ĐẶT VẤN ĐỀ Trong thời gian gần đây, công nghệ nano đã thể hiện được tiềm năng trong cải thiện nhiều đặc tính của dược chất, bao gồm cải thiện độ tan của dược chất ít tan, tăng cường tốc độ hoà tan, tăng sinh khả dụng của các thuốc nói chung, ngoài ra còn có tác dụng bảo vệ dược chất, tăng tính hướng đích, kiểm soát giải phóng khi bao gói dược chất trong các chất mang phù hợp [7], kể cả gây tác dụng hiệp đồng với các hệ phối hợp nhiều thành phần có hoạt tính [3, 56]. Trong các phương pháp bào chế tiểu phân nano, nghiền bi là một trong những phương pháp đơn giản, có hiệu quả tương đối cao và phù hợp với nhiều dược chất, hoạt chất có đặc tính lý hoá khác nhau [59]. Do vậy, việc ứng dụng phương pháp nghiền bi để bào chế và phối hợp tiểu phân nano của nhiều thành phần có hoạt tính là hoàn toàn khả thi. Đề tài lựa chọn hai chất mô hình là andrographolid và betaglucan đều có tác dụng kích thích miễn dịch nhưng có tính chất vật lý, hoá lý khác nhau để nghiên cứu tiềm năng của phương pháp nghiền bi trong giảm kích thước tiểu phân hoạt chất.
Andrographolid (ADG) (KLPT 350,4 g/mol) là thành phần có hoạt tính sinh học chính trong xuyên tâm liên (Andrographis paniculata Wall. Nees, thuộc họ Ô rô Acanthaceae) được biết tới với nhiều tác dụng sinh học, trong đó khả năng kích thích miễn dịch hệ thống đang ngày càng được quan tâm hơn [17, 18, 45, 80, 83, 91]. Tuy nhiên, việc sử dụng ADG bằng đường uống còn hạn chế do ADG gặp vấn đề về độ tan, độ hoà tan, khả năng thấm, dẫn tới sinh khả dụng tương đối thấp [118]. Phản ứng miễn dịch của betaglucan không hoà tan được khởi động ở ruột bởi các tế bào miễn dịch trong mảng Peyer’s [19].
Tuy nhiên, betaglucan thô thường yêu cầu lượng sử dụng tương đối lớn để phát huy tác dụng do chưa có kích thước phù hợp để tế bào M ở mảng Peyer’s bắt giữ [33]. Việc bào chế và phối hợp ADG và betaglucan ở dạng tiểu phân nano có thể giúp giải quyết đồng thời các vấn đề của cả hai thành phần, đồng thời tạo điều kiện đánh giá tác dụng hiệp đồng trên miễn dịch của chúng. Vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Bước đầu ứng dụng phương pháp nghiền bi trong bào chế hệ nano andrographolid và betaglucan” với các mục tiêu: 1. Phát triển phương pháp nghiền bi để bào chế tiểu phân nano andrographolid và nano betaglucan.
Đánh giá một số đặc tính của hệ tiểu phân nano andrographolid và betaglucan. Tổng quan về andrographolid 1. Nguồn gốc và cấu trúc hoá học ADG là thành phần diterpen lacton chính trong xuyên tâm liên (Andrographis paniculata Wall. Nees, thuộc họ Ô rô Acanthaceae).
Bên cạnh ADG, một số thành phần diterpen lacton khác trong xuyên tâm liên cũng thể hiện hoạt tính sinh học như neoandrographolid, 14-deoxy-11,12-didehydroandrographolid, trong đó, ADG có hoạt tính sinh học nổi trội nhất [12, 50]. Cấu trúc phân tử của ADG được thể hiện ở hình 1. Cấu trúc hoá học của ADG Tên khoa học: (3E,4S)-3-[2-[(1R,4aS,5R,6R,8aS)-6-hydroxy-5-(hydroxymethyl)- 5,8a-dimethyl-2-methylidene-3,4,4a,6,7,8-hexahydro-1H-naphthalen-1-yl]ethylidene]-4- hydroxyoxolan-2-one. Công thức phân tử: C20H30O5, khối lượng phân tử: 350,4 g/mol.
Tính chất lý hoá Cảm quan: bột kết tinh trắng hoặc tinh thể hình kim, không màu, không mùi, vị đắng [117]. Độ tan: ADG tan trong ethanol sôi, ít tan trong aceton, methanol, ethanol, butan-1- ol, rất ít tan trong CHCl3, hầu như không tan trong nước [24, 117]. ADG nóng chảy ở 230-231°C [20]. Phổ hồng ngoại: ADG có đỉnh hấp thụ ở số sóng 1727 cm–1 tương ứng với nhóm carbonyl trong vòng α, β–lacton không no và 1672 cm–1 tương ứng với liên kết C=C liên hợp [20].
ADG có thể được định lượng bằng nhiều phương pháp khác nhau, chẳng hạn như phương pháp tạo màu với thuốc thử Kedde [1], sắc kí lỏng hiệu năng cao [100, 122]. Độ ổn định: do có cấu trúc ester nội phân tử, ADG dễ bị thuỷ phân, mở vòng và đồng phân hoá trong dung dịch nước. Ở nhiệt độ thấp, độ ổn định của ADG tăng lên. ADG kém ổn định nhất trong môi trường kiềm, ở pH càng cao, ADG càng kém ổn định.
Ngoài ra, ADG có thể bị thuỷ phân chậm trong điều kiện acid mạnh, còn bền vững trong môi trường trung tính và acid yếu [117]. Tác dụng kích thích miễn dịch Xuyên tâm liên và ADG đã được chứng minh có tác dụng tăng cường miễn dịch trên các mô hình thực nghiệm khác nhau. Hỗn hợp chứa ADG và một số dẫn chất khác như 14-deoxyandrographolid, 14-deoxy-11,12-didehydroandrographolid có tác dụng kích thích miễn dịch, hồi phục hệ miễn dịch bị suy giảm do cyclophosphamid [91]. Cao xuyên tâm liên đã được báo cáo có khả năng kích thích phản ứng miễn dịch tự nhiên ở chuột, thông qua việc xác định chỉ số di chuyển của đại thực bào, khả năng thực bào E.
coli đánh dấu bằng leucin và sự tăng sinh của tế bào lympho lách [80]. Cơ chế kích thích miễn dịch của ADG có liên quan tới hệ thống bạch cầu lympho trong máu ngoại vi: thông qua khả năng kích thích tiết cytokin Th1, hoạt hoá IL2 và TNF-α, ADG làm tăng số lượng tế bào bạch cầu lympho T, tăng cường biệt hoá tế bào T, tăng biểu hiện yếu tố định hướng CD3, CD4, CD8 và CD56 trên bạch cầu lympho, tăng cường hoạt động của tế bào diệt tự nhiên, đặc biệt trên những bệnh nhân bị suy giảm miễn dịch [45, 83]. Trên lâm sàng, ADG cho thấy tác dụng làm giảm tỉ lệ mắc các bệnh viêm đường hô hấp trên và cảm lạnh so với nhóm dùng giả dược, và cũng làm giảm mức độ nghiêm trọng của các triệu chứng viêm đường hô hấp [17, 18], đặc biệt là từ ngày thứ ba tới ngày thứ năm của bệnh [90]. Tác dụng khác Xuyên tâm liên và ADG cũng đã được nghiên cứu về tác dụng chống viêm.
ADG có khả năng ức chế hoạt tính NF-κB luciferase, IL-6, MIP-2 và sự tiết NO dưới sự kích thích tiết của LPS trên mô hình tế bào Raw264. Dịch chiết trong chloroform thể hiện hoạt tính chống viêm mạnh trong 6 giờ khi sử dụng liều 200 mg/kg trên mô hình chuột cống gây viêm bằng carrageenan [75]. Ảnh hưởng của ADG đối với sự tiết yếu tố hoại tử u TNF-α thì phức tạp hơn, trong trường hợp kháng viêm, ADG có xu hướng ức chế TNF-α từ ổ viêm [22, 109], ngược lại với tác dụng kích thích miễn dịch ở những trường hợp suy giảm miễn dịch như đã trình bày ở mục 1. ADG còn được biết tới với nhiều tác dụng khác trên mô hình in vitro như kháng virus [54], kháng khuẩn [94, 120], chống oxy hoá [91, 114], kháng ung thư [60, 83].
Trên mô hình in vivo, ADG đã được nghiên cứu về tác dụng hỗ trợ điều trị đái tháo đường [84, 121], bảo vệ đường tiêu hoá [74], bảo vệ gan [39], bảo vệ tim mạch [115]. Trên lâm sàng, bên cạnh các bệnh viêm đường hô hấp trên, ADG còn được thử nghiệm trên bệnh nhân viêm khớp dạng thấp và viêm đại tràng, thu được kết quả khả quan [16, 98]. Gần đây, các thí nghiệm mô phỏng in silico cũng cho thấy ADG có tiềm năng ức chế một số protein quan trọng của virus SARS-CoV-2 [32, 44]. Đặc điểm hấp thu của andrographolid 3 Mặc dù có nhiều tác dụng sinh học nhưng ADG chưa được sử dụng rộng rãi trong điều trị do sinh khả dụng tuyệt đối của ADG tương đối thấp, chỉ khoảng 2,67% theo đường uống [118].
Vị trí hấp thu tối ưu của ADG là tá tràng và hỗng tràng, tuy nhiên một số nghiên cứu cho thấy tốc độ hoà tan của ADG trong các mẫu cao dược liệu thường tương đối chậm [119], vì vậy, nồng độ thuốc không đạt được giá trị tối ưu tại vùng hấp thu. Mặt khác, tại đó, dưới tác dụng của enzym liên hợp sulfat, ADG bị chuyển hoá thành 14-deoxy-12-sulfoandrographolid tồn tại ở dạng ion hoá cũng làm giảm hấp thu. Khi xuống tới các vùng hỗng tràng-hồi tràng, ADG vẫn có khả năng thấm vào tế bào biểu mô ruột, nhưng bị bơm ngược trở lại lòng ruột bởi các kênh vận chuyển như P-gp và Bcrp [118]. Độ tan tương đối thấp của ADG [24] cũng là yếu tố ảnh hưởng tới sinh khả dụng.
Mặt khác, cấu trúc vòng lacton trong ADG có thể bị thuỷ phân dưới tác dụng của acid mạnh, kiềm mạnh hoặc các enzym thuỷ phân lacton (bản chất là các esterase) [117], như vậy môi trường dịch vị với pH acid và enzym thuỷ phân có thể là yếu tố bất lợi đối với độ ổn định của ADG. Tuy nhiên, nghiên cứu của Ye và cộng sự cho thấy môi trường dịch vị ít ảnh hưởng tới ADG và đây có lẽ không phải là nguyên nhân dẫn tới sinh khả dụng thấp của hoạt chất này [118]. Tổng quan về betaglucan 1. Nguồn gốc và cấu trúc hoá học -glucan (betaglucan) là nhóm hợp chất đường đa được tạo nên từ các đơn phân D- glucose gắn với nhau qua liên kết -glucosid được tìm thấy trong nhiều loại thực phẩm như yến mạch, lúa mạch, nấm men, nấm [48].
Tuỳ thuộc vào nguồn gốc, đặc điểm liên kết glucosid trong phân tử betaglucan có sự khác biệt: Bảng 1. Nguồn gốc và đặc điểm mạch của một số betaglucan [19] Khả năng tan Nguồn gốc Mạch chính Mạch nhánh Liên kết nhánh trong nước Vi khuẩn Chuỗi β-1,3 Không Không Không tan Chuỗi β-1,3 Nấm Chuỗi β-1,3 β-1,6 Không tan rất ngắn Chuỗi β-1,3 Nấm men Chuỗi β-1,3 β-1,6 Không tan dài hơn Ngũ cốc Chuỗi β-1,3-1,4 Không Không Tan Loại betaglucan được sử dụng trong đề tài là -(1,3-1,6)-D-glucan không hoà tancó nguồn gốc từ nấm men S. Công thức phân tử: (C6H10O5)n, khối lượng phân tử 65-3100103 g/mol. 4 Cấu trúc bậc 1 (cấu trúc hoá học) của β-(1,3-1,6)-D-glucan bao gồm mạch chính là mạch β-(1,3)-D-glucan, mạch nhánh là mạch β-(1,3)-D-glucan được nối với mạch chính thông qua liên kết β-(1,6)-glycosid [108].
Cấu trúc bậc một của betaglucan được thể hiện ở hình 1. Cấu trúc hoá học của β-(1,3-1,6)-D-glucan 1. Tính chất lý hoá Cảm quan và độ tan: bột màu vàng nhạt, không tan trong nước và ethanol, tan trong một số dung môi hữu cơ như DMSO [5, 26]. Nhiệt độ nóng chảy: 150C [95].
Tính chất hoá học: với bản chất polysaccharid, betaglucan bị thuỷ phân chậm trong môi trường acid, bao gồm cả việc phá vỡ liên kết 1,3-glycosid và 1,6-glycosid. Thuỷ phân hoàn toàn betaglucan cho monomer là D-glucose [96]. Định lượng: hiện nay phương pháp định lượng phổ biến của betaglucan là phương pháp enzym. Nguyên tắc của phương pháp này là sử dụng enzym thuỷ phân đặc hiệu liên kết glycosid trong betaglucan để tạo thành monomer là glucose, sau đó định lượng glucose thông qua một phản ứng enzym khác [27] hoặc qua sắc ký lỏng hiệu năng cao [77].
Ngoài ra, còn có thể sử dụng phương pháp đo màu [72].