MỞ ĐẦU Theo số liệu thống kê của Viện Dƣợc liệu, hiện nay ở nƣớc ta có gần 5000 loài thực vật đã đƣợc ngƣời dân sử dụng trong y học cổ truyền, y học dân gian, chiếm gần 1/3 tổng số loài thực vật đã biết ở Việt Nam. Giảo cổ lam có tên khoa học Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino, là một trong các cây thuốc quý hiếm đƣợc ngƣời dân sử dụng trong việc điều trị các bệnh biến chứng về tim mạch, làm tan các cục máu đông, chống huyết khối, hạ mỡ máu. Uống nƣớc từ cây thuốc Giảo cổ lam hàng ngày giúp giảm căng thẳng, tăng cƣờng sức khỏe, chống lại quá trình lão hóa, hạ đƣờng huyết, bảo vệ tế bào gan, tăng tiết mật, tăng cƣờng chức năng giải độc cho gan, hỗ trợ điều trị bệnh ung thƣ. Thậm chí ở Nhật Bản và Trung Quốc, ngƣời ta còn coi Giảo cổ lam nhƣ một phƣơng thuốc trƣờng sinh.
Theo các nghiên cứu đã công bố thì hai nhóm hoạt chất chính và có tác dụng trong Giảo cổ lam là flavonoid và saponin. Nƣớc ta hiện có 05 loài thuộc chi Gynostemma [3]. Các loài này có đặc điểm hình thái rất giống nhau. Các dƣợc liệu không phải loài Gynostemma pentaphyllum vẫn đƣợc các thƣơng gia gọi với tên "Giảo cổ lam" và quảng cáo những tác dụng chữa bệnh của dƣợc liệu Giảo cổ lam.
Trên thị trƣờng hiện nay, vị thuốc quý này chủ yếu đƣợc bán dƣới dạng túi trà, các sản phẩm từ Giảo cổ lam không rõ nguồn gốc đang đƣợc bày bán rất nhiều. Điều này không những ảnh hƣởng đến hiệu quả điều trị, sức khỏe và quyền lợi của ngƣời bệnh mà còn gây mất lòng tin của ngƣời tiêu dùng khi sử dụng thuốc từ dƣợc liệu nói chung và Giảo cổ lam nói riêng. Ngoài ra, thành phần hóa học, hàm lƣợng các hoạt chất của Giảo cổ lam ở các vùng có điều kiện thổ nhƣỡng, khí hậu khác nhau thì cũng khác nhau. Đây cũng là một vấn đề cần phải nghiên cứu.
Ở Việt Nam, Dƣợc điển Việt Nam IV (2009) chƣa có chuyên luận Giảo cổ lam [3]. Do đó, việc kiểm soát, đánh giá chất lƣợng của các mẫu Giảo cổ lam và các sản phẩm từ dƣợc liệu này gặp nhiều khó khăn. Các nghiên cứu phân tích thành phần hóa học Giảo cổ lam đã công bố ở trong nƣớc chỉ dừng ở mức định tính hoặc là xác định một nhóm chất [9], [10], [12]. Các nghiên cứu đã công bố ở nƣớc ngoài sử dụng các kỹ 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com thuật, hiện đại, đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền nên khó có thể áp dụng rộng rãi ở các đơn vị kiểm nghiệm và sản xuất trong nƣớc.
Các phƣơng pháp xử lý mẫu tốn kém, tốn nhiều thời gian [25], [31], [38]. Ngoài ra, thành phần hóa học của các mẫu này cũng khác so với nguyên liệu Giảo cổ lam ở trong nƣớc. Do đó, việc xây dựng một phƣơng pháp định lƣợng (khẳng định tính đúng và đánh giá chất lƣợng) của dƣợc liệu Giảo cổ lam là hết sức cần thiết. Các kết quả nghiên cứu đã công bố cho thấy, Rutin và Ginsenoside Rb1 là hai hợp chất chính trong Giảo cổ lam và có nhiều tác dụng tốt đối với sức khỏe con ngƣời [23], [40].
Vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu xây dựng phƣơng pháp định lƣợng các hoạt chất chính trong dƣợc liệu Giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino” với các mục tiêu - Xây dựng đƣợc phƣơng pháp định lƣợng hai hợp chất Rutin và Ginsenoside Rb1 trong dƣợc liệu Giảo cổ lam bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). - Xác định đƣợc hàm lƣợng của hai hoạt chất này trong dƣợc liệu Giảo cổ lam thu hái tại các vùng khác nhau, các mẫu thu mua trên thị trƣờng và sản phẩm chế biến từ dƣợc liệu Giảo cổ lam. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chƣơng I - TỔNG QUAN 1. Tổng quan về dƣợc liệu Giảo cổ lam Giảo cổ lam hay còn gọi là Cổ yếm, Thƣ tràng năm lá có tên khoa học là Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino, thuộc họ Bầu bí (Cucurbitaceae) [6], [15].
Theo nghiên cứu đã công bố, ở Việt Nam hiện nay có 05 loài thuộc chi Gynostemma bao gồm Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino), Cổ yếm lá bóng (Gynostemma laxum (Wall.), Giảo cổ lam Miến Điện (Gynostemma burmanicum King ex Chakrav.), Giảo cổ lam bảy lá (Gynostemma longipes C. W), Giảo cổ lam quả dẹt (Gynostemma compressum X. Trong các loài kể trên, loài Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) là loài đƣợc quan tâm nghiên cứu hơn cả. Các tác dụng của dƣợc liệu Giảo cổ lam đã đƣợc chứng minh qua rất nhiều các nghiên cứu cả ở trong và ngoài nƣớc.
Trong phạm vi của luận văn, chúng tôi sử dụng dƣợc liệu này làm đối tƣợng để nghiên cứu. Dƣợc liệu Giảo cổ lam 1. Đặc điểm thực vật Cây thảo, thân và nhánh mảnh, có góc-rãnh, nhẵn hoặc có lông tơ rải rác. Lá kép chân vịt 3-7 lá chét, có lông tơ hoặc nhẵn; lá chét hình trứng-thuôn hoặc mác, lá chét giữa 3-12 × 1,5-4 cm, lá chét bên nhỏ hơn, cả hai mặt đôi khi có lông cứng, gân bên 6- 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 8 đôi, gốc hẹp dần vào cuống, mép khía tai bèo, đỉnh nhọn hoặc có mũi nhọn ngắn; cuống lá chét 1-5 mm.
Tua cuốn dạng chỉ, 2 nhánh. Hoa đực trong cụm hoa chùy, cuống cụm hoa dạng chỉ, 10-15 (-30) cm, rất nhiều nhánh; cuống hoa dạng chỉ, 1-4 mm; lá bắc hình giùi; ống đài rất ngắn; thùy đài hình tam giác, khoảng 0,7 mm, đỉnh nhọn; tràng màu xanh lá cây nhạt hoặc trắng; thùy tràng hình trứng-mác, 2,5-3× khoảng 1 mm, 1 gân, đỉnh có mũi nhọn dài. Hoa cái: cụm hoa chùy ngắn hơn cụm hoa đực; đài và tràng giống hoa đực; bầu hình cầu, 2 hoặc 3 ô; vòi nhụy 3; núm nhụy 2 thùy; nhị lép 5, ngắn. Quả không tự mở, đen khi trƣởng thành, hình cầu, đƣờng kính 5- 6 mm; 2-3 hạt, nhẵn hoặc dày đặc lông cứng và lông tơ.
Hạt nâu, trứng-tim, đƣờng kính khoảng 4 mm, dẹt, hai mặt có nhú, gốc tim, đỉnh tù. Hoa tháng 3-11, quả tháng 4- 12. Phân bố và sinh thái Giảo cổ lam là cây ƣa ẩm, ƣa sáng đồng thời cũng hơi chịu bóng. Cây thƣờng mọc ở trong rừng, lùm bụi hoặc ven đƣờng ở sƣờn núi, độ cao từ 100 đến hơn 3000 m [6].
Giảo cổ lam có ở nhiều quốc gia nhƣ Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan, Triều Tiên, Nhật Bản. Ở nƣớc ta, cây phân bố ở một số tỉnh nhƣ Lào Cai (Sapa), Cao Bằng, Lạng Sơn, Quảng Ninh (Móng Cái, Hà Côi), Hòa Bình, Vĩnh Phúc (Tam Đảo), Quảng Bình (Vƣờn Quốc gia Phong Nha-Kẻ Bàng), Kon Tum, Đồng Nai [3]. Giảo cổ lam sinh trƣởng mạnh trong mùa mƣa ẩm, từ tháng 4 đến tháng 8. Cây ra quả hàng năm.
Do trữ lƣợng tự nhiên hạn chế, lại bị tìm kiếm khai thác mạnh, nên Giảo cổ lam đã đƣợc đƣa vào tài liệu “Danh lục đỏ các cây thuốc Việt Nam (2006)” và tài liệu “Sách đỏ Việt Nam, phần II-Thực vật (2007)” nhằm khuyến cáo bảo vệ. Thời gian gần đây, để phục vụ nhu cầu sử dụng cao của ngƣời dân, cây đã đƣợc đƣa vào trồng ở một số địa phƣơng miền núi và cho kết quả tốt [6], [15]. 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Thành phần hóa học của Giảo cổ lam Các nghiên cứu đã đƣợc công bố ở trong và ngoài nƣớc chỉ ra rằng thành phần hóa học chính và có tác dụng của loài Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino là saponin và flavonoid [30], [35], [36], [37].
Ngoài ra còn một số nhóm chất khác. Nhóm Saponin Saponin là thành phần hóa học chính trong Giảo cổ lam. Hàm lƣợng saponin toàn phần tính theo Ginsenoside Rb1 trong 3 mẫu thu hái tại Tam Đảo (Vĩnh Phúc), Hòa Bình và Đà Lạt lần lƣợt là 4,12%; 5,10% và 4,12% [2], [12]. Các saponin có trong Giảo cổ lam thuộc nhóm saponin triterpen có khung dammaran tƣơng tự nhƣ trong Nhân sâm (Panax gisneng) với nhiều tác dụng quý đã đƣợc chứng minh [26].
Cho đến nay đã có khoảng trên 100 saponin đƣợc phân lập từ loài Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum (Thunb. Trong đó, có một vài các saponin khung protopanaxadiol của loài Panax ginseng nhƣ Ginsenoside Rb1 (Gypenoside III), Ginsenoside Rc, Ginsenoside Rb3 (Gypenoside IV), Ginsenoside Rd (Gypenoside VIII), Ginsenoside Rg3, Ginsenoside malonyl- Rb1 và Ginsenoside malonyl-Rd [20], [29], [25], [38]. Hợp chất Ginsenoside Rb1 có hàm lƣợng cao trong các mẫu Giảo cổ lam thu hái tại Trung Quốc dao động trong khoảng từ 0,08-0,15% [28]. Hợp chất này cũng đƣợc sử dụng làm chất đánh dấu trong phép phân tích xây dựng “dấu vân tay” bằng 02 phƣơng pháp là sắc ký lỏng hiệu năng cao và sắc ký lớp mỏng của dƣợc liệu Giảo cổ lam [40].
Nhóm flavonoid Cùng với sapomin, flavonoid là một trong hai nhóm chất chính có trong Giảo cổ lam. Các flavonoid có trong loài Gynostemma pentaphyllum chủ yếu là các flavonol. Một số flavonoid đã đƣợc tìm thấy trong loài này ở Việt Nam nhƣ: Ombuin, Ombuoside, Rutin, Quercetin, Quercetin-4,7-dimetylete [1]. Ngoài ra sự có mặt của các hợp chất nhƣ Vitexin, Quercetin-3-O-β-D-glucosid và Kaempferol-3-O-rutinosid trong Giảo cổ lam cũng đã đƣợc công bố trong các nghiên cứu trƣớc đây [25], [30], 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.
Trong các flavonoid nói trên, hợp chất Rutin là hợp chất có hàm lƣợng cao và đã đƣợc sử dụng làm chất đối chiếu trong phép phân tích xây dựng “dấu vân tay” bằng 02 phƣơng pháp là sắc ký lỏng hiệu năng cao và sắc ký lớp mỏng của dƣợc liệu Giảo cổ lam [23], [28], [40]. Công thức cấu tạo của một vài saponin và flavonoid có trong Giảo cổ lam 1. Các thành phần khác Ngoài 02 nhóm hoạt chất chính là saponin và flavonoid, trong loài Giảo cổ lam còn chứa các sterol bao gồm ergostanol, β-sitosterolvà stigmasterol [33], các nguyên tố vô cơ bao gồm: Al, Si, Mg, P, K, Mn, Na, Fe, Ba, Ti, Cu, Cr, Pb, Ag, polysaccharid, vitamin, khoáng chất và các amino axit [29]. 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.
Công dụng và tác dụng sinh học của Giảo cổ lam Theo Y học dân gian, Giảo cổ lam có tác dụng tăng cƣờng sinh lực, thanh nhiệt, giải độc. Ở Trung Quốc, Giảo cổ lam đƣợc dùng làm thuốc bổ và đƣợc xếp vào 10 loại thảo dƣợc có tác dụng bổ nhất ở Trung Quốc. Lá loài này đƣợc dùng làm trà thuốc gọi là trà dƣỡng não. Thân và lá còn đƣợc sử dụng để chữa bệnh đái tháo đƣờng.
Ngoài ra, Giảo cổ lam còn đƣợc sử dụng để chữa viêm thận, loét dạ dày hành tá tràng, phong thấp, đau nhức xƣơng khớp, các bệnh về tim mạch, béo phì [6], [15].TS Phạm Thanh Kỳ (Đại học Dƣợc Hà Nội) là nhà khoa học nghiên cứu đầu tiên và chuyên sâu về cây Giảo cổ lam ở Việt Nam.