Nghiên cứu Phân lập Phytophthora Gây Bệnh Nứt Thân Xì Mủ Trên Sầu Riêng

Khóa luận nghiên cứu phân lập nấm phytophthora gây bệnh nứt thân xì mủ trên sầu riêng và đánh giá hiệu lực phòng trừ của vật liệu nano.

• Tác giả: Duong Minh Khoi
• Người hướng dẫn: TS. Võ Thị Ngọc Hà
• Trường học: Trường Đại Học Nông Lâm
• Chuyên ngành: Bảo Vệ Thực Vật
• Đề tài: Nghiên Cứu Phân Lập Phytophthora Gây Bệnh Nứt Thân Xì Mủ Trên Sầu Riêng Và Hiệu Lực Vật Liệu Nano
• Loại tài liệu: Khóa Luận Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CÁM ƠN
• TÓM TẮT
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về cây sầu riêng
• 1.2. Tình hình sản xuất sầu riêng
• 1.3. Bệnh nứt thân xì mủ trên sầu riêng
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 2.2. Xử lý số liệu
• 2.3. Vật liệu và dụng cụ thí nghiệm
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Phân lập và định danh nấm gây bệnh nứt thân xì mủ trên cây sầu riêng
• 3.2. Kết quả phân lập nấm gây bệnh
• 3.3. Kết quả lây bệnh nhân tạo theo quy tắc Koch
• 3.4. Ảnh hưởng của nano CuNPs-cts 1%, CuNPs-cts 0,4%, CuSiO2-cts 1%, CuSiO2-cts 0,4%, Ag/Cu/SiO2 đến sự phát triển của nấm Phytophthora sp. trên môi trường
• 3.5. Hiệu lực phòng trừ của vật liệu nano CuNPs-cts 1%, CuNPs-cts 0,4%, CuSiO2-cts 1%, CuSiO2-cts 0,4%, Ag/Cu/SiO2 với nấm Phytophthora sp. trên môi trường PDA
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về Nghiên cứu Phân lập Phytophthora Gây Bệnh Nứt Thân Xì Mủ

Nghiên cứu về Phytophthora gây bệnh nứt thân xì mủ trên cây sầu riêng là một vấn đề cấp thiết trong nông nghiệp hiện nay. Bệnh này không chỉ ảnh hưởng đến năng suất mà còn gây thiệt hại lớn về kinh tế cho người trồng. Việc phân lập và xác định tác nhân gây bệnh là bước đầu tiên trong việc tìm kiếm giải pháp phòng ngừa hiệu quả. Nghiên cứu này sẽ cung cấp cái nhìn tổng quan về tình hình bệnh, tác nhân gây bệnh và các biện pháp phòng trừ hiện có.

1.1. Tình hình bệnh nứt thân xì mủ trên sầu riêng

Bệnh nứt thân xì mủ trên cây sầu riêng do Phytophthora gây ra đã trở thành một trong những vấn đề nghiêm trọng nhất trong sản xuất nông nghiệp. Bệnh này thường xuất hiện trong mùa mưa, khi độ ẩm cao tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của nấm. Các triệu chứng bao gồm chảy nhựa, nứt vỏ và thối rễ, dẫn đến thiệt hại lớn cho cây trồng.

1.2. Tác động của bệnh đến sản xuất sầu riêng

Bệnh nứt thân xì mủ không chỉ làm giảm năng suất mà còn ảnh hưởng đến chất lượng trái sầu riêng. Theo thống kê, thiệt hại do bệnh này gây ra có thể lên đến 20-25% sản lượng, tương đương với hàng triệu USD mỗi năm. Việc hiểu rõ tác động của bệnh sẽ giúp các nhà nghiên cứu và nông dân có biện pháp phòng ngừa hiệu quả hơn.

II. Vấn đề và Thách thức trong Nghiên cứu Phytophthora

Nghiên cứu về Phytophthora gặp nhiều thách thức, từ việc phân lập nấm đến việc đánh giá hiệu lực của các biện pháp phòng trừ. Một trong những khó khăn lớn nhất là sự đa dạng của các chủng nấm và khả năng kháng thuốc của chúng. Điều này đòi hỏi các nhà nghiên cứu phải tìm ra các phương pháp mới và hiệu quả hơn để kiểm soát bệnh.

2.1. Khó khăn trong việc phân lập nấm gây bệnh

Phân lập nấm Phytophthora từ mẫu bệnh là một quá trình phức tạp. Các yếu tố như điều kiện môi trường, phương pháp thu thập mẫu và kỹ thuật nuôi cấy đều ảnh hưởng đến kết quả. Việc sử dụng các phương pháp hiện đại như sinh học phân tử có thể giúp cải thiện độ chính xác trong việc xác định tác nhân gây bệnh.

2.2. Tình trạng kháng thuốc của nấm

Nấm Phytophthora có khả năng phát triển kháng thuốc cao, điều này làm cho việc điều trị bệnh trở nên khó khăn hơn. Các nghiên cứu cho thấy rằng việc lạm dụng thuốc hóa học không chỉ làm tăng tình trạng kháng thuốc mà còn gây hại cho môi trường. Do đó, cần tìm kiếm các biện pháp thay thế an toàn và hiệu quả hơn.

III. Phương pháp Nghiên cứu Phân lập Phytophthora

Để phân lập Phytophthora gây bệnh nứt thân xì mủ, nghiên cứu đã áp dụng các phương pháp thí nghiệm đơn yếu tố trong điều kiện phòng thí nghiệm. Các nồng độ khác nhau của vật liệu nano cũng được thử nghiệm để đánh giá hiệu lực phòng trừ. Phương pháp này giúp xác định được nồng độ tối ưu và hiệu quả nhất trong việc kiểm soát bệnh.

3.1. Thiết kế thí nghiệm phân lập nấm

Thí nghiệm được thiết kế theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với nhiều nghiệm thức khác nhau. Mỗi nồng độ của vật liệu nano được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác của kết quả. Phương pháp này giúp xác định rõ ràng tác động của từng yếu tố đến sự phát triển của nấm.

3.2. Đánh giá hiệu lực của vật liệu nano

Các vật liệu nano như CuNPs-cts và AgCuSiO2 được thử nghiệm để đánh giá khả năng ức chế nấm Phytophthora. Kết quả cho thấy một số nồng độ có khả năng ức chế hoàn toàn sự phát triển của nấm, mở ra hướng đi mới trong việc phòng trừ bệnh hiệu quả.

IV. Kết quả Nghiên cứu và Ứng dụng Thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng các vật liệu nano có hiệu lực cao trong việc ức chế nấm Phytophthora gây bệnh nứt thân xì mủ. Các nồng độ như 1% nano CuNPs-cts và 1% CuSiO2-cts đã cho kết quả ức chế lên đến 100%. Điều này chứng tỏ rằng công nghệ nano có thể là một giải pháp tiềm năng trong việc phòng ngừa bệnh cho cây sầu riêng.

4.1. Hiệu quả của vật liệu nano trong phòng trừ bệnh

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng các vật liệu nano không chỉ có khả năng ức chế nấm mà còn an toàn cho môi trường. Việc áp dụng công nghệ nano trong nông nghiệp có thể giúp giảm thiểu việc sử dụng thuốc hóa học, từ đó bảo vệ sức khỏe con người và môi trường.

4.2. Ứng dụng thực tiễn trong sản xuất sầu riêng

Kết quả nghiên cứu có thể được áp dụng trực tiếp vào sản xuất sầu riêng. Việc sử dụng các vật liệu nano trong phòng trừ bệnh sẽ giúp nâng cao năng suất và chất lượng trái, đồng thời giảm thiểu thiệt hại do bệnh gây ra.

V. Kết luận và Hướng phát triển tương lai

Nghiên cứu về Phytophthora gây bệnh nứt thân xì mủ trên cây sầu riêng đã mở ra nhiều hướng đi mới trong việc phòng trừ bệnh. Công nghệ nano cho thấy tiềm năng lớn trong việc kiểm soát bệnh một cách hiệu quả và an toàn. Tuy nhiên, cần tiếp tục nghiên cứu để hoàn thiện các phương pháp và ứng dụng trong thực tiễn.

5.1. Tóm tắt kết quả nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu đã xác định được tác nhân gây bệnh và hiệu lực của các vật liệu nano trong việc phòng trừ nấm Phytophthora. Điều này không chỉ giúp nâng cao hiểu biết về bệnh mà còn cung cấp giải pháp thực tiễn cho nông dân.

5.2. Định hướng nghiên cứu trong tương lai

Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về các chủng nấm Phytophthora và khả năng kháng thuốc của chúng. Đồng thời, việc phát triển các sản phẩm nano mới và an toàn hơn sẽ là hướng đi quan trọng trong việc bảo vệ cây trồng và môi trường.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Sầu riêng (Durio zibethinus) là loại cây ăn trái nhiệt đới có nguồn gốc từ vùng Đông Nam Á, mang lại giá trị kinh tế cao và được mệnh danh là "vua của các loại trái cây". Tại Việt Nam, diện tích canh tác sầu riêng tăng trưởng liên tục trong những năm gần đây, mở rộng từ các tỉnh phía Nam, Đồng bằng sông Cửu Long (Tiền Giang, Bến Tre, Vĩnh Long) đến Đông Nam Bộ (Bình Phước, Đồng Nai, Bình Dương) và Tây Nguyên. Theo số liệu thống kê của Cục Trồng trọt và Tổng cục Thống kê (2021), tổng diện tích trồng sầu riêng trên toàn quốc đạt khoảng 70.000 ha với sản lượng đạt 559.000 tấn vào năm 2020.

Song song với quá trình gia tăng quy mô và mật độ thâm canh, áp lực dịch hại trên cây sầu riêng diễn biến ngày càng phức tạp. Trong số các đối tượng gây hại, bệnh nứt thân xì mủ do nấm Phytophthora là một trong những dịch hại nghiêm trọng nhất. Bệnh thường bùng phát mạnh vào mùa mưa khi độ ẩm không khí đạt từ 80% đến 95%, nấm lây lan qua đất, nguồn nước tưới và các vết thương cơ giới. Nấm tấn công vào vỏ thân, mạch dẫn làm chảy nhựa màu nâu sẫm, thối rễ, cháy lá và chết cây. Bệnh gây thiệt hại năng suất và tỷ lệ chết cây phổ biến từ 15% đến 20%, có những vườn thiệt hại trên 70%; ước tính thiệt hại kinh tế do nấm Phytophthora gây ra trên sầu riêng tại Việt Nam lên tới khoảng 20% - 25%, tương đương 74,25 triệu USD.

Trước thực trạng lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học dẫn đến ô nhiễm môi trường, hiện tượng kháng thuốc và nguy cơ tồn dư hóa chất độc hại, việc nghiên cứu các giải pháp sinh học và vật liệu thế hệ mới là yêu cầu cấp thiết. Công nghệ nano ứng dụng các hạt nano kim loại và hợp chất vô cơ (nano đồng, nano bạc, nano silica liên hợp chitosan) có hoạt tính kháng vi sinh vật mạnh, cơ chế tác động đa điểm và thân thiện với hệ sinh thái. Do đó, đề tài khóa luận tốt nghiệp kỹ sư ngành Bảo vệ Thực vật của tác giả Dương Minh Khởi được thực hiện nhằm phân lập chính xác nguồn bệnh và kiểm chứng hiệu lực ức chế nấm của các vật liệu nano trong điều kiện phòng thí nghiệm.

Mục tiêu và yêu cầu nghiên cứu của đề tài bao gồm:

1. Phân lập nấm Phytophthora gây bệnh nứt thân xì mủ từ các mô bệnh trên cây sầu riêng.
2. Định danh chủng nấm gây bệnh nứt thân xì mủ dựa trên các đặc điểm hình thái học.
3. Đánh giá khả năng ức chế và hiệu lực phòng trừ của 5 loại vật liệu nano (CuNPs-cts 1%, CuNPs-cts 0,4%, CuSiO2-cts 1%, CuSiO2-cts 0,4%, AgCuSiO2) ở các dải nồng độ khác nhau đối với nấm Phytophthora sp. trong điều kiện phòng thí nghiệm (in vitro).

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Mẫu bệnh nứt thân xì mủ thu thập trên cây sầu riêng; chủng nấm Phytophthora sp. phân lập được; 5 dạng vật liệu nano được cung cấp bởi Green Lab (Trường Đại học Khoa học Tự nhiên).
• Phạm vi không gian: Mẫu bệnh được thu thập tại xã Cẩm Sơn, huyện Cai Lậy, tỉnh Tiền Giang; các thí nghiệm phân lập, lây bệnh nhân tạo và thử nghiệm in vitro được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Bệnh cây, Bộ môn Bảo vệ Thực vật, Khoa Nông học, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.
• Phạm vi thời gian: Đề tài được thực hiện từ tháng 05/2022 đến tháng 11/2022.
• Giới hạn nghiên cứu: Đề tài tiến hành định danh chủng nấm qua quan sát đặc điểm hình thái và cấu trúc sinh học, không thực hiện định danh bằng phương pháp sinh học phân tử; các khảo nghiệm hiệu lực nano chỉ thực hiện trên môi trường nhân tạo in vitro.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Cơ sở lý thuyết của nghiên cứu dựa trên các công trình nghiên cứu về phân loại học, bệnh cây học và vật liệu nano trong bảo vệ thực vật:

• Tổng quan về nấm chi Phytophthora và loài Phytophthora palmivora: Dựa trên tài liệu chuyên khảo của Erwin và Ribeiro (1996), Drenth và Sendall (2001), Wilson (1914), nấm P. palmivora thuộc nhóm nấm thủy sinh, có sợi nấm không vách ngăn, hình thành bọc bào tử (sporangium) hình quả chanh có núm đỉnh rõ ràng, có khả năng phóng thích du động bào tử 2 roi (zoospores) bơi trong nước để xâm nhiễm. Khi điều kiện bất lợi, nấm hình thành bào tử ngủ/hậu bào tử (chlamydospores) vách dày hoặc bào tử noãn hữu tính (oospores) để tồn tại trong đất.
• Cơ chế kháng vi sinh vật của vật liệu nano:
  • Nano bạc (AgNPs): Phá hủy màng tế bào, tạo các gốc oxy hóa hoạt tính (ROS), liên kết với nhóm thiol (-SH) và vô hiệu hóa cầu nối disunfit (S-S) của các enzyme chuyển hóa trong tế bào nấm.
  • Nano đồng (CuNPs): Giải phóng liên tục ion Cu+ và Cu2+, thâm nhập màng tế bào, tạo liên kết chéo làm biến tính chuỗi xoắn kép DNA, làm bất hoạt các protein và enzyme thiết yếu.
  • Nano silica (SiO2): Tăng cường hoạt hóa enzyme tự vệ của thực vật (chitinase, peroxidase), khi kết hợp với đồng/bạc tạo phức hợp có hoạt tính diệt nấm bền vững và kéo dài.
  • Chitosan (cts): Đóng vai trò chất bao bọc, ổn định hạt nano và hỗ trợ hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm tự nhiên.

Phương pháp nghiên cứu thực tế được triển khai đồng bộ qua các bước kỹ thuật:

• Phương pháp thu thập và bảo quản mẫu: Thực hiện theo quy trình của Roger và cộng sự (2005) tại 4 vườn sầu riêng thuộc xã Cẩm Sơn, huyện Cai Lậy, tỉnh Tiền Giang. Tổng cộng thu 12 mẫu bệnh từ 12 cây có biểu hiện nứt thân xì mủ điển hình (3 cây/vườn).
• Phương pháp phân lập và nuôi cấy thuần khiết: Áp dụng phương pháp của Burgess và cộng sự (2009). Cắt đoạn mô bệnh dài 2 cm tại ranh giới giữa vùng bệnh và mô khỏe, khử trùng bề mặt bằng cồn ethanol 70% trong 1 phút, rửa lại 4 lần bằng nước cất vô trùng, thấm khô và đặt lên môi trường thạch nước WA (Water Agar: 20 g agar/1000 ml nước cất). Sau khi sợi nấm phát triển ở 25°C - 28°C, cấy chuyển đỉnh sợi sang môi trường thạch khoai tây dextrose PDA (Potato Dextrose Agar: 20 g khoai tây, 20 g agar/1000 ml nước cất) để làm thuần.
• Phương pháp giám định hình thái: Kích thích tạo bọc bào tử bằng cách cấy miếng thạch nấm vào đĩa Petri chứa nước vô trùng, để dưới ánh sáng trong 2 ngày (theo Burgess và cộng sự, 2009). Quan sát khuẩn lạc, sợi nấm và các dạng bào tử dưới kính hiển vi quang học Olympus CX31 kết hợp tài liệu định danh của Klich (2002) và Erwin & Ribeiro (1996).
• Phương pháp chứng minh nguyên nhân gây bệnh (Quy tắc Koch): Sử dụng cây sầu riêng 1 năm tuổi khỏe mạnh, tạo vết thương cơ giới hở trên thân, gắn miếng thạch nấm đã phân lập, bịt kín và theo dõi triệu chứng sau 8 ngày, so sánh với đối chứng chỉ nhỏ nước cất vô trùng (Burgess và cộng sự, 2009).
• Phương pháp bố trí thí nghiệm thử nghiệm hiệu lực nano in vitro:
  • Bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) đơn yếu tố.
  • 5 thí nghiệm tương ứng với 5 loại vật liệu: CuNPs-cts 1%, CuNPs-cts 0,4%, CuSiO2-cts 1%, CuSiO2-cts 0,4%, AgCuSiO2.
  • Mỗi thí nghiệm gồm 6 nghiệm thức: 5 mức nồng độ (16, 32, 64, 125, 250 ppm) và 1 nghiệm thức đối chứng không bổ sung nano (0 ppm).
  • Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần gồm 3 đĩa Petri.
  • Cấy khoanh thạch nấm có đường kính 0,5 cm vào chính giữa đĩa PDA đã trộn nồng độ nano tương ứng ở 45°C - 50°C. Đo đường kính tản nấm trung bình $d = (d_1 + d_2) / 2$ mỗi 24 giờ cho đến khi đối chứng phát triển kín đĩa (8 ngày sau cấy - NSC).
• Công thức tính hiệu lực phòng trừ ($H$): $$H (%) = \frac{D - d}{D} \times 100$$ (Trong đó: $D$ là đường kính tản nấm ở nghiệm thức đối chứng tính bằng mm; $d$ là đường kính tản nấm ở nghiệm thức có bổ sung vật liệu nano tính bằng mm).
• Xử lý số liệu thống kê: Tính toán số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel 2010; phân tích phương sai ANOVA và trắc nghiệm phân hạng bằng phần mềm SAS 9.1 ở mức ý nghĩa $p < 0,01$ (**).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng hợp toàn diện các tư liệu khoa học liên quan đến đối tượng cây trồng, loại dịch hại và các vật liệu nghiên cứu:

• Tình hình phân bố và sản xuất sầu riêng: Cây có nguồn gốc từ đảo Borneo, nhiệt độ sinh trưởng tối ưu từ 27°C - 30°C, độ ẩm 75% - 80%. Thái Lan và Indonesia chiếm khoảng 70% tổng sản lượng sầu riêng toàn cầu (năm 2017). Tại Việt Nam, Tây Nguyên có diện tích lớn nhất (27.838,9 ha), trong khi Đồng bằng sông Cửu Long đạt năng suất bình quân cao nhất (21,1 tấn/ha vào năm 2020).
• Triệu chứng và thiệt hại do Phytophthora: Tổng kết thiệt hại kinh tế do nấm Phytophthora gây ra tại các nước Đông Nam Á (Bảng 1.1), thống kê các đợt bùng phát dịch tại Đồng Tháp, Đồng Nai, Tiền Giang, Quảng Nam (vụ dịch năm 2001 tại xã Quế Trung làm chết 138/3.075 cây, thiệt hại khoảng 15 tỷ đồng).
• Các biện pháp quản lý bệnh: Hệ thống hóa các phương pháp canh tác (thoát nước, bón vôi duy trì pH 5,8 - 6,5, bón phân hữu cơ hoai mục, quét dung dịch Bordeaux), biện pháp sinh học (Trichoderma), và biện pháp hóa học (phun tán, bôi gốc, tiêm thân bằng phosphonate/potassium phosphite 20%, metalaxyl, fosetyl-aluminium).
• Đặc điểm sinh học của nấm Phytophthora palmivora: Kích thước sợi nấm 2 - 6 µm, cành bào tử phân sinh dài 120 - 150 µm, túi bào tử hình chanh có kích thước 29 - 43 x 20 - 28 µm, nhiệt độ sinh trưởng 16°C - 32°C (ngừng phát triển dưới 10°C hoặc trên 35°C).
• Tổng quan về công nghệ nano: Khái niệm theo NNI (kích thước 1 - 100 nm), cơ chế diệt nấm của nano bạc, nano đồng, nano oxit kẽm (ZnO), nano silica tổng hợp từ vỏ trấu và các phức hợp đồng - silica - glycine/glutamate trong bảo vệ cây trồng.

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 trình bày chi tiết quy trình thực nghiệm, trang thiết bị và bố cục thí nghiệm:

• Địa điểm và vật liệu: Tiến hành tại Phòng thí nghiệm Bệnh cây, Khoa Nông học, Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM từ tháng 5/2022 đến tháng 11/2022. Mẫu bệnh lấy từ huyện Cai Lậy, Tiền Giang. Vật liệu nano do Green Lab cung cấp.
• Trang thiết bị phòng thí nghiệm: Tủ cấy vô trùng, tủ sấy khử trùng (180°C), nồi hấp vô trùng hơi nước nóng (121°C, 1 atm, 20 phút), lò vi ba, cân điện tử, kính hiển vi quang học Olympus CX31.
• Quy trình phân lập, nuôi cấy, làm thuần trên môi trường WA và PDA; quy trình lây bệnh nhân tạo Koch trên cây sầu riêng 1 năm tuổi; quy trình kích thích sinh sản tạo bào tử nang trong môi trường nước vô trùng.
• Bố trí 5 thí nghiệm tương ứng 5 loại nano: Thí nghiệm 1 (nano CuNPs-cts 1%), Thí nghiệm 2 (nano CuNPs-cts 0,4%), Thí nghiệm 3 (nano CuSiO2-cts 1%), Thí nghiệm 4 (nano CuSiO2-cts 0,4%), Thí nghiệm 5 (nano AgCuSiO2). Mỗi thí nghiệm bố trí CRD với 6 nghiệm thức (0, 16, 32, 64, 125, 250 ppm), 3 lần lặp lại, 3 đĩa Petri/lần lặp lại.
• Chỉ tiêu theo dõi: Đo đường kính tản nấm trung bình theo hai đường chéo vuông góc qua tâm ($d_1$, $d_2$) mỗi 24 giờ đến 8 NSC; tính toán hiệu lực phòng trừ $H$ (%); phân tích phương sai ANOVA bằng SAS 9.1.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm thu được từ phân lập, định danh đến hiệu lực ức chế nấm của 5 loại vật liệu nano:

• Kết quả phân lập và định danh: Từ 12 mẫu bệnh ban đầu, phân lập và làm thuần thành công 8 mẫu nấm thuộc chi Phytophthora sp. Khuẩn lạc nấm trên môi trường PDA phát triển dạng hình hoa nhiều vòng, màu trắng ngà, tơ nấm mọc bám sát mặt thạch. Sợi nấm không màu, không có vách ngăn, phân nhánh và kích thước không đồng đều. Bào tử nang có hình quả chanh đặc trưng với núm đỉnh rõ ràng, bên trong hình thành trực tiếp các du động bào tử; bào tử ngủ hình cầu, vách dày; bào tử noãn hình cầu có túi đực nhụy kép vách dày.
• Kết quả kiểm chứng lây bệnh nhân tạo theo quy tắc Koch: Ở thời điểm 8 ngày sau khi gắn nấm lên vết thương thân cây sầu riêng 1 năm tuổi, mô thân xuất hiện vết nứt sẫm màu, chảy mủ nâu ướt tương tự mẫu bệnh ngoài thực tế; trong khi vết thương đối chứng nhỏ nước cất vô trùng lành sẹo và khô ráo hoàn toàn.
• Ảnh hưởng của các loại nano đến sự phát triển đường kính tản nấm Phytophthora sp. trên môi trường PDA (theo dõi tại 2, 4, 6 và 8 NSC):
  • Đối chứng (không xử lý nano): Tản nấm phát triển liên tục từ 26,8 - 28,5 mm (2 NSC) lên 40,9 - 46,0 mm (4 NSC), 60,0 - 60,3 mm (6 NSC) và chạm thành đĩa 80,0 mm ở 8 NSC.
  • Xử lý nano: Tất cả 5 loại nano ở các nồng độ đều làm giảm rõ rệt tốc độ lan rộng của tản nấm, nồng độ càng cao thì đường kính nấm càng thu hẹp, sai khác có ý nghĩa thống kê ở mức $p < 0,01$.
  • Tại nồng độ 16 ppm ở thời điểm 8 NSC: Đường kính tản nấm ở các nghiệm thức CuNPs-cts 1%, CuSiO2-cts 1%, CuNPs-cts 0,4%, CuSiO2-cts 0,4%, AgCuSiO2 lần lượt đạt 10,2 mm; 15,4 mm; 20,9 mm; 26,2 mm và 29,4 mm (so với đối chứng 80,0 mm).
  • Khả năng ức chế hoàn toàn (đường kính nấm = 0,0 mm suốt 8 ngày theo dõi): CuNPs-cts 1%, CuSiO2-cts 1% và AgCuSiO2 ức chế hoàn toàn tản nấm từ nồng độ 32 ppm; trong khi CuNPs-cts 0,4% và CuSiO2-cts 0,4% ức chế hoàn toàn từ nồng độ 64 ppm trở lên.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã thu thập và xử lý thực nghiệm chính xác các chỉ tiêu về đường kính tản nấm và hiệu lực phòng trừ (%) của 5 loại vật liệu nano đối với nấm Phytophthora sp. gây bệnh nứt thân xì mủ trên sầu riêng.

Bảng tổng hợp hiệu lực phòng trừ (%) của các vật liệu nano tại các thời điểm theo dõi (2, 4, 6, 8 ngày sau cấy):

Loại vật liệu nano	Nồng độ (ppm)	2 NSC (%)	4 NSC (%)	6 NSC (%)	8 NSC (%)
Nano CuNPs-cts 1%	16	75,9	82,5	86,3	87,3
	32	100,0	100,0	100,0	100,0
	64	100,0	100,0	100,0	100,0
	125	100,0	100,0	100,0	100,0
	250	100,0	100,0	100,0	100,0
Nano CuNPs-cts 0,4%	16	73,0	76,1	74,3	73,9
	32	79,9	86,3	88,7	90,6
	64	100,0	100,0	100,0	100,0
	125	100,0	100,0	100,0	100,0
	250	100,0	100,0	100,0	100,0
Nano CuSiO2-cts 1%	16	73,0	78,6	80,6	80,8
	32	100,0	100,0	100,0	100,0
	64	100,0	100,0	100,0	100,0
	125	100,0	100,0	100,0	100,0
	250	100,0	100,0	100,0	100,0
Nano CuSiO2-cts 0,4%	16	70,1	71,2	68,7	67,3
	32	79,9	85,3	86,4	86,9
	64	100,0	100,0	100,0	100,0
	125	100,0	100,0	100,0	100,0
	250	100,0	100,0	100,0	100,0
Nano AgCuSiO2	16	71,7	69,1	64,7	63,6
	32	100,0	100,0	100,0	100,0
	64	100,0	100,0	100,0	100,0
	125	100,0	100,0	100,0	100,0
	250	100,0	100,0	100,0	100,0

Đóng góp và đề xuất của tác giả:

• Về mặt khoa học: Khóa luận chứng minh được hoạt tính kháng nấm Phytophthora sp. mạnh mẽ của các dạng vật liệu nano phức hợp (kết hợp kim loại Cu, Ag cùng SiO2 và màng polymer sinh học chitosan). Trong đó, vật liệu nano CuNPs-cts 1% thể hiện hoạt lực cao nhất ngay từ nồng độ thấp (16 ppm đạt 87,3% và đạt 100% từ 32 ppm trở lên).
• Về mặt thực tiễn: Cung cấp cơ sở định lượng về nồng độ ức chế tối thiểu in vitro, tạo tiền đề cho việc xây dựng các công thức thuốc bảo vệ thực vật thế hệ mới nhằm thay thế thuốc hóa học độc hại trong phòng trừ bệnh nứt thân xì mủ sầu riêng.
• Kiến nghị của tác giả: Tiếp tục tiến hành thử nghiệm đánh giá hiệu lực phòng trừ của 5 loại vật liệu nano ở các nồng độ đạt hiệu lực 100% trong điều kiện nhà màng và trên các vườn sầu riêng ngoài đồng ruộng.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của đề tài:

• Việc định danh chủng nấm gây bệnh mới chỉ dừng lại ở phương pháp giám định hình thái vi học và quan sát cấu trúc bào tử dưới kính hiển vi quang học, chưa thực hiện định danh ở cấp độ sinh học phân tử (giải trình tự vùng gen ITS/gen chỉ thị phân tử).
• Các thử nghiệm hiệu lực phòng trừ của vật liệu nano chỉ mới thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm (in vitro) trên môi trường thạch nhân tạo PDA, chưa đánh giá phản ứng của mô cây thực tế và các tác động ngoại cảnh ngoài tự nhiên.

Hướng nghiên cứu tiếp theo:

• Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử (PCR, sequencing) để xác định chính xác tên loài của chủng nấm Phytophthora phân lập được.
• Đánh giá hiệu lực ức chế nấm và độc tính đối với cây trồng của các công thức nano (ở nồng độ 32 ppm và 64 ppm) trong điều kiện nhà lưới/nhà màng và ngoài vườn sản xuất sầu riêng.
• Nghiên cứu cơ chế biến đổi tế bào sợi nấm và bào tử dưới tác động của nano bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM/TEM).

Giá trị tham khảo

Khóa luận tốt nghiệp là tài liệu tham khảo có giá trị học thuật và thực tiễn cho các nhóm đối tượng:

• Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Bảo vệ Thực vật, Nông học, Công nghệ Sinh học và Bệnh cây học: Có thể tham khảo chi tiết quy trình phân lập nấm Phytophthora, kỹ thuật làm thuần trên môi trường WA/PDA, kỹ thuật lây bệnh nhân tạo theo quy tắc Koch và phương pháp bố trí thí nghiệm CRD đánh giá hoạt tính kháng nấm của vật liệu nano.
• Các nhà nghiên cứu và kỹ thuật viên phát triển sản phẩm thuốc bảo vệ thực vật sinh học/nano: Có được dữ liệu thực nghiệm chuẩn xác về ngưỡng nồng độ ức chế (16 - 250 ppm) của các hệ hạt nano CuNPs-chitosan, Cu-SiO2-chitosan và Ag-Cu-SiO2 đối với tác nhân Phytophthora.
• Cán bộ kỹ thuật nông nghiệp và người trồng sầu riêng: Tham khảo thông tin tổng quan về triệu chứng, chu kỳ phát triển bệnh nứt thân xì mủ và các giải pháp quản lý tích hợp trên cây sầu riêng.

Câu hỏi thường gặp

1. Tác nhân nấm gây bệnh nứt thân xì mủ được phân lập trong nghiên cứu có đặc điểm hình thái nhận dạng như thế nào?
Khuẩn lạc nấm trên môi trường PDA phát triển dạng hình hoa nhiều vòng, màu trắng, tơ nấm bám sát mặt thạch. Sợi nấm không màu, không có vách ngăn, phân nhánh không đồng đều. Bào tử nang có hình quả chanh đặc trưng với núm đỉnh rõ ràng, nảy mầm giải phóng trực tiếp các du động bào tử có 2 roi; bào tử ngủ hình cầu vách dày; bào tử noãn hình cầu có túi đực nhụy kép vách dày.

2. Tỷ lệ phân lập thành công nấm Phytophthora sp. từ các mẫu bệnh thu thập tại Tiền Giang là bao nhiêu?
Từ 12 mẫu mô bệnh thu thập tại 4 vườn sầu riêng ở xã Cẩm Sơn, huyện Cai Lậy, tỉnh Tiền Giang, tác giả đã phân lập và làm thuần thành công 8 mẫu nấm được xác định là Phytophthora sp., đạt tỷ lệ 66,7%.

3. Ngưỡng nồng độ ức chế hoàn toàn (100%) của từng loại vật liệu nano đối với nấm Phytophthora sp. trong thí nghiệm là bao nhiêu?

• Các vật liệu CuNPs-cts 1%, CuSiO2-cts 1% và AgCuSiO2 đạt hiệu lực ức chế tản nấm 100% (đường kính nấm 0,0 mm) bắt đầu từ nồng độ 32 ppm trở lên (ở các mức 32, 64, 125 và 250 ppm).
• Các vật liệu CuNPs-cts 0,4% và CuSiO2-cts 0,4% đạt hiệu lực ức chế 100% bắt đầu từ nồng độ 64 ppm trở lên (ở các mức 64, 125 và 250 ppm).

4. Vật liệu nano nào cho hiệu lực phòng trừ nấm cao nhất ở nồng độ thấp (16 ppm) tại thời điểm 8 ngày sau cấy?
Ở nồng độ thấp 16 ppm tại thời điểm 8 ngày sau cấy, vật liệu nano CuNPs-cts 1% đạt hiệu lực phòng trừ cao nhất với 87,3% (đường kính tản nấm chỉ 10,2 mm so với đối chứng 80,0 mm), tiếp theo là CuSiO2-cts 1% (80,8%), CuNPs-cts 0,4% (73,9%), CuSiO2-cts 0,4% (67,3%) và AgCuSiO2 (63,6%).

5. Kết quả lây bệnh nhân tạo theo quy tắc Koch trên cây sầu riêng 1 năm tuổi diễn ra như thế nào?
Sau 8 ngày cấy thạch nấm lên vết thương thân cây, cây sầu riêng xuất hiện triệu chứng nứt thân, vết bệnh thâm ướt và chảy mủ màu nâu giống hệt triệu chứng thu thập ngoài tự nhiên; trong khi cây đối chứng nhỏ nước cất vô trùng thì vết thương lành sẹo và khô ráo hoàn toàn.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Dương Minh Khởi đã phân lập và định danh thành công chủng nấm Phytophthora sp. gây bệnh nứt thân xì mủ trên sầu riêng tại tỉnh Tiền Giang thông qua đặc điểm hình thái và quy tắc lây bệnh Koch. Cả 5 loại vật liệu nano thử nghiệm (CuNPs-cts 1%, CuNPs-cts 0,4%, CuSiO2-cts 1%, CuSiO2-cts 0,4%, AgCuSiO2) đều thể hiện khả năng ức chế mạnh sự sinh trưởng tản nấm in vitro, trong đó CuNPs-cts 1%, CuSiO2-cts 1% và AgCuSiO2 ức chế hoàn toàn 100% sự phát triển của nấm từ nồng độ 32 ppm. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học và dữ liệu định lượng quan trọng cho việc định hướng ứng dụng công nghệ nano trong phòng trừ dịch hại cây trồng theo hướng an toàn, bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TỎNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về cây sầu riêng 1.1 Nguồn gốc và phân bố Cây sầu riêng là một loại cây ăn trái nhiệt đới có nguồn gốc từ bán đảo Borneo, giữa ba nước Brunei, Malaysia và Indonesia. Loại cây nhiệt đới nay phát triển tốt nhất trong khoảng nhiệt độ từ 27 - 30°C, với độ am từ 75 - 80%. Sầu riêng được trồng thương mại phổ biến trong phạm vi 12 Vi độ Bắc đến 12 Vĩ độ Nam (Subhadrabandhu và Ketsa, 2001). Có tên khoa là Durio zibethinus, thuộc chi Durio là loài quan trong nhất, có giá trị kinh tế cao và được trồng rộng rãi ở các nước Đông Nam A và các nước khác.

Một số loài khác như Durio oxleyanus, D. testudinarum cũng cho quả ăn được nhưng cơm mỏng, phẩm chất kém nên không được trồng phô biến. Là loại cây có xuất xứ từ vùng đất nhiệt đới Đông Nam Á, sầu riêng còn được trồng nhiều ở Philippin, Myanmar, Thái Lan, Lào, Việt Nam, Campuchia. Ngoài ra còn được trồng ở các nước nhiệt đới Trung Nam Mỹ, một số nước Châu Phi, Châu Đại Dương như Australia.

Theo Lê Thanh Phong và ctv (1994), sầu riêng có rất nhiều giống, được du nhập vào Việt Nam cách đây khoảng hơn 100 năm từ Thái Lan và được trồng đầu tiên tại vùng Tân Quy - Biên Hòa, sau đó được trồng rộng rãi các vùng Đồng bằng sông Cửu Long, Tây Nguyên, Đông Nam Bộ.2 Tình hình sản xuất sầu riêng 1.1 Tình hình sản xuất trên thế giới Theo FAO năm 2017 sản lượng ước tính lần lượt của Thái Lan và Indonesia đạt 840.000 tan, tong cộng chiếm xấp xi 70% tong sản lượng sau riêng thê giới, còn lại thuộc vê Malaysia và Việt Nam với sản lượng sâu riêng ước 3 đạt lần lượt 390. Sau riêng là nông sản có giá trị đặc biệt cao và đang là một trong những loại quả có sản lượng cao tại Đông Nam Á, thị trường sầu riêng đang trải qua tăng trưởng mạnh. Sự ưa chuộng ngày càng tăng đối với sầu riêng không phải chỉ đến từ cái mùi cực mạnh, mà còn từ hương vị đặc biệt của loại quả này. Thương mại sầu riêng toàn cầu ước đạt 609.000 tan trong năm 2017, tăng 18% so với năm 2016.

Thái Lan là nước xuất khâu sau riêng lớn nhất thé giới và chiếm thị phần áp đảo trung bình 82% trong giai đoạn 2015 - 2017. Trung Quốc là nước nhập khẩu sầu riêng lớn nhất thế giới, với kim ngạch nhập khâu hàng năm đạt trung bình khoảng 300.000 tấn trong giai đoạn 2015 - 2017. Sự ưa thích ngày càng tăng đối với sầu riêng đã vượt ra khỏi biên giới châu Á khi giá trị xuất khẩu sầu riêng tươi Thái Lan sang Mỹ đã tăng 68% trong năm 2017 lên xấp xỉ 5,1 triệu USD.2 Tình hình sản xuất ở Việt Nam Theo tổng cục Thống kê (2021) diện tích, năng suất và sản lượng sau riêng Việt Nam trong những năm qua đều tăng mạnh và đạt khoảng 6,2% tông diện tích trồng cây ăn quả trên cả nước. Năm 2010, tổng điện tích sầu riêng trên cả nước khoảng 17.600 ha và sản lượng dat 107.

Năm 2015, tổng diện tích sầu riêng khoảng 31.900 ha và 6 sản lượng đạt 366. Năm 2020, tổng diện tích trồng sầu riêng khoảng 70.000 ha và tông sản lượng sầu riêng đạt 559. Trong đó, diện tích trồng sầu riêng lớn nhất tại các tinh Tây Nguyên (27.838,9 ha), Đồng bang sông Cửu Long (24.913,6 ha), Đông Nam Bộ (13. Năng suất bình quân trong năm 2020 đạt cao nhất ở các tỉnh vùng Đồng bằng sông Cửu Long dat 21,1 tắn/ha, Tây Nguyên 13,6 tan/ha, Đông Nam Bộ 9,4 tan/ha.

Thời gian thu hoạch sau riêng hàng năm tại vùng Đồng bằng sông Cửu Long và Đông Nam Bộ vào khoảng tháng 5 - 7.