Tổng quan luận án
Nghiên cứu xác định dạng tồn tại của các nguyên tố vết trong mẫu sinh học và môi trường là một hướng đi quan trọng của hóa học phân tích hiện đại. Luận án tiến sĩ hóa học của tác giả Lê Thị Duyên với đề tài "Nghiên cứu xác định một số dạng selen trong hải sản bằng phương pháp Von-Ampe hòa tan" (chuyên ngành Hóa phân tích, mã số 62.01, thực hiện tại Viện Hóa học thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Hà Nội, năm 2012; dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Lê Lan Anh và PGS. TS. Lê Đức Liêm) giải quyết bài toán phân tích dạng của selen trong các đối tượng hải sản.
Tính cấp thiết của luận án bắt nguồn từ đặc tính sinh học hai mặt của selen (Se). Selen vừa là nguyên tố vi lượng thiết yếu, tham gia vào cấu trúc trung tâm hoạt hóa của một số enzym chống oxy hóa (như glutathion peroxyđaza), cần thiết cho chức năng tế bào và hỗ trợ phòng ngừa một số bệnh tim mạch hay ung thư; vừa là chất độc có độ độc cao khi vượt ngưỡng cho phép. Khoảng nồng độ selen được phép đưa vào cơ thể người hàng ngày mà không gây độc là rất hẹp, chỉ dao động trong khoảng 50–200 µg/ngày (khuyến cáo cho nam giới là 80 µg/ngày và nữ giới là 55 µg/ngày). Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hàm lượng selen trung bình trong máu người cần đạt trên 0,15 µg/ml để duy trì thể trạng bình thường. Thiếu hụt selen dẫn đến nguy cơ mắc bệnh Keshan (liên quan đến chức năng cơ tim), bệnh Kashin-Beck (gây teo và hoại tử mô sụn) hoặc suy giảm hoạt động tuyến giáp. Ngược lại, tiếp xúc quá liều gây ngộ độc với các biểu hiện đặc trưng như hơi thở có mùi tỏi, rụng tóc, bong tróc móng, tổn thương thần kinh, xơ gan, phù phổi và có thể tử vong.
Khoảng trống nghiên cứu được chỉ ra là mức độ độc tính và hiệu lực sinh học của selen phụ thuộc chặt chẽ vào dạng hóa học cụ thể: các hợp chất vô cơ bậc oxy hóa cao như selenat ($SeO_4^{2-}$) và selenit ($SeO_3^{2-}$) có độ độc rất cao, các hợp chất hữu cơ chứa selen (như selencystin, selenmethionin, dimetyl diselenua) có hoạt tính sinh học cao, trong khi selen nguyên tố hoặc selenua kim loại lại có độc tính thấp. Do đó, việc chỉ xác định hàm lượng tổng selen trong thực phẩm không phản ánh chính xác nguy cơ độc học và giá trị dinh dưỡng. Hải sản là nguồn thực phẩm tích lũy lượng selen đáng kể, nhưng tại Việt Nam trước thời điểm nghiên cứu chưa có quy trình phân tích dạng selen nào được thiết lập trên đối tượng này bằng phương pháp điện hóa.
Mục tiêu tổng quát của luận án:
- Nghiên cứu một cách hệ thống, xác lập các điều kiện từ lấy, bảo quản, xử lý, chiết tách, làm giàu đến ghi đo xác định chính xác và tin cậy một số dạng selen trong mẫu hải sản.
Các nhiệm vụ cụ thể được đánh số theo văn bản:
- Nghiên cứu tính chất điện hóa, xác lập các điều kiện và thông số máy tối ưu xác định các dạng selenit (Se(IV)), selencystin (Se-Cyst), dimetyl diselenua (DMDSe) bằng phương pháp Von-Ampe hòa tan trên điện cực giọt treo thủy ngân (HMDE).
- Nghiên cứu điều kiện và quy trình lấy, bảo quản và xử lý mẫu đảm bảo nguyên trạng và toàn vẹn dạng selen trong mẫu hải sản.
- Nghiên cứu các điều kiện tối ưu, chiết tách làm giàu, ghi đo xây dựng quy trình xác định chính xác và tin cậy Se tổng, dạng Se vô cơ và Se hữu cơ trong mẫu hải sản bằng phương pháp Von-Ampe hòa tan sử dụng điện cực HMDE làm điện cực làm việc.
- Đánh giá phương pháp, quy trình và áp dụng phân tích selen tổng và dạng selen trong mẫu thật.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
- Đối tượng phân tích: Ba dạng selen đại diện gồm dạng vô cơ Se(IV) ($SeO_3^{2-}$), hai dạng hữu cơ là selencystin (Se-Cyst, ký hiệu công thức $H_3N^+CH(COO^-)CH_2SeSeCH_2CH(COO^-)NH_3^+$) và dimetyl diselenua (DMDSe, công thức $(CH_3)_2Se_2$), cùng việc xác định chuyển hóa Se(VI) và Se tổng.
- Đối tượng mẫu thực tế: Các loại hải sản tiêu thụ phổ biến tại Việt Nam gồm cá Khoai, tôm Sú, Mực và Ngao, cùng mẫu cá chuẩn quốc tế DORM-2 (hàm lượng Se tổng chứng chỉ 1,40 ± 0,09 mg/kg).
- Phạm vi nghiên cứu: Các thí nghiệm phân tích điện hóa và kiểm chứng được tiến hành tại Viện Hóa học (Hà Nội), bảo vệ năm 2012.
Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án
Luận án tổng quan hệ thống các công trình nghiên cứu về hành vi điện hóa và các phương pháp định lượng selen:
Về tính chất điện hóa của Se(IV), Lingane và Niedrach [11] là những người đầu tiên quan sát sóng khuếch tán của $SeO_3^{2-}$ trên điện cực thủy ngân trong đệm amoni ứng với quá trình khử từ $Se^{+4}$ về $Se^{-2}$. Speranskaya [12] ghi nhận hai sóng khử của Se(IV) trong môi trường axit: sóng thứ nhất khử về Se nguyên tố ($Se^0$), sóng thứ hai khử tiếp về $Se^{-2}$. Christian và các cộng sự [13] khảo sát chi tiết cực phổ của Se(IV) trong các nền axit $H_2SO_4$, $HCl$, $HNO_3$, $HClO_4$ và đệm ortho-photphat 0,2M; xác định bước trao đổi 4 electron tạo kết tủa thủy ngân selenua ($HgSe$) và bước khử 2 electron thuận nghịch tiếp theo của $HgSe$ tạo khí $H_2Se$. Đối với các dạng hữu cơ, Grier và cộng sự [14] quan sát thấy pic khử của Se-Cyst ở thế -0,45 V trong nền $HClO_4$ 0,1M hoặc $H_2SO_4$ 0,1M khi quét CSV. Maria Ochsenkühn-Petropoulou và cộng sự [9] ghi nhận pic của Se-Cyst tại -0,33 ± 0,05 V trong nền $HCl$ 0,1M và DMDSe tại -0,22 ± 0,03 V trong pha hữu cơ khi ghi DPCSV. Rugayah Mohamed và cộng sự [15] quan sát pic khử của DMDSe ở -300 mV trong $HCl$ 0,05M trên đường quét CV.
Về phương pháp xác định hàm lượng tổng selen:
- Phương pháp quang phổ phân tử: Forbes và cộng sự [16] tạo phức giữa Se(IV) với 2,3-diaminonaphtalen ở pH 1 để xác định Se trong đất và cây trồng nhằm so sánh với DPCSV; Lâm Ngọc Thụ và cộng sự [17] dùng thuốc thử trioxyazobenzen đo độ hấp thụ quang tại bước sóng 610 nm để xác định selen trong cây trinh nữ sau khi oxy hóa về Se(VI).
- Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS): Kỹ thuật ngọn lửa (FAAS), lò graphit (GFAAS) và hidrua hóa (HG-AAS) được nhiều nhóm tác giả áp dụng. Araz Bidari và cộng sự [18] dùng GFAAS đạt giới hạn phát hiện (LOD) 2 µg/l trong nước; Hortensia Méndez và cộng sự [19] dùng ET-AAS xác định Se trong hải sản đạt LOD 0,16 µg/g; Isela Lavilla và cộng sự [20] đạt LOD 0,3 µg/g trong cá và giáp xác; Suvarna Sounderajan và cộng sự [21] đạt LOD 0,025 µg/g trong mô cá và máu động vật; Denise Bohrer và cộng sự [24] so sánh GFAAS (LOD 1 µg/l) và HG-AAS (LOD 0,6 µg/l) trong thịt gà; Mindak và cộng sự [25] dùng HG-AAS xác định Se trong thức ăn với LOQ 0,02 mg/kg; Norooz Maleki và cộng sự [26] đạt LOD 10,6 ng/ml trong đất và nước.
- Phương pháp huỳnh quang nguyên tử (AFS): Rosa Sabé và cộng sự [28] xác định Se trong nước tiểu đạt LOD 57 pg/l và LOQ 190 pg/l; Cabañero và cộng sự [29] xác định Se và Hg trong mô cá.
- Phương pháp kích hoạt nơtron (NAA) và khối phổ (ICP-MS): Nguyễn Ngọc Tuấn và cộng sự [40], Nguyễn Giằng và cộng sự [41] ứng dụng NAA xác định Se qua đường ăn uống; Takafumi Kawano và cộng sự [43] dùng MS đạt LOD 90 ng/g; B’Hymer và cộng sự [44] và Thierry Guérin và cộng sự [45] dùng ICP-MS định lượng Se trong hải sản.
- Phương pháp điện hóa: Trần Chương Huyến và cộng sự [30] dùng cực phổ xung vi phân (DPP) định lượng Se ở nồng độ $2 \cdot 10^{-5}$ M trong dược phẩm; Recai İnam và cộng sự [31, 33, 36] xác định Se trong máu (620 ± 44 µg/l), xác định đồng thời Se và Pb, hoặc dùng DPCSV nền $HCl$ 0,1M xác định Se trong sữa bò (khoảng tuyến tính 1,2–75 µg/l); Britta Lange và cộng sự [37] dùng CSV xúc tác với Rh(III) đạt LOD 2,4 pM; Gunnar Mattsson và cộng sự [38] dùng CSV với sự có mặt của Cu(II) đạt LOD 2 ng/l; Claudete Fernandes Pereira và cộng sự dùng DPASV trên điện cực vàng.
Về phân tích dạng selen: Các kỹ thuật ghép nối hiện đại như HPLC-ICP-MS được Maїté Bueno và cộng sự [53], Fangshi Li và cộng sự [60], Orero Iserte và cộng sự [62], Z.C Le và cộng sự [63] sử dụng để tách và định lượng các dạng Se(IV), Se(VI), Se-Cyst, SeMet trong mẫu nước, trầm tích và cá ngừ hộp. Ruoh-Yun Wang và cộng sự [88] dùng IC-ICP-MS phân tích cá kiếm và mẫu DORM-2, ghi nhận việc dùng metanol 80% chiết mẫu chỉ thu hồi được 35% selen dù thu hồi tới 99% asen. Önning [89] và Åkesson và cộng sự [90] sử dụng sắc ký gel kết hợp GFAAS và HG-AAS để tách các hợp chất Se trọng lượng phân tử thấp và cao trong cá.
Tại Việt Nam, các nghiên cứu phân tích dạng vết kim loại đã được thực hiện đối với Hg và As trong mẫu sinh học - môi trường [91, 92], As trong môi trường biển [93–95], Pb, Cd, Cr, Cu trong đất, nước và trầm tích [74, 96–98]. Tuy nhiên, chưa có công trình nào nghiên cứu về phân tích dạng selen trong hải sản.
Khoảng trống nghiên cứu được luận án giải quyết: Phương pháp HPLC-ICP-MS đòi hỏi thiết bị đắt tiền, chi phí vận hành cao và hiệu suất chiết mẫu với dung môi thông thường còn thấp. Phương pháp Von-Ampe hòa tan catot xung vi phân (DPCSV) có độ nhạy tương đương (cỡ $10^{-9}$ đến $10^{-10}$ M), thiết bị gọn nhẹ hơn và cho phép xác định trực tiếp dạng hoạt động điện hóa. Do đó, luận án tập trung lấp đầy khoảng trống về một quy trình phân tích hoàn chỉnh tại Việt Nam: từ xử lý mẫu hải sản không làm biến đổi dạng, kỹ thuật chiết tách định lượng, đến ghi đo đơn lẻ và đồng thời các dạng Se(IV), Se-Cyst và DMDSe bằng phương pháp DPCSV trên điện cực HMDE.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu
Luận án dựa trên cơ sở lý thuyết về phân tích dạng hóa học (chemical speciation analysis), tức nghiên cứu đặc tính hóa học và trạng thái tồn tại của các dạng cụ thể của nguyên tố trong mẫu mà không làm phá vỡ cân bằng hóa lý tự nhiên, phân biệt với phân tích phân đoạn (fractionation).
Cơ chế điện hóa của selen trên điện cực giọt treo thủy ngân (HMDE):
- Dạng vô cơ Se(IV): Trong môi trường axit ($HCl$), quá trình điện hóa trên HMDE diễn ra qua hai giai đoạn liên tiếp:
- Giai đoạn điện phân làm giàu (tích lũy tại thế catot $E_{dep}$ thích hợp): ion selenit phản ứng với bề mặt thủy ngân tạo thành hợp chất thủy ngân selenua không tan bám trên giọt điện cực: $$(Hg) + SeO_3^{2-} + 6H^+ + 4e \rightarrow HgSe\downarrow + 3H_2O$$
- Giai đoạn hòa tan (quét thế phân cực về phía catot): hợp chất $HgSe$ bị khử thuận nghịch trao đổi 2 electron giải phóng selenua hidrô và hoàn nguyên bề mặt giọt thủy ngân, sinh ra dòng pic hòa tan catot ($I_p$): $$HgSe + 2e + 2H^+ \rightarrow Hg + H_2Se$$
- Trong dung dịch có pH cao hơn, Se(IV) có thể tham gia quá trình khử bất thuận nghịch trực tiếp trao đổi 6 electron: $$SeO_3^{2-} + 6H^+ + 6e \rightarrow Se^{2-} + 3H_2O$$
- Dạng hữu cơ Se-Cyst và DMDSe: Cả hai dạng hữu cơ này đều có các nhóm hoạt động điện hóa tương tác với bề mặt thủy ngân ở thế làm giàu thích hợp. Khi quét thế theo chiều catot, quá trình khử diễn ra bất thuận nghịch (chỉ quan sát thấy pic khử trên đường quét thuận, không xuất hiện pic oxy hóa trên đường quét ngược của đường Von-Ampe vòng).
Kỹ thuật ghi đo: Sử dụng kỹ thuật Von-Ampe hòa tan catot xung vi phân (DPCSV). Việc áp dụng các xung vi phân có biên độ và chu kỳ nhất định giúp triệt tiêu dòng dung dịch tụ điện (charging current), cho phép ghi nhận dòng điện hóa thuần túy (Faradaic current) với tỉ số tín hiệu trên nhiễu ($S/N$) cao, xác định nồng độ ở mức nồng độ phần tỷ (ppb).
Phương pháp thực nghiệm và thu thập dữ liệu:
- Hệ thiết bị ghi đo: Máy phân tích cực phổ đa năng 797 VA Computrace (Metrohm, Thụy Sĩ) điều khiển bằng máy vi tính HP; bình điện phân thạch anh 50 ml; hệ 3 điện cực gồm: điện cực làm việc là điện cực giọt treo thủy ngân (HMDE), điện cực so sánh là bạc/bạc clorua ($Ag|AgCl|KCl\text{ 3M}$), và điện cực đối/phù trợ là platin (Pt).
- Thiết bị phụ trợ: Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử lò graphit Perkin-Elmer AA 3300 (dùng để kiểm chứng phương pháp), máy đo pH HM 16S, máy cất nước siêu sạch hai lần UHQ-ELGA, máy ly tâm MISTRAL 1000, cân phân tích độ chính xác 0,01 mg.
- Hóa chất: Các muối chuẩn $Na_2SeO_3$ 99%, $Na_2SeO_4$ 99%, Selencystin 99% (Sigma), DMDSe (Merck); các axit siêu tinh khiết $HCl$ 37%, $HNO_3$ 65%, $H_2SO_4$ 98%, $HClO_4$ 98% (PA, Merck); $LiClO_4 \cdot 5H_2O$ (Sigma-Aldrich); khí $N_2$ 99,99% (Air Liquide); mẫu chuẩn cá DORM-2.
- Quy trình chuẩn bị và xử lý mẫu thực tế: Mẫu hải sản tươi (cá, tôm, ngao) được sơ chế chỉ lấy phần ăn được: tôm bóc vỏ bỏ đầu lấy thịt; cá đánh vẩy, mổ bỏ ruột và đầu; ngao tách vỏ, loại bỏ nội tạng/phân. Toàn bộ phần mô ăn được đem đông khô (lyophilisation) ở -24 °C trong 72 giờ để loại bỏ nước mà vẫn giữ nguyên vẹn liên kết của các dạng selen hữu cơ kém bền nhiệt. Mẫu khô được nghiền mịn, đồng nhất và bảo quản lạnh.
Phương pháp xử lý thống kê: Dữ liệu đo lặp lại 10 lần được xử lý bằng các công cụ thống kê toán học:
- Độ lệch chuẩn mẫu ($S$): $$S = \sqrt{\frac{\sum_{i=1}^{N}(X_i - \bar{X})^2}{N - 1}}$$
- Độ lệch chuẩn trung bình ($S_{\bar{x}}$): $$S_{\bar{x}} = \frac{S}{\sqrt{N}}$$
- Hệ số biến động ($V%$): $$V% = \frac{S}{\bar{X}} \cdot 100$$
- Sử dụng chuẩn Dixon ($Q$-test) để loại bỏ sai số thô khi $N < 10$; dùng chuẩn Student ($t$-test) để đánh giá độ đúng với mẫu chuẩn; dùng chuẩn Fisher ($F$-test) để so sánh phương sai giữa hai phương pháp DPCSV và GFAAS.
- Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) tính toán theo quy tắc $3\sigma$ và $10\sigma$: $$\text{LOD} = \frac{3S}{b}, \quad \text{LOQ} = \frac{10S}{b}$$ trong đó $S$ là độ lệch chuẩn của 10 lần đo mẫu trắng/mẫu nồng độ thấp và $b$ là hệ số góc của đường chuẩn tuyến tính ($I = k \cdot C$).
Nội dung chính theo từng chương
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN
Chương 1 cung cấp cơ sở dữ liệu lý thuyết và thực tiễn về nguyên tố selen, độc tính sinh học, tính chất điện hóa và các phương pháp phân tích:
- Phân bố và dạng tồn tại của selen trong tự nhiên: Selen đứng thứ 17 về khối lượng trên vỏ trái đất, phân bố không đồng đều. Hàm lượng trong đất dao động từ 0,1 ppm (vùng thiếu Se ở New Zealand) đến 1200 ppm (Ireland); nước tự nhiên chứa từ 0,1 µg/l đến 9 mg/l; nước biển chứa khoảng 0,05–0,5 µg/l; thực vật chứa khoảng 0,1 mg/kg khô; động vật chứa từ 0,1 đến vài mg/kg ướt. Selen tồn tại ở ba trạng thái oxy hóa chính: +6, +4 và -2. Bảng 1.1 trong luận án tổng hợp các dạng selen chính trong môi trường và hệ sinh học:
| Tên dạng selen | Ký hiệu | Công thức hóa học |
|---|---|---|
| Selenit | Se(IV) | $SeO_3^{2-}$ |
| Selenat | Se(VI) | $SeO_4^{2-}$ |
| Selencystin | Se-Cyst | $H_3N^+CH(COO^-)CH_2SeSeCH_2CH(COO^-)NH_3^+$ |
| Selenmethionin | SeMet | $H_3N^+-CH(COO^-)-CH_2-CH_2-Se-Me$ |
| Selencystein | - | $H_3N^+-CH(COO^-)-CH_2-SeH$ |
| Dimetyl selenua | DMSe | $(CH_3)_2Se$ |
| Ion trimetyl selen | TMSe | $(CH_3)_3Se^+$ |
| Se-metyl-selencystein | - | $H_3N^+-CH(COO^-)-CH_2-Se-Me$ |
| Se-metyl-selenmethionin | - | $H_3N^+-CH(COO^-)-CH_2-CH_2-Se^+(CH_3)_2$ |
| Selencystathionin | - | $H_3N^+CH(COO^-)CH_2CH_2SeCH_2CH(COO^-)NH_3^+$ |
| Dimetyl diselenua | DMDSe | $(CH_3)_2Se_2$ |
| Dimetyl selenon | - | $(CH_3)_2SeO_2$ |
| Selencystamin | - | $H_2N-CH_2-CH_2-Se-Se-CH_2-CH_2-NH_2$ |
| Selenhomocystein | - | $H_3N^+-CH(COO^-)-CH_2-CH_2-SeH$ |
| $\gamma$-Glutamyl-Se-metylselencystein | - | $H_3N^+CH(COO^-)CH_2CH_2CONHCH(COO^-)CH_2SeCH_3$ |
- Tác động của selen đối với sức khỏe và mức độ độc tính: Luận án dẫn chứng mức độ độc tính chênh lệch rất lớn giữa các dạng qua giá trị liều gây chết trên động vật thực nghiệm (Bảng 1.2):
| Dạng selen | Liều lượng gây chết (mg Se/kg trọng lượng) |
|---|---|
| $Na_2SeO_3$ | 7 (LD50, chuột, ở miệng); 2,3 (LD50, thỏ, ở miệng); 3,25–3,5 (M, chuột, ở bụng); 3 (M, chuột, trong tĩnh mạch) |
| $Na_2SeO_4$ | 5,25–5,75 (M, chuột, ở bụng) |
| Se-Cyst | 4 (M, chuột, ở bụng) |
| SeMet | 4,25 (M, chuột, ở bụng) |
| DMSe | 1.600 (LD50, chuột, ở bụng) |
| TMSe | 49,4 (LD50, chuột, ở bụng) |
| Se nguyên tố | 6.700 (LD50, chuột, ở miệng) |
(Ghi chú: M là liều gây chết nhỏ nhất; LD50 là liều gây chết trung bình).
- Đặc tính điện hóa của selen: Dạng Se(IV) hoạt động điện hóa tốt và cho ba sóng khử tùy thuộc vào pH của môi trường. Bảng 1.3 tổng hợp thế bán sóng ($E_{1/2}$) của Se(IV) trong một số dung dịch nền:
| Nền điện li | Thế bán sóng thứ nhất ($V$) | Thế bán sóng thứ hai ($V$) | Điện cực so sánh |
|---|---|---|---|
| $HNO_3$ 0,1M | -0,083 | -0,561 | SCE |
| $HNO_3$ 1M | -0,021 | -0,411 | SCE |
| $HNO_3$ 2M | -0,34 | -0,850 | Đáy anot Hg |
| $KNO_3$ 2M | -0,185 | -0,861 | SCE |
| $HCl$ 0,1M | -0,011 | -0,541 | SCE |
| $HCl$ 1M | -0,101 | -0,511 | SCE |
| $HClO_4$ 0,1M | -0,098 | -0,541 | SCE |
Dạng Se(VI) trơ điện hóa do tốc độ phản ứng khử trên điện cực quá nhỏ. Về vật liệu điện cực, luận án tổng hợp khoảng thế làm việc (Bảng 1.4): điện cực thủy ngân (Hg) có khoảng thế rộng về phía catot (-1,2 V đến 0,3 V trong $H_2SO_4$ 1M; -2,0 V đến 0,1 V trong $NaOH$ 1M), quá thế hydro lớn, bề mặt giọt luôn được làm mới, rất thích hợp cho kỹ thuật Von-Ampe hòa tan catot.
CHƯƠNG 2 - THỰC NGHIỆM
Chương 2 trình bày chi tiết về trang thiết bị máy móc, chuẩn bị hóa chất, quy trình xử lý mẫu và thiết kế các bước khảo sát tối ưu:
- Pha chế các dung dịch chuẩn: Dung dịch Se(IV) 1000 mg/l (hòa tan 1,376 g $Na_2SeO_3$ trong nước cất siêu sạch định mức 1000 ml); Se(VI) 1000 mg/l (hòa tan 1,32 g $Na_2SeO_4$ có thêm 0,35 ml $HNO_3$ đặc định mức 1000 ml); Se-Cyst 1000 mg/l (hòa tan 0,101 g Se-Cyst trong $HCl$ 0,1M định mức 100 ml); DMDSe 1000 mg/l (hút 51,3 µl, tức 0,102 g DMDSe định mức 100 ml bằng etanol); dung dịch nền $LiClO_4$ 2M trong etanol; axit stearic 1000 mg/l trong etanol; các chuẩn kim loại cản trở Cu(II), Pb(II), Zn(II), Cd(II), Fe(III), As(V).
- Các bước thực nghiệm khảo sát:
- Khảo sát thăm dò tính chất điện hóa bằng Von-Ampe vòng (CV) trên điện cực HMDE đối với từng dạng Se(IV), Se-Cyst và DMDSe.
- Khảo sát đơn biến các điều kiện dung dịch nền và thông số máy nhằm tìm ra giá trị tối ưu để dòng hòa tan $I_p$ đạt cực đại, chân pic thấp và đỉnh pic cân đối, đối xứng.
- Khảo sát ảnh hưởng của các ion kim loại có mặt trong hải sản có khả năng gây nhiễu tín hiệu (xác định ngưỡng nồng độ làm biến thiên tín hiệu dòng $I_p$ vượt quá ±10%).
- Lập đường chuẩn nồng độ ở hai khoảng: khoảng hẹp nồng độ thấp và khoảng nồng độ cao (0,08–1 ppb và 0,8–10 ppb đối với Se(IV); 0,5–8 ppb và 5–45 ppb đối với Se-Cyst; 2–22 ppb đối với DMDSe).
- Đánh giá phương pháp thông qua độ lặp lại (10 phép đo liên tục), xác định LOD, LOQ, đánh giá hiệu suất thu hồi mẫu thêm chuẩn và so sánh thống kê ($F$-test, $t$-test) với phương pháp đối chứng GFAAS trên mẫu thật và mẫu chuẩn cá DORM-2.
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
- Khảo sát tính chất điện hóa bằng Von-Ampe vòng (CV):
- Se(IV) (200 ppb trong $HCl$ 0,1M, dải quét +0,1 V đến -1,0 V, tốc độ 50 mV/s): xuất hiện một pic khử tại thế -0,481 V. Chiều quét ngược từ -1,0 V về +0,1 V không xuất hiện pic oxy hóa.
- Se-Cyst (700 ppb trong $HCl$ 0,1M, dải quét +0,1 V đến -0,8 V, tốc độ 50 mV/s): xuất hiện một pic khử tại thế -0,374 V, chiều quét ngược không có pic oxy hóa.
- DMDSe (50 ppb trong pha hữu cơ $CH_2Cl_2/C_2H_5OH$ tỉ lệ 1:1 có mặt $HCl$ 0,06M và $LiClO_4$ 0,2M, dải quét +0,1 V đến -1,0 V, tốc độ 50 mV/s): xuất hiện một pic khử tại thế -0,288 V, chiều quét ngược không có pic oxy hóa. Kết luận: Cả ba dạng đều có hoạt tính điện hóa và đều trải qua quá trình oxy hóa khử bất thuận nghịch trên điện cực giọt treo thủy ngân.
- Khảo sát lựa chọn các thông số thực nghiệm tối ưu cho Se(IV) và Se-Cyst:
- Lựa chọn nền điện li: So sánh ba nền axit nồng độ 0,1M ($HCl$, $HNO_3$) và 0,05M ($H_2SO_4$). Với Se(IV), $I_p$ trong $H_2SO_4$ đạt 14,1 nA, $HCl$ đạt 11,2 nA, $HNO_3$ đạt 10,4 nA. Với Se-Cyst, $I_p$ trong $HCl$ đạt 26,4 nA, $H_2SO_4$ đạt 23,1 nA, $HNO_3$ đạt 21,9 nA. Nền $HCl$ được chọn cho cả hai chất vì tín hiệu pic cao, cân đối, đồng thời $HCl$ là môi trường bắt buộc dùng để khử Se(VI) về Se(IV) ở 90–100 °C khi xác định Se tổng, tạo sự đồng nhất cho quy trình phân tích.
- Nồng độ $HCl$ (Bảng 3.3): Khảo sát từ 0,01M đến 1,3M. Khi tăng nồng độ axit, thế đỉnh pic dịch chuyển về phía dương hơn và chân pic nâng lên. Nồng độ 0,1M được chọn vì cho $I_p$ cao và chân pic thấp ($I_p$ của Se(IV) là 14,1 nA tại $E_p = -0,452$ V; Se-Cyst là 25,7 nA tại $E_p = -0,351$ V).
| STT | Nồng độ $HCl$ (M) | Se(IV) 2 ppb: $I_p$ (nA) | Se(IV): $E_p$ (V) | Se-Cyst 25 ppb: $I_p$ (nA) | Se-Cyst: $E_p$ (V) |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 0,01 | 9,2 | -0,463 | 19,5 | -0,422 |
| 2 | 0,05 | 14,0 | -0,458 | 22,2 | -0,374 |
| 3 | 0,10 | 14,1 | -0,452 | 25,7 | -0,351 |
| 4 | 0,30 | 13,7 | -0,414 | 25,3 | -0,327 |
| 5 | 0,50 | 15,0 | -0,406 | 25,7 | -0,287 |
| 6 | 1,00 | 14,7 | -0,398 | 26,7 | -0,279 |
| 7 | 1,30 | 8,4 | -0,406 | 25,0 | -0,271 |
- Thế điện phân làm giàu ($E_{dep}$) (Bảng 3.4): Khảo sát từ 0 đến -0,4 V. $E_{dep}$ tối ưu được chọn là -0,3 V đối với Se(IV) ($I_p = 12,2$ nA) và -0,2 V đối với Se-Cyst ($I_p = 28,4$ nA), đảm bảo cách xa thế đỉnh pic ít nhất 0,2 V ($\Delta E \ge 0,2$ V).
| STT | $E_{dep}$ (V) | 0 | -0,05 | -0,1 | -0,2 | -0,3 | -0,35 | -0,4 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | $I_p$ Se(IV) (nA) | 7,05 | 9,28 | 10,5 | 12,0 | 12,2 | 11,7 | 10,6 |
| 2 | $I_p$ Se-Cyst (nA) | - | 26,7 | 27,8 | 28,4 | 8,47 | - | - |
- Thời gian điện phân làm giàu ($t_{dep}$) (Bảng 3.5): Khảo sát từ 30 s đến 200 s. $I_p$ tăng dần theo thời gian tích lũy, tuy nhiên ở thời gian 200 s pic bị biến dạng. Luận án chọn $t_{dep} = 90$ s cho cả hai chất trong các phép đo tiêu chuẩn ($I_p$ đạt 11,4 nA với Se(IV) và 41,9 nA với Se-Cyst).
| STT | Thời gian điện phân (s) | 30 | 60 | 90 | 120 | 150 | 180 | 200 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | $I_p$ Se(IV) (nA) | 4,2 | 7,8 | 11,4 | 14,6 | 19,3 | 16,7 | Biến dạng |
| 2 | $I_p$ Se-Cyst (nA) | 11,3 | 27,8 | 41,9 | 51,5 | 63,6 | 70,8 | Biến dạng |
- Tốc độ quét thế ($v$) (Bảng 3.6): Khảo sát từ 0,01 đến 0,06 V/s. Tốc độ quét nhanh làm chân pic nâng cao và pic mất cân đối. Tốc độ quét 0,02 V/s được lựa chọn ($I_p$ của Se(IV) đạt 13,1 nA, Se-Cyst đạt 38,8 nA).
| STT | Tốc độ quét (V/s) | 0,01 | 0,015 | 0,02 | 0,03 | 0,04 | 0,06 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | $I_p$ Se(IV) (nA) | 10,9 | 12,4 | 13,1 | 13,5 | 13,5 | 13,8 |
| 2 | $I_p$ Se-Cyst (nA) | 30,6 | 37,6 | 38,8 | 43,2 | 43,3 | 48,8 |
- Biên độ xung (Bảng 3.7): Khảo sát từ 0,03 đến 0,18 V. Biên độ xung quá lớn làm pic biến dạng. Giá trị tối ưu được chọn là 0,05 V ($I_p$ Se(IV) đạt 13,9 nA, Se-Cyst đạt 31,1 nA).
- Thời gian đặt xung (Bảng 3.8): Khảo sát từ 0,005 s đến 0,060 s. Khi thời gian đặt xung quá ngắn chân pic rất cao; khi quá dài dòng $I_p$ giảm mạnh. Thời gian đặt xung tối ưu là 0,02 s ($I_p$ Se(IV) đạt 16,6 nA, Se-Cyst đạt 74,5 nA).
- Tốc độ khuấy dung dịch (Bảng 3.9): Khảo sát từ 400 đến 2800 vòng/phút. Tốc độ 2000 vòng/phút được chọn vì cho độ lặp lại cao nhất và không làm rơi giọt thủy ngân ($I_p$ Se(IV) là 16,6 nA, Se-Cyst là 56,5 nA).
- Kích thước giọt thủy ngân (Bảng 3.10): Khảo sát từ cỡ 1 đến cỡ 9. Cỡ giọt số 6 được chọn để đảm bảo diện tích bề mặt điện cực ổn định và tránh giọt bị rơi ($I_p$ Se(IV) đạt 16,8 nA, Se-Cyst đạt 79,3 nA).
- Thời gian cân bằng/nghỉ (Bảng 3.11): Khảo sát từ 5 s đến 40 s. Thời gian cân bằng 15 s cho tín hiệu dòng ổn định và độ lặp lại tốt nhất ($I_p$ Se(IV) đạt 16,2 nA, Se-Cyst đạt 74,6 nA).
- Thời gian sục khí trơ $N_2$ đuổi oxy (Bảng 3.12): Khảo sát từ 0 s đến 400 s. Khi không sục khí, sóng oxy gây nhiễu nghiêm trọng (Se(IV) chỉ đạt 19,2 nA và pic bị nâng cao, Se-Cyst hoàn toàn không xuất hiện pic). Thời gian sục khí 300 s cho dòng cực đại và ổn định ($I_p$ Se(IV) đạt 23,7 nA, Se-Cyst đạt 76,8 nA).
Bảng 3.13 tổng hợp các điều kiện tối ưu để phân tích riêng rẽ Se(IV) và Se-Cyst:
| Thông số kỹ thuật ghi đo | Dạng Se(IV) (2 ppb) | Dạng Se-Cyst (25 ppb) |
|---|---|---|
| Điện cực làm việc | HMDE | HMDE |
| Chế độ ghi đo | Xung vi phân (DP) | Xung vi phân (DP) |
| Kích thước giọt thủy ngân | Cỡ 6 | Cỡ 6 |
| Tốc độ khuấy dung dịch | 2000 vòng/phút | 2000 vòng/phút |
| Thời gian sục khí $N_2$ | 300 s | 300 s |
| Nền điện li $HCl$ | 0,05M ÷ 1M (chọn 0,1M) | 0,1M ÷ 1M (chọn 0,1M) |
| Thế điện phân làm giàu ($E_{dep}$) | -0,2 V ÷ -0,3 V (chọn -0,3 V) | -0,1 V ÷ -0,2 V (chọn -0,2 V) |
| Thời gian điện phân làm giàu ($t_{dep}$) | 90 s ÷ 150 s (chọn 90 s) | 90 s ÷ 150 s (chọn 90 s) |
| Thời gian cân bằng | 15 s | 15 s |
| Biên độ xung | 0,05 V | 0,05 V |
| Thời gian đặt xung | 0,02 s | 0,02 s |
| Tốc độ quét thế | 0,02 V/s | 0,02 V/s |
| Khoảng thế quét | -0,2 V ÷ -0,7 V | -0,2 V ÷ -0,7 V |
- Khả năng xác định đồng thời Se(IV) và Se-Cyst: Dựa trên khoảng cách tách biệt về thế đỉnh pic giữa Se-Cyst (khoảng -0,35 V) và Se(IV) (khoảng -0,45 V) trong cùng nền $HCl$ 0,1M, tác giả xác lập điều kiện ghi đo đồng thời cả hai dạng trong cùng một phép đo DPCSV (Bảng 3.14): thế điện phân làm giàu được đặt cố định ở -0,2 V, thời gian làm giàu 90–150 s, các thông số xung và thủy động học tương tự như bảng 3.13. Phép ghi đo trên mẫu tự tạo (chứa 2 ppb Se(IV) và 10 ppb Se-Cyst) bằng phương pháp thêm chuẩn thu được hai pic tách biệt hoàn toàn, định lượng chính xác cả hai dạng.
Kết quả và những đóng góp mới
Các đóng góp mới của luận án được tác giả khẳng định:
- Đã nghiên cứu thiết lập các điều kiện tối ưu, lần đầu tiên ở Việt Nam, xây dựng thành công phương pháp xác định riêng rẽ các dạng Se(IV), Se-Cyst, DMDSe cũng như đồng thời chính xác và tin cậy hai dạng Se(IV) và Se-Cyst bằng cùng một phép ghi đo DPCSV.
- Đã nghiên cứu thành công kỹ thuật chiết tách tối ưu, toàn vẹn và định lượng các dạng selen từ mẫu hải sản.
- Đã nghiên cứu thiết lập được quy trình hoàn chỉnh từ lấy, bảo quản, xử lý mẫu, chiết tách và xác định ba dạng selen (Se(IV), Se-Cyst, DMDSe) trong mẫu cá Khoai, tôm Sú và Mực bằng phương pháp DPCSV.
Kiến nghị và giải pháp đề xuất từ kết quả nghiên cứu:
- Ứng dụng quy trình phân tích DPCSV vào công tác kiểm nghiệm thực phẩm tại các phòng thí nghiệm phân tích trong nước nhằm kiểm soát hàm lượng dạng độc Se(IV) và các dạng selen hữu cơ trong hải sản thương phẩm.
- Sử dụng kỹ thuật đông khô (-24 °C trong 72 giờ) làm tiêu chuẩn chuẩn bị mẫu sinh học biển nhằm đảm bảo tính toàn vẹn của các hợp chất cơ selen kém bền nhiệt.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
Hạn chế của nghiên cứu:
- Luận án mới chỉ tập trung phân tích định lượng ba dạng selen cụ thể (Se(IV), Se-Cyst, DMDSe) và Se tổng; chưa mở rộng định lượng trực tiếp các dạng axit amin selen quan trọng khác như selenmethionin (SeMet) hay selenoprotein trong cùng một phép đo do các dạng này có đặc tính điện hóa tương đồng hoặc chưa tối ưu hóa được điều kiện tách trên điện cực giọt treo thủy ngân.
- Dạng Se(VI) trơ điện hóa trên HMDE nên không thể xác định trực tiếp bằng DPCSV mà bắt buộc phải qua bước chuyển hóa hóa học (khử về Se(IV) bằng đun nóng với $HCl$ đặc ở 90–100 °C) để tính toán qua hàm lượng hiệu số.
- Phương pháp sử dụng điện cực giọt treo thủy ngân (HMDE), mặc dù cho bề mặt điện cực sạch và độ nhạy cao nhưng đòi hỏi xử lý cẩn trọng đối với chất thải thủy ngân kim loại trong phòng thí nghiệm.
Hướng nghiên cứu tiếp:
- Nghiên cứu phát triển các loại vật liệu điện cực làm việc thân thiện môi trường hơn (như điện cực màng bismut, điện cực than mềm biến tính hoặc điện cực vàng) để thay thế điện cực giọt thủy ngân trong phân tích dạng selen.
- Mở rộng phạm vi nghiên cứu sang các loài thủy hải sản khác và các loại thực phẩm giàu selen trên cạn, hoàn thiện quy trình tách phân đoạn các hợp chất selen hữu cơ phức tạp.
Giá trị tham khảo
Luận án có giá trị tham khảo học thuật và ứng dụng thực tiễn:
- Đối với nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên chuyên ngành Hóa phân tích và Hóa điện hóa: Luận án là tài liệu tham khảo chi tiết về phương pháp luận tối ưu hóa đa thông số trên thiết bị cực phổ Von-Ampe, cơ chế khử điện hóa trên điện cực giọt treo thủy ngân, và kỹ thuật phân tích dạng vết nguyên tố. Các bảng dữ liệu khảo sát đơn biến trong Chương 3 cung cấp mô hình thực nghiệm chuẩn mực cho nghiên cứu điện hóa phân tích.
- Đối với các viện nghiên cứu dinh dưỡng, trung tâm y tế dự phòng và cơ quan kiểm nghiệm vệ sinh an toàn thực phẩm: Cung cấp quy trình phân tích tin cậy, chi phí hóa chất và thiết bị thấp hơn đáng kể so với hệ thống sắc ký ghép khối phổ (HPLC-ICP-MS), phù hợp với điều kiện cơ sở vật chất của nhiều phòng kiểm nghiệm tại Việt Nam.
- Đối với cán bộ nghiên cứu môi trường biển và nuôi trồng thủy sản: Cung cấp phương pháp chuẩn bị mẫu bằng kỹ thuật đông khô bảo toàn dạng hóa học và các dẫn liệu thực nghiệm về hàm lượng vết selen trong cá Khoai, tôm Sú và Mực.
Câu hỏi thường gặp
1. Tại sao cần phải phân tích dạng tồn tại của selen thay vì chỉ xác định hàm lượng tổng selen trong hải sản?
Độ độc và hiệu lực sinh học của selen phụ thuộc vào dạng hóa học cụ thể. Khoảng nồng độ có lợi cho cơ thể người rất hẹp (50–200 µg/ngày). Dạng vô cơ Se(IV) ($Na_2SeO_3$) cực độc với liều gây chết trung bình qua đường miệng ở chuột là 7 mg/kg; các dạng hữu cơ như Se-Cyst và SeMet có hoạt tính sinh học cao với liều gây chết nhỏ nhất ở chuột là 4–4,25 mg/kg; trong khi dimetyl selenua (DMSe) có LD50 lên tới 1600 mg/kg và Se nguyên tố là 6700 mg/kg. Do đó, chỉ xác định hàm lượng tổng sẽ không đánh giá được chính xác mức độ an toàn hay nguy cơ ngộ độc của thực phẩm.
2. Cơ chế quá trình làm giàu và hòa tan của Se(IV) trên điện cực HMDE trong môi trường axit diễn ra như thế nào?
Trong môi trường axit $HCl$, tại thế điện phân làm giàu ($E_{dep} = -0,3$ V), ion $SeO_3^{2-}$ bị khử 4 electron và phản ứng với bề mặt giọt thủy ngân tạo lớp kết tủa thủy ngân selenua không tan:
$$(Hg) + SeO_3^{2-} + 6H^+ + 4e \rightarrow HgSe\downarrow + 3H_2O$$
Khi quét thế catot theo chiều âm, hợp chất $HgSe$ bị khử thuận nghịch trao đổi 2 electron tạo ra dòng pic hòa tan catot ($I_p$) đặc trưng:
$$HgSe + 2e + 2H^+ \rightarrow Hg + H_2Se$$
3. Làm thế nào để phân tích đồng thời hai dạng Se(IV) và Se-Cyst trong cùng một phép ghi đo DPCSV?
Luận án chỉ ra rằng trong nền $HCl$ 0,1M, thế đỉnh pic hòa tan của Se-Cyst xuất hiện ở khoảng -0,35 V và Se(IV) ở khoảng -0,45 V. Khoảng cách thế đỉnh này đủ lớn để ghi nhận hai pic tách biệt mà không bị chồng lấn tín hiệu. Tác giả chọn thế điện phân làm giàu cố định ở -0,2 V (dương hơn cả hai thế đỉnh pic), thời gian làm giàu 90 s, tốc độ quét thế 0,02 V/s, biên độ xung 0,05 V và dùng phương pháp thêm chuẩn để định lượng đồng thời cả hai dạng.
4. Vì sao kỹ thuật đông khô được lựa chọn để xử lý mẫu hải sản trong luận án?
Yêu cầu nghiêm ngặt nhất của phép phân tích dạng là phải giữ nguyên trạng thái cân bằng hóa lý và không làm biến đổi dạng hóa học ban đầu của nguyên tố. Các hợp chất cơ selen rất kém bền nhiệt. Kỹ thuật đông khô (lyophilisation) ở -24 °C trong 72 giờ giúp thăng hoa loại bỏ toàn bộ lượng nước trong mô ăn được của cá, tôm, mực ở nhiệt độ âm mà không làm gãy đứt các liên kết hữu cơ của selen, giúp mẫu dễ nghiền đồng nhất và bảo quản lâu dài.
5. Vì sao dạng Se(VI) không thể xác định trực tiếp bằng phương pháp Von-Ampe hòa tan trên điện cực thủy ngân?
Dạng Se(VI) ($SeO_4^{2-}$) là dạng không hoạt động điện hóa trên điện cực giọt treo thủy ngân do tốc độ phản ứng khử điện cực của nó cực kỳ nhỏ. Để xác định Se(VI) hoặc Se tổng, bắt buộc phải khử Se(VI) về dạng hoạt động điện hóa Se(IV) bằng phản ứng hóa học (đun nóng mẫu trong môi trường $HCl$ đặc ở nhiệt độ 90–100 °C), sau đó tiến hành ghi đo DPCSV của Se(IV) tạo thành.
Kết luận
Luận án tiến sĩ của tác giả Lê Thị Duyên đã giải quyết bài toán phân tích dạng vết của selen trong hải sản bằng phương pháp Von-Ampe hòa tan catot xung vi phân (DPCSV) trên điện cực giọt treo thủy ngân (HMDE). Tác giả đã làm rõ bản chất điện hóa bất thuận nghịch của Se(IV), Se-Cyst, DMDSe, đồng thời thiết lập hệ thống các thông số tối ưu cho phép đo riêng rẽ và đồng thời các dạng trong dung dịch nền $HCl$ 0,1M. Công trình đã xây dựng quy trình thực nghiệm từ khâu xử lý bảo quản mẫu bằng đông khô ở -24 °C, chiết tách định lượng, đến ứng dụng phân tích mẫu thật cá Khoai, tôm Sú và Mực với độ tin cậy được kiểm chứng qua mẫu chuẩn quốc tế DORM-2. Kết quả của luận án là tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu chuyên sâu về hóa học phân tích dạng vết và kỹ thuật kiểm nghiệm an toàn thực phẩm.