Tổng quan nghiên cứu

Theo báo cáo của ngành y tế, tính đến tháng 5 năm 2012, Việt Nam có khoảng 66.191 người nhiễm HIV, trong đó 62.654 người lớn và 3.537 trẻ em, với 70% bệnh nhân đang điều trị ARV tập trung tại 10 tỉnh thành, đặc biệt Thành phố Hồ Chí Minh chiếm 30,9% tổng số bệnh nhân điều trị. Trên thế giới, năm 2008 có khoảng 2,7 triệu người nhiễm mới HIV, và liệu pháp điều trị kháng retrovirus (ARV) đã giúp kéo dài sự sống cho hàng triệu người. Tại Việt Nam, thuốc kháng HIV như Lamivudine (3TC), Zidovudine (AZT) và Nevirapine (NVP) được sử dụng phổ biến trong phác đồ điều trị phối hợp nhằm nâng cao hiệu quả và giảm nguy cơ kháng thuốc.

Việc kiểm soát chất lượng thuốc kháng HIV là rất quan trọng để đảm bảo an toàn và hiệu quả điều trị. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) hiện được sử dụng rộng rãi nhưng có nhược điểm về chi phí và tác động môi trường do sử dụng dung môi hữu cơ. Do đó, nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng các hoạt chất kháng HIV bằng phương pháp điện di mao quản (CE) với ưu điểm về hiệu quả tách cao, thời gian phân tích nhanh và tiêu hao mẫu thấp là cần thiết. Mục tiêu nghiên cứu là phát triển và tối ưu hóa phương pháp CE, đặc biệt kỹ thuật điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC), để định lượng đồng thời Lamivudine, Zidovudine và Nevirapine trong chế phẩm thuốc kháng HIV, góp phần nâng cao công tác quản lý chất lượng thuốc tại Việt Nam.

Phạm vi nghiên cứu tập trung vào các chế phẩm viên nén chứa 3TC, AZT và NVP sản xuất trong giai đoạn 2011-2013, sử dụng thiết bị điện di mao quản hiện đại tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. Nghiên cứu có ý nghĩa thực tiễn lớn trong việc cung cấp phương pháp phân tích nhanh, chính xác, thân thiện môi trường, hỗ trợ kiểm soát chất lượng thuốc kháng HIV trong sản xuất và lưu hành.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Phương pháp điện di mao quản (Capillary Electrophoresis - CE) dựa trên nguyên tắc tách các ion trong mao quản dưới tác dụng của điện trường cao, với sự phân tách dựa trên độ linh động điện di khác nhau của các phân tử. Kỹ thuật CE có nhiều kiểu tách, trong đó điện di mao quản vùng (CZE) và điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) được ứng dụng phổ biến trong phân tích dược phẩm.

MEKC là sự kết hợp giữa sắc ký và điện di, sử dụng các micelle (mixen) như pha tĩnh giả để tách các chất trung tính và mang điện tích dựa trên sự phân bố động học giữa pha micelle và pha động. Chất hoạt động bề mặt anion như Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) được dùng để tạo micelle, giúp tách hiệu quả các hoạt chất kháng HIV có tính chất hóa học khác nhau.

Ba khái niệm chính trong nghiên cứu gồm:

  • Độ điện di hiệu dụng (µef): đại lượng thể hiện tốc độ di chuyển của chất phân tích trong mao quản sau khi trừ đi tốc độ dòng điện di thẩm thấu (EOF).
  • Hệ số phân bố nhiệt động (Ki): xác định sự phân bố của chất phân tích giữa pha micelle và pha động, ảnh hưởng đến thời gian lưu và độ phân giải.
  • Độ phân giải (R): chỉ số đánh giá khả năng tách biệt các pic trên điện di đồ, phụ thuộc vào điều kiện pH, nồng độ SDS, điện thế và nhiệt độ.

Ngoài ra, các cyclodextrin (CD) được nghiên cứu như pha tĩnh giả trong CE nhằm tăng khả năng tách các đồng phân quang học, tuy nhiên trong nghiên cứu này β-cyclodextrin không phù hợp để tách ba hoạt chất 3TC, AZT và NVP.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu chính là các chuẩn quốc gia Lamivudine, Zidovudine, Nevirapine và các chế phẩm viên nén chứa các hoạt chất này do các công ty dược phẩm Ấn Độ sản xuất. Thiết bị sử dụng là máy điện di mao quản Agilent CE system 9001 với detector mảng diod (DAD) cho phép quét phổ UV từ 190-400 nm.

Phương pháp phân tích được xây dựng và tối ưu qua các bước:

  • Khảo sát phổ hấp thụ UV để chọn bước sóng phát hiện tối ưu cho từng hoạt chất (270,5 nm cho 3TC, 264,5 nm cho AZT, 268,5 nm cho NVP).
  • Lựa chọn kiểu điện di phù hợp giữa CZE và MEKC, xác định MEKC với SDS là phương pháp tối ưu để tách đồng thời ba hoạt chất.
  • Tối ưu các điều kiện điện di gồm pH dung dịch đệm (chọn pH 9,3), nồng độ chất điện ly (Na2B4O7 10 mM), nồng độ SDS (50 mM), điện thế (20 kV), nhiệt độ mao quản (25°C), thời gian và áp suất bơm mẫu (5 giây, 50 mbar).
  • Thẩm định phương pháp theo các tiêu chí: khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng, tính tương thích hệ thống và tính đặc hiệu.
  • Áp dụng phương pháp vào định lượng các mẫu thuốc thực tế trên thị trường.

Cỡ mẫu nghiên cứu gồm 5-7 mẫu chuẩn với nồng độ khác nhau để xây dựng đường chuẩn, 5 mẫu độc lập để đánh giá độ lặp lại, 6 lần lặp lại để xác định độ đúng và tính tương thích hệ thống. Phương pháp chọn mẫu là lấy mẫu ngẫu nhiên từ các lô thuốc sản xuất trong giai đoạn nghiên cứu.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Lựa chọn bước sóng phát hiện:
    Phổ hấp thụ UV của ba hoạt chất cho thấy bước sóng hấp thụ cực đại lần lượt là 270,5 nm (3TC), 264,5 nm (AZT) và 268,5 nm (NVP). Việc chọn bước sóng riêng biệt giúp tăng độ nhạy và chính xác trong định lượng.

  2. Chọn phương pháp tách:
    Phương pháp CZE không thể tách đồng thời 3TC và NVP do pKa gần nhau, chỉ cho 2 pic trên điện di đồ. Khi thêm SDS 50 mM vào dung dịch đệm (MEKC), cả ba hoạt chất được tách rõ ràng với độ phân giải cao, thời gian phân tích dưới 20 phút.

  3. Ảnh hưởng pH dung dịch đệm:
    pH từ 8,76 đến 10,17 được khảo sát. Ở pH 9,3, các pic tách rõ, đường nền ổn định, thời gian phân tích hợp lý. pH cao hơn làm tăng độ phân giải nhưng kéo dài thời gian phân tích và giảm diện tích pic do ảnh hưởng hấp thụ nền.

  4. Ảnh hưởng nồng độ SDS:
    Nồng độ SDS 25 mM, 50 mM và 75 mM được thử nghiệm. Ở 50 mM SDS, độ phân giải và chiều cao pic tối ưu, thời gian phân tích ngắn hơn so với 75 mM, trong khi 25 mM cho chiều cao pic thấp hơn. Nồng độ SDS cao gây tăng dòng điện và hiệu ứng nhiệt Jun, làm giảm hiệu suất tách.

  5. Đánh giá thẩm định phương pháp:

    • Khoảng tuyến tính: 20-200 µg/mL cho 3TC (r² > 0,999), 5-50 µg/mL cho AZT (r² > 0,998), 25-250 µg/mL cho NVP (r² > 0,998).
    • Độ lặp lại: RSD < 5% cho diện tích pic của cả ba hoạt chất.
    • Độ đúng: Tỷ lệ thu hồi đạt ≥ 99,7% với RSD ≤ 1,8%.
    • Tính tương thích hệ thống: RSD của 6 lần tiêm lặp lại < 2%, độ phân giải Rs > 1,5 giữa các pic.
    • Tính đặc hiệu: Không phát hiện pic nhiễu trong mẫu trắng, xác định rõ các hoạt chất trong mẫu thuốc.

Thảo luận kết quả

Phương pháp MEKC với SDS đã chứng minh hiệu quả vượt trội so với CZE trong việc tách đồng thời ba hoạt chất kháng HIV nhờ cơ chế phân bố vào pha tĩnh giả micelle. Việc tối ưu pH và nồng độ SDS là yếu tố quyết định đến độ phân giải và thời gian phân tích, phù hợp với các nghiên cứu trước đây về phân tích thuốc bằng CE.

Sự lựa chọn pH 9,3 cân bằng giữa độ phân giải và thời gian phân tích, đồng thời giảm ảnh hưởng hấp thụ nền UV, giúp tăng độ nhạy phát hiện. Nồng độ SDS 50 mM là điểm tối ưu tránh hiệu ứng nhiệt Jun và duy trì dòng điện ổn định trong mao quản.

Phương pháp thẩm định cho thấy độ chính xác, độ lặp lại và độ đúng cao, phù hợp với yêu cầu kiểm soát chất lượng thuốc. So với phương pháp HPLC truyền thống, CE tiết kiệm dung môi, thân thiện môi trường và thời gian phân tích nhanh hơn, phù hợp cho phân tích trong phòng thí nghiệm và sản xuất.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ đường chuẩn thể hiện mối quan hệ tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ, bảng tổng hợp các thông số thẩm định như RSD, tỷ lệ thu hồi và độ phân giải Rs để minh chứng tính khả thi của phương pháp.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Triển khai áp dụng phương pháp MEKC trong kiểm soát chất lượng thuốc kháng HIV:
    Các cơ sở sản xuất và kiểm nghiệm thuốc nên áp dụng phương pháp này để định lượng nhanh, chính xác các hoạt chất 3TC, AZT và NVP, giảm chi phí và thời gian phân tích. Thời gian thực hiện: trong vòng 6 tháng.

  2. Đào tạo kỹ thuật viên và cán bộ phân tích về kỹ thuật điện di mao quản:
    Tổ chức các khóa đào tạo chuyên sâu về CE và MEKC nhằm nâng cao năng lực phân tích, đảm bảo vận hành thiết bị và xử lý dữ liệu chính xác. Chủ thể thực hiện: các trường đại học, viện nghiên cứu, phòng kiểm nghiệm. Thời gian: 3-6 tháng.

  3. Nghiên cứu mở rộng ứng dụng CE cho các hoạt chất kháng HIV khác và các thuốc phối hợp:
    Tiếp tục khảo sát và phát triển phương pháp CE cho các thuốc ARV mới, tăng cường khả năng phân tích đa thành phần trong cùng một mẫu. Thời gian: 1-2 năm.

  4. Xây dựng quy trình chuẩn và hướng dẫn kỹ thuật áp dụng CE trong kiểm soát chất lượng thuốc:
    Bộ Y tế và các cơ quan quản lý cần ban hành hướng dẫn kỹ thuật chuẩn, quy trình thẩm định và kiểm tra chất lượng thuốc dựa trên CE để đồng bộ và nâng cao hiệu quả quản lý. Thời gian: 1 năm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Các nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Hóa phân tích, Dược học:
    Luận văn cung cấp kiến thức chuyên sâu về kỹ thuật điện di mao quản và ứng dụng trong phân tích thuốc kháng HIV, hỗ trợ nghiên cứu và phát triển phương pháp phân tích mới.

  2. Cán bộ kiểm nghiệm chất lượng thuốc tại các phòng thí nghiệm và cơ sở sản xuất dược phẩm:
    Tài liệu giúp hiểu rõ quy trình xây dựng và thẩm định phương pháp CE, áp dụng thực tế trong kiểm soát chất lượng thuốc ARV.

  3. Cơ quan quản lý nhà nước về dược phẩm và y tế:
    Thông tin về phương pháp phân tích hiện đại, thân thiện môi trường, hỗ trợ xây dựng chính sách và quy định kiểm soát chất lượng thuốc kháng HIV.

  4. Các nhà sản xuất thuốc kháng HIV và các công ty dược phẩm:
    Hướng dẫn kỹ thuật giúp nâng cao hiệu quả kiểm soát chất lượng nguyên liệu và sản phẩm cuối cùng, đảm bảo an toàn và hiệu quả điều trị cho người bệnh.

Câu hỏi thường gặp

  1. Phương pháp điện di mao quản (CE) có ưu điểm gì so với HPLC trong phân tích thuốc kháng HIV?
    CE tiêu thụ ít dung môi, thời gian phân tích nhanh hơn, hiệu quả tách cao và thân thiện môi trường hơn so với HPLC. Ví dụ, thời gian phân tích MEKC chỉ khoảng 20 phút so với 30-40 phút của HPLC.

  2. Tại sao chọn phương pháp MEKC thay vì CZE để tách ba hoạt chất 3TC, AZT và NVP?
    CZE không tách được đồng thời 3TC và NVP do pKa gần nhau, trong khi MEKC sử dụng micelle SDS giúp tách hiệu quả nhờ cơ chế phân bố vào pha tĩnh giả, tạo độ phân giải cao.

  3. Làm thế nào để tối ưu điều kiện pH và nồng độ SDS trong phương pháp MEKC?
    Thử nghiệm pH từ 8,7 đến 10,2 và SDS từ 25 đến 75 mM cho thấy pH 9,3 và SDS 50 mM là điều kiện tối ưu cân bằng giữa độ phân giải, thời gian phân tích và độ nhạy.

  4. Phương pháp này có thể áp dụng cho các loại thuốc kháng HIV khác không?
    Có thể mở rộng áp dụng cho các hoạt chất khác trong nhóm ARV, tuy nhiên cần khảo sát và tối ưu điều kiện riêng cho từng loại thuốc hoặc phối hợp thuốc.

  5. Độ chính xác và độ lặp lại của phương pháp được đảm bảo như thế nào?
    Qua thẩm định, phương pháp đạt RSD < 5% cho độ lặp lại và tỷ lệ thu hồi ≥ 99,7%, đảm bảo độ chính xác và tin cậy trong phân tích định lượng.

Kết luận

  • Phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) với chất hoạt động bề mặt SDS được xây dựng thành công để định lượng đồng thời Lamivudine, Zidovudine và Nevirapine trong chế phẩm thuốc kháng HIV.
  • Điều kiện tối ưu gồm dung dịch đệm Na2B4O7 10 mM, SDS 50 mM, pH 9,3, điện thế 20 kV, nhiệt độ 25°C, bơm mẫu thủy động học 50 mbar trong 5 giây.
  • Phương pháp có độ chính xác cao, độ lặp lại tốt, khoảng tuyến tính rộng và tính đặc hiệu rõ ràng, phù hợp cho kiểm soát chất lượng thuốc.
  • Nghiên cứu góp phần đa dạng hóa kỹ thuật phân tích thuốc kháng HIV tại Việt Nam, giảm chi phí và tác động môi trường so với phương pháp HPLC truyền thống.
  • Khuyến nghị triển khai áp dụng phương pháp trong các phòng kiểm nghiệm, đào tạo nhân lực và nghiên cứu mở rộng ứng dụng cho các hoạt chất ARV khác trong thời gian tới.

Hành động tiếp theo là tổ chức đào tạo kỹ thuật viên, hoàn thiện quy trình chuẩn và phối hợp với các cơ quan quản lý để đưa phương pháp vào ứng dụng thực tế, góp phần nâng cao chất lượng điều trị HIV/AIDS tại Việt Nam.