Định lượng Astilbin chế phẩm dược liệu Thổ phục linh bằng HPLC - Hoàng Thùy Linh

Nghiên cứu định lượng astilbin trong các chế phẩm dược liệu chứa thổ phục linh bằng phương pháp HPLC. Khóa luận cung cấp quy trình phân tích và đánh giá chất

• Tác giả: Hoàng Thị Thuỳ Linh
• Người hướng dẫn: TS. Trần Nguyên Hà
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Hóa phân tích
• Đề tài: Định lượng Astilbin trong chế phẩm dược liệu chứa Thổ phục linh bằng HPLC
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về định lượng Astilbin trong chế phẩm Thổ phục linh bằng HPLC

Thổ phục linh (Smilax glabra Roxb.) là dược liệu quý trong y học cổ truyền. Dược liệu này chứa nhiều hoạt chất có giá trị. Astilbin (AST) là flavonoid đặc trưng. Hợp chất này có tác dụng chống viêm, chống oxy hóa. Định lượng AST giúp đánh giá chất lượng chế phẩm. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được ưu tiên. HPLC cho kết quả chính xác, độ nhạy cao. Phương pháp này tách biệt AST khỏi các thành phần khác. Quy trình bao gồm chiết xuất, sắc ký, phát hiện. Dung môi chiết là methanol 60%. Thời gian chiết bằng siêu âm ảnh hưởng đến hiệu suất. Nghiên cứu xây dựng quy trình tối ưu. Thẩm định phương pháp đảm bảo độ tin cậy. Kết quả áp dụng cho nhiều loại chế phẩm. Phương pháp này phục vụ kiểm soát chất lượng sản phẩm dược.

1.1. Tầm quan trọng của Astilbin trong dược liệu Thổ phục linh

Astilbin là flavonoid chính trong rễ Thổ phục linh. Hợp chất này có công thức hóa học C21H22O11. AST có tác dụng chống viêm mạnh mẽ. Nghiên cứu cho thấy AST ức chế miễn dịch chọn lọc. Chất này bảo vệ gan khỏi tổn thương. AST kích hoạt quá trình apoptosis tế bào lympho. Hàm lượng AST phản ánh chất lượng dược liệu. Các sản phẩm chứa Thổ phục linh thường chuẩn hóa theo AST. Đánh giá hàm lượng AST là yêu cầu bắt buộc. Điều này đảm bảo hiệu quả điều trị của chế phẩm.

1.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC trong phân tích dược liệu

HPLC là kỹ thuật phân tích hiện đại. Phương pháp này dựa trên nguyên lý sắc ký phân pha. Hệ thống HPLC gồm bơm, cột sắc ký, detector. Cột C18 được sử dụng phổ biến. Di động pha thường là MeOH và nước. Detector UV-Vis phát hiện AST ở bước sóng phù hợp. HPLC tách hiệu quả các flavonoid phức tạp. Thời gian phân tích ngắn, độ lặp lại cao. Phương pháp đáp ứng yêu cầu thẩm định quốc tế. HPLC được công nhận rộng rãi trong kiểm nghiệm dược phẩm.

II. Các vấn đề trong định lượng Astilbin từ Thổ phục linh

Định lượng AST gặp nhiều thách thức. Quy trình xử lý mẫu phức tạp. Chiết xuất AST cần điều kiện tối ưu. Siêu âm là phương pháp chiết hiệu quả. Thời gian chiết ảnh hưởng đến thu hồi. Số lần chiết cần được khảo sát kỹ. Ma trận mẫu chứa nhiều thành phần khác. Các flavonoid có cấu trúc tương tự AST. Tách biệt AST khỏi tạp chất là khó khăn. Điều kiện sắc ký cần được tối ưu hóa. Lưu lượng di động pha tác động đến tách sắc ký. Nhiệt độ cột ảnh hưởng đến sắc đồ. Độ pH di động pha quyết định hình dạng pic. Nồng độ mẫu phải nằm trong khoảng tuyến tính. Sai số pha loãng cần được kiểm soát. Kết quả phải có độ chính xác cao.

2.1. Thách thức trong quy trình xử lý mẫu

Mẫu chế phẩm có dạng viên nang cứng. Bột thuốc cần nghiền mịn trước chiết. Dung môi chiết phải hòa tan AST hoàn toàn. MeOH 60% cho hiệu suất chiết tốt nhất. Siêu âm giúp phá vỡ cấu trúc tế bào. Thời gian siêu âm tối ưu là 15-30 phút. Ly tâm tách pha rắn-lỏng hiệu quả. Lọc qua màng 0,45 µm loại bỏ tạp chất lớn. Mỗi bước ảnh hưởng đến kết quả cuối cùng. Quy trình phải được chuẩn hóa nghiêm ngặt.

2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến độ chính xác kết quả

Nhiều yếu tố tác động đến kết quả định lượng. Độ chính xác cân mẫu rất quan trọng. Dung cụ định mức phải đạt chuẩn A. Bơm HPLC cần hiệu chuẩn thường xuyên. Cột sắc ký có tuổi thọ giới hạn. Nhiệt độ phòng ảnh hưởng đến thể tích. Ánh sáng có thể phân hủy flavonoid. Mẫu phải được bảo quản đúng cách. Chuẩn gốc AST cần đạt độ tinh khiết cao. Đường chuẩn phải có hệ số tương quan tốt. RSD không được vượt quá ngưỡng cho phép.

III. Phương pháp định lượng Astilbin bằng HPLC và thẩm định

Xây dựng phương pháp HPLC đòi hỏi nhiều bước. Đầu tiên là khảo sát quy trình xử lý mẫu. Phương pháp chiết được tối ưu hóa. Thời gian và số lần chiết được xác định. Điều kiện sắc ký được lựa chọn kỹ lưỡng. Cột C18 phù hợp cho phân tích flavonoid. Di động pha MeOH-Nước cho sắc đồ tốt. Detector UV phát hiện AST ở λ tối ưu. Thẩm định phương pháp đảm bảo độ tin cậy. Độ phù hợp hệ thống được kiểm tra đầu tiên. Đường chuẩn xây dựng với 5-7 nồng độ. Hệ số tương quan r² phải đạt ≥0,999. Độ lặp lại đánh giá qua RSD. Độ đúng kiểm tra bằng mẫu thêm chuẩn. Giới hạn phát hiện và định lượng được xác định. Phương pháp được áp dụng cho nhiều chế phẩm thực tế.

3.1. Quy trình xử lý mẫu và chiết xuất Astilbin

Cân chính xác 0,1250 g bột thuốc vào bình 10 ml. Thêm MeOH 60% đến vạch. Siêu âm ở nhiệt độ phòng. Lắc xoáy giúp trích ly hoàn toàn. Ly tâm ở tốc độ cao 10 phút. Hút dịch trên qua xylanh. Lọc qua màng 0,45 µm vào lọ mẫu. Thu được dung dịch thử trong suốt. Quy trình phải thực hiện nhất quán. Mỗi mẫu xử lý theo cùng quy trình. Điều này đảm bảo độ lặp lại kết quả.

3.2. Thẩm định phương pháp HPLC cho định lượng Astilbin

Thẩm định gồm nhiều thông số quan trọng. Độ phù hợp hệ thống kiểm tra sắc đồ chuẩn. 5 lần tiêm liên tiếp đánh giá RSD. Đường chuẩn xây dựng từ 5-15 ppm. 9 mẫu thử thêm ở 3 mức nồng độ. Mức 5, 10, 15 ppm đánh giá độ đúng. Thu hồi phải đạt 95-105%. RSD độ lặp lại ≤2%. LOD xác định từ tỷ lệ tín hiệu-nhiễu. LOQ tính bằng 3,3 lần LOD. Tất cả phải đạt tiêu chuẩn dược điển.

IV. Kết luận và ứng dụng định lượng Astilbin trong thực tế

Phương pháp HPLC định lượng AST đã được thiết lập. Quy trình xử lý mẫu được tối ưu hóa. MeOH 60% là dung môi chiết hiệu quả. Siêu âm 15 phút cho thu hồi cao. Điều kiện sắc ký đảm bảo tách pic tốt. Phương pháp đạt các tiêu chuẩn thẩm định. Độ tuyến tính, chính xác, đúng đều đạt yêu cầu. LOD và LOQ đủ nhạy cho phân tích thực tế. Phương pháp áp dụng thành công cho viên nang Thổ phục linh. Nhiều sản phẩm thương mại được kiểm tra. Kết quả cho thấy hàm lượng AST biến động. Kiểm soát chất lượng là cần thiết. Phương pháp có thể mở rộng cho mẫu khác. Đây là công cụ hữu ích cho ngành dược phẩm.

4.1. Ứng dụng trong kiểm soát chất lượng chế phẩm dược

Phương pháp áp dụng cho nhiều loại chế phẩm. Viên nang cứng chứa Thổ phục linh được phân tích. Hàm lượng AST được so sánh với tiêu chuẩn. Sản phẩm đạt chất lượng phải có AST đủ hàm lượng. Kết quả giúp đánh giá sản phẩm lưu thông. Kiểm soát chất lượng bảo vệ người tiêu dùng. Nhà sản xuất có cơ sở đánh giá sản phẩm. Cơ quan quản lý sử dụng để giám sát thị trường. Phương pháp đơn giản, dễ thực hiện. Chi phí phân tích hợp lý cho sản xuất.

4.2. Hướng phát triển và cải tiến phương pháp định lượng

Phương pháp có thể cải tiến thêm. Kết hợp HPLC-MS tăng độ đặc hiệu. Phân tích đa thành phần trong một lần chạy. Tối ưu hóa gradient elution cho sắc đồ tốt hơn. Mở rộng sang mẫu dịch chiết lỏng. Áp dụng cho dược liệu thô chưa bào chế. Xây dựng tiêu chuẩn hóa cho sản phẩm thảo dược. Đào tạo nhân viên kỹ thuật phân tích. Chuẩn hóa quy trình trên toàn quốc. Nghiên cứu thêm về tính ổn định mẫu.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay bên cạnh các loại thuốc tổng hợp hóa học thì việc sử dụng các loại cây cỏ, thảo mộc để điều chế thuốc chữa bệnh, thực phẩm chăm sóc sức khỏe cũng được phát triển rộng rãi và ngày càng được ưa chuộng. Không nằm ngoài xu hướng chung của thế giới, nguồn dược liệu thực vật Việt Nam ngày càng được khẳng định có giá trị to lớn trong việc chữa bệnh, chăm sóc sức khỏe. Nhiều loại thuốc được sản xuất từ dược liệu Việt Nam như Berberin, Palmatin… Đối với các nhà khoa học, các nhà quản lý, yêu cầu về việc kiểm soát thành phần cũng như hoạt tính sinh học của các dược liệu càng được đề cao nhằm mục đích sử dụng chúng một cách hợp lý, khoa học và hiệu quả. Trong số các bài thuốc dân gian đã và đang được quan tâm nghiên cứu đầy đủ về hoạt chất và hoạt tính sinh học, trong đó phải kể đến là cây Thổ phục linh.

Thổ phục linh (Smilax glabra) vốn là một loại cây mọc hoang ở các vùng miền núi ở nước ta. Từ rất lâu, trong Y học cổ truyền Việt Nam, Thổ phục linh được sử dụng trong nhiều bài thuốc chữa các bệnh về gân cốt, trị giun sán, ung nhọt, giải độc, chống viêm …[1]. Theo Y học cổ truyền Trung Quốc thì rễ của Thổ phục linh (TPL) có tác dụng giải độc, làm giảm mất nước, có thể được sử dụng để điều trị bệnh trùng xoắn, viêm da, bệnh giang mai, bệnh brucella, cấp tính do vi khuẩn kiết lỵ…[1]. Y học hiện đại cũng chỉ ra trong rễ Thổ phục linh có chứa astilbin (AST), đóng vai trò quan trọng trong việc ngăn chặn hoạt động của acid uric trong máu, tăng sản hoạt dịch, giảm viêm, ngăn chặn xâm nhập tế bào vào màng hoạt dịch, từ đó làm giảm quá trình ăn mòn sụn khớp [18, 21].

Hơn nữa, trong các loài TPL, chỉ có chi Smilax chứa AST có tác dụng dược lý và là chất chỉ điểm của loài này [3]. Tại Việt Nam, đã có một số nghiên cứu về thành phần hoá học [4], hoạt tính sinh học [3, 4] cũng như phương pháp định tính, định lượng trong dược liệu TPL [2, 4]. Trong DĐVN V, AST đã được lựa chọn làm chất đánh dấu trong cả chỉ tiêu định tính và định lượng cho dược liệu TPL [2]. Nhưng 1 chưa có nghiên cứu nào xây dựng phương pháp định lượng AST trong dược phẩm, thực phẩm bảo vệ sức khoẻ từ TPL và các dược liệu khác.

Trong khi đó, các thành phần của TPL cũng như các dược liệu khác thường khá phức tạp, không thể ứng dụng trực tiếp phương pháp định lượng AST trong dược liệu của Dược điển Việt Nam vào các sản phẩm này. Các sản phẩm bảo vệ sức khỏe chứa TPL trên thị trường chủ yếu là dạng viên nang cứng, một số ít là dạng cao lỏng, nước uống, viên hoàn. Chính vì thế, chúng tôi thực hiện đề tài “Xây dựng phương pháp định lượng Astilbin trong chế phẩm chứa thổ phục linh bằng HPLC” nhằm mục tiêu như sau: Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng AST trong chế phẩm chứa Thổ phục linh bằng HPLC góp phần kiểm tra chất lượng sản phẩm. TỔNG QU AN 1.

Tổng quan về đối tượng nghiên cứu 1. Thực vật học Thực vật học Thổ phục linh thuộc: - Họ Khúc Khắc (Smilacaceae) - Chi Khúc khắc (Smilax) Hình 1.1: Cây thổ phục linh Thổ phục linh có tên khoa học là Smilax glabra hay còn gọi là Khúc Khắc, Kim cang, khau đâu, cẩu ngổ lực (Tày), mọi hoi dòi (Dao), D’rang lò (Châu Mạ), tơ pớt (K’Ho), Lái (K’Dong), Smilax gabre, squine (Pháp). TPL thuộc chi Khúc Khắc (Smilax) là chi của khoảng hơn 200 loài dây leo hay thân thảo trong thực vật có hoa, nhiều loài trong số đó là các cây thân gỗ hay có gai. Các loài trong chi Smilax mọc thành dạng cây bụi, tạo ra bụi rậm dày đặc khó xuyên qua.

Chúng thuộc họ Smilacaceae. Tên gọi là Sarsaparilla là tên chung cho nhiều loài thuộc họ Khúc Khắc (Smilacaceae). Có rất nhiều loài của họ Smilacaceae mang chung một tên là Sarsaparilla như loài offiinalis, aristolochiaefolia, glabra, febrifuga, ornata, regelii, japicanga mọc ở nhiều nơi khác nhau trên thế giới nhưng giống nhau về hình dáng, về tính năng và thành phần hoá học cũng như sử dụng. Họ Khúc Khắc bao gồm khoảng 350 loài, được phân bố tại những vùng khí hậu ôn hoà, nhiệt đới và cận nhiệt đới như Nam Mỹ, Jamaica, Caribbean, Mexica, Lào, Campuchia, Thái Lan, Việt 3 Nam,… Trong đó Smilax glabra ( Roxb) phân bố chủ yếu ở Trung Quốc, Đài Loan, Lào, Campuchia, Thái Lan và Việt Nam.

Ở Việt Nam, TPL phẩn bố rải rác khắp các tỉnh ở miền núi cũng như trung du và một vài đảo lớn. TPL là loại cây leo, sống lâu năm, trườn dài 4-5 m (có thể tới 10 m), phân nhiều cành. Cành nhỏ, mềm, không gai, lá mọc so le, hình bầu dục hoặc trái xoan, dài 5-11 cm, rộng 1-5 cm, gốc tròn, đầu nhọn, mặt trên sáng bóng, mặt dưới bệnh như phấn trắng, lá khô có màu hạt dẻ rất đặc sắc, gân chính 3, cuống lá dài 1 cm mang tua cuốn mảnh và dài do lá kèm biến đổi. Cụm hoa mọc ở kẽ lá, cuống rất ngắn và gần như không cuống, mang 1 tán đơn gồm nhiều hoa màu vàng nhạt, cuống hoa mảnh như sợi chỉ, dài 1 cm hoặc hơn.

Hoa đực và hoa cái riêng rẽ, hoa đực có lá đài hình tim dày, cánh hoa bầu hơi khum, nhị không cuống, bao phấn thuôn, hoa cái giống hoa đực. Sinh trưởng mạnh trong mùa mưa ẩm, ra hoa đầu tháng năm. Tuy nhiên chỉ những cây được chiếu sáng đầy đủ mới có nhiều hoa, quả. Quả mọng, hình cầu, đường kính 6-7 mm gần như 3 cánh, chứa 3 hạt, khi chín màu đen [1].

Astilbin và các thành phần hoá học trong rễ Thổ phục linh Astilbin - AST là một flavanonol, một dạng của flavonoid có dạng đồng phân 2R – trans, dạng neoisoastilbin là đồng phân (2S – cis) và isoastilbin là dạng đồng phân (2R-cis). AST được tìm thấy trong nhiều họ như Hypericaceae, Smilacaceae, …. - CTPT: C21H22O11 - Trọng lượng phân tử: 450 g/mol - Công thức cấu tạo: Hình 1. Công thức cấu tạo của AST 4 - Tên IUPAC: (2R,3R) – 2 - (3”,4”- dihydroxyphenyl) - 5,7 – dihydroxy – 3 - [(2S,3R,4R,5R,6S) - 3,4,5 – trihydroxy – 6 – methyloxan – 1 - yl] oxy - 2,3 dihydrochromen – 4 - ol.

- Tên thường gọi: Astilbin; Taxifolin-3-O-alpha-L-rhamnopyranoside. - Dạng đồng phân này của AST được phân lập từ rễ của cây thổ phục linh (Smilax glabra Roxb). AST được xem là hoạt chất chính trong rễ Thổ phục linh. AST được sử dụng trong y học cổ truyền Trung Quốc, nó có tác dụng trừ sâu, kháng khuẩn và làm lành vết thương.

Những nghiên cứu mới đây đã chỉ ra AST có tác dụng chống ung thư [19], tác dụng bảo vệ gan [32], chống oxy hoá [17] và kháng khuẩn [20]. - Độ ổn định của AST: Hình 1. Độ ổn định của AST phụ thuộc vào nhiệt độ, pH và dung môi [29] Sự phân huỷ của AST phụ thuộc vào pH, nhiệt độ và môi trường cùng với sự đồng phân hoá của AST thành 3 đồng phân lập thể của nó. Quá trình phân 5 huỷ tuân theo mô hình động học bậc nhất và tốc độ phân huỷ có k tăng lên trong khi thời gian bán rã giảm khi pH và nhiệt độ tăng lên.

Tính ổn định của AST liên quan đến sự thay thế vòng B. Ngoài ra, độ ổn định của AST khác nhau tuỳ thuộc vào dung môi và tuân thủ theo thứ tự 50% ethanol > ethanol > methanol > 50% methanol > nước [29]. Độ ổn định của AST được mô tả trực tiếp như hình 1. Nhận xét: - AST là hợp chất có vòng thơm benzen nên khả năng hấp thụ UV-VIS mạnh.

Do đó, có thể phát hiện AST bằng detector UV-VIS. - AST có độ ổn định phụ thuộc vào pH, nhiệt độ và môi trường chiết xuất. Do đó, khi lựa chọn điều kiện chiết xuất, điều kiện định lượng cần lựa chọn dung môi, nhiệt độ, pH thích hợp để không ảnh hưởng đến kết quả. Thành phần hoá học trong rễ Thổ phục linh Trong dịch chiết nước của rễ TPL, polysaccharid chiếm hàm lượng rất lớn đến 32% trọng lượng mẫu khô, điều này giải thích vì sao rễ Thổ phục linh đã từng sử dụng thay lương thực khi nạn đói xuất hiện ở Trung Quốc.

Rất nhiều các cấu tử có hoạt tính sinh học trong rễ Thổ phục linh quyết định dược tính đã được phân lập. Trong đó, lớp chất các flavonoid được xem là các cấu tử hoạt tính chính, ngoài ra là các hợp chất phenylpropanoid glycoside, lignan glycoside, các polyphenol, phenolic acid và các glycoside của nó bao gồm là các resveratrol, các acid hữu cơ và một số các hợp chất khác. Tổng cộng có khoảng 40 hợp chất đã được phân lập từ rễ TPL. Các flavonoid [45, 46]: Lớp hoạt chất chính trong rễ thổ phục linh là các flavonoid, trong đó có 12 flavonoid đã được tách ra thuộc về 5 hợp chất là dihydroflavonol, dihydroflavone, flavonol, isoflavon và flavanol.

Trong các flavonoid được phân lập thì dihydroflavonol có hàm lượng chính bao gồm khoảng 10 cấu tử là astilbin (3-O-alpha-L-rhamnoside-5,7,3’,4’- tetrahydroxydihydroflavonol)(1) hay (taxifolin-3-O-alpha-L-rhamnoside) và các dạng đồng phân lập thể của nó là neoastilbin(2), isoastilbin(3), neoisoastilbin(4), taxifolin(5), taxifolin-3”-O-beta-D-glucopyranoside(6), engeletin(7), 6 stereoisomeride isoengeletin(8), smitilbin(9) và đồng phân lập thể của nó là neosmitilbin(10) được mô tả trong hình 1. Những flavonoid khác là các flavone là quercetin(11), naringenin(12), isoflavon 7,6”-dihydroxy-3”- methoxyisoflavon(13) và flavanol(-)-epicatechin(14) được trình bày trong hình 1. Dihydroflavonol được tách từ rễ TPL Hình 1. Một số các flavonoid khác được tách từ rễ TPL 7 Lignan glycoside: lignan glycoside là chất mới (+) – syringaresinol 4-O- β-D-glucopyranosyl-(1-6)-β-D-glucopyranoside đã được tách ra với 12 cấu tử trên bởi Yuan(2003) [47].

Lignan glycoside được tách từ rễ TPL Các hợp chất phenylpropanoid glycoside [12] là lớp chất thứ hai có 7 cấu tử trong đó 5 cấu tử mới là smiglaside A-E. Các polyphenol, phenolic acid và các glycoside của nó [45]: lớp chất này bao gồm 9 cấu tử gồm các resveratrol. Các acid hữu cơ bao gồm các butan diacid, palmitic acid, và 2,2- dimethylsuccinic acid. Các chất sterol gồm các β-sterol và stigmasterol.

Cuối cùng là các hợp chất khác như các fructoside, các hợp chất dị tố, các acid amine, protein, … 1. Một số phương pháp phân tích AST từ dược liệu Thổ Phục Linh Bảng 1. Một số phương pháp phân tích AST từ dược liệu Thổ Phục Linh STT Phương pháp Điều kiện phân tích Kết quả phân tích [TLTK] chiết - Dung môi HPLC Dược liệu phải chứa chiết: MeOH - Pha động: MeOH: không dưới 0,45% 1 [2] 60%. AST tính theo dược - Điều kiện - Pha tĩnh: Cột kích thước liệu khô kiệt.

chiết: đun hồi (25 cm x 4,6 mm; 5 µm) 8 lưu trong 1h.