Luận văn xây dựng phương pháp định lượng một số hoạt chất kháng hiv trong thuốc bằng phương pháp điện di mao quản

Chuyên khảo kỹ thuật phân tích Luận văn xây dựng phương pháp định lượng một số hoạt chất kháng hiv trong thuốc bằng phương pháp, đánh giá các khía cạnh quan trọng, đề xuất hướng

• Tác giả: Nguyễn Thị Thùy Linh
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Văn Ri
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Hóa phân tích
• Đề tài: Xây Dựng Phương Pháp Định Lượng Một Số Hoạt Chất Kháng HIV Trong Thuốc Bằng Phương Pháp Điện Di Mao Quản
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2012
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Giới thiệu về các thuốc điều trị HIV
• 1.2. Tình hình sử dụng thuốc HIV ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay
• 1.3. Các phương pháp phân tích định lượng thuốc HIV
• 1.3.1. Các phương pháp sắc ký (HPLC & HPTLC)
• 1.3.2. Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis - CE)
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Điều kiện nghiên cứu
• 2.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Nội dung nghiên cứu
• 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Nghiên cứu khảo sát tối ưu điều kiện tách 3TC, NVP và AZT
• 3.1.1. Chọn bước sóng phát hiện chất
• 3.1.2. Mao quản và xử lý mao quản
• 3.1.3. Chọn phương pháp bơm mẫu
• 3.1.4. Độ điện di và độ điện di hiệu dụng
• 3.1.5. Lựa chọn cơ chế tách
• 3.1.6. Ảnh hưởng pH của dung dịch đệm điện di
• 3.1.7. Ảnh hưởng của thành phần dung dịch đệm
• 3.1.8. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất tạo mixen SDS
• 3.1.9. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đệm
• 3.1.10. Khảo sát ảnh hưởng thời gian bơm mẫu
• 3.1.11. Khảo sát ảnh hưởng thế điện di
• 3.1.12. Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ của mao quản
• 3.1.13. Tổng kết điều kiện tối ưu
• 3.2. Định tính 3TC, AZT và NVP trong điều kiện điện di thiết lập
• 3.3. Đánh giá phương pháp phân tích
• 3.3.1. Khảo sát tính tương thích hệ thống
• 3.3.2. Tính đặc hiệu
• 3.3.3. Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đường chuẩn
• 3.3.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
• 3.3.5. Độ lặp lại của phương pháp
• 3.3.6. Độ đúng của phương pháp
• 3.3.7. Kết quả định lượng trong chế phẩm
• 3.3.8. Ưu nhược điểm của phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC)
• 3.3.9. Hướng phát triển của đề tài
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• DANH MỤC VIẾT TẮT
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về phương pháp điện di mao quản

Phương pháp điện di mao quản (Capillary Electrophoresis - CE) là một kỹ thuật phân tích hóa học hiện đại, được sử dụng rộng rãi trong việc tách và định lượng các hợp chất trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là trong dược phẩm. Nguyên tắc hoạt động của phương pháp này dựa trên sự di chuyển của các ion trong một mao quản dưới tác động của điện trường. Các yếu tố như pH, nồng độ dung dịch đệm và điện thế đều ảnh hưởng đến hiệu quả tách. CE có nhiều ưu điểm như thời gian phân tích ngắn, tiêu tốn ít mẫu và độ nhạy cao. Đặc biệt, phương pháp này có thể áp dụng để phân tích các hoạt chất kháng HIV trong thuốc, giúp đảm bảo chất lượng và hiệu quả điều trị cho bệnh nhân. Theo nghiên cứu, CE đã cho thấy khả năng tách biệt tốt các hoạt chất như Lamivudin (3TC), Zidovudin (AZT) và Nevirapin (NVP) trong các mẫu thuốc. Điều này cho thấy giá trị thực tiễn của CE trong việc kiểm soát chất lượng thuốc kháng HIV.

1.1 Nguyên tắc của phương pháp điện di mao quản

Nguyên tắc của điện di mao quản dựa trên sự phân tách các ion trong dung dịch khi chịu tác động của điện trường. Các ion di chuyển với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào kích thước, điện tích và hình dạng của chúng. Sự phân tách này diễn ra trong một mao quản nhỏ, nơi mà các yếu tố như điện thế và pH được điều chỉnh để tối ưu hóa quá trình tách. Kết quả là các hợp chất được tách ra và có thể được phát hiện bằng các phương pháp như phổ UV-VIS. Phương pháp này không chỉ nhanh chóng mà còn cho phép phân tích nhiều mẫu cùng lúc, điều này rất quan trọng trong việc kiểm soát chất lượng thuốc kháng HIV. CE đã chứng minh được tính hiệu quả trong việc định lượng các hoạt chất kháng HIV, từ đó hỗ trợ cho việc điều trị và quản lý bệnh nhân một cách hiệu quả.

II. Định lượng hoạt chất kháng HIV trong thuốc

Việc định lượng các hoạt chất kháng HIV như Lamivudin, Zidovudin, và Nevirapin trong thuốc là rất quan trọng để đảm bảo hiệu quả điều trị. Phương pháp CE cho phép xác định nồng độ của các hoạt chất này với độ chính xác cao. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng, với điều kiện điện di tối ưu, CE có thể tách biệt các hoạt chất này trong thời gian ngắn, từ đó cung cấp kết quả định lượng nhanh chóng. Việc sử dụng CE trong định lượng không chỉ giúp tiết kiệm thời gian mà còn giảm thiểu lượng mẫu cần thiết, điều này rất có lợi trong các nghiên cứu lâm sàng. Hơn nữa, CE có thể được kết hợp với các kỹ thuật khác như phổ khối để nâng cao độ nhạy và độ chính xác của phương pháp. Điều này mở ra cơ hội cho việc phát triển các phương pháp phân tích mới, đáp ứng nhu cầu ngày càng cao trong việc kiểm soát chất lượng thuốc kháng HIV.

2.1 Phân tích định lượng theo điện di mao quản

Phân tích định lượng theo điện di mao quản được thực hiện thông qua việc thiết lập các điều kiện tối ưu cho quá trình tách. Các yếu tố như pH của dung dịch đệm, nồng độ chất tạo micelle và điện thế đều ảnh hưởng đến kết quả phân tích. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng, việc điều chỉnh pH dung dịch đệm có thể cải thiện đáng kể độ phân giải giữa các hoạt chất. Hơn nữa, việc sử dụng chất hoạt động bề mặt như SDS trong dung dịch đệm cũng giúp tăng cường khả năng tách biệt các hợp chất. Kết quả thu được từ các thí nghiệm cho thấy CE có thể đạt được độ chính xác và độ lặp lại cao trong việc định lượng các hoạt chất kháng HIV, từ đó khẳng định giá trị của phương pháp này trong việc kiểm soát chất lượng thuốc.

III. Đánh giá phương pháp điện di mao quản

Đánh giá phương pháp điện di mao quản cho thấy đây là một công cụ hữu ích trong việc phân tích và định lượng các hoạt chất kháng HIV. Phương pháp này không chỉ nhanh chóng mà còn có độ nhạy cao, cho phép phát hiện các hoạt chất ở nồng độ thấp. Kết quả nghiên cứu cho thấy CE có thể đạt được độ lặp lại và độ chính xác cao trong việc định lượng các hoạt chất như Lamivudin, Zidovudin và Nevirapin. Hơn nữa, CE còn có khả năng tách biệt các tạp chất, điều này rất quan trọng trong việc đảm bảo chất lượng thuốc. Việc áp dụng CE trong phân tích dược phẩm không chỉ giúp nâng cao hiệu quả điều trị mà còn góp phần vào việc quản lý chất lượng thuốc kháng HIV một cách hiệu quả.

3.1 Ưu nhược điểm của phương pháp điện di mao quản

Phương pháp điện di mao quản có nhiều ưu điểm nổi bật như thời gian phân tích ngắn, tiêu tốn ít mẫu và độ nhạy cao. Tuy nhiên, cũng cần lưu ý đến một số nhược điểm như yêu cầu về thiết bị phức tạp và cần có kỹ thuật viên có kinh nghiệm để vận hành. Mặc dù vậy, với những lợi ích mà CE mang lại, phương pháp này đang ngày càng được ưa chuộng trong lĩnh vực phân tích dược phẩm. Việc phát triển và cải tiến các kỹ thuật CE sẽ mở ra nhiều cơ hội mới trong việc nghiên cứu và phát triển các phương pháp phân tích hiệu quả hơn cho các hoạt chất kháng HIV.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Theo báo cáo của ngành y tế, tính đến tháng 5 năm 2012, Việt Nam có khoảng 66.191 người nhiễm HIV, trong đó 62.654 người lớn và 3.537 trẻ em, với 70% bệnh nhân đang điều trị ARV tập trung tại 10 tỉnh thành, đặc biệt Thành phố Hồ Chí Minh chiếm 30,9% tổng số bệnh nhân điều trị. Trên thế giới, năm 2008 có khoảng 2,7 triệu người nhiễm mới HIV, và liệu pháp điều trị kháng retrovirus (ARV) đã giúp kéo dài sự sống cho hàng triệu người. Tại Việt Nam, thuốc kháng HIV như Lamivudine (3TC), Zidovudine (AZT) và Nevirapine (NVP) được sử dụng phổ biến trong phác đồ điều trị phối hợp nhằm nâng cao hiệu quả và giảm nguy cơ kháng thuốc.

Việc kiểm soát chất lượng thuốc kháng HIV là rất quan trọng để đảm bảo an toàn và hiệu quả điều trị. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) hiện được sử dụng rộng rãi nhưng có nhược điểm về chi phí và tác động môi trường do sử dụng dung môi hữu cơ. Do đó, nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng các hoạt chất kháng HIV bằng phương pháp điện di mao quản (CE) với ưu điểm về hiệu quả tách cao, thời gian phân tích nhanh và tiêu hao mẫu thấp là cần thiết. Mục tiêu nghiên cứu là phát triển và tối ưu hóa phương pháp CE, đặc biệt kỹ thuật điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC), để định lượng đồng thời Lamivudine, Zidovudine và Nevirapine trong chế phẩm thuốc kháng HIV, góp phần nâng cao công tác quản lý chất lượng thuốc tại Việt Nam.

Phạm vi nghiên cứu tập trung vào các chế phẩm viên nén chứa 3TC, AZT và NVP sản xuất trong giai đoạn 2011-2013, sử dụng thiết bị điện di mao quản hiện đại tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. Nghiên cứu có ý nghĩa thực tiễn lớn trong việc cung cấp phương pháp phân tích nhanh, chính xác, thân thiện môi trường, hỗ trợ kiểm soát chất lượng thuốc kháng HIV trong sản xuất và lưu hành.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Phương pháp điện di mao quản (Capillary Electrophoresis - CE) dựa trên nguyên tắc tách các ion trong mao quản dưới tác dụng của điện trường cao, với sự phân tách dựa trên độ linh động điện di khác nhau của các phân tử. Kỹ thuật CE có nhiều kiểu tách, trong đó điện di mao quản vùng (CZE) và điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) được ứng dụng phổ biến trong phân tích dược phẩm.

MEKC là sự kết hợp giữa sắc ký và điện di, sử dụng các micelle (mixen) như pha tĩnh giả để tách các chất trung tính và mang điện tích dựa trên sự phân bố động học giữa pha micelle và pha động. Chất hoạt động bề mặt anion như Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) được dùng để tạo micelle, giúp tách hiệu quả các hoạt chất kháng HIV có tính chất hóa học khác nhau.

Ba khái niệm chính trong nghiên cứu gồm:

• Độ điện di hiệu dụng (µef): đại lượng thể hiện tốc độ di chuyển của chất phân tích trong mao quản sau khi trừ đi tốc độ dòng điện di thẩm thấu (EOF).
• Hệ số phân bố nhiệt động (Ki): xác định sự phân bố của chất phân tích giữa pha micelle và pha động, ảnh hưởng đến thời gian lưu và độ phân giải.
• Độ phân giải (R): chỉ số đánh giá khả năng tách biệt các pic trên điện di đồ, phụ thuộc vào điều kiện pH, nồng độ SDS, điện thế và nhiệt độ.

Ngoài ra, các cyclodextrin (CD) được nghiên cứu như pha tĩnh giả trong CE nhằm tăng khả năng tách các đồng phân quang học, tuy nhiên trong nghiên cứu này β-cyclodextrin không phù hợp để tách ba hoạt chất 3TC, AZT và NVP.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu chính là các chuẩn quốc gia Lamivudine, Zidovudine, Nevirapine và các chế phẩm viên nén chứa các hoạt chất này do các công ty dược phẩm Ấn Độ sản xuất. Thiết bị sử dụng là máy điện di mao quản Agilent CE system 9001 với detector mảng diod (DAD) cho phép quét phổ UV từ 190-400 nm.

Phương pháp phân tích được xây dựng và tối ưu qua các bước:

• Khảo sát phổ hấp thụ UV để chọn bước sóng phát hiện tối ưu cho từng hoạt chất (270,5 nm cho 3TC, 264,5 nm cho AZT, 268,5 nm cho NVP).
• Lựa chọn kiểu điện di phù hợp giữa CZE và MEKC, xác định MEKC với SDS là phương pháp tối ưu để tách đồng thời ba hoạt chất.
• Tối ưu các điều kiện điện di gồm pH dung dịch đệm (chọn pH 9,3), nồng độ chất điện ly (Na2B4O7 10 mM), nồng độ SDS (50 mM), điện thế (20 kV), nhiệt độ mao quản (25°C), thời gian và áp suất bơm mẫu (5 giây, 50 mbar).
• Thẩm định phương pháp theo các tiêu chí: khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng, tính tương thích hệ thống và tính đặc hiệu.
• Áp dụng phương pháp vào định lượng các mẫu thuốc thực tế trên thị trường.

Cỡ mẫu nghiên cứu gồm 5-7 mẫu chuẩn với nồng độ khác nhau để xây dựng đường chuẩn, 5 mẫu độc lập để đánh giá độ lặp lại, 6 lần lặp lại để xác định độ đúng và tính tương thích hệ thống. Phương pháp chọn mẫu là lấy mẫu ngẫu nhiên từ các lô thuốc sản xuất trong giai đoạn nghiên cứu.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Lựa chọn bước sóng phát hiện:
   Phổ hấp thụ UV của ba hoạt chất cho thấy bước sóng hấp thụ cực đại lần lượt là 270,5 nm (3TC), 264,5 nm (AZT) và 268,5 nm (NVP). Việc chọn bước sóng riêng biệt giúp tăng độ nhạy và chính xác trong định lượng.

2. Chọn phương pháp tách:
   Phương pháp CZE không thể tách đồng thời 3TC và NVP do pKa gần nhau, chỉ cho 2 pic trên điện di đồ. Khi thêm SDS 50 mM vào dung dịch đệm (MEKC), cả ba hoạt chất được tách rõ ràng với độ phân giải cao, thời gian phân tích dưới 20 phút.

3. Ảnh hưởng pH dung dịch đệm:
   pH từ 8,76 đến 10,17 được khảo sát. Ở pH 9,3, các pic tách rõ, đường nền ổn định, thời gian phân tích hợp lý. pH cao hơn làm tăng độ phân giải nhưng kéo dài thời gian phân tích và giảm diện tích pic do ảnh hưởng hấp thụ nền.

4. Ảnh hưởng nồng độ SDS:
   Nồng độ SDS 25 mM, 50 mM và 75 mM được thử nghiệm. Ở 50 mM SDS, độ phân giải và chiều cao pic tối ưu, thời gian phân tích ngắn hơn so với 75 mM, trong khi 25 mM cho chiều cao pic thấp hơn. Nồng độ SDS cao gây tăng dòng điện và hiệu ứng nhiệt Jun, làm giảm hiệu suất tách.

5. Đánh giá thẩm định phương pháp:

   • Khoảng tuyến tính: 20-200 µg/mL cho 3TC (r² > 0,999), 5-50 µg/mL cho AZT (r² > 0,998), 25-250 µg/mL cho NVP (r² > 0,998).
   • Độ lặp lại: RSD < 5% cho diện tích pic của cả ba hoạt chất.
   • Độ đúng: Tỷ lệ thu hồi đạt ≥ 99,7% với RSD ≤ 1,8%.
   • Tính tương thích hệ thống: RSD của 6 lần tiêm lặp lại < 2%, độ phân giải Rs > 1,5 giữa các pic.
   • Tính đặc hiệu: Không phát hiện pic nhiễu trong mẫu trắng, xác định rõ các hoạt chất trong mẫu thuốc.

Thảo luận kết quả

Phương pháp MEKC với SDS đã chứng minh hiệu quả vượt trội so với CZE trong việc tách đồng thời ba hoạt chất kháng HIV nhờ cơ chế phân bố vào pha tĩnh giả micelle. Việc tối ưu pH và nồng độ SDS là yếu tố quyết định đến độ phân giải và thời gian phân tích, phù hợp với các nghiên cứu trước đây về phân tích thuốc bằng CE.

Sự lựa chọn pH 9,3 cân bằng giữa độ phân giải và thời gian phân tích, đồng thời giảm ảnh hưởng hấp thụ nền UV, giúp tăng độ nhạy phát hiện. Nồng độ SDS 50 mM là điểm tối ưu tránh hiệu ứng nhiệt Jun và duy trì dòng điện ổn định trong mao quản.

Phương pháp thẩm định cho thấy độ chính xác, độ lặp lại và độ đúng cao, phù hợp với yêu cầu kiểm soát chất lượng thuốc. So với phương pháp HPLC truyền thống, CE tiết kiệm dung môi, thân thiện môi trường và thời gian phân tích nhanh hơn, phù hợp cho phân tích trong phòng thí nghiệm và sản xuất.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ đường chuẩn thể hiện mối quan hệ tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ, bảng tổng hợp các thông số thẩm định như RSD, tỷ lệ thu hồi và độ phân giải Rs để minh chứng tính khả thi của phương pháp.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Triển khai áp dụng phương pháp MEKC trong kiểm soát chất lượng thuốc kháng HIV:
   Các cơ sở sản xuất và kiểm nghiệm thuốc nên áp dụng phương pháp này để định lượng nhanh, chính xác các hoạt chất 3TC, AZT và NVP, giảm chi phí và thời gian phân tích. Thời gian thực hiện: trong vòng 6 tháng.

2. Đào tạo kỹ thuật viên và cán bộ phân tích về kỹ thuật điện di mao quản:
   Tổ chức các khóa đào tạo chuyên sâu về CE và MEKC nhằm nâng cao năng lực phân tích, đảm bảo vận hành thiết bị và xử lý dữ liệu chính xác. Chủ thể thực hiện: các trường đại học, viện nghiên cứu, phòng kiểm nghiệm. Thời gian: 3-6 tháng.

3. Nghiên cứu mở rộng ứng dụng CE cho các hoạt chất kháng HIV khác và các thuốc phối hợp:
   Tiếp tục khảo sát và phát triển phương pháp CE cho các thuốc ARV mới, tăng cường khả năng phân tích đa thành phần trong cùng một mẫu. Thời gian: 1-2 năm.

4. Xây dựng quy trình chuẩn và hướng dẫn kỹ thuật áp dụng CE trong kiểm soát chất lượng thuốc:
   Bộ Y tế và các cơ quan quản lý cần ban hành hướng dẫn kỹ thuật chuẩn, quy trình thẩm định và kiểm tra chất lượng thuốc dựa trên CE để đồng bộ và nâng cao hiệu quả quản lý. Thời gian: 1 năm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Các nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Hóa phân tích, Dược học:
   Luận văn cung cấp kiến thức chuyên sâu về kỹ thuật điện di mao quản và ứng dụng trong phân tích thuốc kháng HIV, hỗ trợ nghiên cứu và phát triển phương pháp phân tích mới.

2. Cán bộ kiểm nghiệm chất lượng thuốc tại các phòng thí nghiệm và cơ sở sản xuất dược phẩm:
   Tài liệu giúp hiểu rõ quy trình xây dựng và thẩm định phương pháp CE, áp dụng thực tế trong kiểm soát chất lượng thuốc ARV.

3. Cơ quan quản lý nhà nước về dược phẩm và y tế:
   Thông tin về phương pháp phân tích hiện đại, thân thiện môi trường, hỗ trợ xây dựng chính sách và quy định kiểm soát chất lượng thuốc kháng HIV.

4. Các nhà sản xuất thuốc kháng HIV và các công ty dược phẩm:
   Hướng dẫn kỹ thuật giúp nâng cao hiệu quả kiểm soát chất lượng nguyên liệu và sản phẩm cuối cùng, đảm bảo an toàn và hiệu quả điều trị cho người bệnh.

Câu hỏi thường gặp

1. Phương pháp điện di mao quản (CE) có ưu điểm gì so với HPLC trong phân tích thuốc kháng HIV?
   CE tiêu thụ ít dung môi, thời gian phân tích nhanh hơn, hiệu quả tách cao và thân thiện môi trường hơn so với HPLC. Ví dụ, thời gian phân tích MEKC chỉ khoảng 20 phút so với 30-40 phút của HPLC.

2. Tại sao chọn phương pháp MEKC thay vì CZE để tách ba hoạt chất 3TC, AZT và NVP?
   CZE không tách được đồng thời 3TC và NVP do pKa gần nhau, trong khi MEKC sử dụng micelle SDS giúp tách hiệu quả nhờ cơ chế phân bố vào pha tĩnh giả, tạo độ phân giải cao.

3. Làm thế nào để tối ưu điều kiện pH và nồng độ SDS trong phương pháp MEKC?
   Thử nghiệm pH từ 8,7 đến 10,2 và SDS từ 25 đến 75 mM cho thấy pH 9,3 và SDS 50 mM là điều kiện tối ưu cân bằng giữa độ phân giải, thời gian phân tích và độ nhạy.

4. Phương pháp này có thể áp dụng cho các loại thuốc kháng HIV khác không?
   Có thể mở rộng áp dụng cho các hoạt chất khác trong nhóm ARV, tuy nhiên cần khảo sát và tối ưu điều kiện riêng cho từng loại thuốc hoặc phối hợp thuốc.

5. Độ chính xác và độ lặp lại của phương pháp được đảm bảo như thế nào?
   Qua thẩm định, phương pháp đạt RSD < 5% cho độ lặp lại và tỷ lệ thu hồi ≥ 99,7%, đảm bảo độ chính xác và tin cậy trong phân tích định lượng.

Kết luận

• Phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) với chất hoạt động bề mặt SDS được xây dựng thành công để định lượng đồng thời Lamivudine, Zidovudine và Nevirapine trong chế phẩm thuốc kháng HIV.
• Điều kiện tối ưu gồm dung dịch đệm Na2B4O7 10 mM, SDS 50 mM, pH 9,3, điện thế 20 kV, nhiệt độ 25°C, bơm mẫu thủy động học 50 mbar trong 5 giây.
• Phương pháp có độ chính xác cao, độ lặp lại tốt, khoảng tuyến tính rộng và tính đặc hiệu rõ ràng, phù hợp cho kiểm soát chất lượng thuốc.
• Nghiên cứu góp phần đa dạng hóa kỹ thuật phân tích thuốc kháng HIV tại Việt Nam, giảm chi phí và tác động môi trường so với phương pháp HPLC truyền thống.
• Khuyến nghị triển khai áp dụng phương pháp trong các phòng kiểm nghiệm, đào tạo nhân lực và nghiên cứu mở rộng ứng dụng cho các hoạt chất ARV khác trong thời gian tới.

Hành động tiếp theo là tổ chức đào tạo kỹ thuật viên, hoàn thiện quy trình chuẩn và phối hợp với các cơ quan quản lý để đưa phương pháp vào ứng dụng thực tế, góp phần nâng cao chất lượng điều trị HIV/AIDS tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.Giới thiệu về các thuốc điều trị HIV Nhóm 1: thuốc ức chế men sao chép ngược có gốc nucleosides (nucleoside reverse transcriptase inhibitors = NRTIs): Zidovudine (AZT, ZDV), Didanosine (DDI), Zalcitabine (DDC), Stavudine (D4T), Lamivudine (3TC), Abacavir (ABC), Tenofovir disoproxil fumarate. Nhóm 2: thuốc ức chế men sao chép ngược không có gốc nucleosides (non- nucleoside reverse transcriptase inhibitors = NNRTIs): Nevirapine, Delavirdine, Effavirenz. Nhóm 3: là thuốc ức chế proteases (protease inhibitors = PIs): Indinavir, Ritonavir, Saquinavir, Nelfinavir, Amprenavir, Lopinavir. Qua nghiên cứu, người ta thấy không nên đơn hóa trị liệu mà nên phối hợp các thuốc nhóm 1 với nhau và với một thuốc nhóm 2 hoặc với một thuốc nhóm 3 để đạt được hiệu quả điều trị cao.

Phác đồ phối hợp Lamivudin, Zidovudin và Nevirapin trong điều trị Lamivudin và Zidovudin có cấu trúc tương tự nucleosid có tác dụng kháng retrovirus bao gồm cả HIV-1 và HIV-2 do ức chế enzym phiên mã ngược của virus. Hai thuốc này được sử dụng phối hợp trong liệu pháp kháng retrovirus để điều trị HIV. Bệnh nhân uống 3TC, AZT kết hợp Nevirapine trong 6 tháng cho kết quả khá khả quan. Các chỉ số đánh giá tình trạng bệnh nhân được cải thiện rõ rệt và có ý nghĩa thống kê.

Người bệnh tăng cân, có số lượng tế bào lymphocyte tăng rõ rệt (từ 1273/mm3 lên 1547/mm3), số lượng tế bào CD4 từ 70/mm3 lên 145/mm3 làm cho số lượng tế bào CD4 bị phá hủy giảm đi. Như vậy, phác đồ D4T/3TC/NVP có thể khống chế sự phát triển của virus. Liệu pháp kháng retrovirus làm tăng thời gian sống sót của người bệnh có số lượng tế bào CD4 dưới 500 trong 1mm 3. Liệu pháp này cũng có thể dùng cho những người bệnh có mật độ virus HIV trên 30000/ml huyết tương, không phụ thuộc vào số lượng tế bào CD4, vì mật độ HIV là một yếu tố tiên lượng sự tiến triển của bệnh [12].

3 Liều dùng dựa trên thể trọng và tuổi của người bệnh, bệnh lý mắc kèm. 150mg 3TC, 30mg d4T ngày hai lần và NVP 200mg ngày một lần trong hai tuần đầu sau đó NVR 200mg ngày hai lần cho người cân nặng dưới 60kg với người lớn và thiếu niên trên 16 tuổi kể cả phụ nữ có thai, trẻ em, bệnh nhân lao và bệnh nhân đồng nhiễm viêm gan B * Lamivudin: (3TC) Công thức phân tử: C8H11N3O3S. Phân tử lượng 229,3. Tên khoa học: 4-amino-1[2-(hydroxymethyl)-1,3- oxathiolan-5- yl]-2(1H) pyrimidinon Tính chất: Là bột kết tinh màu trắng.

Nhiệt độ nóng chảy: 1600-1620C. Dễ tan trong nước, ít tan trong cồn, khó tan trong các dung môi hữu cơ. Năng suất quay cực: [α]21D = - 1350 ( C = 0,38 % trong methanol ) Hằng số pKa= 3,31. Lamivudin hấp thụ UV ở bước sóng hấp thụ cực đại là 278nm; A 1%1cm trong H+ 1M ~ 600 abs Sau khi uống Lamivudin khoảng 1giờ, sinh khả dụng 80%, không bị ảnh hưởng bởi thức ăn.

Đạt Tmax khoảng 1h sau khi dùng thuốc. Nồng độ đỉnh sau khi uống 150mg là khoảng 1,5μg/ml. 4 *Zidovudin: (AZT) Công thức phân tử C10H13N5O4. Phân tử lượng 267.

Tên khoa học: 1-[(2R,4S,5S)-4-azido-5-(hydroxymethyl) oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4- dione Tính chất : Tinh thể trắng hoặc hơi nâu. Nhiệt độ nóng chảy: ~ 1240C. Khó tan trong nước, ít tan trong cồn. Năng suất quay cực + 60,5 0 → + 63,00 ( C = 1% trong EtOH) ; + 99 0 (C = 0,5% trong nước) Hằng số pKa= 9,36 Sau khi uống Zidovudin khoảng 0,5- 1giờ, sinh khả dụng 60-70%, bị ảnh hưởng khi ăn nhiều chất béo.

Đạt Tmax khoảng 1h sau khi dùng thuốc. Nồng độ đỉnh sau khi uống 250mg là khoảng 1,2 μg/ml. *Nevirapin (NVP) Công thức phân tử C15H14N4O. Phân tử lượng 266.

Tên khoa học: 5 11-cyclopropyl-4-methyl-5,11-dihydro-6H- dipyrido[3,2-b:2′,3′-e][1,4]diazepin-6- one Tính chất : Bột kết tinh màu trắng hoặc gần như trắng. Thực tế không tan trong nước, ít tan trong CH3Cl. Năng suất quay cực + 60,5 0 → + 63,00 ( C = 1% trong EtOH) ; + 99 0 (C = 0,5% trong nước) Hằng số pKa= 2,42. Sau khi uống Nevirapin khoảng 4 giờ, sinh khả dụng > 90%, không bị ảnh hưởng bởi thức ăn hoặc thuốc kháng acid.

Đạt Tmax khoảng 4h sau khi dùng liều duy nhất. Tình hình sử dụng thuốc HIV ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay Tính đến 31/5/2012, trên toàn quốc có 66.191 người nhiễm HIV trong đó có 62.654 người lớn và 3.537 trẻ em, đạt 94,6% kế hoạch năm 2012. Kết quả báo cáo tại 10 tỉnh có số người được điều trị cao nhất là 46.332 bệnh nhân, chiếm 70% số người nhiễm HIV đang được điều trị trên toàn quốc. Thành phố Hồ Chí Minh tiếp tục là thành phố dẫn đầu cả nước về số lượng người nhiễm HIV đang điều trị.

Tính đến 31/5/2012, thành phố Hồ Chí Minh có 20.435 người nhiễm HIV đang điều trị, chiếm 30,9% số lượng bệnh nhân đang điều trị trên toàn quốc[10]. Tốc độ tăng trưởng bệnh nhân điều trị ARV trung bình là 950 bệnh nhân/tháng. Phác đồ bậc 1 chiếm đa số với tỷ lệ là 96,76%, phác đồ bậc 2 là 2,97% và có 0,27% thuộc phác đồ khác. - Thực hiện chỉ đạo của Lãnh đạo Bộ Y tế tại Quyết định số 4139/QĐ-BYT ngày 26/11/2011 về việc sửa đổi, bổ sung một số nội dung “Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị HIV/AIDS” được ban hành kèm theo Quyết định số 3003/QĐ- BYT ngày 19/8/2009 của Bộ trưởng Bộ Y tế, Cục Phòng, chống HIV/AIDS đã ban hành các văn bản hướng dẫn về việc điều trị bằng thuốc ARV tại các địa phương với các nội dung chính như sau: - Bệnh nhân bắt đầu điều trị ARV: Phác đồ chỉ định là TDF/3TC/EFV hoặc TDF/3TC/NVP.

Không sử dụng phác đồ có Stavudin (d4T) cho các bệnh nhân bắt đầu điều trị ARV. 6 - Đối với bệnh nhân đang điều trị ARV với phác đồ có Stavudin (d4T): thay thế dần tiến đến loại trừ việc sử dụng thuốc d4T vào tháng 6/2013. Thuốc d4T chủ yếu được chuyển đổi sang phác đồ có TDF hoặc AZT. Hiện nay Cục Phòng, chống HIV/AIDS đang điều phối toàn bộ các nguồn thuốc ARV do các chương trình, dự án hỗ trợ để cung cấp thuốc ARV điều trị cho bệnh nhân trên toàn quốc.

Phối hợp chặt chẽ với các đối tác trong việc nhập khẩu các dạng bào chế mới của thuốc ARV nhằm tăng cường sự tuân thủ điều trị ở người bệnh đặc biệt việc mua thuốc viên kết hợp 3 loại thuốc TDF/3TC/EFV ngày uống 1 lần.[10] Kể từ ca nhiễm HIV được phát hiện đầu tiên tại Mỹ từ năm 1981, cho đến nay loài người đã trải qua 30 năm đối phó với một đại dịch quy mô lớn, phức tạp, tính đến cuối năm 2009, có 33,3 triệu người đang bị nhiễm HIV, tỷ lệ người nhiễm HIV trong nhóm tuổi 15-49 là 0,8%. Riêng năm 2009 ước tính có 2,6 triệu người nhiễm mới HIV và 1,8 triệu người tử vong do AIDS. So sánh với năm 1999, số người nhiễm mới HIV đã giảm 21%. Báo cáo UNAIDS cũng ghi nhận tính cuối năm 2009 đã có 33 nước có số ca nhiễm mới giảm, trong đó 22 nước khu vực cận Saharan, Châu Phi.

Tuy nhiên hiện vẫn còn 7 nước tỷ lệ nhiễm mới tăng trên 25% khi so sánh giữa năm 1999 và 2009[11]. Các phương pháp phân tích định lượng thuốc HIV 1. Các phương pháp sắc ký (HPLC & HPTLC) Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau, nhất là trong việc tách và phân tích lượng vết các chất. Phương pháp HPLC với cột tách pha đảo được sử dụng rất rộng rãi để xác định thuốc HIV trong các loại mẫu khác nhau do có nhiều ưu thế so với các phương pháp khác vì có độ chính xác, độ nhạy, độ lặp lại cao, khoảng tuyến tính rộng… Detector ghép nối trong máy HPLC cho phép phát hiện sự xuất hiện chất sau khi rửa giải.

Hiện nay có rất nhiều loại detector được sử dụng cho mục đích này đã mở rộng khả năng phân tích được rất nhiều loại chất bằng phương pháp HPLC. Đối với 7 phân tích dư lượng, detector khối phổ (MS) là một sự lựa chọn ưu tiên do có thể phát hiện và phân tích chất trong các đối tượng phức tạp. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) với pha động là 20mM đệm Natri photphats (8mM muối Natrioctanesulphonic acid) : axetolnitril (04:01,v/v), pH= 3,5 điều chỉnh bằng acid photphoric. Pha tĩnh là Cột C18-ODS Hypersil (5µm x 250mm x 4,6mm).

Thời gian lưu của mỗi chất là Stavudine là 2,85 phút, Lamivudine là 4,33 phút và Nevirapine là 8,39 phút.[26] Xác định bằng Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao với dung môi pha động là chloroform: methanol(9:1,v/v), pha tĩnh là bản mỏng Silicagen 60F 254 và định lượng các chất ở bước song hấp thụ 265nm. Hệ số lưu giữ của Stavudine, Lamivudine và Nevirapine lần lượt là 0.[26] Xác định thuốc HIV trong huyết tương bằng phương pháp LC-MS/MS với metaxalone là chất chuẩn nội với giai đoạn đầu tiên là Chiết pha rắn, sau đó sử dụng cột C18 (5µm x 150mm x 3.9mm) pha động là 0.5% acetic băng trong nước : axetolnitril (20:80,v/v). Các ion được tách ra và theo dõi trên máy phổ khối tứ cực. Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis - CE) Gần đây, phương pháp CE được sử dụng rộng rãi do tính chất ưu việt về hiệu quả tách cao, thời gian tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít.

Phương pháp đã được ứng dụng để tách và xác định thuốc HIV trong nhiều đối tượng mẫu khác nhau. Xác định Lamivudin (3TC), Stavudine( d4T) và Nevirapin (NVP) bằng phương pháp MEKC. Tác giả đã sử dụng Cột mao quản silica trần dài 73,5 cm (chiều dài hiệu dụng 62cm), đường kính trong là 75µm. Dung dịch điện li nền bao gồm 10mM sodium tetraborat (pH= 9,8), 100mM sodiumdodecylsunphat (SDS) và 15%(v/v) 2- propanol.Bơm mẫu bằng áp suất 50mbar trong 9s.

Tất cả các chất được tách ra trong vòng 14 phút.