ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, đời sống ngày càng phát triển, con người càng quan tâm hơn đến các vấn đề về thực phẩm bẩn, nhiễm độc, thậm chí là trong cả thức ăn cho động vật. Cần phải có các biện pháp phù hợp để kiểm tra, quản lý vấn đề nhức nhối này. Còn đối với EG, ngộ độc EG có thể gây suy gan, suy thận, có thể ảnh hưởng tới cả tính mạng nếu nồng độ cao. Riêng với loài mèo, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng hai chất này sử dụng lâu có thể ảnh hưởng đến sức khỏe của mèo, thậm chí gây ngộ độc cấp, dẫn tới tử vong.
Như vậy, hai chất này là hai chất có độc tính mạnh, có thể gây ảnh hưởng lớn tới sức khoẻ của mèo, thậm chí tử vong. Vì vậy, cần phải kiểm soát các chất này trong thức ăn của mèo. Hiện nay có rất nhiều phương pháp được sử dụng để định lượng EG và DEG trong thức ăn cho mèo như phương pháp sắc ký khí – khối phổ (GC – MS), sắc ký khí – ion hóa ngọn lửa (GC – FID), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC),… Mỗi phương pháp đều có ưu nhược điểm nhất định, tuy nhiên các phương pháp GC cần thời gian phân tích lâu hơn, không phù hợp vì EG và DEG đều là những chất có độc tính, cần phân tích nhanh, phương pháp HPLC thì có LOD và LOQ cao, độ đặc hiệu lại kém, cần có một phương pháp phân tích đáng tin cậy với độ nhạy phù hợp để kiểm soát nồng độ EG và DEG trong thức ăn cho mèo. Xuất phát từ nhu cầu trên và những đặc tính ưu việt của kỹ thuật LC-MS/MS trong phân tích, nhóm nghiên cứu đã tiến hành đề tài: “Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định Ethylene glycol và Diethylene glycol trong thực phẩm bằng sắc ký lỏng khối phổ”, trong đó chủ yếu nhóm nghiên cứu hướng tới xác định 2 chất này trong thức ăn cho mèo với 2 mục tiêu sau: 1.
Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định Ethylene glycol và Diethylene glycol trong thực phẩm cho mèo bằng kỹ thuật LC-MS/MS. Áp dụng phương pháp trên để xác định hàm lượng Ethylene glycol và Diethylene glycol trong một số mẫu thực phẩm cho mèo trên thị trường. Tổng quan về Ethylene glycol 1. Khái quát chung Ethylene glycol là chất lỏng trong suốt, không mùi, ít bay hơi, có tính chất hút ẩm, có độ nhớt thấp.
Ethylene glycol được sử dụng chủ yếu như một nguyên liệu thô trong sản xuất sợi polyester và cho các công thức chống ăn mòn. Ngoài ra ethylene glycol còn được dùng như một loại siro vị ngọt không màu, không mùi. Chất này có độc tính vừa phải. Định danh và tính chất lý hóa 1.
Định danh Thông tin về định danh hóa học của EG [21] được thể hiện trong bảng 1-1. Định danh hóa học của EG Đặc điểm Thông tin Tên hóa học Ethylene glycol Tên khác và tên Ethan-1,2-diol, 1,2-ethandiol, ethylen alcohol, thương mại hypodicarbonous acid, 1,2-dihydroxyethan Công thức hóa C2H6O2 học Công thức cấu tạo Cấu trúc hóa học HO – CH2 – CH2 - OH 1. Tính chất lý hóa Một số tính chất lý học, hóa học của EG [21] được trình bày trong bảng 1-2. Bảng 1 - 1: Tính chất lý hóa của EG Đặc tính Thông tin Khối lượng phân tử 62,07 Màu sắc Không màu Trạng thái vật lý Lỏng Nhiệt độ nóng chảy -13,0oC Nhiệt độ sôi 197,3oC Tỷ trọng ở 20oC (g/cm3) 1,11351 pKa 15,1 Mùi, vị Không mùi, vị ngọt Độ tan 2 Đặc tính Thông tin - Trong nước - Trộn lẫn được với nước - Trong dung môi hữu cơ - Tan trong alcol, eter, benzen, acteton,… Hệ số log Kow (n – octanol/nước) -1,36 Độ nhớt 1,61×10-2 N*s/m² 1.
Độc tính Ngộ độc ethylene glycol có thể nhanh chóng dẫn đến suy thận cấp không hồi phục và tổn thương cơ quan khác, mang một tiên lượng nghiêm trọng trừ khi được chẩn đoán sớm và bắt đầu điều trị đầy đủ trong vòng 8 giờ sau khi uống. Độc tính của ethylene glycol có liên quan đến việc sản xuất các chất chuyển hóa độc hại bởi enzyme rượu dehydrogenase (ADH), dẫn đến các dấu hiệu sớm của đa niệu nặng (PU) và chứng chảy nước mắt (PD), viêm dạ dày, mất điều hòa và suy nhược thần kinh trung ương, tiếp theo là mất nước dần dần, và cuối cùng là suy thận thiểu niệu. Ngoài chăm sóc hỗ trợ chung, các can thiệp điều trị phải bao gồm cả thuốc giải độc ngăn chặn chuyển hóa qua trung gian ADH hoặc máu kỹ thuật thanh lọc để loại bỏ cả hợp chất gốc và các chất chuyển hóa độc hại [7]. Ethylene glycol là một chất độc hại được báo cáo là gây ra tổn thương không thể phục hồi đối với thận và ảnh hưởng đến gan, tim mạch và hệ thống thần kinh trung ương.
Chất này không mùi, và có vị ngọt. Nếu không bắt đầu điều trị thích hợp trong vòng vài giờ, sẽ dẫn tới tiên lượng nghiêm trọng với tiến triển từ tổn thương thận cấp đến suy thận cấp. Các trường hợp nhiễm độc ethylene glycol ở chó và mèo đã được báo cáo thường xuyên tại Hoa Kỳ. 510 trường hợp phơi nhiễm ethylene glycol ở động vật, trong đó 98% là chó và mèo, được tổng hợp bởi ASPCA National Animal Trung tâm kiểm soát chất độc ở Illinois, Hoa Kỳ, từ 1995–1997.
Báo cáo trường hợp cá nhân về ethylene độc tính cũng đã được công bố trong địa lý khác các địa điểm bao gồm Thụy Sĩ, Nam Phi và Tây Ban Nha [7]. Tiêu thụ một lượng nhỏ EG cũng đủ để gây tử vong cho mèo với LD50 của EG qua đường miệng cho mèo là 1650 mg/kg [3]. Theo thông tin tìm kiếm từ Trung tâm kiểm soát độc động vật của Mỹ (APCC) và FDA, không tìm thấy tài liệu cho thấy EG được dùng với vai trò phụ gia trực tiếp cho vào thực phẩm. Tổng quan về Diethylene glycol 1.
Khái quát chung Diethylene glycol là chất lỏng trong suốt, không màu, thực tế không mùi, nhớt, hút ẩm với vị ngọt. Chất này thường được sử dụng làm dung môi và thành phần trong nhiều sản phẩm tiêu dùng, ví dụ như chế phẩm chống đông, chất tẩy giấy dán tường, 3 hóa chất ô tô (ví dụ như dầu phanh) và trong dung dịch sương mù nhân tạo. Đây là một chất độc liên quan đến nhiều vụ ngộ độc chết người và trên cả động vật. Định danh và tính chất lý hóa 1.
Định danh Thông tin về định danh hóa học của DEG [22] được thể hiện trong bảng 1-3. Định danh hóa học của DEG Đặc điểm Thông tin Tên hóa học Diethylene glycol Tên khác và tên 2,2’–Oxydietanol diglycol, 2,2’–Oxybisethanol, 2-(2- thương mại Hydroxyetoxy) etanol, Bis(2-hydroxyetyl) ete, Dietylenglykol, Glycol ete Công thức hóa học C4H10O3 Công thức cấu tạo Cấu trúc hóa học (CH2 – CH2 – OH)2O 1. Tính chất lý hóa Một số tính chất lý học, hóa học của DEG [22] được trình bày trong bảng 1-4 Bảng 1 - 3. Tính chất lý hóa của DEG Đặc tính Thông tin Khối lượng phân tử 106,12 g/mol Màu sắc Không màu Trạng thái vật lý Lỏng Nhiệt độ nóng chảy -10,4 oC Nhiệt độ sôi 245 oC Mùi, vị Không mùi, vị ngọt Độ tan 4 Đặc tính Thông tin - Trong nước - Có thể trộn với nước - Trong dung môi hữu cơ - Hòa tan trong cloroform, etanol, etyl ete 1.
Độc tính - Độc học: Sau khi uống, DEG được hấp thu và phân phối nhanh chóng trong cơ thể, chủ yếu đến các vùng được tưới máu tốt. Quá trình chuyển hóa xảy ra chủ yếu ở gan và cả chất gốc và chất chuyển hóa, acid 2-hydroxyethoxyacetic (HEAA), đều được thải trừ nhanh chóng qua thận. [19] - Cơ chế gây độc: Mặc dù cơ chế gây độc chưa được làm sáng tỏ rõ ràng, nhưng nghiên cứu cho thấy rằng chất chuyển hóa DEG, HEAA, là tác nhân chính gây độc cho thận và thần kinh. Tổng quan phương pháp xác định EG và DEG 1.
Một số phương pháp xác định EG và DEG trên thế giới Một số phương pháp xác định EG và DEG trong các nền mẫu khác nhau được thể hiện trong bảng 1-5. Một số phương pháp đã dùng trong xác định EG và DEG Độ thu Xử lý mẫu, và phương pháp Phương LOD Nền mẫu hồi TLTK phân tích pháp LOQ (%) Huyết Pha loãng 50 µl mẫu trong 200 LOD = thanh/Nước µl nước cất có chứa 2,3- 2,5 tiểu butandiol làm chất chuẩn nội. mg/dL Tiêm vào cột, phân tách trong GC [15,16] LOQEG 4 phút ở 200oC, sử dụng N2 = 0,5 làm khí mang. mM Thực phẩm Chuẩn bị mẫu chiết xuất lỏng 81,2- dạng lỏng – lỏng (SALLE).
109,3 LOD = (EG); GC-FID 0,2-1 [11] mg/L 99,1- 109,1 (DEG) Bia Pha loãng mẫu với ethanol, sau LODEG đó định lượng. = 10,0 mg/L 91,9- GC-MS [18] LODDEG 108,9% = 5,0 mg/L 5 Độ thu Xử lý mẫu, và phương pháp Phương LOD Nền mẫu hồi TLTK phân tích pháp LOQ (%) LOQEG = 15,0 mg/L LOQDEG = 15,0 mg/L Glycerin và Hỗn hợp dung môi khai triển: các sản toluen-aceton-amoniac 5M phẩm có (5:85:10 (theo thể tích)). chứa Dung dịch thử: 15 µl dung TLC [12] glycerin dịch thử chứa 400 mg/ml được thêm 0,1% và 0,05% mỗi loại EG và DEG. Mỹ phẩm Nhiệt độ nằm trong khoảng từ 40°C (giữ trong 1 phút) đến 240°C.
Tổng thời gian chạy là LOD = 29 phút. Helium (độ tinh khiết 0,07- 99,999%) được sử dụng làm GC-MS 91-108 [9] 0,75 khí mang với lưu lượng không µg/g đổi 0,8mL. Thể tích mẫu là 1 µL và nhiệt độ bộ tiêm được đặt ở 240 °C. Chất tẩy rửa Khảo sát quá trình phân hủy sinh học của glycol trong nhà LOD = máy bùn hoạt tính trong phòng HPLC [20] 4 mg/L thí nghiệm và để xác định hàm lượng glycol hoặc rượu.
Kem đánh DEG được tạo dẫn xuất thành răng este bằng cách sử dụng PIAA với sự có mặt của 1-ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl) carbodimide hydrochloride (làm chất khử nước) và 4- LOD = 89,0- (dimetylamino) pyridin (làm HPLC 0,01 [17] 94,9 chất xúc tác bazơ) trong mg/mL acetonitril ở 60°C trong 75 tối thiểu. Phát hiện huỳnh quang được thực hiện với kích thích ở bước sóng 340 nm và phát xạ ở bước sóng 377 nm. 6 Ưu-nhược điểm của một số phương pháp định lượng EG và DEG được trình bày trong bảng 1-6. Ưu nhược điểm của một số phương pháp đã được sử dụng để định lượng EG và DEG: Phương Ưu điểm Nhược điểm TLTK pháp GC – FID Đơn giản.
Thời gian phân tích lâu hơn. FID GC – MS Xử lý mẫu dễ độ nhạy kém hơn. Pic kéo đuôi dàng. và nhiễm chéo.
Phân tích được [9,11,15,16,18] đồng phân vị trí tốt hơn LC. HPLC Thời gian phân LOD, LOQ cao hơn so với dùng tích ngắn hơn GC. [17,20] Độ đặc hiệu kém hơn GC. TLC Đơn giản Độ đặc hiệu kém.