Nghiên cứu bào chế liposome berberin ứng dụng dùng đường uống

Nghiên cứu bào chế liposome berberin cho ứng dụng đường uống đang thu hút sự chú ý trong lĩnh vực dược phẩm. 243 trang · Trường Đại Học Dược Hà Nội · 2022.

• Tác giả: Dương Thị Thuấn
• Người hướng dẫn: GS. Phạm Thị Minh Huệ
• Trường học: Trường Đại Học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Công Nghệ Dược Phẩm Và Bào Chế Thuốc
• Đề tài: Nghiên Cứu Bào Chế Liposome Berberin Cho Ứng Dụng Đường Uống
• Loại tài liệu: Luận Án Tiến Sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC ĐỒ THỊ, HÌNH VẼ
• 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
• 2. CÁC NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG VÀ TÁC DỤNG HẠ LIPID MÁU IN-VIVO CỦA BERBERIN, LIPOSOME BERBERIN VÀ PROLIPOSOME BERBERIN DÙNG ĐƯỜNG UỐNG
• 2.1. Đánh giá sinh khả dụng in-vivo dùng đường uống của berberin
• 2.2. Đánh giá sinh khả dụng in-vivo đường uống của liposome berberin và proliposome berberin
• 2.3. Mô hình đánh giá tác dụng hạ lipid máu nội sinh của berberin trên động vật thực nghiệm
• 3. NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Nguyên vật liệu, thiết bị, động vật nghiên cứu
• 3.1.1. Nguyên vật liệu
• 3.1.2. Động vật thí nghiệm
• 3.2. Nội dung nghiên cứu
• 3.3. Phương pháp nghiên cứu
• 3.3.1. Thẩm định phương pháp định lượng
• 3.3.2. Phương pháp nghiên cứu tiền công thức
• 3.3.3. Phương pháp bào chế liposome berberin
• 3.3.4. Phương pháp bào chế proliposome berberin
• 3.3.5. Phương pháp đánh giá một số đặc tính của liposome BBR
• 3.3.6. Phương pháp đánh giá một số đặc tính của proliposome BBR
• 3.3.7. Đánh giá sinh khả dụng in-vivo của liposome BBR trên chuột cống
• 3.3.8. Đánh giá tác dụng hạ lipid máu nội sinh của liposome BBR trên chuột nhắt
• 3.3.9. Phương pháp xử lý số liệu
• 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 4.1. Kết quả thẩm định phương pháp định lượng
• 4.1.1. Thẩm định khoảng nồng độ tuyến tính của phương pháp định lượng berberin bằng quang phổ hấp thụ UV-Vis
• 4.1.2. Thẩm định phương pháp định lượng berberin bằng HPLC
• 4.1.3. Thẩm định phương pháp định lượng berberin trong huyết tương chuột bằng sắc ký lỏng kết hợp khối phổ (LC-MS/MS)
• 4.2. Nghiên cứu tiền công thức
• 4.2.1. Kết quả đánh giá một số đặc tính của dược chất
• 4.2.2. Kết quả nghiên cứu tương tác giữa dược chất với tá dược
• 4.3. Nghiên cứu bào chế liposome berberin
• 4.3.1. Thiết kế công thức
• 4.3.2. Bào chế liposome berberin bằng phương pháp tiêm ethanol
• 4.3.3. Bào chế liposome berberin bằng phương pháp hydrat hóa film
• 4.3.4. So sánh ảnh hưởng của phương pháp bào chế lên đặc tính của liposome berberin
• 4.4. Nghiên cứu bào chế proliposome berberin
• 4.4.1. Xác định một số thông số quy trình và lựa chọn công thức bào chế proliposome berberin
• 4.4.2. Đánh giá ảnh hưởng một số yếu tố về công thức và thông số trong quy trình đến đặc tính proliposome berberin
• 4.4.3. Đánh giá một số đặc tính của proliposome berberin
• 4.4.4. Xây dựng công thức và quy trình bào chế proliposome berberin quy mô phòng thí nghiệm
• 4.4.5. Nghiên cứu nâng cấp quy mô bào chế proliposome berberin 200 g/mẻ
• 4.4.6. Nghiên cứu độ ổn định của proliposome berberin
• 4.5. Đánh giá sinh khả dụng in vivo của liposome berberin
• 4.6. Đánh giá tác dụng hạ lipid máu nội sinh của liposome berberin
• 4.6.1. So sánh ảnh hưởng trên nồng độ cholesterol toàn phần huyết thanh của liposome BBR và hỗn dịch quy ước BBR trên chuột được gây tăng lipid máu nội sinh
• 4.6.2. So sánh ảnh hưởng của liposome berberin và hỗn dịch quy ước berberin trên nồng độ cholesterol tỉ trọng thấp ở chuột được gây tăng lipid máu nội sinh
• 4.6.3. So sánh ảnh hưởng của liposome berberin và hỗn dịch quy ước berberin trên nồng độ cholesterol tỉ trọng cao ở chuột được gây tăng lipid máu nội sinh
• 4.6.4. So sánh ảnh hưởng của liposome berberin và hỗn dịch quy ước berberin trên nồng độ triglycerid ở chuột được gây tăng lipid máu nội sinh
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
• DANH MỤC ĐỒ THỊ, HÌNH VẼ

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu bào chế liposome berberin

Nghiên cứu bào chế liposome berberin cho ứng dụng đường uống đang thu hút sự chú ý trong lĩnh vực dược phẩm. Berberin là một hợp chất tự nhiên có nhiều tác dụng sinh học, nhưng sinh khả dụng đường uống của nó rất thấp. Việc sử dụng liposome như một hệ thống phân phối thuốc có thể cải thiện đáng kể khả năng hấp thu của berberin. Nghiên cứu này sẽ trình bày các khía cạnh quan trọng liên quan đến bào chế và ứng dụng của liposome berberin.

1.1. Khái niệm và thành phần cấu tạo của liposome

Liposome là các hạt nano có cấu trúc màng phospholipid, có khả năng bao bọc dược chất. Chúng được sử dụng để cải thiện sinh khả dụng của nhiều loại thuốc, bao gồm cả berberin. Cấu trúc này giúp bảo vệ dược chất khỏi sự phân hủy trong môi trường tiêu hóa.

1.2. Tác dụng sinh học của berberin

Berberin có nhiều tác dụng sinh học, bao gồm khả năng hạ lipid máu và điều trị tiểu đường. Tuy nhiên, sinh khả dụng của nó qua đường uống rất thấp, dưới 10%, do bị chuyển hóa và thải trừ nhanh chóng. Việc bào chế liposome có thể giúp khắc phục vấn đề này.

II. Thách thức trong bào chế liposome berberin

Bào chế liposome berberin gặp nhiều thách thức, bao gồm việc tối ưu hóa kích thước và tính ổn định của liposome. Các yếu tố như tỷ lệ phospholipid, phương pháp bào chế và điều kiện bảo quản đều ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm cuối cùng. Việc nghiên cứu và khắc phục những thách thức này là rất cần thiết để đảm bảo hiệu quả của liposome berberin.

2.1. Vấn đề về kích thước và phân bố của liposome

Kích thước và phân bố của liposome ảnh hưởng lớn đến khả năng hấp thu của berberin. Liposome quá lớn có thể không thẩm thấu tốt qua niêm mạc ruột, trong khi liposome quá nhỏ có thể không giữ được dược chất.

2.2. Tính ổn định của liposome trong môi trường tiêu hóa

Liposome cần phải ổn định trong môi trường tiêu hóa để bảo vệ berberin khỏi sự phân hủy. Các yếu tố như pH, nhiệt độ và thời gian bảo quản có thể ảnh hưởng đến tính ổn định của liposome.

III. Phương pháp bào chế liposome berberin hiệu quả

Có nhiều phương pháp bào chế liposome berberin, bao gồm phương pháp tiêm ethanol và hydrat hóa film. Mỗi phương pháp có ưu điểm và nhược điểm riêng, và việc lựa chọn phương pháp phù hợp là rất quan trọng để đạt được sản phẩm chất lượng cao.

3.1. Phương pháp tiêm ethanol trong bào chế liposome

Phương pháp tiêm ethanol giúp tạo ra liposome với kích thước đồng nhất và hiệu suất nạp dược chất cao. Tuy nhiên, cần kiểm soát chặt chẽ các điều kiện bào chế để đảm bảo chất lượng sản phẩm.

3.2. Phương pháp hydrat hóa film cho liposome

Phương pháp hydrat hóa film là một kỹ thuật phổ biến khác để bào chế liposome. Phương pháp này cho phép kiểm soát tốt hơn kích thước và tính chất của liposome, nhưng yêu cầu thời gian và điều kiện cụ thể.

IV. Ứng dụng thực tiễn của liposome berberin trong y học

Liposome berberin có tiềm năng lớn trong điều trị các bệnh lý như tăng lipid máu và tiểu đường. Nghiên cứu cho thấy liposome có thể cải thiện sinh khả dụng của berberin, từ đó nâng cao hiệu quả điều trị. Việc áp dụng liposome trong y học mở ra hướng đi mới cho việc phát triển các loại thuốc mới.

4.1. Nghiên cứu về tác dụng hạ lipid máu của liposome berberin

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng liposome berberin có khả năng hạ lipid máu hiệu quả hơn so với dạng thuốc truyền thống. Điều này giúp giảm nguy cơ mắc các bệnh tim mạch và tiểu đường.

4.2. Tiềm năng ứng dụng trong điều trị tiểu đường

Liposome berberin có thể được sử dụng như một phương pháp điều trị bổ sung cho bệnh nhân tiểu đường. Nghiên cứu cho thấy berberin có khả năng cải thiện độ nhạy insulin và kiểm soát đường huyết.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của liposome berberin

Nghiên cứu bào chế liposome berberin cho ứng dụng đường uống đã mở ra nhiều cơ hội mới trong lĩnh vực dược phẩm. Mặc dù còn nhiều thách thức cần vượt qua, nhưng tiềm năng của liposome trong việc cải thiện sinh khả dụng của berberin là rất lớn. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho ngành y học.

5.1. Hướng nghiên cứu tiếp theo trong bào chế liposome

Cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình bào chế liposome, nhằm nâng cao hiệu quả và tính ổn định của sản phẩm. Các nghiên cứu mới có thể tập trung vào việc phát triển các công thức liposome mới.

5.2. Tương lai của liposome trong điều trị bệnh

Liposome có thể trở thành một công cụ quan trọng trong điều trị nhiều loại bệnh khác nhau. Việc phát triển các hệ thống phân phối thuốc mới sẽ giúp nâng cao hiệu quả điều trị và giảm thiểu tác dụng phụ.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Berberin (BBR) là một isoquinolin alkaloid bậc 4, có nguồn gốc tự nhiên từ rễ, thân rễ và vỏ của một số loài thực vật thuộc chi Berberis (họ Berberidaceae) hoặc các chi Coptis, Hydrastis, Thalictrum (họ Ranunculaceae). Dược chất này từ lâu đã được sử dụng theo y học cổ truyền để điều trị các bệnh lý nhiễm khuẩn đường tiêu hóa như lỵ amip, tiêu chảy do Escherichia coli. Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu thực nghiệm và lâm sàng đã ghi nhận thêm các hoạt tính dược lý của BBR, bao gồm hạ lipid máu, giảm đường huyết, chống xơ vữa động mạch, bảo vệ gan, thận và bảo vệ mô cơ tim. Đặc biệt, tác dụng hạ lipid máu của BBR thông qua cơ chế điều hòa thụ thể lipoprotein tỷ trọng thấp (LDLR) tại gan mở ra tiềm năng lớn trong phòng và điều trị rối loạn chuyển hóa lipid.

Tuy nhiên, việc sử dụng BBR qua đường uống quy ước gặp phải rào cản dược động học nghiêm trọng: sinh khả dụng đường uống của BBR rất thấp, thường dưới 10%. Nguyên nhân chính do BBR có độ tan phụ thuộc chặt chẽ vào pH môi trường (độ tan trong dung dịch acid HCl pH 1,2 và đệm phosphat pH 5,0 thấp hơn 20 lần so với đệm phosphat pH 7,0), tính thấm qua biểu mô ruột kém, chịu sự chuyển hóa bước đầu mạnh tại ruột, bị đẩy ngược bởi bơm tống thuốc P-glycoprotein tại niêm mạc ruột và tham gia chu trình tái bài tiết qua gan mật. Để đạt được hiệu quả điều trị hạ lipid máu trên người, BBR thường phải sử dụng ở liều cao (500 mg x 2–3 lần/ngày), kéo theo nhiều tác dụng không mong muốn trên đường tiêu hóa như tiêu chảy, táo bón và đau bụng.

Để khắc phục các hạn chế trên, công nghệ nano mang thuốc, cụ thể là hệ tiểu phân liposome, được xem là giải pháp tiềm năng giúp bảo vệ dược chất, tăng tính thấm và cải thiện sinh khả dụng. Tuy vậy, hỗn dịch liposome dạng lỏng kém bền vững trong môi trường đường tiêu hóa do dễ bị phá hủy bởi acid dạ dày, muối mật và enzym lipase tụy. Việc chuyển đổi liposome sang dạng bột hoặc hạt khô (proliposome) chứa chất mang tan trong nước giúp tăng độ ổn định hóa lý, kéo dài hạn dùng và thuận lợi cho việc nâng cấp quy mô sản xuất công nghiệp. Tại Việt Nam, trước thời điểm nghiên cứu này, chưa có công trình nào công bố việc bào chế liposome BBR hay proliposome BBR ứng dụng dùng đường uống nhằm mục đích hạ lipid máu.

Xuất phát từ thực tiễn đó, luận án tiến sĩ dược học của nghiên cứu sinh Dương Thị Thuấn với đề tài "Nghiên cứu bào chế liposome berberin ứng dụng dùng đường uống" (Chuyên ngành: Công nghệ Dược phẩm và Bào chế thuốc, Mã số: 9720202, thực hiện tại Trường Đại học Dược Hà Nội, bảo vệ năm 2022) được triển khai nhằm giải quyết các mục tiêu cụ thể sau:

1. Xây dựng được công thức và quy trình bào chế liposome berberin và proliposome berberin ở quy mô phòng thí nghiệm.
2. Đánh giá được sinh khả dụng đường uống của liposome berberin và tác dụng hạ lipid máu nội sinh của liposome berberin trên động vật thực nghiệm.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của luận án bao gồm:

• Đối tượng nghiên cứu: Hoạt chất berberin base (độ tinh khiết 98,06%), các tá dược phospholipid (HSPC, DSPG), muối mật (natri deoxycholat - NaDC), chất chống oxy hóa (α-tocopherol), chất mang tan trong nước (manitol), cùng các hệ phân tán liposome BBR và dạng hạt proliposome BBR.
• Phạm vi không gian: Nghiên cứu được thực hiện tại Bộ môn Bào chế, Bộ môn Dược lý, Bộ môn Vật lý – Hóa lý, Bộ môn Công nghiệp Dược và Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia (Trường Đại học Dược Hà Nội); đồng thời có sự phối hợp thực hiện một số thử nghiệm chuyên sâu tại Viện Nghiên cứu Dược (Đại học Tartu, Estonia), Khoa Y Sinh (Đại học Helsinki, Phần Lan) và Viện Vật lý (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam).
• Phạm vi thời gian và mô hình thực nghiệm: Luận án là một phần kết quả thuộc đề tài khoa học công nghệ cấp thành phố Hà Nội (Mã số: 01C-06/04-2020-3), hoàn thành năm 2022. Thử nghiệm dược động học đánh giá sinh khả dụng in vivo được tiến hành trên chuột cống trắng; thử nghiệm tác dụng dược lý hạ lipid máu nội sinh được thực hiện trên chuột nhắt trắng thông qua mô hình gây tăng lipid máu cấp bằng Poloxamer 407 (P-407).

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã tổng quan toàn diện các hướng nghiên cứu trong nước và quốc tế liên quan đến cấu trúc hóa học, tính chất lý hóa, tác dụng dược lý của berberin, công nghệ liposome/proliposome và các phương pháp đánh giá sinh khả dụng cũng như tác dụng hạ lipid máu.

Các hướng nghiên cứu trước đây

Về tác dụng hạ lipid máu và cơ chế phân tử của BBR:

• Kong et al. (2004) [149] và Wang et al. (2004) [82] đã chứng minh BBR liều 50–150 mg/kg làm giảm nồng độ cholesterol tỷ trọng thấp (LDL-C) từ 31–41% và cholesterol toàn phần (TC) từ 29–33% trên chuột cống; giảm LDL-C từ 26–42% trên chuột hamster sau 10 ngày điều trị.
• Gu et al. (2015) [65] ghi nhận mức giảm triglycerid (TG) 34,7% và TC 9% ở liều BBR 380 mg/kg trên chuột cống sau 2 tuần.
• Về cơ chế, các nghiên cứu của Cameron et al. (2008) [42], Li et al. (2009) [86], Abidi et al. (2005) [9] và Brusq et al. (2006) [30] đã làm sáng tỏ khả năng làm ổn định thụ thể LDL-C tại gan thông qua cơ chế kinase điều hòa tín hiệu ngoại bào (ERK) và con đường JNK (c-Jun N-terminal kinase), kết hợp hoạt hóa AMPK (5’-AMP kinase) để ức chế tổng hợp lipid nội sinh và ức chế hấp thu cholesterol tại niêm mạc ruột.

Về sinh khả dụng in vivo của BBR:

• Các nghiên cứu của Zuo et al. (2006) [164] (liều 40 mg/kg), Godugu et al. (2014) [54] (liều 25 mg/kg), Liu et al. (2010) [95] (liều 90 mg/kg), Li et al. (2011) [88] (liều 90 mg/kg) và Chen et al. (2011) [51] (liều 100 mg/kg) trên đối tượng chuột cống đều chỉ ra diện tích dưới đường cong nồng độ - thời gian ($\text{AUC}_{0-36\text{h}}$) rất thấp, thường dưới 100 ng·h/mL, khẳng định sự hấp thu qua đường tiêu hóa của BBR tự do bị hạn chế nghiêm trọng.

Về công nghệ bào chế liposome BBR và proliposome:

• Bào chế liposome BBR: Các tác giả Lin et al. (2013) [92], Nguyen et al. (2014) [110], Shan et al. (2013) [124], Allijn et al. (2017) [15] đã áp dụng các phương pháp hydrat hóa film, tiêm ethanol hoặc bốc hơi pha đảo với các phospholipid như HSPC, SPC, EPC và cholesterol. Kích thước tiểu phân (KTTP) được thu nhỏ bằng phương pháp siêu âm hoặc đùn qua màng polycarbonate (100–400 nm), cho hiệu suất nạp dược chất dao động lớn từ 14% đến 94%.
• Bào chế proliposome dùng đường uống: Bắt đầu từ công trình của Katare et al. (1990, 1991) [75], [76] trên ibuprofen và indomethacin, tiếp nối bởi Janga et al. (2012) [68], Nekkanti et al. (2009) [109], Rojanarat et al. (2011) [116]. Đối với riêng BBR, Jia et al. (2019) [69] đã nghiên cứu bào chế proliposome BBR bằng phương pháp đối dung môi siêu tới hạn (SEDS) trên chất mang lipid HSPC/EPC/cholesterol, cho hàm lượng BBR 9%, hiệu suất nạp 92% và sinh khả dụng tăng gấp 20 lần so với BBR tự do.

Khoảng trống nghiên cứu luận án lựa chọn giải quyết

Mặc dù phương pháp đối dung môi siêu tới hạn của Jia et al. (2019) đạt hiệu quả cao nhưng đòi hỏi thiết bị kỹ thuật phức tạp, chi phí vận hành lớn và khó triển khai phổ biến. Đồng thời, các hệ liposome thông thường dễ bị thủy phân trong dịch tiêu hóa do thiếu cấu trúc bảo vệ đặc hiệu. Luận án đã lựa chọn giải quyết các khoảng trống sau:

• Thiết kế hệ bilosome (liposome tích hợp muối mật natri deoxycholat) sử dụng phospholipid bão hòa có nhiệt độ chuyển pha cao (HSPC, DSPG) nhằm tăng cường độ bền cấu trúc trước tác động của acid dạ dày và enzym tụy.
• Xây dựng quy trình bào chế proliposome BBR dạng rắn bằng phương pháp bao tầng sôi sử dụng chất mang tan trong nước (manitol), một phương pháp có tính khả thi kỹ thuật cao, dễ chuẩn hóa và dễ nâng cấp quy mô (từ 25 g/mẻ lên 200 g/mẻ).
• Thiết lập hệ thống dữ liệu thực nghiệm hoàn chỉnh từ đánh giá trạng thái vi cấu trúc (SEM, TEM, Cryo-EM, CLSM, XRPD, FTIR), thử giải phóng in vitro, độ ổn định hóa lý 6 tháng theo hướng dẫn ICH, đến việc chứng minh đồng thời sự gia tăng sinh khả dụng in vivo trên chuột cống và tác dụng cải thiện 4 chỉ số lipid máu (TC, LDL-C, HDL-C, TG) trên chuột nhắt trắng.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

Luận án dựa trên lý thuyết màng phospholipid kép đồng tâm (lipid bilayer) bao bọc nhân nước của hệ phân tán liposome. Màng liposome được thiết lập từ các phospholipid có nhiệt độ chuyển pha gel – tinh thể lỏng ($T_c$) cao hơn thân nhiệt:

• Hydrogenated soy phosphatidylcholin (HSPC, $T_c \approx 55\text{–}60^\circ\text{C}$).
• Distearoyl phosphatidylglycerol (DSPG, $T_c = 55^\circ\text{C}$, tích điện âm).
• Việc kết hợp natri deoxycholat (NaDC) tạo ra cấu trúc bilosome giúp màng phospholipid đề kháng với sự hòa tan của muối mật nội sinh, tăng cường tính linh động và tăng khả năng thâm nhập qua lớp nhầy niêm mạc ruột.
• Lý thuyết proliposome: Lớp màng lipid chứa dược chất được phân tán đồng nhất dưới dạng màng mỏng bao quanh hạt chất mang manitol. Khi tiếp xúc với nước hoặc dịch tiêu hóa, manitol hòa tan nhanh chóng, giải phóng các phiến màng lipid tự đóng vòng tạo thành các tiểu phân liposome kích thước nanomet.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Luận án là công trình nghiên cứu thực nghiệm công nghệ dược phẩm và dược lý học, kết hợp đồng bộ các kỹ thuật phân tích hóa lý, công nghệ bào chế và đánh giá in vivo:

1. Phương pháp phân tích và thẩm định định lượng:

   • Quang phổ hấp thụ UV-Vis: Sử dụng để định lượng BBR giải phóng trong các phép thử hòa tan/giải phóng in vitro.
   • Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): Định lượng hàm lượng BBR trong nguyên liệu, dịch liposome và chế phẩm proliposome.
   • Sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ (LC-MS/MS): Sử dụng hệ thống đầu dò khối phổ 3 tứ cực với nguồn ion hóa phun điện trường (ESI+), định lượng nồng độ BBR trong huyết tương chuột cống; thẩm định đầy đủ về khoảng tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại, độ chọn lọc và yếu tố nền mẫu (Matrix Factor).

2. Phương pháp bào chế:

   • Bào chế liposome trực tiếp: Khảo sát và so sánh phương pháp tiêm ethanol và phương pháp hydrat hóa màng film (kết hợp thiết bị đùn qua màng polycarbonate kích thước lỗ lọc 400 nm).
   • Bào chế proliposome: Kỹ thuật bao hạt trên thiết bị tầng sôi đáy sấy tầng sôi Mini-Glatt (quy mô 25 g/mẻ) và thiết bị Diosna-minilab (quy mô nâng cấp 200 g/mẻ).

3. Phương pháp đánh giá đặc tính hóa lý:

   • Kích thước tiểu phân (KTTP) và chỉ số đa phân tán (PDI): Đo bằng phương pháp tán xạ ánh sáng động (DLS - Dynamic Light Scattering) trên máy Malvern Zetasizer.
   • Hình thái và cấu trúc vi mô: Kính hiển vi điện tử quét (SEM), kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM), kính hiển vi điện tử đông lạnh (Cryo-EM) và kính hiển vi quét laser đồng tiêu (CLSM).
   • Trạng thái tinh thể và tương tác phân tử: Nhiễu xạ tia X bột (XRPD) và quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR).
   • Hiệu suất nạp dược chất (EE%): Tách dược chất tự do bằng phương pháp thẩm tích qua màng bán thấm hoặc siêu lọc ly tâm.
   • Động học giải phóng in vitro: Sử dụng màng thẩm tích (MWCO 12.000–14.000 Da) trong các môi trường đệm pH 1,2; pH 4,5 và pH 6,8 ở 37°C.
   • Đánh giá độ ổn định: Theo dõi hàm lượng, độ ẩm (mất khối lượng do làm khô), KTTP, PDI và EE% của proliposome sau 6 tháng bảo quản ở điều kiện thực (25 ± 2°C / 60 ± 5% RH) và điều kiện lão hóa cấp tốc (40 ± 2°C / 75 ± 5% RH).

4. Phương pháp đánh giá in vivo trên động vật:

   • Đánh giá dược động học và sinh khả dụng: Tiến hành trên chuột cống trắng uống liều đơn tương đương 100 mg BBR/kg thể trọng (so sánh giữa hỗn dịch liposome BBR và hỗn dịch BBR quy ước). Lấy mẫu máu theo chuỗi thời gian, phân tích nồng độ bằng LC-MS/MS, tính toán các thông số dược động học ($C_{\max}$, $T_{\max}$, $\text{AUC}{0-t}$, $\text{AUC}{0-\infty}$, $\text{MRT}$) theo mô hình không ngăn (non-compartmental analysis).
   • Đánh giá tác dụng hạ lipid máu nội sinh: Chuột nhắt trắng được gây tăng lipid máu nội sinh cấp tính bằng tiêm màng bụng Poloxamer 407 (P-407 liều 500 mg/kg). Điều trị liên tục trong 10 ngày bằng liposome BBR hoặc hỗn dịch quy ước BBR (đối chứng dương: Atorvastatin). Thu huyết thanh xác định hàm lượng TC, LDL-C, HDL-C và TG bằng kit xét nghiệm hóa sinh.

Danh mục nguyên liệu chính	Nguồn gốc	Tiêu chuẩn chất lượng
Berberin base	Trung Quốc (Sichuan Weikeqi)	Nhà sản xuất (98,06%)
Berberin chuẩn đối chiếu	Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương	Chuẩn làm việc (86,2%)
Hydrogenated soy phosphatidylcholin (HSPC)	Đức (Lipoid GmbH)	Nhà sản xuất (>98%)
Distearoyl phosphatidylglycerol (DSPG)	Đức (Lipoid GmbH)	Nhà sản xuất (>98%)
Natri deoxycholat (NaDC)	Hoa Kỳ (Thermo Fisher)	Nhà sản xuất (>98%)
Manitol	Trung Quốc (Damao Co., Ltd)	Nhà sản xuất
Poloxamer 407	Hoa Kỳ (Sigma Aldrich)	Nhà sản xuất
Atorvastatin (Lipitor 20 mg)	Hoa Kỳ (Pfizer)	Nhà sản xuất

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Tổng quan

Chương Tổng quan hệ thống hóa cơ sở lý luận về dược chất berberin, hệ mang thuốc liposome và proliposome dùng đường uống:

• Trình bày công thức phân tử ($\text{C}{20}\text{H}{18}\text{NO}_4^+$), khối lượng phân tử (336,36 g/mol), tính chất hóa lý, độ tan phụ thuộc pH và độ ổn định hóa học của BBR (dễ bị thoái giáng bởi tác nhân oxy hóa, kiềm mạnh hoặc bức xạ tử ngoại).
• Phân tích cơ chế hạ lipid máu của BBR: Tăng biểu hiện thụ thể LDLR tại gan nhờ ổn định mRNA qua con đường ERK/JNK, hoạt hóa AMPK dẫn đến ức chế quá trình sinh tổng hợp acid béo và cholesterol, đồng thời ức chế hấp thu lipid tại đường ruột.
• Tổng kết các rào cản sinh học đối với liposome dùng đường uống (acid dịch vị dạ dày, muối mật, enzym lipase tụy phá hủy màng lipid; tế bào M ở mảng Peyer chỉ chiếm 1% diện tích niêm mạc ruột).
• Phân tích các giải pháp công nghệ: Ứng dụng phospholipid bão hòa có $T_c > 37^\circ\text{C}$, bổ sung muối mật (bilosome) và phát triển dạng rắn proliposome trên chất mang manitol nhằm giải quyết triệt để tính kém bền vững của liposome dạng lỏng.

Chương 2. Nguyên liệu, trang thiết bị, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết thông số các thiết bị, hóa chất và quy trình thực nghiệm:

• Thẩm định phương pháp định lượng BBR trên hệ thống LC-MS/MS: Sử dụng pha động gồm acetonitril và nước (chứa 0,1% acid formic), chế độ rửa giải gradient, ion định lượng ở chế độ ESI+ ($m/z$ chuyển tiếp đặc trưng). Đạt yêu cầu về độ chọn lọc, độ lặp lại và không bị ảnh hưởng bởi nền mẫu huyết tương chuột.
• Quy trình bào chế liposome BBR: Khảo sát các thông số nhiệt độ phối hợp pha, áp suất và nhiệt độ cất quay thu hồi dung môi hữu cơ, số lần đùn qua màng polycarbonate 400 nm.
• Quy trình bào chế proliposome BBR trên thiết bị bao tầng sôi Mini-Glatt và Diosna-minilab: Thiết lập các thông số vận hành buồng tầng sôi gồm nhiệt độ khí vào ($45\text{–}55^\circ\text{C}$), áp suất khí phun ($1,0\text{–}1,5\text{ bar}$), tốc độ bơm dịch phun ($1,0\text{–}2,5\text{ mL/phút}$) và lưu lượng khí thổi.
• Thiết kế các lô thử nghiệm dược động học trên chuột cống (uống liều 100 mg/kg, lấy mẫu máu tại các thời điểm từ 0 đến 36 giờ) và thử nghiệm dược lý trên chuột nhắt trắng gây tăng lipid máu bởi Poloxamer 407.

Chương 3. Kết quả nghiên cứu

Chương 3 trình bày toàn bộ các số liệu thực nghiệm thu được từ quá trình nghiên cứu:

1. Nghiên cứu tiền công thức và bào chế liposome BBR:
   • Kết quả tương tác dược chất - tá dược sau 1 tháng lão hóa cấp tốc xác nhận BBR tương thích hoàn toàn với HSPC, DSPG, NaDC và manitol; không xuất hiện sản phẩm phân hủy bất thường.
   • So sánh hai phương pháp bào chế liposome lỏng: Phương pháp hydrat hóa film kết hợp đùn qua màng 400 nm cho quần thể liposome đồng nhất hơn, chỉ số PDI thấp hơn và hiệu suất liposome hóa (EE%) đạt trên 80%, cao hơn đáng kể so với phương pháp tiêm ethanol đơn thuần.

Thông số đánh giá	Phương pháp tiêm ethanol	Phương pháp hydrat hóa film (sau đùn màng)
Kích thước tiểu phân trung bình (nm)	$185,4 \pm 6,2$	$132,6 \pm 4,1$
Chỉ số đa phân tán (PDI)	$0,285 \pm 0,021$	$0,118 \pm 0,015$
Hiệu suất liposome hóa (EE%)	$62,4 \pm 3,5%$	$84,7 \pm 2,1%$
Cấu trúc vi mô (Cryo-EM)	Liposome đơn lớp/đa lớp không đều	Liposome đơn lớp hình cầu đồng nhất

2. Nghiên cứu bào chế proliposome BBR và nâng cấp quy mô:

   • Tối ưu hóa thành phần công thức proliposome: Tỷ lệ mol tối ưu giữa HSPC : DSPG : NaDC : BBR được xác định giúp màng bao trải đều trên bề mặt manitol, bột tơi xốp, độ trơn chảy tốt.
   • Ảnh chụp SEM cho thấy bề mặt chất mang manitol gồ ghề ban đầu được bao phủ hoàn toàn bởi lớp film phospholipid nhẵn mịn. Phổ XRPD và FTIR khẳng định BBR chuyển sang trạng thái vô định hình phân tán trong cấu trúc lipid.
   • Ảnh chụp CLSM ghi nhận màng film trên hạt proliposome hydrat hóa nhanh chóng và tự đóng vòng tạo liposome trong các môi trường pH 1,2; pH 4,5 và pH 6,8.
   • Nâng cấp quy mô từ 25 g/mẻ (Mini-Glatt) lên 200 g/mẻ (Diosna-minilab): Hiệu suất quy trình đạt trên 90%, độ ẩm < 2,5%, hàm lượng BBR ổn định giữa các mẻ. Liposome hoàn nguyên từ proliposome quy mô 200 g/mẻ có KTTP dao động trong khoảng $140\text{–}160\text{ nm}$, $\text{PDI} < 0,2$ và $\text{EE} > 80%$.
   • Độ ổn định: Sau 6 tháng bảo quản ở điều kiện dài hạn và lão hóa cấp tốc, các chỉ tiêu về độ ẩm, hàm lượng BBR, KTTP và hiệu suất nạp của liposome hoàn nguyên không có sự thay đổi có ý nghĩa thống kê.

3. Kết quả đánh giá sinh khả dụng in vivo:

   • Nồng độ BBR trong huyết tương chuột cống sau khi uống liposome BBR cao hơn rõ rệt tại mọi thời điểm so với nhóm uống hỗn dịch BBR quy ước.
   • Nồng độ đỉnh trong huyết tương ($C_{\max}$) và diện tích dưới đường cong ($\text{AUC}_{0-t}$) của nhóm liposome BBR tăng gấp nhiều lần so với nhóm đối chứng dùng hỗn dịch quy ước, chứng minh sự gia tăng vượt trội về sinh khả dụng đường uống.

Nhóm thử nghiệm (Liều 100 mg/kg)	$C_{\max}$ (ng/mL)	$T_{\max}$ (giờ)	$\text{AUC}_{0-36\text{h}}$ (ng·h/mL)	$\text{MRT}_{0-36\text{h}}$ (giờ)
Hỗn dịch BBR quy ước	$9,82 \pm 2,41$	$2,50 \pm 0,85$	$54,32 \pm 11,25$	$6,14 \pm 1,02$
Hỗn dịch Liposome BBR	$46,75 \pm 8,12$	$1,50 \pm 0,50$	$286,40 \pm 35,60$	$8,45 \pm 1,20$

4. Kết quả đánh giá tác dụng hạ lipid máu nội sinh:
   • Trên mô hình chuột nhắt gây tăng lipid máu bởi P-407, sau 10 ngày điều trị, nhóm dùng liposome BBR thể hiện hiệu quả kiểm soát lipid máu vượt trội so với hỗn dịch BBR quy ước ở cùng mức liều ($p < 0,05$):
     • Cholesterol toàn phần (TC): Giảm có ý nghĩa thống kê so với lô bệnh lý.
     • LDL-C: Giảm mạnh, tiệm cận hiệu quả của nhóm đối chứng dương Atorvastatin.
     • Triglycerid (TG): Giảm rõ rệt.
     • HDL-C (cholesterol có lợi): Tăng có ý nghĩa so với lô mô hình.

Nhóm nghiên cứu	Nồng độ TC (mmol/L)	Nồng độ LDL-C (mmol/L)	Nồng độ TG (mmol/L)	Nồng độ HDL-C (mmol/L)
Chứng sinh học (bình thường)	$2,85 \pm 0,31$	$0,62 \pm 0,08$	$1,15 \pm 0,14$	$1,72 \pm 0,18$
Mô hình bệnh lý (tiêm P-407)	$14,20 \pm 1,45$	$6,85 \pm 0,72$	$8,90 \pm 0,95$	$0,85 \pm 0,11$
Hỗn dịch BBR quy ước	$10,45 \pm 1,12$	$4,92 \pm 0,55$	$6,12 \pm 0,68$	$1,05 \pm 0,12$
Liposome BBR	$5,62 \pm 0,64$	$2,15 \pm 0,28$	$3,25 \pm 0,41$	$1,58 \pm 0,16$
Đối chứng Atorvastatin	$4,85 \pm 0,51$	$1,80 \pm 0,22$	$2,95 \pm 0,35$	$1,65 \pm 0,15$

Chương 4. Bàn luận

Chương Bàn luận phân tích và lý giải các cơ chế khoa học dựa trên kết quả đạt được:

• Bàn luận về việc lựa chọn tá dược: HSPC và DSPG có nhiệt độ chuyển pha cao giúp màng lipid bền vững ở $37^\circ\text{C}$. Việc phối hợp muối mật NaDC giúp tạo cấu trúc bilosome, vừa làm giảm sự phá hủy của dịch tụy, vừa đóng vai trò như chất tăng thấm sinh lý giúp mở rộng con đường hấp thu qua niêm mạc ruột.
• Bàn luận về công nghệ bao tầng sôi: Manitol đóng vai trò giá mang lý tưởng do cấu trúc xốp, diện tích bề mặt riêng lớn, tan nhanh khi tiếp xúc với nước mà không tạo độ nhớt cản trở sự tự đóng vòng của liposome.
• Bàn luận về cải thiện sinh khả dụng và tác dụng dược lý: Sự gia tăng $\text{AUC}$ và $C_{\max}$ in vivo giải thích trực tiếp cho hiệu quả hạ lipid máu vượt trội của liposome BBR trên chuột nhắt trắng, khẳng định hệ mang nano đã đưa được lượng dược chất có hoạt tính vào tuần hoàn lớn hơn nhiều so với dạng thuốc thông thường.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về lý luận và thực tiễn

1. Đóng góp về mặt khoa học (Lý luận):

   • Đã chứng minh được việc phối hợp phospholipid có nhiệt chuyển pha cao (HSPC, DSPG) kết hợp với muối mật (natri deoxycholat) tạo nên cấu trúc bilosome bền vững, bảo vệ berberin tránh khỏi sự giáng hóa trong đường tiêu hóa và nâng cao khả năng vận chuyển dược chất qua hàng rào biểu mô ruột.
   • Làm sáng tỏ cơ chế hydrat hóa và tự đóng vòng của màng phospholipid từ bề mặt hạt mang manitol trong các môi trường pH sinh lý khác nhau thông qua kỹ thuật hiển vi quét laser đồng tiêu (CLSM).
   • Chứng minh trạng thái vô định hình của berberin khi phân tán trong chất mang proliposome qua phân tích XRPD và FTIR, lý giải khả năng hòa tan và giải phóng nhanh của chế phẩm.

2. Đóng góp về mặt thực tiễn (Công nghệ và Ứng dụng):

   • Đã xây dựng hoàn chỉnh công thức và quy trình bào chế proliposome berberin bằng phương pháp bao tầng sôi ở quy mô phòng thí nghiệm (25 g/mẻ trên máy Mini-Glatt) và nâng cấp thành công lên quy mô 200 g/mẻ trên thiết bị Diosna-minilab với độ lặp lại cao và hiệu suất thu hồi lớn (>90%).
   • Xây dựng được dự thảo tiêu chuẩn chất lượng và chứng minh độ ổn định hóa lý của proliposome berberin trong thời gian 6 tháng ở cả điều kiện thường và điều kiện lão hóa cấp tốc theo hướng dẫn của ICH.
   • Thẩm định thành công phương pháp định lượng berberin trong huyết tương động vật bằng LC-MS/MS, áp dụng đánh giá chính xác các thông số dược động học in vivo.
   • Chứng minh dạng bào chế liposome BBR giúp tăng sinh khả dụng đường uống trên chuột cống và tăng cường rõ rệt hiệu lực hạ lipid máu nội sinh (giảm TC, LDL-C, TG và tăng HDL-C) trên chuột nhắt trắng so với dạng berberin quy ước.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

• Tiếp tục nghiên cứu dập viên nén hoặc đóng nang cứng từ hạt proliposome berberin nhằm hoàn thiện dạng thuốc phân liều thương mại tiện dụng cho bệnh nhân.
• Nghiên cứu nâng cấp quy mô sản xuất proliposome ở mức pilot và quy mô công nghiệp trên thiết bị tầng sôi công suất lớn.
• Triển khai các thử nghiệm độc tính bán trường diễn, độc tính trường diễn và thử nghiệm lâm sàng trên người bệnh rối loạn lipid máu nhằm khẳng định giá trị điều trị thực tế của chế phẩm.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế của luận án:
  • Nghiên cứu thực nghiệm dược động học và dược lý mới dừng lại trên đối tượng động vật gặm nhấm nhỏ (chuột cống trắng và chuột nhắt trắng), chưa thử nghiệm trên các loài động vật lớn hơn (như thỏ, chó, khỉ) hoặc trên người.
  • Quy mô bào chế nâng cấp mới đạt mức phòng thí nghiệm mở rộng (200 g/mẻ), chưa tiến hành sản xuất ở quy mô pilot công nghiệp.
  • Chế phẩm dừng lại ở dạng hạt cốm proliposome hoàn nguyên trước khi dùng, chưa hoàn thiện thành dạng viên phân liều cuối cùng (viên nén hoặc nang cứng).
• Hướng nghiên cứu tiếp theo:
  • Tối ưu hóa công thức để đóng nang cứng hoặc dập viên từ hạt proliposome BBR với tá dược trơn chảy và rã phù hợp.
  • Đánh giá độ ổn định dài hạn của chế phẩm dạng viên trong 24–36 tháng.
  • Tiến hành thử nghiệm tiền lâm sàng mở rộng và thử nghiệm lâm sàng giai đoạn 1 trên người tình nguyện khỏe mạnh.

---

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu chuyên khảo có giá trị cao đối với nhiều nhóm đối tượng trong ngành Dược và Y học:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Bào chế - Công nghệ Dược phẩm: Tham khảo quy trình thiết kế công thức hệ phân tán nano lipid, kỹ thuật bao hạt tầng sôi tạo proliposome trên chất mang tan trong nước và các phương pháp đánh giá vi cấu trúc hiện đại (Cryo-EM, CLSM, XRPD, DLS).
• Các nhà nghiên cứu phân tích và kiểm nghiệm thuốc: Tham khảo quy trình xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng alkaloid trong dịch sinh học bằng hệ thống sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần (LC-MS/MS).
• Các nhà dược lý học và nghiên cứu tiền lâm sàng: Tham khảo mô hình gây tăng lipid máu nội sinh cấp tính bằng Poloxamer 407 trên chuột nhắt trắng và quy trình thiết kế thử nghiệm dược động học in vivo trên chuột cống.
• Các doanh nghiệp sản xuất Dược phẩm: Tham khảo các thông số công nghệ bao tầng sôi để định hướng phát triển các sản phẩm nano hóa hoạt chất tự nhiên khó tan nhằm nâng cao giá trị sử dụng và hiệu quả điều trị.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao berberin dạng quy ước dùng đường uống lại có sinh khả dụng rất thấp?

Berberin tự do có sinh khả dụng đường uống dưới 10% do đồng thời chịu tác động của nhiều rào cản: độ tan kém trong môi trường acid dịch vị dạ dày; tính thấm qua màng biểu mô ruột rất thấp; bị chuyển hóa bước đầu mạnh tại tế bào biểu mô ruột; bị hệ thống bơm tống thuốc P-glycoprotein tại niêm mạc ruột bài xuất ngược trở lại lòng ruột; và bị tái bài tiết nhanh qua chu trình gan mật.

2. Thành phần tá dược tạo vỏ liposome trong luận án gồm những chất nào và có vai trò gì?

Thành phần tạo màng bao gồm:

• HSPC (Hydrogenated soy phosphatidylcholin) và DSPG (Distearoyl phosphatidylglycerol): Là các phospholipid bão hòa có nhiệt độ chuyển pha cao ($T_c \approx 55\text{–}60^\circ\text{C}$), giúp màng liposome duy trì trạng thái gel bền vững, không bị phá hủy ở thân nhiệt $37^\circ\text{C}$.
• Natri deoxycholat (NaDC): Muối mật sinh lý được tích hợp vào màng lipid tạo cấu trúc bilosome, giúp chống lại sự hòa tan của muối mật ngoại sinh trong đường ruột và đóng vai trò chất tăng thấm niêm mạc ruột.
• α-tocopherol: Đóng vai trò chất chống oxy hóa bảo vệ màng lipid khỏi sự giáng hóa.

3. Ưu điểm của việc bào chế proliposome bằng phương pháp bao tầng sôi trên chất mang manitol là gì?

Phương pháp bao tầng sôi giúp dung dịch lipid chứa dược chất được phun và sấy khô liên tục thành lớp film mỏng bám đều trên bề mặt hạt manitol. Dạng hạt proliposome rắn khắc phục được hoàn toàn hiện tượng rò rỉ dược chất và bất ổn định hóa lý của hỗn dịch liposome lỏng trong quá trình bảo quản. Khi tiếp xúc với nước, manitol hòa tan tức thì giúp các lớp film lipid hydrat hóa nhanh và tự đóng vòng thành liposome kích thước nanomet đồng đều. Quy trình này dễ kiểm soát thông số, đạt hiệu suất thu hồi cao (>90%) và thuận lợi cho việc nâng cấp quy mô lên 200 g/mẻ.

4. Kết quả đánh giá sinh khả dụng và tác dụng hạ lipid máu của liposome berberin thể hiện như thế nào so với dạng berberin thông thường?

• Về sinh khả dụng in vivo (trên chuột cống trắng, liều 100 mg/kg): Nhóm uống liposome BBR đạt nồng độ đỉnh $C_{\max} = 46,75 \pm 8,12\text{ ng/mL}$ (cao gấp hơn 4,7 lần so với hỗn dịch quy ước là $9,82 \pm 2,41\text{ ng/mL}$) và diện tích dưới đường cong $\text{AUC}_{0-36\text{h}} = 286,40 \pm 35,60\text{ ng}\cdot\text{h/mL}$ (cao gấp hơn 5,2 lần so với hỗn dịch quy ước là $54,32 \pm 11,25\text{ ng}\cdot\text{h/mL}$).
• Về tác dụng hạ lipid máu (trên chuột nhắt trắng tiêm Poloxamer 407): Sau 10 ngày điều trị, liposome BBR làm giảm nồng độ TC, LDL-C, TG và tăng nồng độ HDL-C vượt trội so với hỗn dịch BBR quy ước ở cùng mức liều ($p < 0,05$), đạt hiệu quả tiệm cận với nhóm đối chứng dùng Atorvastatin.

5. Những phương pháp hiển vi hiện đại nào đã được sử dụng để chứng minh vi cấu trúc của liposome và proliposome berberin?

Luận án đã phối hợp 4 kỹ thuật hiển vi chuyên sâu:

• Kính hiển vi điện tử quét (SEM): Quan sát hình thái bề mặt hạt chất mang manitol trước và sau khi bao màng proliposome.
• Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) và Kính hiển vi điện tử đông lạnh (Cryo-EM): Xác nhận hình thái hạt cầu và cấu trúc màng phospholipid đơn lớp của liposome sau khi hoàn nguyên.
• Kính hiển vi quét laser đồng tiêu (CLSM): Ghi nhận trực tiếp quá trình hydrat hóa và tự đóng vòng của màng film lipid trên hạt proliposome trong các môi trường pH 1,2; pH 4,5 và pH 6,8.

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ của Dương Thị Thuấn đã xây dựng thành công công thức và quy trình công nghệ bào chế hệ phân tán liposome berberin và hạt proliposome berberin trên chất mang manitol bằng phương pháp bao tầng sôi ở quy mô phòng thí nghiệm và nâng cấp thành công lên quy mô 200 g/mẻ. Bằng việc kết hợp hệ phospholipid có nhiệt độ chuyển pha cao và muối mật natri deoxycholat, chế phẩm proliposome thu được có độ ổn định hóa lý tốt trong 6 tháng, dễ dàng hoàn nguyên thành các tiểu phân bilosome kích thước nanomet ($140\text{–}160\text{ nm}$). Nghiên cứu đã chứng minh dạng bào chế mới giúp cải thiện vượt trội sinh khả dụng đường uống trên chuột cống trắng và nâng cao rõ rệt hiệu lực hạ lipid máu nội sinh trên chuột nhắt trắng so với dạng thuốc berberin thông thường, đóng góp cơ sở khoa học và thực tiễn quan trọng cho việc phát triển các dạng thuốc mới từ berberin.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Sử dụng thuốc qua đường uống cho đến nay vẫn là sự lựa chọn hàng đầu cho bệnh nhân bởi dễ sử dụng, dễ kiểm soát liều, thuận lợi trong điều trị các bệnh mạn tính, giảm chi phí. Tuy nhiên, một số thuốc không thể sử dụng được đường uống bởi tính thấm kém, độ tan thấp, không ổn định trong đường tiêu hóa và bị cơ chế bơm ngược thuốc. Vượt qua các rào cản đó là một trong những thách thức lớn cho hệ đưa thuốc qua đường uống [58], [157]. Một số biện pháp đã sử dụng để cải thiện sinh khả dụng đường uống, trong đó có liposome, được biết đến như là một hệ mang thuốc tương đồng sinh học, làm tăng sinh khả dụng cho nhiều dược chất [4].

Kể từ khi được phát minh bởi Bangham và Horne vào năm 1964 [21] cho đến nay, liposome - hệ mang dược chất tiềm năng- đã được nghiên cứu rộng rãi qua các đường dùng khác nhau như đường uống, đường tiêm, đường xông hít, đường nhỏ mũi, mắt và hấp thu qua da [60], [141]. Gần đây, nhiều nghiên cứu mới cho thấy BBR có tiềm năng cao trong điều trị một số bệnh như: tăng lipid máu [82], tiểu đường [156], nhồi máu cơ tim [15]. Đặc biệt, nhiều nghiên cứu đã công bố tác dụng hạ lipid máu của BBR rất đáng chú ý trên động vật thí nghiệm [82], [149] và trên người khi sử dụng liều cao 500 mg x 2-3 lần/ngày [41], [82]. Tuy nhiên, để có tác dụng này, BBR cần được hấp thu vào tuần hoàn.

Trong khi đó, BBR bị hạn chế bởi sinh khả dụng đường uống kém (dưới 10%) do BBR có tính thấm kém, bị chuyển hóa lần đầu ngay tại ruột, bị ảnh hưởng bởi bơm tống thuốc có trên bề mặt niêm mạc ruột, bị tái bài tiết bởi chu trình gan mật [97], [142], [161]. Việc sử dụng BBR dạng thuốc truyền thống qua đường uống với liều cao để điều trị đã dẫn đến những tác dụng không mong muốn, biểu hiện trên đường ruột như: tiêu chảy, táo bón, đau bụng [156]. Những hạn chế về sinh khả dụng đường uống của BBR có thể được khắc phục bằng sử dụng hệ mang dược chất liposome. Mặc dù BBR có tiềm năng lớn nhưng hiện nay chưa có nghiên cứu nào trong nước về bào chế liposome BBR ứng dụng đường uống để hạ lipid máu.

Vì vậy, cần thiết phải nghiên cứu bào chế liposome BBR nhằm phát triển dạng bào chế mới, có 1 tiềm năng tăng giá trị sử dụng của BBR. Do đó, đề tài: “Nghiên cứu bào chế liposome berberin ứng dụng dùng đường uống” được thực hiện với 2 mục tiêu sau: 1. Xây dựng được công thức và quy trình bào chế liposome berberin và proliposome berberin ở quy mô phòng thí nghiệm. Đánh giá được sinh khả dụng đường uống của liposome berberin và tác dụng hạ lipid máu nội sinh của liposome berberin trên động vật thực nghiệm.

Nguồn gốc Berberin (BBR) là một isoquinolin alkaloid bậc 4, được chiết xuất từ rễ, thân rễ và vỏ của một số loài thuộc chi Berberis, họ Hoàng liên gai (Berberidaceae) hoặc một số loài khác thuộc các chi Coptis, Hydrastis, Thlictrum, họ Mao lương (Ranunculaceae) [3], [108], [158]. Ngày nay, BBR đã được tổng hợp và sử dụng rộng rãi trong ngành Dược. Công thức - Công thức phân tử: C20H18NO4+ - Khối lượng phân tử: 336,36 g/mol - Tên khoa học: 5,6-Dihydro-9,10-dimethoxybenzo[g]1,3-benzodioxolo [5,6- a] quinolizinium [165]. - Công thức cấu tạo: Hình 1.

Công thức cấu tạo của berberin - Các dạng được sử dụng: berberin base, berberin clorid, berberin sulfat. Tính chất vật lý - Hình thức: tinh thể hay bột kết tinh màu vàng, không mùi, vị rất đắng - Độ tan: Trong môi trường nước, BBR có độ tan 5,27 mM ở 25 oC và 8,5 mM ở 37 oC. Trong môi trường đệm phosphat pH 7,0, BBR có độ tan ở 25 oC và 37oC lần lượt là 4,05 mM và 9,69 mM. Trong môi trường dung dịch acid HCl pH 1,2 và dung dịch đệm phosphat pH 5,0, độ tan thấp hơn 20 lần so với môi trường đệm phosphat pH 7,0 [24].

3 - Nhiệt nóng chảy: 204 - 206 oC - LogP: -1,5 [24]. - Log Dow : - 4,2 ở pH 4,0; -1,03 ở pH 7,3; -0,09 ở pH 10,2 [128]. - Có khả năng phát quang khi kích thích ở bước sóng 350 nm [47]. Tính chất hóa học - Ở vị trí N của berberin không bền trong môi trường kiềm mạnh, tham gia phản ứng mở vòng isoquinolin.

- Liên kết C=N+ trong cấu trúc phân tử berberin dễ bị tác nhân ái nhân tấn công để tạo các dẫn xuất ở vị trí C8 như 8-dihydroberberin hoặc 8- acetonyldihydroberberin [140]. - Có cấu trúc phân tử lưỡng cực tạo ra bởi ion N+ làm thuận lợi cho tương tác lưỡng cực với các phân tử khác. Vì vậy, bất cứ chất nào liên kết với BBR đều cho phổ phát xạ huỳnh quang với cường độ khác nhau [47]. Định tính và định lượng Theo chuyên luận “Berberin clorid” trong Dược điển Việt nam V [2], BBR có thể định tính bằng phổ hồng ngoại hoặc phương pháp hóa học dựa trên sự xuất hiện tủa hoặc màu sắc phù hợp với thuốc thử đặc trưng.

Hàm lượng BBR trong nguyên liệu hoặc trong chế phẩm bào chế có thể định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Định lượng dược chất giải phóng từ chế phẩm bào chế trong phép thử độ hòa tan bằng phương pháp đo phổ hấp thụ UV-Vis. Độ ổn định BBR khá ổn định trong các dung dịch đệm có pH khác nhau. Nghiên cứu của Battu và cộng sự cho thấy, khi bảo quản các dung dịch BBR trong các môi trường đệm với nồng độ đệm 0,2 mM (đệm borat pH 9,0, đệm phosphat pH 7,0, đệm phtalat pH 5,0 và 3,0, và dung dịch acid HCl pH 1,2 ) ở 2 điều kiện nhiệt độ 25 oC và 40 oC trong 6 tháng giảm ít hơn 5% hàm lượng dược chất so với ban đầu [24].

Nhưng BBR bị giáng hóa trong thời gian từ 2-6 giờ sau khi phơi nhiễm với các yếu tố môi trường khắc nghiệt như tia tử ngoại, chất oxy hóa, dung dịch HCl 1N, dung dịch NaOH 1N ở nhiệt độ 80 oC [53]. Tác dụng dược lý Tác dụng truyền thống của BBR là kháng khuẩn và các ký sinh trùng đường 4 ruột như lỵ amip, E. Coli, dùng điều trị tại chỗ các bệnh đường tiêu hóa như đau bụng, tiêu chảy [3], [140]. Ngày nay, có nhiều nghiên cứu in vitro và in vivo cho thấy BBR dạng clorid có nhiều tác dụng dược lý tiềm năng như làm giảm đường huyết [14], [37], [151], [156], chống xơ vữa động mạch [38], bảo vệ nội mô [95], [147], [152], bảo vệ thận [45], [111], bảo vệ gan [48], [162], bảo vệ tim trong suy tim và thiếu máu cục bộ [34], [112], điều hòa miễn dịch [89], [96], [105], chống oxy hóa [13], [129], ức chế tế bào ung thư [93], [148], [159].

Tác dụng làm giảm lipid máu của BBR được khẳng định trong nhiều nghiên cứu trên động vật. Trên chuột cống, BBR ở cả 3 mức liều 50mg/kg, 100mg/kg và 150mg/kg làm giảm cholesterol tỉ trọng thấp (LDL-C) ở mức 31-41%, giảm cholesterol toàn phần (TC) 29-33% so với nhóm chứng sau 8 tuần điều trị. Mức giảm không có sự khác biệt giữa các liều [149]. Trong lúc đó, trên chuột hamster, tỉ lệ giảm LDL-C ở mức liều 50 mg/kg là 26% và ở mức liều 100 mg/kg là 42% so với nhóm chứng sau 10 ngày điều trị [82].

Với mức liều BBR 380mg/kg trên chuột cống sau 2 tuần điều trị, mức giảm triglycerid (TG) và TC lần lượt là 34,7% và 9% so với nhóm chứng [65]. Một nghiên cứu khác trên chuột cống ở mức liều 200mg/kg cho thấy, nồng độ TC và LDL-C trong máu cũng giảm có ý nghĩa thống kê sau thời gian điều trị 16 tuần [35]. Trên chuột nhắt ở liều 250mg/kg (tương đương với liều 125mg/kg trên chuột cống) sau 4 tuần điều trị, BBR làm giảm TC và TG lần lượt là 41,7% và 41,9% so với nhóm chứng một cách có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) [160]. Như vậy, BBR ở mức liều từ 50mg/kg có thể làm giảm đồng thời hoặc riêng lẻ nồng độ TC, LDL-C và TG trong máu chuột cống và chuột hamster.

Cơ chế làm giảm lipid máu chính nhờ làm ổn định thụ thể LDL-cholesterol (LDL-C) ở gan bằng con đường điều hòa tín hiệu ngoại bào phụ thuộc kinase, và cũng làm tăng hoạt động phiên mã của chất mồi LDLR qua con đường JNK (c-Jun N terminal kinase) làm tăng biểu hiện và tuổi thọ của thụ thể LDL, do đó làm tăng quá trình thực bào LDL [9], [42], [86]. Ngoài điều chỉnh LDLR, BBR còn hoạt hóa 5’- AMP kinase (AMPK) trong khi chặn con đường hoạt hóa protein mitogen kinase (Mitogen-actived protein kinase-MAPK)/ERK (Extracellular signal-regulated kinase). Kết quả là ức chế tổng hợp lipid [30]. Cơ chế làm giảm lipid máu của BBR 5 được tóm tắt ở sơ đồ sau (hình 1.

Cơ chế làm giảm lipid máu của berberin (BBR)[42]. Ngoài cơ chế tại gan, BBR còn làm giảm lipid máu bằng cách ức chế hấp thu cholesterol ở ruột [149]. Với kết quả từ những nghiên cứu trên, có thể thấy rằng BBR có tác dụng làm giảm lipid máu một cách hiệu quả trên động vật thí nghiệm. Sinh khả dụng Tuy BBR có nhiều tác dụng dược lý tiềm năng, nhưng sinh khả dụng đường uống của BBR được báo cáo là thấp (dưới 10%) [161].

Trên động vật, BBR có nồng độ tối đa trong huyết tương (Cmax) là 4 ng/ml sau khi uống liều 100mg/kg chuột cống, AUC0-48h=57,9 ±20,6 ng. Cũng với liều uống này trên chuột cống, một nghiên cứu khác công bố Cmax = 9,48 ± 3,40 ng/ml, Tmax= 2,60 ± 1,14 h, AUC0- 36h=56,5 ±12,8 ng. Khái niệm, thành phần cấu tạo Liposome là những túi nhỏ hình cầu, chứa một hoặc nhiều lớp phospholipid kép đồng tâm bao bọc ngăn nước ở giữa hoặc ngăn cách bởi các ngăn nước, có kích thước thay đổi từ hàng chục đến hàng ngàn nanomet [4], [10]. Thành phần cấu tạo của liposome bao gồm lớp vỏ phospholipid và dược chất.

Ngoài ra còn có các thành phần khác [4], [64] (hình 1. Sơ đồ minh họa đại diện thành phần cấu tạo của liposome [127] Lớp vỏ liposome: Lớp vỏ liposome được cấu tạo phổ biến nhất từ hai thành phần phospholipid và cholesterol [4], [64]. Phospholipid: Phospholipid cũng là thành phần chính cấu tạo nên màng tế bào. Phospholipid dùng bào chế liposome chủ yếu có hai loại là glycerophosphat và sphinomyelin.

Phospholipid có thể tạo thành lớp lipid kép bởi đặc tính lưỡng tính của loại phospholipid gồm đuôi kỵ nước cấu tạo bởi hai chuỗi các acid béo và một đầu thân nước có chứa nhóm phosphat [12], [64]. Một số phospholipid thường dùng để bào chế liposome được trình bày ở bảng 1.