Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Progesteron (PGT) là một hormon steroid nội sinh giữ vai trò thiết yếu trong việc điều hòa chức năng sinh sản ở nữ giới, được chỉ định phổ biến trong điều trị dọa sảy thai, sảy thai liên tiếp, rối loạn kinh nguyệt, hỗ trợ sinh sản và liệu pháp hormon thay thế. Tuy nhiên, progesteron có độ tan trong nước rất thấp (7,00 – 8,81 mg/l), tính thấm hạn chế và chịu sự chuyển hóa bước đầu rất mạnh tại gan (khoảng 60 – 65% bởi enzym 5α-reductase), dẫn đến sinh khả dụng (SKD) theo đường uống chỉ đạt khoảng 2,4%.

Để khắc phục rào cản về độ tan, các hệ phân phối thuốc dựa trên lipid (LBFs), đặc biệt là hệ nano tự nhũ hóa (SNEDDS), đã được nghiên cứu nhằm tăng độ hòa tan của dược chất lên nhiều lần. Mặc dù vậy, khi đưa vào đường tiêu hóa, cấu trúc vật lý và hóa học của hệ SNEDDS bị biến đổi mạnh mẽ dưới tác động của dịch tụy (pancreatin) và muối mật, làm phát sinh nguy cơ tái kết tinh hoặc kết tủa dược chất, ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu suất hấp thu. Mặt khác, các phương pháp thử độ hòa tan in vitro truyền thống theo Dược điển (thiết bị giỏ quay hay cánh khuấy USP I, II) không phản ánh được quá trình chuyển hóa lipid này. Nhằm đánh giá chính xác số phận của dược chất trong đường tiêu hóa, việc thiết lập mô hình ly giải lipid in vitro (in vitro lipolysis) là bước đi cần thiết nhưng chưa được thực hiện đầy đủ tại Việt Nam. Đồng thời, dạng bào chế nang mềm gelatin chứa hệ SNEDDS còn mở ra tiềm năng tận dụng chính vỏ gelatin để ức chế quá trình tái kết tinh của progesteron.

Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ của tác giả Nguyễn Thanh Tùng (Trường Đại học Dược Hà Nội, 2022) xác định 3 mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

  1. Nghiên cứu hoàn thiện công thức bào chế hệ nano tự nhũ hóa (SNEDDS) thông qua đánh giá quá trình ly giải lipid in vitro.
  2. Nghiên cứu bào chế viên nang mềm chứa SNEDDS progesteron bằng phương pháp nhúng khuôn và đánh giá tác dụng ức chế tái kết tinh dược chất của gelatin.
  3. Nghiên cứu so sánh in vivo của hệ nano tự nhũ hóa chứa progesteron với viên đối chiếu (Utrogestan® 100 mg) và mẫu nguyên liệu trên mô hình động vật thỏ.

Đối tượng nghiên cứu bao gồm: dược chất progesteron chuẩn và nguyên liệu, các tá dược tạo hệ tự nhũ hóa (acid oleic, Tween 80, ethanol), tá dược làm vỏ nang mềm (gelatin, glycerin, nipagin, nipasol), chế phẩm đối chiếu Utrogestan® 100 mg (Besins, Pháp) và động vật thực nghiệm (thỏ trắng giống đực trưởng thành, trọng lượng 2 – 3 kg). Nghiên cứu được thực hiện tại Bộ môn Bào chế - Trường Đại học Dược Hà Nội và Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia trong giai đoạn 2020 – 2022.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng các cơ sở lý thuyết dược học và mô hình đánh giá hiện đại:

  • Hệ thống phân loại công thức lipid (Lipid Formulation Classification System - LFCS): Áp dụng phân loại của C. Pouton (Nhóm I đến Nhóm IV) để định hình công thức SNEDDS thuộc nhóm tự nhũ hóa, có khả năng tạo thành các giọt nano nhũ tương kích thước từ 100 – 250 nm khi tiếp xúc với môi trường nước.
  • Cơ chế hấp thu thuốc thân lipid và vận chuyển qua hệ bạch huyết: Thuốc ưa lipid (log P > 5, hoặc có độ tan cao trong lipid chuỗi dài) sau khi nhũ hóa và phân cắt thành các micell hỗn hợp sẽ gắn với các phân tử lipoprotein (chylomicron) tại mạng lưới nội chất của tế bào biểu mô ruột, vận chuyển vào mạch bạch huyết để đi thẳng vào tuần hoàn chung, tránh được chuyển hóa qua gan lần đầu.
  • Mô hình ly giải lipid in vitro một ngăn (pH-stat dynamic lipolysis model): Mô phỏng quá trình tiêu hóa tại ruột non trong môi trường đệm Tris maleat 2 mM (pH 6,5), NaCl 150 mM, CaCl2.2H2O 1,4 mM, muối mật natri taurodeoxycholat (NaTDC) 3 mM, phospholipid (PC) 0,75 mM và dịch chiết pancreatin từ tụy lợn (hoạt độ lipase ≥ 800 U/ml). Quá trình giải phóng acid béo tự do được theo dõi liên tục thông qua lượng dung dịch NaOH 0,2 M tiêu tốn để duy trì pH cố định ở 6,5.

Các phương pháp thực nghiệm chính bao gồm:

  • Phương pháp bào chế: Bào chế hệ SNEDDS bằng kỹ thuật phối hợp và khuấy đồng nhất từ tính; bào chế vỏ nang mềm bằng phương pháp nhúng khuôn kim loại ở quy mô phòng thí nghiệm và đóng dịch nhân bằng bơm tiêm định lượng, hàn nhiệt.
  • Phương pháp phân tích - hóa lý:
    • Định lượng progesteron in vitro bằng phương pháp HPLC (thiết bị Shimadzu, cột Agilent C18 250 x 4,6 mm, 5 µm; pha động methanol : nước cất tỉ lệ 80:20 v/v; detector UV 254 nm; tốc độ dòng 1,0 ml/phút).
    • Đo kích thước giọt và chỉ số đa phân tán (PDI) bằng thiết bị đo tán xạ ánh sáng động Zetasizer Nano ZS90 (Malvern, Anh).
    • Đánh giá khả năng ức chế kết tinh bằng phương pháp thay đổi dung môi (solvent shift method), đo kích thước tủa trên thiết bị Mastersizer 3000E và tính toán mức độ siêu bão hòa (DS).
    • Phân tích tương tác liên kết giữa progesteron và gelatin bằng quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR 6700) với kỹ thuật dập viên KBr trong dải sóng 600 – 4000 cm⁻¹.
    • Thử độ giải phóng in vitro trên thiết bị cánh khuấy Erweka-DT trong môi trường đệm phosphat pH 6,8 (có bổ sung pepsin đối với mẫu vỏ nang khó rã).
  • Phương pháp đánh giá in vivo và xử lý dịch sinh học:
    • Thiết kế thử nghiệm song song trên 11 con thỏ trắng đực (chia 3 lô: F3 liều 2,5 mg/kg, Utrogestan® liều 10 mg/kg, progesteron nguyên liệu liều 10 mg/kg), lấy mẫu máu tại các thời điểm từ 5 đến 360 phút qua ống tráng EDTA.
    • Chiết tách progesteron trong huyết tương bằng kỹ thuật QuEChERS (sử dụng acetonitril, MgSO4, NaCl) cùng chất nội chuẩn đồng vị PGT-d9.
    • Định lượng nồng độ thuốc trong huyết tương thỏ bằng hệ thống LC-MS/MS (Agilent LC-MS/MS, cột Agilent Eclipse XD8-C18 3,0 x 150 mm, 3,5 µm; rửa giải gradient acetonitril và dung dịch acid formic 0,1%).
    • Tính toán các thông số dược động học (Cmax, Tmax, AUC0-∞) bằng phần mềm chuyên dụng Phoenix WinNonlin 8 và xử lý thống kê bằng Microsoft Excel 2016.

Nội dung chính theo từng chương

Đặt vấn đề và Tổng quan

Tác giả hệ thống hóa cơ sở lý thuyết về cấu trúc hóa học của progesteron (C21H30O2, phân tử lượng 314,47 g/mol, log P = 3,87), đặc tính dược động học và dược lý học của hoạt chất. Khóa luận phân tích chi tiết Hệ thống phân loại công thức lipid (LFCS), cơ chế tiêu hóa các dạng bào chế lipid tại ruột dưới tác động phối hợp của lipase tụy, muối mật và ion calci, cũng như vai trò hình thành cấu trúc keo micell giúp đưa dược chất vào hệ bạch huyết. Chương này cũng phân tích tổng quan các mô hình ly giải lipid in vitro (mô hình 1 ngăn, 1 ngăn động, 2 ngăn dạ dày - ruột) và các yếu tố ảnh hưởng tới hiệu suất ly giải (nồng độ NaTDC, ion Ca²⁺, hoạt độ pancreatin, nồng độ dược chất).

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết tiêu chuẩn nguyên liệu (progesteron đạt chuẩn USP 41, các tá dược đạt DĐVN V hoặc BP 2020), danh mục trang thiết bị phân tích hiện đại, quy trình thẩm định/thẩm tra phương pháp định lượng HPLC và LC-MS/MS. Chương 2 chuẩn hóa quy trình thí nghiệm ly giải lipid in vitro 1 ngăn, các bước phân tách 3 pha sau ly giải (pha dầu nổi, pha keo micell, pha tủa rắn) bằng siêu ly tâm, quy trình bào chế vỏ nang mềm từ gelatin-glycerin, phương pháp thay đổi dung môi khảo sát hiện tượng siêu bão hòa, cùng thiết kế chi tiết thử nghiệm dược động học trên thỏ.

Kết quả và bàn luận

Chương kết quả tập trung vào 4 nội dung thực nghiệm trọng tâm:

  1. Thẩm tra phương pháp định lượng:

    • Phương pháp HPLC: Đạt độ lặp lại cao với RSD thời gian lưu là 0,17%, RSD diện tích pic là 0,04% (đều ≤ 2%); phương trình hồi quy tuyến tính trong khoảng 6 – 150 µg/ml là $y = 51244x + 41829$ với hệ số tương quan $R^2 = 0,9998$.
    • Phương pháp LC-MS/MS trong huyết tương: Đường chuẩn từ 2 – 2000 ng/ml đạt phương trình $y = 0,012x + 0,0024$ với $R^2 = 0,9997$.

  2. Nghiên cứu hoàn thiện công thức SNEDDS qua ly giải lipid in vitro:

    • Đánh giá khả năng mô phỏng của mô hình: So sánh công thức F2 trong môi trường có enzym/muối mật và không có enzym/muối mật cho thấy môi trường ly giải tiêu thụ lượng NaOH 0,2 M cao hơn rõ rệt và làm giảm tỉ lệ PGT kết tủa, chứng minh hệ SNEDDS bị phân cắt một phần tá dược diện hoạt (Tween 80) và tạo pha keo hòa tan hoạt chất.
    • Ảnh hưởng của hàm lượng dược chất: Khảo sát 3 công thức F1 (100 mg PGT), F2 (50 mg PGT), F3 (25 mg PGT) trên cùng nền tá dược (360 mg acid oleic, 135 mg Tween 80, 405 mg ethanol). Khi hàm lượng PGT giảm từ 100 mg xuống 25 mg, tỉ lệ dược chất duy trì trong pha keo tăng mạnh từ 15,52% (F1) lên 30,86% (F2) và đạt 73,40% (F3). Kích thước giọt nano trong pha keo giảm từ 133,2 nm xuống 104,9 nm. Độ hòa tan bão hòa của PGT trong pha keo đạt $264,10 \pm 70,14$ µg/ml; tỉ lệ siêu bão hòa (SR) của F3 đạt 1,69 lần.
    • So sánh với viên đối chiếu Utrogestan® 100 mg: Mẫu F3 nhũ hóa nhanh, hoàn toàn và có 73,40% dược chất ở pha keo; trong khi Utrogestan® chỉ đạt 2,69% PGT trong pha keo sau ly giải do lượng lipid trong dầu lạc và lecithin khó tự nhũ hóa nếu thiếu tác nhân cơ học mạnh, phần lớn PGT nằm lại ở pha dầu đặc dính và cắn tủa.
Chỉ số đánh giá in vitro Công thức F1 (100 mg PGT) Công thức F2 (50 mg PGT) Công thức F3 (25 mg PGT) Đối chiếu Utrogestan® 100 mg
Tiêu tốn NaOH 0,2 M (ml) 0,80 0,80 0,80 0,92
Tỉ lệ PGT trong pha keo (%) 15,52 30,86 73,40 2,69
Kích thước giọt pha keo (nm) 133,2 119,7 104,9 112,9
Chỉ số đa phân tán (PDI) - - 0,352 0,571
Tỉ lệ siêu bão hòa (SR) - - 1,69 -

  1. Nghiên cứu bào chế vỏ nang mềm và tương tác gelatin - progesteron:

    • Bào chế thành công vỏ nang mềm với công thức: Gelatin 45%, Glycerin 15%, Methyl paraben 0,15%, Propyl paraben 0,03%, Nước 39,82%. Độ ẩm vỏ nang đạt $6,53 \pm 1,04$% (nằm trong giới hạn yêu cầu 5 – 8%).
    • Khi có mặt 1 g vỏ nang trong môi trường ly giải, mức độ tiêu hóa tăng (lượng NaOH 0,2 M tăng lên 1,03 – 1,18 ml do gelatin giải phóng acid amin), đồng thời tỉ lệ PGT trong pha keo tăng lên ở cả 3 công thức, kích thước giọt giảm.
    • Thử nghiệm thay đổi dung môi: Ở tỉ lệ PGT : gelatin = 1:18, mức độ siêu bão hòa (DS) đạt 1,27 tại thời điểm 30 phút; kích thước hạt tủa PGT sau 60 phút được khống chế ở mức $27,87 \pm 0,93$ µm (so với $60,8$ µm ở mẫu không có gelatin).
    • Phổ FT-IR: Đỉnh hấp thụ của nhóm hydroxyl/amino trên gelatin dịch chuyển từ $3547,09\text{ cm}^{-1}$ xuống $3286,06 \pm 4,85\text{ cm}^{-1}$, pic tù hơn; các đỉnh carbonyl của PGT (1701 cm⁻¹ và 1663 cm⁻¹) cũng bị dịch chuyển, khẳng định có sự hình thành liên kết hydro liên phân tử giữa gelatin và progesteron.
    • Thử giải phóng in vitro: Viên nang mềm chứa F3 giải phóng tối đa 59,14% sau 45 phút và duy trì ổn định ở mức 55,14% sau 120 phút (ít bị kết tinh lại). Viên F1 đạt đỉnh 61,35% tại 30 phút nhưng tụt dốc xuống 22,14% tại 120 phút do kết tủa nhanh. Viên Utrogestan® chỉ giải phóng 1,77% sau 120 phút trong điều kiện thử nghiệm.

  2. Nghiên cứu đánh giá dược động học in vivo trên thỏ:

Thông số dược động học Hệ SNEDDS F3 (25 mg) Viên nang Utrogestan® 100 mg Progesteron nguyên liệu
Liều dùng cho thỏ (mg/kg) 2,5 10,0 10,0
$C_{\text{max}}$ (ng/ml) $711,04 \pm 267,13$ $407,74 \pm 322,15$ $10,40 \pm 1,46$
$T_{\text{max}}$ (phút) $5 \pm 0$ $9 \pm 2,45$ $25 \pm 10$
$\text{AUC}_{0-\infty}$ (ng.phút/ml) $9424,87 \pm 2666,32$ $17460,67 \pm 13464,36$ $2290,57 \pm 1166,77$

So sánh dược động học cho thấy: Dù dùng liều chỉ bằng 1/4 ($2,5\text{ mg/kg}$ so với $10\text{ mg/kg}$), hệ F3 đạt nồng độ đỉnh $C_{\text{max}}$ cao gấp 1,74 lần so với Utrogestan® và gấp 68,37 lần so với mẫu nguyên liệu. Giá trị $\text{AUC}{0-\infty}$ của F3 cao gấp 4,11 lần so với nguyên liệu. Thời gian đạt nồng độ đỉnh ($T{\text{max}}$) của F3 ngắn nhất ($5\text{ phút}$). Hệ F3 cũng cho thấy độ lệch chuẩn tương đối thấp hơn nhiều so với Utrogestan®, phản ánh mức độ hấp thu ổn định và ít phụ thuộc vào sự biến thiên enzym tiêu hóa giữa các cá thể.

Kết quả và đóng góp của nghiên cứu

Nghiên cứu đã hoàn thiện trọn vẹn công thức viên nang mềm chứa hệ nano tự nhũ hóa progesteron với các thành phần cụ thể:

  • Dịch nhân (F3): Progesteron 25 mg, Acid oleic 360 mg, Tween 80 135 mg, Ethanol 405 mg.
  • Vỏ nang gelatin: Gelatin 450 mg, Glycerin 150 mg, Methyl paraben 1,5 mg, Propyl paraben 0,3 mg, Nước 398,2 mg.

Các đóng góp khoa học chính mà tác giả đã đạt được:

  • Phương pháp luận: Bước đầu ứng dụng và chuẩn hóa thành công mô hình ly giải lipid in vitro (in vitro lipolysis) tại Việt Nam để đánh giá hệ phân phối thuốc tự nhũ hóa, bổ khuyết cho hạn chế của các phép thử hòa tan USP truyền thống đối với dạng thuốc dựa trên lipid.
  • Phát hiện khoa học: Làm sáng tỏ cơ chế ức chế tái kết tinh dược chất của gelatin thông qua liên kết hydro giữa nhóm amino/hydroxyl của gelatin với nhóm carbonyl của progesteron, chứng minh vai trò tích cực của vỏ nang mềm trong việc duy trì trạng thái siêu bão hòa của thuốc trong lòng ruột.
  • Ý nghĩa sinh dược học: Chứng minh hệ SNEDDS phân tán nhanh, kích thước hạt nano (~105 nm) giúp progesteron hấp thu ưu tiên qua hệ bạch huyết ruột, tránh được chuyển hóa qua gan lần đầu, làm tăng vọt $C_{\text{max}}$ và giảm thiểu sự dao động sinh khả dụng giữa các cá thể so với dạng hỗn dịch dầu truyền thống (Utrogestan®).

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp theo

Khóa luận đã thẳng thắn ghi nhận phạm vi và đề xuất các hướng triển khai tiếp theo:

  • Cần tiếp tục tối ưu hóa sâu hơn công thức bào chế hệ nano tự nhũ hóa để gia tăng hàm lượng tải dược chất mà vẫn duy trì độ bền pha keo.
  • Quy mô thử nghiệm in vivo còn ở mức hẹp ($n = 11$ thỏ); cần mở rộng đánh giá sinh khả dụng trên quy mô mẫu động vật lớn hơn.
  • Cần thiết kế các thử nghiệm chuyên sâu nhằm đánh giá ảnh hưởng của trạng thái thức ăn giàu lipid (trạng thái no/đói) đối với mức độ hấp thu và sinh khả dụng đường uống của hệ SNEDDS progesteron.

Giá trị tham khảo

Công trình là tài liệu chuyên khảo thực nghiệm có giá trị cao cho:

  • Cán bộ nghiên cứu và sinh viên ngành Dược (chuyên ngành Bào chế và Công nghệ Dược phẩm): Cung cấp quy trình chi tiết từ thiết kế công thức LBFs, kỹ thuật bào chế nang mềm bằng phương pháp nhúng khuôn, đến cách thức triển khai mô hình ly giải lipid in vitro bằng máy chuẩn độ pH-stat.
  • Nghiên cứu viên phân tích và kiểm nghiệm dược phẩm: Tham khảo quy trình chiết QuEChERS xử lý mẫu sinh học huyết tương chứa hormon sinh dục và phương pháp định lượng LC-MS/MS sử dụng chất nội chuẩn đồng vị ($PGT-d_9$).
  • Các nhóm phát triển thuốc mới: Cung cấp cơ sở dữ liệu thực nghiệm về mối tương quan giữa sự phân bố pha keo in vitro với các thông số dược động học in vivo của các hoạt chất thuộc nhóm kém tan, chuyển hóa bước một cao (BCS II và IV).

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao thử nghiệm ly giải lipid in vitro lại ưu việt hơn phép thử hòa tan Dược điển (USP) đối với hệ SNEDDS? Các phương pháp USP (cánh khuấy, giỏ quay) chỉ hòa loãng mẫu trong môi trường đệm thông thường, không chứa enzym lipase và muối mật. Trong khi đó, hệ SNEDDS khi vào cơ thể sẽ bị tiêu hóa thành phần lipid, làm thay đổi hoàn toàn khả năng hòa tan và có thể làm hoạt chất kết tủa ngay trong lòng ruột. Mô hình ly giải in vitro tái lập được quá trình tiêu hóa sinh lý này, giúp định lượng chính xác tỉ lệ thuốc nằm trong pha keo micell có khả năng hấp thu.

2. Vì sao công thức F3 (chứa 25 mg PGT) lại cho hiệu suất ly giải tốt hơn F1 (100 mg PGT) và F2 (50 mg PGT)? Dù mức độ tiêu hóa tá dược là tương đương nhau (cùng tiêu thụ 0,8 ml NaOH 0,2 M), nhưng ở F1 và F2 lượng dược chất vượt quá ngưỡng bão hòa tối đa của hệ keo micell sinh ra sau tiêu hóa, dẫn đến hiện tượng tái kết tinh mạnh (F1 bị tủa tới 84,48%). Ngược lại, F3 duy trì được trạng thái siêu bão hòa ổn định (SR = 1,69), giữ tới 73,40% PGT trong pha keo dưới dạng hạt nano ($104,9\text{ nm}$).

3. Vỏ nang gelatin đóng vai trò gì ngoài việc chứa đựng khối thuốc? Gelatin không chỉ là chất tạo vỏ mà còn đóng vai trò như một chất ức chế kết tinh (precipitation inhibitor). Thông qua các nhóm chức hydroxyl và amino, gelatin tạo liên kết hydro với nhóm carbonyl của progesteron (đã được chứng minh bằng phổ FT-IR), giúp duy trì trạng thái siêu bão hòa (DS > 1) và ngăn cản sự lớn lên của các mầm tinh thể progesteron khi hệ tự nhũ hóa phân tán trong dịch ruột.

4. Dữ liệu in vivo trên thỏ chứng minh ưu thế của hệ SNEDDS F3 so với viên đối chiếu Utrogestan® như thế nào? Ở liều dùng chỉ bằng 1/4 so với Utrogestan® ($2,5\text{ mg/kg}$ so với $10\text{ mg/kg}$), hệ F3 đạt nồng độ đỉnh $C_{\text{max}}$ cao gấp 1,74 lần ($711,04\text{ ng/ml}$ so với $407,74\text{ ng/ml}$) và đạt đỉnh nhanh hơn ($T_{\text{max}} = 5\text{ phút}$ so với $9\text{ phút}$). Đồng thời, khoảng biến thiên số liệu ở F3 nhỏ hơn nhiều, chứng tỏ mức độ hấp thu ít bị phụ thuộc vào lượng enzym tiêu hóa của từng cá thể động vật.

Kết luận

Khóa luận của tác giả Nguyễn Thanh Tùng đã xây dựng và hoàn thiện thành công công thức viên nang mềm chứa hệ nano tự nhũ hóa progesteron 25 mg kết hợp vỏ gelatin 450 mg. Bằng việc ứng dụng mô hình ly giải lipid in vitro và phân tích phổ FT-IR, nghiên cứu đã chứng minh bản chất liên kết hydro giữa gelatin và progesteron giúp hạn chế tái kết tinh dược chất trong dịch tiêu hóa. Kết quả thử nghiệm in vivo trên thỏ khẳng định hệ SNEDDS bào chế giúp gia tăng vượt bậc nồng độ đỉnh trong huyết tương ($C_{\text{max}}$ đạt $711,04\text{ ng/ml}$ ở liều $2,5\text{ mg/kg}$) và rút ngắn thời gian hấp thu so với chế phẩm đối chiếu Utrogestan® 100 mg.