ CHÂN TRẮNG TRONG SẢN XUẤT CHITIN
• 3.2.1. Nghiên cứu lựa chọn enzyme protease
• 3.2.2. Nghiên cứu khử protein còn lại ở đầu vỏ tôm bằng NaOH loãng và khử khoáng bằng HCl loãng
• 3.2.3. Đề xuất quy trình sản xuất chitin từ đầu vỏ tôm bằng phương pháp sử dụng enzyme flavourzyme khử protein
• 3.3. NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHITIN TỪ ĐẦU VỎ TÔM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG VI KHUẨN LACTIC ĐỂ KHỬ PROTEIN VÀ CÁC TẠP CHẤT
• 3.3.1. Lựa chọn chủng vi khuẩn lactic thích hợp
• 3.3.2. Nghiên cứu sản xuất chitin từ đầu vỏ tôm bằng phương pháp sử dụng vi khuẩn lactic L. plantarum VTCC-B 431 để khử protein và các tạp chất
• 3.3.3. Nghiên cứu khử protein còn lại ở bán chế phẩm chitin bằng enzyme flavourzyme
• 3.3.4. Nghiên cứu khử khoáng còn lại ở chitin thô bằng HCl
• 3.3.5. Đề xuất quy trình sản xuất chitin từ đầu vỏ tôm bằng phương pháp sử dụng vi khuẩn lactic L. plantarum VTCC-B 431 để khử protein và các tạp chất
• 3.3.6. Đánh giá chất lượng chitin sản xuất theo quy trình sử vi khuẩn lactic để khử protein và các tạp chất
• 3.4. NGHIÊN CỨU DEACETYL CHITIN ĐỂ SẢN XUẤT CHITOSAN CÓ ĐỘ DEACETYL CAO
• 3.4.1. XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ NAOH THÍCH HỢP CHO QUÁ TRÌNH DEACETYL CHITIN
• 3.4.2. XÁC ĐỊNH THỜI GIAN DEACETYL
• 3.4.3. ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHITOSAN CÓ ĐỘ DEACETYL CAO
• 3.5. NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM OLIGOCHITOSAN BẰNG KỸ THUẬT BỨC XẠ
• 3.5.1. XÁC ĐỊNH ĐỘ HÒA TAN CỦA CHITOSAN TRONG DUNG DỊCH ACID
• 3.5.2. XÁC ĐỊNH LIỀU XẠ THÍCH HỢP CHO VIỆC CẮT MẠCH CHITOSAN TẠO OLIGOCHITOSAN
• 3.5.3. TÁCH PHÂN ĐOẠN OLIGOCHITOSAN SAU KHI CHIẾU XẠ
• 3.5.4. ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH SẢN XUẤT OLIGOCHITOSAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾU XẠ SỬ DỤNG BỨC XẠ GAMMA CO-60
• 3.5.5. NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ TRỌNG LƯỢNG PHÂN TỬ CỦA OLIGOCHITOSAN SẢN XUẤT BẰNG CÁCH SỬ DỤNG BỨC XẠ ĐỂ PHÂN CẮT CHITOSAN
• 3.5.5.1. Đánh giá thành phần các phân đoạn của chế phẩm chiếu xạ chitosan
• 3.5.5.2. Sử dụng phổ FTIR để đánh giá cấu trúc của sản phẩm sau chiếu xạ chitosan
• 3.5.5.3. Xác định khối lượng phân tử và cấu trúc của oligochitosan
• 3.6. NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA OLIGOCHITOSAN
• 3.6.1. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của chế phẩm oligochitosan bằng phương pháp MIC
• 3.6.2. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của chế phẩm oligochitosan bằng phương pháp nuôi cấy trên đĩa thạch
• 3.7. ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH HOÀN THIỆN SẢN XUẤT OLIGOCHITOSAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG BỨC XẠ GAMMA COBAN 60
• 3.8. THỬ NGHIỆM ĐỘC TÍNH CỦA OLIGOCHITOSAN TRÊN CHUỘT LANG THÍ NGHIỆM
• 3.9. SỬ DỤNG OLIGOCHITOSAN TRONG BẢO QUẢN TÔM BẠC NGUYÊN LIỆU
• 3.9.1. XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ OLIGOCHITOSAN THÍCH HỢP CHO QUÁ TRÌNH BẢO QUẢN TÔM
• 3.9.2. XÁC ĐỊNH CHẾ ĐỘ BẢO QUẢN TÔM NGUYÊN LIỆU BẰNG OLIGOCHITOSAN
• 3.9.2.1. Xác định thời gian nhúng tôm nguyên liệu bằng dung dịch oligochitosan
• 3.9.2.2. Xác định chế độ bao gói thích hợp để bảo quản tôm bạc bằng oligochitosan
• 3.9.3. ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH BẢO QUẢN TÔM BẰNG OLIGOCHITOSAN
• KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Sản xuất oligochitosan

Sản xuất oligochitosan là quá trình chuyển đổi chitosan thành các phân tử nhỏ hơn, có hoạt tính sinh học cao. Luận án đã nghiên cứu và đề xuất quy trình sản xuất oligochitosan bằng phương pháp chiếu xạ gamma Coban-60. Phương pháp này giúp cắt mạch chitosan hiệu quả, tạo ra các phân đoạn oligochitosan có khối lượng phân tử thấp và độ hòa tan cao. Quy trình bao gồm các bước: xác định liều xạ thích hợp, tách phân đoạn và đánh giá cấu trúc bằng phổ FTIR và NMR. Kết quả cho thấy, oligochitosan sản xuất bằng phương pháp này có tiềm năng ứng dụng cao trong các lĩnh vực y sinh và bảo quản thực phẩm.

1.1. Phương pháp chiếu xạ gamma Coban 60

Phương pháp chiếu xạ gamma Coban-60 được sử dụng để cắt mạch chitosan, tạo ra oligochitosan. Quá trình này bao gồm việc xác định liều xạ tối ưu (50 kGy) để đảm bảo hiệu quả cắt mạch mà không làm biến đổi cấu trúc hóa học của chitosan. Kết quả phân tích phổ FTIR và NMR cho thấy, oligochitosan thu được có cấu trúc ổn định và khối lượng phân tử phù hợp cho các ứng dụng thực tiễn.

1.2. Đánh giá cấu trúc và hoạt tính

Cấu trúc và hoạt tính của oligochitosan được đánh giá thông qua phổ FTIR và NMR. Các phân đoạn oligochitosan có khối lượng phân tử từ 1.000 đến 5.000 Da, phù hợp cho các ứng dụng trong bảo quản thực phẩm và y sinh. Phân tích hoạt tính kháng khuẩn cho thấy, oligochitosan có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây hư hỏng thực phẩm, đặc biệt là trong bảo quản tôm sau thu hoạch.

II. Ứng dụng oligochitosan trong bảo quản tôm

Ứng dụng oligochitosan trong bảo quản tôm sau thu hoạch là một trong những mục tiêu chính của luận án. Oligochitosan được sử dụng như một chất bảo quản tự nhiên, giúp kéo dài thời gian bảo quản và duy trì chất lượng của tôm. Nghiên cứu đã xác định nồng độ oligochitosan thích hợp (1%) và thời gian nhúng tối ưu (10 phút) để đạt hiệu quả bảo quản cao nhất. Kết quả cho thấy, oligochitosan giúp giảm thiểu sự phát triển của vi khuẩn và duy trì độ tươi của tôm trong thời gian dài.

2.1. Xác định nồng độ và thời gian nhúng

Nghiên cứu đã xác định nồng độ oligochitosan 1% và thời gian nhúng 10 phút là tối ưu cho quá trình bảo quản tôm sau thu hoạch. Kết quả cho thấy, việc sử dụng oligochitosan ở nồng độ này giúp giảm đáng kể sự phát triển của vi khuẩn và duy trì chất lượng cảm quan của tôm trong thời gian bảo quản lạnh.

2.2. Hiệu quả bảo quản

Oligochitosan đã chứng minh hiệu quả trong việc bảo quản tôm sau thu hoạch, giúp giảm thiểu sự biến đổi pH, hàm lượng NH3 và hoạt tính oxy hóa. Kết quả nghiên cứu cho thấy, tôm được xử lý bằng oligochitosan duy trì được độ tươi và chất lượng dinh dưỡng trong thời gian bảo quản lên đến 6 ngày.

III. Đánh giá độc tính và an toàn

Luận án đã tiến hành đánh giá độc tính của oligochitosan trên chuột lang để đảm bảo tính an toàn khi ứng dụng trong bảo quản thực phẩm. Kết quả cho thấy, oligochitosan không gây ra bất kỳ tác động tiêu cực nào đến sức khỏe của chuột lang, bao gồm cả trọng lượng cơ thể và chức năng gan, thận. Điều này khẳng định tính an toàn của oligochitosan khi sử dụng trong các ứng dụng thực phẩm.

3.1. Thử nghiệm độc tính cấp

Thử nghiệm độc tính cấp trên chuột lang cho thấy, oligochitosan không gây ra bất kỳ thay đổi đáng kể nào về trọng lượng cơ thể, chức năng gan và thận. Kết quả sinh hóa máu và nước tiểu của chuột lang cũng không có sự khác biệt đáng kể so với nhóm đối chứng.

3.2. Đánh giá an toàn

Kết quả đánh giá an toàn cho thấy, oligochitosan không gây độc tính cấp hoặc mãn tính trên chuột lang. Điều này khẳng định tính an toàn của oligochitosan khi sử dụng trong các ứng dụng thực phẩm, đặc biệt là trong bảo quản tôm sau thu hoạch.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Công nghiệp chế biến thủy sản tại Việt Nam giữ vị trí mũi nhọn với định hướng kim ngạch xuất khẩu đạt mức 10 tỷ USD vào năm 2020. Trong chiến lược phát triển kinh tế biển gắn liền với bảo vệ chủ quyền biển đảo, công tác khai thác và bảo quản nguyên liệu thủy sản sau thu hoạch trên các tàu đánh bắt xa bờ đóng vai trò then chốt. Thực tế cho thấy các loài thủy sản như tôm, cá, mực sau khi đánh bắt rất dễ bị suy giảm chất lượng. Mặc dù quy chuẩn HACCP yêu cầu nguyên liệu phải được ướp đá duy trì nhiệt độ $\le 4^\circ\text{C}$, việc thiếu thốn trang thiết bị bảo quản lạnh trên tàu thuyền dẫn đến tình trạng ngư dân lạm dụng kháng sinh và các hóa chất độc hại như hàn the, urea, gây mất an toàn vệ sinh thực phẩm. Bên cạnh đó, hoạt động chế biến giáp xác thải ra lượng phế liệu đầu vỏ rất lớn, chiếm tới 45% khối lượng nguyên liệu, tương đương hơn 20 triệu tấn phế thải thủy sản mỗi năm trên toàn cầu (chiếm khoảng 25% tổng sản lượng chế biến).

Khoảng trống nghiên cứu được luận án tập trung giải quyết là việc tìm kiếm giải pháp bảo quản sinh học tự nhiên, an toàn để thay thế hóa chất bảo quản độc hại, đồng thời tận dụng nguồn phế liệu đầu vỏ tôm. Các quy trình sản xuất chitin và chitosan truyền thống lạm dụng hóa chất vô cơ nồng độ cao ở nhiệt độ cao gây ô nhiễm môi trường và làm suy giảm phẩm chất polyme. Việc điều chế oligochitosan bằng phương pháp hóa học hay enzyme thông thường cũng tồn tại hạn chế về dư lượng acid, chi phí enzyme cao hoặc quy trình tinh sạch phức tạp. Do đó, luận án hướng tới việc thiết lập quy trình sinh học kết hợp trong sản xuất chitin, thực hiện deacetyl ở nhiệt độ thường, ứng dụng kỹ thuật chiếu xạ gamma Coban-60 để phân cắt mạch chitosan tạo oligochitosan, kiểm định độc tính in vivo và ứng dụng bảo quản tôm bạc biển.

Mục tiêu nghiên cứu được xác định cụ thể:

• Mục tiêu chung: Nghiên cứu sản xuất chế phẩm oligochitosan có hoạt tính kháng khuẩn bằng công nghệ bức xạ Coban 60 và ứng dụng để kéo dài thời gian bảo quản nguyên liệu tôm bạc biển.
• Mục tiêu cụ thể:
  1. Sử dụng phương pháp sinh học phối hợp giữa vi khuẩn lactic và enzyme protease để khử protein và khoáng chất ở đầu vỏ tôm thẻ trong quá trình sản xuất chitin nhằm giảm thiểu hóa chất sử dụng trong quá trình này.
  2. Sản xuất chitosan có độ deacetyl cao bằng NaOH nồng độ cao trong điều kiện nhiệt độ thường để dễ dàng triển khai sản xuất ở quy mô lớn.
  3. Sản xuất được oligochitosan bằng công nghệ bức xạ Coban 60 và sử dụng oligochitosan sản xuất được trong bảo quản tôm biển.

Nội dung nghiên cứu của luận án gồm 4 phần:

1. Nghiên cứu sử dụng phương pháp sinh học để khử protein và các tạp chất có trong đầu và vỏ tôm thẻ chân trắng trong sản xuất chitin.
2. Nghiên cứu deacetyl chitin để sản xuất chitosan có độ deacetyl cao.
3. Nghiên cứu sản xuất chế phẩm oligochitosan bằng kỹ thuật bức xạ Coban 60.
4. Sử dụng oligochitosan trong bảo quản tôm bạc nguyên liệu.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng: Phế liệu đầu vỏ tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei); tôm bạc biển nguyên liệu; chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum VTCC-B 431; enzyme thương phẩm Flavourzyme; các chủng vi khuẩn kiểm định hoạt tính kháng khuẩn (Escherichia coli O157:H7, Salmonella typhimurium, Bacillus subtilis, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus); chuột lang thí nghiệm dùng thử nghiệm độc tính.
• Phạm vi không gian: Trường Đại học Nha Trang, Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm (Trường Đại học Công nghiệp TP. Hồ Chí Minh) và Trung tâm chiếu xạ thuộc Viện Nghiên cứu Hạt nhân Đà Lạt.
• Phạm vi thời gian: Thực hiện trong khuôn khổ Đề tài Cấp Nhà nước KC07.02/11-15 (giai đoạn 2011 - 2015), hoàn thành và bảo vệ luận án năm 2018.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan tài liệu của luận án hệ thống hóa các công trình nghiên cứu về cấu trúc, phương pháp trích ly chitin, chuyển hóa chitosan, phân cắt oligochitosan và ứng dụng bảo quản thực phẩm:

• Nguồn gốc và thành phần nguyên liệu: Lịch sử nghiên cứu ghi nhận Rouget xử lý chitin bằng kiềm đặc, Hoppe Seiler (1894) đặt tên cho chitosan. Các nghiên cứu định lượng thành phần vỏ giáp xác chỉ ra tỷ lệ chitin dao động từ 15% - 40%, protein 20% - 40%, canxi carbonat 20% - 50%. Tỷ lệ chitin và $\text{CaCO}_3$ thay đổi theo loài: Crangon sp. và Pandalus sp. chứa 17% - 40% chitin và 20% - 30% $\text{CaCO}_3$; Penaeus sp. chứa khoảng 40% chitin và 20% - 30% $\text{CaCO}_3$; Nephrops sp. và Homarus sp. chứa 60% - 75% chitin và 20% - 30% $\text{CaCO}_3$.
• Phương pháp sản xuất chitin và chitosan:
  • Phương pháp hóa học truyền thống: Khử protein bằng $\text{NaOH}$ hoặc $\text{KOH}$ nồng độ 1% - 10% ở $10^\circ\text{C} - 100^\circ\text{C}$ (xử lý ở $100^\circ\text{C}$ trong 72 giờ gây cắt mạch polyme); khử khoáng bằng $\text{HCl}$ 0,5N - 2N, $\text{EDTA}$ hoặc acid hữu cơ (acid formic, acid acetic, acid lactic); tẩy màu bằng $\text{H}_2\text{O}_2$, $\text{NaOCl}$; deacetyl bằng $\text{NaOH}$ 40% - 50% ở nhiệt độ cao $\ge 100^\circ\text{C}$ hoặc ở điều kiện $15\text{ psi}/121^\circ\text{C}$ trong 30 phút.
  • Phương pháp sinh học: Shimahara K. (1988) dùng protease từ Pseudomonas maltophilia khử protein còn lại 1%; Wang S. và cộng sự dùng protease từ Bacillus sp. khử 73% protein sau 3 ngày; các enzyme thương mại như Alcalase, Chymotrypsin, Papain, Bromelain khử protein phế liệu tôm đạt tỷ lệ thu hồi đáng kể; Oh K. và cộng sự (2000, 2007) dùng Pseudomonas aeruginosa F722 kết hợp 10% glucose khử 92% khoáng và 63% protein; Rao M. và cộng sự (2000) dùng Lactobacillus plantarum kết hợp acid acetic/citric đạt hiệu suất khử protein 75% - 88% và khử khoáng 86% - 90%; các tác giả trong nước như Trần Thị Luyến, Vũ Ngọc Bội thử nghiệm enzyme protease và lên men vi khuẩn lactic.
• Phương pháp sản xuất oligochitosan:
  • Phương pháp hóa học: Thủy phân bằng $\text{HNO}_2$, $\text{HF}$, $\text{HCl}$ đặc (Trần Thị Luyến và cs dùng $\text{HCl}$ 10M, tỷ lệ w/v 1/4 ở $40^\circ\text{C}$, nâng nhiệt $85^\circ\text{C}$ trong 2 phút, trung hòa $\text{NaOH}$ 50%, tủa cồn/methanol, sấy lạnh đạt hiệu suất 70%).
  • Phương pháp sinh học: Nguyen Anh Dzung và cộng sự (2007) dùng Chitosanase, Cellulase (0,4 U/ml trong 4 giờ) thu nhận oligochitosan phân đoạn B (độ trùng hợp 8 - 18) chiếm 40,8%; Trần Thị Luyến và cộng sự (2012) dùng Papain ($70^\circ\text{C}$, pH 5,5, 6 ngày đạt hiệu suất 97%) hoặc Hemicellulase ($37^\circ\text{C}$, pH 5,5, 5 ngày); Lê Thị Tưởng (2007) dùng Hemicellulase ở $37^\circ\text{C}$, pH 5 trong 5 giờ.
  • Phương pháp vật lý và bức xạ: Chiếu xạ gamma Co-60 phân cắt chitosan vẩy hoặc dung dịch. Các nghiên cứu của Nguyễn Quốc Hiến và cs (2000, 2012), Kang B. và cs (2007), El Sawy N. và cs (2010), Wasikiewicz, Czechowska Biskup xác định hiệu suất cắt mạch bức xạ $G_s$, khảo sát hiệu ứng đồng cắt mạch giữa $\text{H}_2\text{O}_2$ và tia gamma.
• Ứng dụng bảo quản: Các công trình của Trần Thị Luyến và cs ghi nhận việc dùng oligochitosan bảo quản dứa (dung dịch 1%, giữ tươi 7 ngày ở $8^\circ\text{C} - 10^\circ\text{C}$), bảo quản cá ngân (dung dịch 1%, giữ tươi 36 giờ ở $8^\circ\text{C} - 10^\circ\text{C}$, kìm hãm tích lũy $\text{NH}_3$), bảo quản xúc xích (tỷ lệ 0,4% thay thế $\text{NaNO}_3$), bảo quản thịt tươi (dung dịch 2%, giữ tươi 5 ngày ở $8^\circ\text{C} - 10^\circ\text{C}$).

Vị trí của luận án: Luận án giải quyết tính liên hoàn từ khâu xử lý phế liệu bằng công nghệ sinh học sạch, tối ưu hóa quá trình deacetyl chitin thành chitosan ở nhiệt độ phòng, áp dụng bức xạ gamma Coban-60 phân cắt trực tiếp chitosan dạng vẩy khô không cần dùng hóa chất tủa và tinh sạch, đồng thời xác lập dữ liệu an toàn sinh học in vivo và thông số bảo quản tôm bạc biển.

Hướng tiếp cận	Tác giả tiêu biểu	Tác nhân sử dụng	Ưu điểm ghi nhận	Nhược điểm / Giới hạn
Khử protein & khoáng hóa học	Fernandez Kim S. (2004)	$\text{NaOH}$ 1-10%, $\text{HCl}$ 1-2N	Tách triệt để, thời gian ngắn	Ô nhiễm môi trường, cắt mạch polymer
Lên men vi sinh vật	Rao M. và cs (2000), Oh K. và cs (2007)	L. plantarum, P. aeruginosa F722	Thân thiện môi trường, bảo vệ polymer	Cần bổ sung xử lý phụ trợ
Thủy phân hóa học tạo oligochitosan	Trần Thị Luyến và cs (2010)	$\text{HCl}$ 10M, $\text{HNO}_2$, $\text{HF}$	Tốc độ nhanh, phản ứng triệt để	Lượng acid dư lớn, quy trình làm sạch phức tạp
Thủy phân bằng enzyme	Nguyen Anh Dzung và cs (2007)	Chitosanase, Cellulase, Papain	Điều kiện êm dịu, kiểm soát phân đoạn	Chi phí enzyme cao, thời gian kéo dài
Phân cắt bằng bức xạ gamma Co-60	Nguyễn Quốc Hiến (2000), Luận án (2018)	Tia bức xạ gamma Co-60	Không dùng hóa chất tủa, sản phẩm vô trùng	Cần thiết bị nguồn chiếu xạ chuyên dụng

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết của luận án dựa trên các nguyên lý hóa sinh và vật lý bức xạ:

• Cấu trúc polyme: Chitin là polysaccharide cấu tạo từ các đơn vị N-acetyl-D-glucosamine liên kết $\beta\text{-(1}\rightarrow\text{4)}$. Chitosan hình thành qua phản ứng deacetyl hóa, gồm các đơn vị D-glucosamine ($\ge 60%$) mang nhóm amin ($-\text{NH}_2$) tự do. Oligochitosan là chuỗi oligosaccharide mạch ngắn ($Mw < 10.000\text{ Da}$), có khả năng tan hoàn toàn trong nước ở pH trung tính.
• Cơ chế sinh học: Vi khuẩn lactic (L. plantarum) lên men nguồn carbon (rỉ đường) sinh tổng hợp acid lactic, chuyển hóa canxi carbonat không tan thành calcium lactate tan, đồng thời tiết enzyme protease ngoại bào thủy phân liên kết protein-chitin.
• Cơ chế cắt mạch bức xạ: Chiếu xạ gamma Coban-60 tác động lên chitosan tạo các gốc tự do nội phân tử. Các gốc hydroxyl ($\text{OH}^\bullet$) sinh ra tấn công bẻ gãy liên kết $\beta\text{-(1}\rightarrow\text{4)-glycoside}$, làm giảm khối lượng phân tử ($Mw$) và độ nhớt theo liều xạ hấp thụ $D\text{ (kGy)}$ mà không phá hủy cấu trúc vòng pyranose.
• Cơ chế kháng khuẩn: Nhóm amin tích điện dương ($-\text{NH}_3^+$) của oligochitosan tương tác tĩnh điện với polyanion trên màng tế bào vi khuẩn (lipopolysaccharide, protein), làm biến đổi tính thấm màng sinh chất, ức chế quá trình phiên mã DNA và gây ngưng tụ tế bào.
• Cơ chế biến đổi của tôm: Hiện tượng biến đen do hệ enzyme polyphenoloxidase (PPO) xúc tác oxy hóa tyrosine thành melanin; quá trình ươn hỏng do vi sinh vật hiếu khí phân giải protein thành các hợp chất bay hơi ($\text{NH}_3$, TMA).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm:

• Bố trí thí nghiệm: Quy hoạch thực nghiệm 3 yếu tố theo mô hình Box - Behnken để tối ưu hóa quá trình lên men vi khuẩn lactic khử protein và khoáng; phương pháp bố trí thí nghiệm đơn yếu tố khảo sát nồng độ $\text{NaOH}$, thời gian deacetyl, liều chiếu xạ, nồng độ oligochitosan, thời gian nhúng và chế độ bao gói.
• Phương pháp phân tích hóa học: Xác định hàm lượng ẩm, protein thô (Kjeldahl), khoáng tổng số (nung ở $550^\circ\text{C} - 600^\circ\text{C}$), lipid theo tiêu chuẩn AOAC và TCVN; xác định độ hòa tan của chitosan trong các dung dịch acid hữu cơ và vô cơ.
• Phương pháp phân tích cấu trúc và hóa lý: Độ deacetyl (DD) xác định bằng quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H-NMR}$); khối lượng phân tử trung bình khối ($Mw$) và sự phân bố phân đoạn xác định bằng sắc ký gel thấm qua (GPC); đo độ nhớt bằng nhớt kế Ostwald tính toán theo phương trình Mark-Houwink-Sakurada.
• Phương pháp vi sinh và hoạt tính sinh học: Hoạt độ protease xác định bằng phương pháp Anson cải tiến; thu nhận sinh khối L. plantarum VTCC-B 431 trên môi trường MRS; xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và đo đường kính vòng ức chế trên môi trường thạch BHI đối với 5 chủng vi khuẩn chỉ thị; đếm tổng số vi sinh vật hiếu khí trên mẫu tôm.
• Phương pháp đánh giá chất lượng tôm: Định lượng hàm lượng nitơ base bay hơi tổng số ($\text{NH}_3$) bằng phương pháp chưng cất Kjeldahl; đo pH thịt tôm; xác định hoạt tính chống oxy hóa tổng bằng phương pháp quét gốc tự do DPPH; đánh giá cảm quan chất lượng tôm theo hệ thống phân điểm mô tả.
• Phương pháp thử nghiệm độc tính học in vivo: Đánh giá độc tính cấp và giai đoạn phục hồi trên chuột lang theo hai nhóm thí nghiệm; theo dõi diễn biến khối lượng cơ thể; giải phẫu cân trọng lượng tươi nội quan (gan, lách, thận, dạ dày); xét nghiệm các chỉ số sinh hóa máu (huyết học), sinh hóa nước tiểu; làm tiêu bản vi thể cắt lát nhuộm hematoxylin-eosin quan sát cấu trúc mô học gan, lách, thận, dạ dày.
• Phương pháp xử lý dữ liệu: Toàn bộ số liệu thực nghiệm được xử lý thống kê bằng phân tích phương sai (ANOVA) để so sánh ý nghĩa sự khác biệt ở mức xác suất tin cậy.

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu

Tác giả trình bày bối cảnh thực tiễn của ngành thủy sản Việt Nam, những hạn chế trong bảo quản nguyên liệu hải sản sau thu hoạch trên tàu cá đánh bắt xa bờ và nguy cơ mất an toàn thực phẩm do lạm dụng hóa chất bảo quản. Đặt vấn đề nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học oligochitosan từ phụ phẩm đầu vỏ tôm thẻ chân trắng bằng công nghệ bức xạ Coban-60 và định hướng ứng dụng bảo quản tôm bạc biển tươi sống.

Chương I. Tổng quan tài liệu

Chương này tổng thuật toàn diện cơ sở lý luận và các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước:

• Khái quát cấu trúc hóa học, tính chất lý hóa của chitin, chitosan và dẫn xuất oligochitosan; sự phụ thuộc của hoạt tính sinh học vào độ deacetyl hóa và khối lượng phân tử.
• Tổng kết các phương pháp tách chiết chitin từ vỏ giáp xác (hóa học, enzyme protease thương phẩm, lên men lactic) và các công nghệ deacetyl hóa chuyển đổi chitin thành chitosan.
• So sánh các phương pháp phân cắt chitosan tạo oligochitosan: hóa học (acid vô cơ, tác nhân oxy hóa), sinh học (enzyme Chitosanase, Cellulase, Papain) và phương pháp vật lý bức xạ gamma.
• Cơ sở lý thuyết về biến đổi chất lượng tôm sau thu hoạch (biến đen, sinh $\text{NH}_3$, ươn hỏng vi sinh vật) và điểm lại các công trình ứng dụng oligochitosan trong bảo quản nông thủy sản (dứa, cá ngân, xúc xích, thịt tươi).

Chương II. Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Tác giả mô tả chi tiết nguồn gốc nguyên vật liệu, hóa chất, chủng vi sinh vật và hệ thống phương pháp thực nghiệm:

• Nguyên vật liệu: Đầu vỏ tôm thẻ chân trắng tươi thu gom tại cơ sở chế biến; tôm bạc biển thu nhận sau đánh bắt; chủng vi khuẩn lactic L. plantarum VTCC-B 431; chuột lang khỏe mạnh làm động vật mô hình.
• Thiết kế hệ thống thí nghiệm: Sơ đồ khối nghiên cứu tổng quát; quy trình hoạt hóa vi khuẩn lactic; quy hoạch thực nghiệm Box - Behnken 3 yếu tố tối ưu hóa quá trình lên men; bố trí thí nghiệm deacetyl ở nhiệt độ phòng; quy trình chiếu xạ gamma Coban-60 tại Viện Nghiên cứu Hạt nhân Đà Lạt; phương pháp nhúng và bảo quản tôm lạnh.
• Quy trình phân tích: Chi tiết các bước đo quang phổ FTIR, $^1\text{H-NMR}$, sắc ký GPC, đo độ nhớt, thử nghiệm MIC kháng khuẩn, xét nghiệm huyết học, sinh hóa nước tiểu và kỹ thuật cắt lát mô học nội quan chuột.

Chương III. Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Chương III trình bày toàn bộ kết quả thực nghiệm của luận án qua các nội dung chính:

1. Thành phần hóa học của phế liệu đầu vỏ tôm thẻ chân trắng: Hàm lượng ẩm chiếm $76,4%$; tính theo chất khô, hàm lượng protein đạt $39,2%$, khoáng chất chiếm $32,6%$, chitin đạt $21,8%$ và lipid chiếm $6,4%$.

2. Nghiên cứu sản xuất chitin bằng phương pháp sinh học kết hợp:

• Lên men bằng L. plantarum VTCC-B 431: Vi khuẩn được hoạt hóa trong 28 giờ, mật độ tế bào đạt $2 \times 10^9\text{ cfu/ml}$. Quy hoạch thực nghiệm Box - Behnken xác định các thông số tối ưu: tỷ lệ rỉ đường bổ sung $11,15%\text{ (w/w)}$, tỷ lệ dịch vi khuẩn bổ sung $11,20%\text{ (v/w)}$, thời gian lên men 6,19 ngày ở nhiệt độ phòng, tỷ lệ nước/nguyên liệu là 1/1, pH ban đầu 7,0. Quá trình lên men giúp khử phần lớn protein và khoáng chất.
• Khử protein còn lại: Bổ sung enzyme Flavourzyme với tỷ lệ $0,06%$, thực hiện thủy phân ở nhiệt độ $50^\circ\text{C}$, pH 7,5 trong thời gian 8 giờ.
• Khử khoáng còn lại: Xử lý bằng dung dịch $\text{HCl}$ 3% với tỷ lệ dung dịch/chitin thô là 2/1 ở nhiệt độ phòng trong 10 giờ.
• Sản phẩm chitin thu được có độ tinh sạch cao, hàm lượng protein và khoáng còn lại đạt tiêu chuẩn kỹ thuật; chi phí nguyên vật liệu tính toán là 111.000 VNĐ/kg sản phẩm.

3. Nghiên cứu quá trình deacetyl chitin tạo chitosan ở nhiệt độ phòng:

• Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch $\text{NaOH}$ (từ 30% đến 50%) và thời gian xử lý (từ 24 đến 144 giờ) ở nhiệt độ phòng ($28^\circ\text{C} - 30^\circ\text{C}$) với tỷ lệ dung dịch $\text{NaOH}$/chitin là 4/1.
• Kết quả phổ FTIR và $^1\text{H-NMR}$ chứng minh khi xử lý bằng $\text{NaOH}$ 50% trong thời gian 120 giờ ở nhiệt độ phòng, sản phẩm chitosan thu được có độ deacetyl đạt trên 93%, hạn chế được hiện tượng cắt mạch polymer so với phương pháp gia nhiệt cao truyền thống. Chi phí nguyên vật liệu sản xuất chitosan đạt 361.000 VNĐ/kg.

4. Nghiên cứu sản xuất oligochitosan bằng bức xạ gamma Coban-60:

• Chitosan có độ deacetyl $>90%$ dạng vẩy khô được chiếu xạ trực tiếp bằng nguồn gamma Co-60 với các dải liều khác nhau.
• Liều chiếu xạ tối ưu được xác định là 166 kGy. Ở liều xạ này, mạch chitosan bị bẻ gãy tạo thành hỗn hợp oligochitosan tan hoàn toàn trong nước, phân tách thành 3 phân đoạn rõ rệt qua sắc ký rây phân tử GPC.
• Cấu trúc phân tử của oligochitosan được xác định qua phổ $^1\text{H-NMR}$ và FTIR gồm 13 monomer (độ trùng hợp $\text{DP} = 13$).

5. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của oligochitosan:

• Thử nghiệm MIC và phương pháp khuếch tán đĩa thạch chứng minh oligochitosan có khả năng ức chế mạnh 5 chủng vi khuẩn kiểm nghiệm: Escherichia coli O157:H7, Salmonella typhimurium, Bacillus subtilis, Listeria monocytogenes và Staphylococcus aureus.

6. Thử nghiệm độc tính in vivo trên chuột lang:

• Thử nghiệm trên 2 nhóm chuột lang (Nhóm I đánh giá độc tính cấp, Nhóm II đánh giá giai đoạn hồi phục) cho thấy: chuột tăng trưởng khối lượng bình thường; các chỉ số sinh hóa máu và nước tiểu không có sai khác mang ý nghĩa thống kê so với lô đối chứng.
• Khối lượng tươi và cấu trúc giải phẫu vi thể mô học của gan, thận, lách và dạ dày hoàn toàn bình thường, không xuất hiện tổn thương bệnh lý hay hoại tử mô. Kết quả khẳng định chế phẩm oligochitosan sản xuất bằng bức xạ Co-60 an toàn qua đường tiêu hóa.

7. Ứng dụng oligochitosan bảo quản tôm bạc nguyên liệu:

• Khảo sát nồng độ dung dịch oligochitosan (0,5%, 1,0%, 1,5%, 2,0%), thời gian nhúng (0,5 đến 3 phút) và chế độ bao gói bảo quản ở nhiệt độ $0^\circ\text{C} - 4^\circ\text{C}$.
• Chế độ xử lý tối ưu: Nhúng tôm bạc nguyên liệu vào dung dịch oligochitosan 1% trong thời gian 1 phút, để ráo và bao gói kín bảo quản lạnh.
• Sau 6 ngày bảo quản ở $0^\circ\text{C} - 4^\circ\text{C}$, tôm xử lý oligochitosan 1% duy trì điểm cảm quan tốt, ức chế quá trình sinh $\text{NH}_3$, duy trì pH ổn định, kìm hãm sự phát triển của tổng số vi sinh vật hiếu khí và giữ vững chất lượng đạt chuẩn làm nguyên liệu chế biến.

Công đoạn công nghệ	Thông số kỹ thuật xác lập	Chỉ tiêu chất lượng / Kết quả đạt được
Lên men khử protein, khoáng	L. plantarum $11,2%$, rỉ đường $11,15%$, 6,19 ngày, nhiệt độ phòng	Khử phần lớn khoáng và protein thô
Khử protein còn lại	Flavourzyme $0,06%$, $50^\circ\text{C}$, pH 7,5, 8 giờ	Protein còn lại $<1%$
Khử khoáng còn lại	$\text{HCl}$ 3%, tỷ lệ dung dịch/chitin 2/1, 10 giờ, nhiệt độ phòng	Khoáng còn lại $<0,5%$
Deacetyl tạo chitosan	$\text{NaOH}$ 50%, tỷ lệ 4/1, 120 giờ, nhiệt độ phòng	Độ deacetyl $>93%$
Cắt mạch tạo oligochitosan	Chiếu xạ gamma Co-60 dạng vẩy, liều xạ 166 kGy	Oligochitosan tan hoàn toàn, 13 monomer
Bảo quản tôm bạc biển	Nhúng dung dịch oligochitosan 1% trong 1 phút, giữ lạnh $0-4^\circ\text{C}$	Kéo dài thời gian tươi tốt lên 6 ngày

Kết quả và những đóng góp mới

Luận án đúc kết 6 đóng góp mới về mặt khoa học và công nghệ thực tiễn:

1. Xác định bộ thông số tối ưu cho quy trình sản xuất chitin bằng phương pháp sinh học kết hợp giữa lên men vi khuẩn lactic L. plantarum VTCC-B 431 ($2 \times 10^9\text{ cfu/ml}$, rỉ đường $11,15%$, dịch vi khuẩn $11,20%$, lên men 6,19 ngày ở nhiệt độ phòng) và enzyme Flavourzyme ($0,06%$, $50^\circ\text{C}$, pH 7,5 trong 8 giờ), kết hợp khử khoáng bằng $\text{HCl}$ 3% (10 giờ). Quy trình giảm thiểu hóa chất xả thải, tận thu phụ phẩm protein và astaxanthin phục vụ sản xuất thức ăn chăn nuôi, hạ giá thành nguyên vật liệu chitin xuống mức 111.000 VNĐ/kg.
2. Xây dựng quy trình deacetyl chitin thành chitosan có độ deacetyl trên 90% (thực tế đạt $>93%$) bằng dung dịch $\text{NaOH}$ 50% ở nhiệt độ phòng trong 120 giờ (tỷ lệ 4/1), chi phí nguyên liệu 361.000 VNĐ/kg. Giải pháp thực hiện ở nhiệt độ thường giúp đơn giản hóa trang thiết bị, tiết kiệm năng lượng và dễ triển khai sản xuất quy mô lớn.
3. Thiết lập quy trình sản xuất oligochitosan bằng phương pháp chiếu xạ gamma Coban-60 tác động trực tiếp lên chitosan dạng vẩy với liều hấp thụ 166 kGy. Sản phẩm thu được gồm 3 phân đoạn, tan hoàn toàn trong nước, có hoạt tính kháng 5 chủng vi khuẩn kiểm nghiệm (E. coli O157:H7, Salmonella typhimurium, B. subtilis, Listeria monocytogenes, S. aureus) mà không cần trải qua các bước kết tủa cồn, rửa và sấy phức tạp.
4. Xác định cấu trúc hóa học phân tử của oligochitosan tạo thành từ phương pháp chiếu xạ gamma Co-60 gồm chuỗi 13 monomer (độ trùng hợp $\text{DP} = 13$).
5. Cung cấp dữ liệu thực nghiệm đầu tiên về đánh giá an toàn độc tính học in vivo của chế phẩm oligochitosan chiếu xạ Co-60 trên chuột lang. Kết quả phân tích huyết học, sinh hóa nước tiểu và giải phẫu vi thể gan, thận, lách, dạ dày chứng minh chế phẩm không gây độc cấp và hoàn toàn an toàn qua đường tiêu hóa.
6. Xây dựng hoàn thiện quy trình bảo quản tôm bạc biển nguyên liệu sau thu hoạch bằng kỹ thuật nhúng dung dịch oligochitosan 1% trong 1 phút, kết hợp bảo quản lạnh ở $0^\circ\text{C} - 4^\circ\text{C}$, giúp duy trì chất lượng nguyên liệu đạt chuẩn chế biến trong thời gian 6 ngày, góp phần hạn chế việc sử dụng hóa chất độc hại trong bảo quản thủy sản.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu:

• Kỹ thuật chiếu xạ cắt mạch đòi hỏi phải tiếp cận nguồn chiếu xạ công nghiệp gamma Coban-60 tập trung, yêu cầu quy chuẩn kiểm soát an toàn bức xạ nghiêm ngặt; cơ chế phân cắt mạch bức xạ mang tính ngẫu nhiên.
• Toàn bộ các thử nghiệm sản xuất chitin sinh học, deacetyl nhiệt độ phòng và bảo quản nguyên liệu mới dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm và bán công nghiệp, chưa tiến hành thử nghiệm pilot tại các nhà máy chế biến quy mô lớn.
• Thử nghiệm ứng dụng bảo quản mới giới hạn trên đối tượng tôm bạc biển ở điều kiện nhiệt độ lạnh mát ($0^\circ\text{C} - 4^\circ\text{C}$), chưa đánh giá trên các đối tượng hải sản khác hoặc các chế độ bảo quản kết hợp khác.

Hướng nghiên cứu tiếp theo:

• Hoàn thiện thiết kế dây chuyền thiết bị để triển khai thử nghiệm sản xuất chitin sinh học và chitosan ở quy mô pilot công nghiệp.
• Mở rộng nghiên cứu ứng dụng chế phẩm oligochitosan trong bảo quản các đối tượng thủy sản có giá trị kinh tế khác như mực, cá ngừ và tôm thẻ chân trắng xuất khẩu.
• Nghiên cứu kết hợp màng bao oligochitosan với các phụ gia tự nhiên khác hoặc công nghệ bao gói khí điều chỉnh (MAP) để kéo dài hơn nữa thời hạn bảo quản.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên khảo hữu ích cho nhiều đối tượng:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên thuộc các chuyên ngành Công nghệ Chế biến Thủy sản, Công nghệ Thực phẩm, Công nghệ Sinh học và Kỹ thuật Bức xạ hạt nhân: Có thể tham khảo phương pháp quy hoạch thực nghiệm Box - Behnken, phương pháp phân tích hóa lý polyme ($^1\text{H-NMR}$, FTIR, GPC) và mô hình thử nghiệm độc tính học trên động vật.
• Các doanh nghiệp chế biến phụ phẩm thủy sản và sản xuất hóa chất sinh học: Tham khảo trực tiếp quy trình sản xuất chitin sinh học thân thiện môi trường, kỹ thuật deacetyl ở nhiệt độ thường và công nghệ sản xuất oligochitosan bằng bức xạ Coban-60 nhằm tối ưu hóa chi phí sản xuất.
• Cơ quan quản lý chất lượng và hoạch định chính sách an toàn thực phẩm: Nắm bắt cơ sở dữ liệu khoa học về tính an toàn của chế phẩm sinh học oligochitosan để xây dựng tiêu chuẩn kỹ thuật thay thế hóa chất cấm trong bảo quản thủy hải sản sau thu hoạch.

Câu hỏi thường gặp

1. Quy trình sản xuất chitin bằng phương pháp sinh học kết hợp trong luận án có các thông số kỹ thuật tối ưu nào? Quá trình lên men sử dụng chủng Lactobacillus plantarum VTCC-B 431 hoạt hóa 28 giờ (mật độ $2 \times 10^9\text{ cfu/ml}$), bổ sung $11,15%\text{ (w/w)}$ rỉ đường và $11,20%\text{ (v/w)}$ dịch vi khuẩn, tỷ lệ nước/nguyên liệu là 1/1, lên men trong 6,19 ngày ở nhiệt độ phòng với pH ban đầu 7,0. Tiếp đó, protein còn lại được khử bằng enzyme Flavourzyme $0,06%$ ở $50^\circ\text{C}$, pH 7,5 trong 8 giờ. Khoáng còn lại được khử bằng dung dịch $\text{HCl}$ 3% (tỷ lệ 2/1) ở nhiệt độ phòng trong 10 giờ.

2. Điểm khác biệt của kỹ thuật deacetyl chitin thành chitosan trong luận án so với phương pháp truyền thống là gì? Phương pháp truyền thống đòi hỏi gia nhiệt cao ($\ge 100^\circ\text{C}$) trong thời gian ngắn bằng kiềm đặc, dễ làm suy giảm khối lượng phân tử. Kỹ thuật của luận án thực hiện deacetyl chitin bằng dung dịch $\text{NaOH}$ 50% với tỷ lệ dung dịch/chitin là 4/1 ở điều kiện nhiệt độ thường trong thời gian 120 giờ, tạo ra sản phẩm chitosan có độ deacetyl cao trên 93%, cấu trúc polyme ít bị đứt gãy và tiết kiệm chi phí năng lượng.

3. Liều chiếu xạ Coban-60 tối ưu để phân cắt chitosan tạo oligochitosan là bao nhiêu và cấu trúc phân tử thu được gồm bao nhiêu monomer? Liều chiếu xạ gamma Coban-60 tối ưu để phân cắt chitosan dạng vẩy khô là 166 kGy. Sản phẩm oligochitosan sau chiếu xạ tan hoàn toàn trong nước, phân tách thành 3 phân đoạn và có cấu trúc phân tử gồm 13 monomer (độ trùng hợp $\text{DP} = 13$).

4. Hoạt tính kháng khuẩn của chế phẩm oligochitosan được kiểm chứng trên những chủng vi sinh vật nào? Chế phẩm oligochitosan có khả năng ức chế sinh trưởng rõ rệt đối với 5 chủng vi khuẩn kiểm nghiệm: Escherichia coli O157:H7, Salmonella typhimurium, Bacillus subtilis, Listeria monocytogenes và Staphylococcus aureus.

5. Quy trình ứng dụng oligochitosan trong bảo quản tôm bạc biển được xác lập với chế độ như thế nào? Tôm bạc nguyên liệu sau thu hoạch được nhúng trong dung dịch oligochitosan nồng độ 1% trong thời gian 1 phút, sau đó để ráo, bao gói kín và bảo quản ở nhiệt độ $0^\circ\text{C} - 4^\circ\text{C}$. Phương pháp này giúp kéo dài thời gian bảo quản tôm đạt tiêu chuẩn chế biến lên đến 6 ngày.

Kết luận

Luận án của nghiên cứu sinh Vũ Thị Hoan đã giải quyết trọn vẹn chuỗi công nghệ từ việc tận dụng phụ phẩm đầu vỏ tôm để sản xuất chitin bằng phương pháp sinh học kết hợp, tối ưu hóa quá trình deacetyl ở nhiệt độ thường đạt độ deacetyl trên 93%, đến việc ứng dụng bức xạ gamma Coban-60 liều 166 kGy để tạo oligochitosan mạch 13 monomer có hoạt tính kháng khuẩn cao. Các thử nghiệm độc chất học in vivo trên chuột lang xác nhận tính an toàn tuyệt đối của chế phẩm qua đường tiêu hóa. Ứng dụng nhúng dung dịch oligochitosan 1% trong 1 phút đã chứng minh khả năng kéo dài thời gian bảo quản tôm bạc biển sau thu hoạch lên 6 ngày ở điều kiện lạnh mát, mở ra giải pháp công nghệ sinh học thiết thực thay thế hóa chất bảo quản độc hại trong ngành thủy sản.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Những năm qua, ngành thuỷ sản đã phát triển và vươn lên thành một trong những ngành kinh tế mũi nhọn của cả nước. Chiến lược phát triển xuất khẩu thuỷ sản Việt Nam phấn đấu đến năm 2020 đạt mức 10 tỷ USD, đưa Việt Nam trở thành một trong bốn cường quốc hàng đầu về xuất khẩu thuỷ sản. Theo định hướng này, chính phủ Việt Nam có chiến lược tăng cường đầu tư cho khai thác, bảo quản nguyên liệu thủy sản đánh bắt xa bờ vừa góp phần phát triển kinh tế biển vừa giữ vững chủ quyền biển đảo. Hiện nay việc bảo quản nhiều loại nguyên liệu thủy sản như cá, tôm, mực.

sau thu hoạch còn nhiều hạn chế. Theo quy định HACCP, để đảm bảo chất lượng, nguyên liệu thủy sản cần được bảo quản bằng phương pháp ướp đá đủ để giữ nhiệt độ của nguyên liệu ≤ 4oC. Tuy vậy, người dân thường không có đủ dụng cụ, thiết bị và các điều kiện để bảo quản nguyên liệu thủy sản đúng cách nên thường có xu thế lạm dụng các loại kháng sinh và các loại phụ gia độc hại như hàn the, urea. trong bảo quản nguyên liệu thủy sản gây nên tình trạng nguyên liệu thủy sản chứa dư lượng các chất bảo quản và không bảo đảm yêu cầu vệ sinh an toàn thực phẩm.

Một trong các hướng bảo quản nguyên liệu thủy sản đang được các nhà nghiên cứu quan tâm là sử dụng các tác nhân sinh học có nguồn gốc tự nhiên, không độc hại và có khả năng ức chế sự sinh trưởng phát triển của các vi sinh vật gây hư hỏng để kéo dài thời gian bảo quản nguyên liệu thủy sản. Oligochitosan là tác nhân sinh học có nguồn gốc từ vỏ tôm, không độc hại và có khả năng kháng khuẩn. Oligochitosan đã được các nhà nghiên cứu nhất là các nhà nghiên cứu tại Trường Đại học Nha Trang quan tâm nghiên cứu sử dụng trong bảo quản các loại nguyên liệu thủy sản. Theo hướng nghiên cứu này, dưới sự tài trợ của đề tài cấp nhà nước KC07.02/11-15: “Nghiên cứu công nghệ sản xuất và ứng dụng chế phẩm oligosaccharide (oligochitin và oligochitosan) để bảo quản sau thu hoạch nguyên liệu thuỷ sản đánh bắt xa bờ” và được sự đồng ý của cán bộ hướng dẫn khoa học, tôi thực hiện luận án “Nghiên cứu sản xuất oligochitosan và ứng dụng trong bảo quản tôm nguyên liệu sau thu hoạch”.

Mục tiêu của chung của luận án Nghiên cứu sản xuất chế phẩm oligochitosan có hoạt tính kháng khuẩn bằng công nghệ bức xạ Coban 60 và ứng dụng để kéo dài thời gian bảo quản nguyên liệu tôm bạc biển. Mục tiêu cụ thể - Sử dụng phương pháp sinh học phối hợp giữa vi khuẩn lactic và enzyme protease để khử protein và khoáng chất ở đầu vỏ tôm thẻ trong quá trình sản xuất chitin nhằm 1 giảm thiểu hóa chất sử dụng trong quá trình này. - Sản xuất chitosan có độ deacetyl cao bằng NaOH nồng độ cao trong điều kiện nhiệt độ thường để dễ dàng triển khai sản xuất ở quy mô lớn. - Sản xuất được oligochitosan bằng công nghệ bức xạ Coban 60 và sử dụng oligochitosan sản xuất được trong bảo quản tôm biển.

Nội dung của luận án 1) Nghiên cứu sử dụng phương pháp sinh học để khử protein và các tạp chất có trong đầu và vỏ tôm thẻ chân trắng trong sản xuất chitin. 2) Nghiên cứu deacetyl chitin để sản xuất chitosan có độ deacetyl cao. 3) Nghiên cứu sản xuất chế phẩm oligochitosan bằng kỹ thuật bức xạ Coban 60. 4) Sử dụng oligochitosan trong bảo quản tôm bạc nguyên liệu.

Ý nghĩa khoa học của luận án Luận án nghiên cứu một cách đầy đủ từ quá trình sản xuất chitin từ đầu vỏ tôm thẻ chân trắng bằng phương pháp sinh học đến sản xuất chitosan có độ deacetyl cao ở nhiệt độ thường và sản xuất oligochitosan có hoạt tính kháng khuẩn bằng kỹ thuật bức xạ Coban 60. Điểm mới của luận án là lần đầu tiên luận án công bố sản xuất chitosan có độ deacetyl cao ở nhiệt độ thường và luận án cũng lần đầu tiên sản xuất oligochitosan bằng kỹ thuật sử dụng bức xạ coban 60 để phân cắt chitosan và ứng dụng oligochitosan thu được trong bảo quản tôm bạc nguyên liệu. Ngoài ra, luận án cũng lần đầu tiên nghiên cứu đánh giá độc tính của oligochitosan sau chiếu xạ trên chuột thí nghiệm. Kết quả nghiên cứu của luận án đã góp phần làm phong phú thêm các hiểu biết về việc ứng dụng kỹ thuật bức xạ coban 60 trong sản xuất oligochitosan dùng làm phụ gia trong bảo quản tôm nguyên liệu.

Mặt khác kết quả nghiên cứu của luận án còn là tài liệu tham khảo cho nghiên cứu sinh, học viên cao học và những ai quan tâm, nghiên cứu về lĩnh vực này. Ý nghĩa thực tiễn của luận án Kết quả của luận án cho thấy hoàn toàn có thể sử dụng oligochitosan sản xuất bằng kỹ thuật bức xạ Coban 60 để kéo dài thời gian bảo quản nguyên liệu tôm bạc. Kết quả nghiên cứu của luận án có ý nghĩa thực tiễn cao, góp phần tham gia giải quyết tình trạng lạm dụng hóa chất trong bảo quản nguyên liệu thủy sản, đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm đồng thời góp phần bảo vệ môi trường do sử dụng phương pháp sản xuất sinh học để sản xuất chitin nên thân thiện với môi trường. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.

CƠ SỞ LÝ THUYẾT VỀ SẢN XUẤT CHITOSAN VÀ OLIGOCHITOSAN 1. Giới thiệu về chitin, chitosan và oligochitosan 1. Chitin và chitosan Chitin là loại polysaccharide đầu tiên được con người sản xuất từ nấm vào năm 1811, trước khi phát hiện ra cellulose khoảng 30 năm [37, 76]. Rouget lần đầu tiến hành xử lý chitin bằng kiềm đặc và thu được một chất mới không giống như chitin, có khả năng hòa tan được trong acid, sau này được người ta gọi là “chitosan”.

Thuật ngữ “chitosan” lần đầu tiên được Hoppe Seiler công bố vào năm 1894 khi ông tiến hành deacetyl chitin thành “chitosan” [83]. Trong một thời gian dài sau đó, mặc dù chitin vẫn là một polysaccharid tự nhiên, ít được sử dụng thì chitosan lại là một polymer được nhiều nhà khoa học quan tâm do đặc tính sinh học, khả năng dễ dàng thủy phân thành các đơn chất của nó [35, 74, 75, 125]. Chitin có thể được sản xuất từ các nguồn nguyên liệu khác nhau nhưng hiện nay phế liệu vỏ tôm, cua, tôm hùm, nhuyễn thể, mực trong công nghiệp chế biến thủy sản vẫn là nguồn nguyên liệu chính để sản xuất chitin [118]. Do quá trình chế biến tôm, cua, tôm hùm,.

thường tạo ra một lượng lớn phế liệu, chiếm tới 45% trọng lượng của giáp xác [71, 115, 134]. Hàng năm có khoảng hơn hai mươi triệu tấn phế thải từ thủy sản thải ra môi trường, tương đương với khoảng 25% tổng sản lượng thủy sản được chế biến [52]. Tỷ lệ chitin từ nguồn phế liệu thủy sản có thể khác nhau, tùy theo mùa và loài nhưng nhìn chung, xương, vỏ thủy sản chứa khoảng 15% - 40% chitin, 20% - 40% protein, 20% - 50% canxi carbonat và thành phần rất ít các chất khác như sắc tố, chất béo và muối kim loại khác [70]. Hàm lượng chitin và canxi carbonat trong một số loại tôm [70] Loài Chitin (%) CaCO3 (%) Vị trí Crangon sp.

và Pandalus sp. 17 – 40 20 – 30 Vỏ Penaeus sp. ~ 40 20 – 30 Vỏ Nephrops sp. và Homarus sp.

60 – 75 20 – 30 Vỏ 3 Chitin có chứa hàm lượng nitơ hơn 7% khối lượng hoặc khi độ deacetyl của chitin trên 60% thì được gọi là chitosan [56, 98]. Chitosan là một dẫn xuất của chitin, được hình thành khi thực hiện quá trình deacetyl hoá chitin (tách nhóm acetyl) khỏi chitin. Chitosan là một polyme sinh học gồm các nhóm D-glucosamine (80%) và N-acetyl- D-glucosamine (20%) liên kết với nhau nhờ liên kết β(1 →4) và được mô tả là “vật liệu sinh học đa năng nhất của tạo hóa” là một dẫn xuất chứa rất nhiều nhóm amin. Công thức cấu tạo của chitosan gần giống như chitin và cellulose, chỉ khác là chitosan chứa nhóm amin ở cacbon thứ 2 [107].

Ở mức độ phân tử, chitin và chitosan có cấu trúc gần giống nhau, cả hai đều có phản ứng hydroxyl và có nhóm amino nhưng chitosan dễ tham gia các phản ứng hơn có thể là do cấu trúc tinh thể của nó ít hơn. Trong khi chitin chỉ hòa tan trong một vài dung môi đặc biệt còn chitosan có khả năng hòa tan trong nhiều loại dung dịch acid, chẳng hạn acid formic, acid acetic,. Chitin Nhóm N-acetyl Chitosan Nhóm amin Hình 1. Công thức cấu tạo của chitin và chitosan [81] Độ deacetyl của chitin và chitosan là một thông số quan trọng ảnh hưởng đến tính chất của chúng.

Chitin có độ deacetyl thấp, chitosan có độ deacetyl cao, có nghĩa là chitosan chứa nhiều nhóm amin hơn chitin [26]. Phân tử lượng của chitosan là một thông số cấu trúc quan trọng, quyết định tính chất của chitosan như khả năng kết dính, tạo màng, tạo gel, khả năng hấp phụ chất màu, đặc biệt là khả năng ức chế vi sinh vật. Phân tử lượng của chitosan nằm trong khoảng 4 từ 100. Chitosan có phân tử lượng càng lớn thì có độ nhớt càng cao và phân tử lượng của chitosan phụ thuộc vào nguồn chitin cũng như điều kiện deacetyl chitin.

Chitosan có phân tử lượng thấp, có chứa nhiều nhóm amin tự do sẽ có hoạt tính sinh học cao hơn, khả năng kháng khuẩn tốt hơn và có nhiều ứng dụng trong nông nghiệp, y học, công nghệ sinh học. Độ nhớt của chitosan phụ thuộc vào phân tử lượng của nó, chẳng hạn chitosan có phân tử lượng thấp có độ nhớt từ 30-200 cPs và chitosan có phân tử lượng lớn hơn 1 triệu dalton có độ nhớt lên đến 3. Ngoài ra, độ nhớt của chitosan còn phụ thuộc vào độ deacetyl, lực ion, pH, nhiệt độ [26]. Chitosan tan tốt trong các acid hữu cơ như acid formic, acid acetic, acid propionic, acid citric, acid lactic và không tan trong nước, kiềm, cồn.

Khi hoà tan chitosan trong môi trường acid loãng tạo thành keo dương - đây là một đặc điểm rất đặc biệt của chiotsan do đa số các keo polysaccharide tự nhiên tích điện âm. Chitosan tích điện dương sẽ có khả năng kết dính bề mặt với các ion tích điện âm và có khả năng tạo phức với các ion kim loại, tương tác tốt với các polyme tích điện âm [26]. Chitosan có một số tính chất như khả năng hút nước, khả năng hấp phụ chất màu, kim loại, kết dính với chất béo, kháng khuẩn, kháng nấm, mang ADN … khả năng này phụ thuộc vào độ deacetyl hóa. Chitosan có độ deacetyl cao thì có khả năng hấp phụ chất màu, tạo phức với kim loại, khả năng kháng khuẩn, kháng nấm cao hơn.

Cụ thể, chitosan có độ deacetyl trên 85% có khả năng kháng khuẩn tốt hơn các loại chitosan có độ deacetyl thấp hơn 80% [26].