Luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học xây dựng phương pháp multiplexpcr sàng lọc phát hiện thành phần biến đổi gen gm trong sản phẩm có nguồn gốc từ đậu nành và bắp

Luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học nghiên cứu phương pháp multiplex PCR phát hiện biến đổi gen trong sản phẩm từ đậu nành và bắp.

• Tác giả: Nguyễn Phan Viễn Phương
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Tiến Dũng
• Trường học: Trường Đại Học Bách Khoa
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Xây Dựng Phương Pháp Multiplex-PCR Sàng Lọc Phát Hiện Thành Phần Biến Đổi Gen (GM) Trong Sản Phẩm Có Nguồn Gốc Từ Đậu Nành Và Bắp
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt

I. Tổng quan về phương pháp multiplex PCR phát hiện GM

Phương pháp multiplex PCR là một kỹ thuật tiên tiến trong phân tích gen, cho phép phát hiện nhiều trình tự gen cùng một lúc. Kỹ thuật này đặc biệt hữu ích trong việc xác định sự hiện diện của gen biến đổi trong các sản phẩm thực phẩm như đậu nành và bắp. Việc áp dụng multiplex PCR giúp tiết kiệm thời gian và chi phí so với các phương pháp truyền thống. Nghiên cứu này sẽ trình bày chi tiết về quy trình và ứng dụng của phương pháp này trong việc phát hiện GM.

1.1. Định nghĩa và nguyên lý hoạt động của multiplex PCR

Multiplex PCR là một phương pháp cho phép khuếch đại nhiều đoạn DNA trong cùng một phản ứng. Nguyên lý hoạt động dựa trên việc sử dụng nhiều cặp mồi khác nhau, mỗi cặp mồi sẽ nhắm đến một trình tự gen cụ thể. Điều này giúp phát hiện đồng thời nhiều gen trong một mẫu, tăng độ chính xác và hiệu quả của quá trình phân tích.

1.2. Lợi ích của việc sử dụng multiplex PCR trong phát hiện GM

Việc sử dụng multiplex PCR mang lại nhiều lợi ích, bao gồm khả năng phát hiện nhanh chóng và chính xác các thành phần biến đổi gen trong sản phẩm thực phẩm. Phương pháp này giúp giảm thiểu thời gian phân tích và chi phí, đồng thời tăng cường độ tin cậy của kết quả. Điều này rất quan trọng trong bối cảnh an toàn thực phẩm và kiểm soát chất lượng sản phẩm.

II. Thách thức trong việc phát hiện GM trong sản phẩm đậu nành và bắp

Mặc dù phương pháp multiplex PCR mang lại nhiều lợi ích, nhưng vẫn tồn tại một số thách thức trong việc phát hiện GM trong sản phẩm đậu nành và bắp. Các vấn đề như độ nhạy của phương pháp, sự hiện diện của các chất ức chế trong mẫu, và sự biến đổi của các trình tự gen có thể ảnh hưởng đến kết quả phân tích. Nghiên cứu này sẽ phân tích các thách thức và đề xuất giải pháp để cải thiện độ chính xác của phương pháp.

2.1. Độ nhạy và độ đặc hiệu của multiplex PCR

Độ nhạy và độ đặc hiệu là hai yếu tố quan trọng trong việc đánh giá hiệu quả của multiplex PCR. Độ nhạy liên quan đến khả năng phát hiện các gen biến đổi ở nồng độ thấp, trong khi độ đặc hiệu đảm bảo rằng phương pháp không phát hiện nhầm các gen không phải biến đổi. Cần tối ưu hóa các điều kiện phản ứng để đạt được cả hai yếu tố này.

2.2. Ảnh hưởng của chất ức chế trong mẫu

Sự hiện diện của các chất ức chế trong mẫu có thể làm giảm hiệu quả của phản ứng PCR. Các chất này có thể đến từ môi trường hoặc quá trình chế biến sản phẩm. Việc xác định và loại bỏ các chất ức chế là cần thiết để đảm bảo độ chính xác của kết quả phân tích.

III. Quy trình multiplex PCR trong phát hiện GM

Quy trình multiplex PCR bao gồm nhiều bước từ chuẩn bị mẫu đến phân tích kết quả. Đầu tiên, DNA được tách chiết từ mẫu đậu nành hoặc bắp. Sau đó, các cặp mồi được thiết kế để nhắm đến các trình tự gen cụ thể. Cuối cùng, sản phẩm PCR được phân tích để xác định sự hiện diện của gen biến đổi. Nghiên cứu này sẽ trình bày chi tiết từng bước trong quy trình.

3.1. Tách chiết DNA từ mẫu thực phẩm

Quá trình tách chiết DNA là bước đầu tiên và quan trọng trong multiplex PCR. Các phương pháp tách chiết khác nhau có thể ảnh hưởng đến chất lượng và số lượng DNA thu được. Cần lựa chọn phương pháp tách chiết phù hợp để đảm bảo DNA đủ lượng và chất lượng cho phản ứng PCR.

3.2. Thiết kế cặp mồi cho multiplex PCR

Thiết kế cặp mồi là bước quan trọng trong multiplex PCR. Cặp mồi cần được thiết kế sao cho có độ đặc hiệu cao với trình tự gen mục tiêu và không gây ra phản ứng chéo. Việc tối ưu hóa nồng độ mồi và nhiệt độ bắt cặp cũng rất cần thiết để đạt được kết quả tốt nhất.

IV. Ứng dụng thực tiễn của multiplex PCR trong phát hiện GM

Multiplex PCR đã được áp dụng rộng rãi trong việc phát hiện GM trong các sản phẩm thực phẩm như đậu nành và bắp. Kết quả từ các nghiên cứu cho thấy phương pháp này có độ chính xác cao và có thể phát hiện được nồng độ thấp của gen biến đổi. Nghiên cứu này sẽ trình bày các ứng dụng thực tiễn và kết quả đạt được từ việc sử dụng multiplex PCR.

4.1. Kết quả nghiên cứu từ ứng dụng multiplex PCR

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng multiplex PCR có thể phát hiện đồng thời nhiều trình tự gen trong sản phẩm thực phẩm. Kết quả cho thấy phương pháp này có độ nhạy cao, có thể phát hiện gen biến đổi ở nồng độ thấp, từ đó giúp đảm bảo an toàn thực phẩm.

4.2. So sánh với các phương pháp khác

So với các phương pháp phân tích khác, multiplex PCR cho thấy ưu điểm vượt trội về thời gian và chi phí. Phương pháp này không chỉ tiết kiệm thời gian mà còn giảm thiểu sai sót trong quá trình phân tích, từ đó nâng cao độ tin cậy của kết quả.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của multiplex PCR

Multiplex PCR là một phương pháp hứa hẹn trong việc phát hiện GM trong sản phẩm đậu nành và bắp. Với những lợi ích vượt trội về độ nhạy và độ chính xác, phương pháp này có thể trở thành tiêu chuẩn trong phân tích thực phẩm trong tương lai. Nghiên cứu này sẽ tóm tắt những kết luận chính và đề xuất hướng phát triển tiếp theo cho phương pháp multiplex PCR.

5.1. Tóm tắt kết quả nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu cho thấy multiplex PCR là một công cụ hiệu quả trong việc phát hiện gen biến đổi. Phương pháp này đã chứng minh được tính khả thi và độ tin cậy trong phân tích thực phẩm, góp phần nâng cao an toàn thực phẩm.

5.2. Hướng phát triển trong tương lai

Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu và phát triển các kỹ thuật multiplex PCR để cải thiện độ nhạy và độ đặc hiệu. Việc áp dụng công nghệ mới và tối ưu hóa quy trình sẽ giúp nâng cao hiệu quả của phương pháp này trong việc phát hiện GM.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về GMO, lược sử hình thành và phát triển 1. Giới thiệu về GMO Sinh vật biến đổi gen (GMO-GeneticallyModified Orgarnisms) hay còn được gọi với tên sinh vật chuyển gen (Transgenic Orgarnisms) là những sinh vật có vật liệu di truyền được biến đổi bằng kỹ thuật gen, trong đó, phiên bản gen gốc được tăng cường hoặc ức chế hoặc loại bỏ (knocked out) ở mức độ biểu hiện hoặc bị thay thế bởi gen có nguồn gốc từ sinh vật khác quy định các tính trạng phục vụ cho lợi ích của con người nhằm mục đích làm thực phẩm, dược phẩm, nông nghiệp, xử lý môi trường…Các tính trạng này không thể xuất hiện thông qua tái tổ hợp tự nhiên hoặc giao phối [31]. Quá trình từ lúc nghiên cứu, khảo nghiệm đến lúc cấp phép và công bố một giống GMO đảm bảo an toàn sinh học đủ điều kiện sử dụng làm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi được gọi là một sự kiện chuyển gen (Event).

Mỗi sự kiện chuyển gen sau khi cấp phép sẽ được cấp mã số sự kiện giống như giấy chứng minh nhân dân của con người cho mỗi giống GMO.Ví dụ: sự kiện đậu nành GST 40-3-2, sự kiện bắp MON 810, bắp Bt11xGA21…Thông tin cơ bản về mỗi sự kiện có thể tra cứu trên Website của tổ chức quốc tế về tiếp thu các ứng dụng công nghệ sinh học trong nông nghiệp (ISAAA). Lược sử hình thành, phát triển Trong lịch sử nông nghiệp, từ xa xưa cho đến thời điểm hiện tại, con người đã và đang đạt được nhiều thành tựu nổi bật nhờ vào kỹ thuật di truyền chọn giống dựa trên nguyên tắc góp nhặt, lựa chọn cho các cá thể mang các đột biến tự nhiên biểu hiện tính trạng mong muốn giao phối với nhau qua một hoặc nhiều thế hệ để tạo ra giống mới có biến đổi về mặt di truyền. Tuy nhiên, các giống này vẫn không được xem là GMO bởi vẫn chưa phá vỡ được ranh giới di truyền giữa các loài. Năm 1973, Herbert Boyer và Stanley Cohen, bằng kỹ thuật tái tổ hợp DNA đã tạo sinh vật biến đổi gen đầu tiên đó là chủng vi khuẩn kháng kháng sinh nhờ được 5 Tổng quan tài liệu nhận gen kháng từ chủng vi khuẩn khác.

Sự kiện này đặt nền móng đầu tiên cho kỹ thuật di truyền hiện đại, cũng là thời điểm đánh dấu cho sự hình thành và bùng nổ của GMO. Các năm sau đó các sinh vật biến đổi gen lần lượt ra đời bằng kỹ thuật di truyền và các sự kiện liên quan liên tiếp diễn ra [51, 52], không ngừng phát triển: Năm 1974, Rudolf Jaenisch và Beatrice Mintz tạo ra mô hình chuột khảm trong nghiên cứu ung thư, được xem là động vật biến đổi gen đầu tiên. Năm 1980, Tòa án tối cao Hoa Kỳ cấp bảng quyền sáng chế cho chủng vi khuẩn biến đổi gen có khả năng chuyển hóa Hydrocarbon trong dầu thô giúp giải quyết sự cố tràn dầu cho công ty General Electric. Sự kiện này là một sự khích lệ to lớn đối với các công ty công nghệ sinh học trong việc nghiên cứu ứng dụng GMO.

Năm 1982, FDA cấp phép lưu hành sinh dược Humulin, tên thương mại của Insulin người sản xuất bởi vi khuẩn Escherichia coli tái tổ hợp. Năm 1992, Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ cấp phép cho cây trồng chuyển gen đầu tiên là cà chua FLAVR SAVR. Năm 1995, Cục bảo vệ môi sinh Hoa Kỳ cấp phép cho giống bắp chuyển gen kháng côn trùng. Năm 1996, Monsanto công bố giống đậu nành biến đổi gen kháng thuốc diệt cỏ gốc Glyphosate đầu tiên với tên thương mại Roundup Ready.

Năm 2000, Ingo Potrykus và Peter Beyer tạo ra giống gạo GMO giàu vitamin A với tên gọi Golden Rice. Năm 2009, Atryn, tên thương mại của sinh dược Anticoagulant Antithrombin dùng chữa trị bệnh rối loạn đông máu được sản xuất từ sữa dê biến đổi gen được FDA cấp phép lưu hành. Năm Theo báo cáo thường niên mới nhất về hiện trạng thương mại hóa cây trồng biến đổi gen 2018 của tổ chức quốc tế về tiếp thu các ứng dụng công nghệ sinh học trong nông nghiệp (ISAAA), số lượng giống cây trồng biến đổi gen không ngừng tăng về số lượng và chủng loại theo năm tháng. Hoa Kỳ, quốc gia công nhận 6 Tổng quan tài liệu nhiều sự kiện biến đổi gen nhất thế giới, đã cấp phép lên đến 544 sự kiện biến đổi gen.

Cũng theo thống kê này, ba loại cây trồng GMO có diện tích canh tác lớn nhất trên thế giới lần lượt là đậu nành (50%), bắp (30,7%) và bông (13%) [8]. Xu hướng ứng dụng GMO Qua lược sử hình thành và phát triển GMO, có thể thấy GMO đầu tiên được tạo ra với mục đích phục vụ nghiên cứu. Theo thời gian, với sự phát triển của kỹ thuật sinh học phân tử và nhu cầu ứng dụng thực tiễn trong nhiều lĩnh vực khác nhau đã làm cho GMO không ngừng gia tăng về số lượng và chủng loại. Trong đó, nông nghiệp, y dược, thực phẩm và xử lý môi trường là những hướng ứng dụng chủ đạo của GMO.

GMO ứng dụng trong nông nghiệp, thực phẩm Theo dự đoán của FAO, dân số thế giới sẽ đạt 9 tỷ người vào 2050, đòi hỏi sản lượng nông nghiệp phải tăng 70% trong giai đoạn từ 2005 đến 2050 mới đáp ứng được nhu cầu lương thực [11]. Mục tiêu này phải đạt được trong bối cảnh diện tích đất và mặt nước phục vụ nông nghiệp ngày càng giảm. Biến đổi khí hậu làm gia tăng hạn hán, lũ lụt, xâm nhập mặn; tình hình sâu bệnh, ký sinh trùng, cỏ dại kháng thuốc ngày càng tăng. Thực trạng khó khăn vừa nêu là động lực nghiên cứu, ứng dụng và phát triển cây trồng biến đổi gen, cây GM truyền thống chủ yếu mang tính trạng kháng côn trùng, kháng thuốc diệt cỏ hoặc mang cùng lúc cả hai tính trạng kháng (cây trồng mang tính trạng này chiếm 3,7% tổng diện tích trồng cây biến đổi gen trên toàn thế giới vào năm 2014 [11]).

Các công trình nghiên cứu hiện tại và trong tương lai đang hướng đến việc tạo ra các giống cây trồng chịu hạn/mặn, kháng bệnh, năng suất cao, hàm lượng vitamin, hàm lượng dinh dưỡng cao [11]. Khi nói đến GMO ứng dụng trong nông nghiệp, thực phẩm, chúng ta thường nói và biết nhiều về cây trồng. Vì đến thời điểm hiện tại, động vật biến đổi gen vẫn đang bị kiểm soát chặt chẽ, các nghiên cứu vẫn còn đang trong giai đoạn khảo nghiệm. Chỉ duy nhất giống cá hồi biến đổi gen AquAdvantage được FDA cấp phép nuôi trồng với điều kiện kiểm soát ngặt ngèo nhằm ngăn chặn giống cá này phát tán ra môi trường tự nhiên, được mua bán làm thực phẩm nhưng chỉ giới hạn ở thị trường Mỹ 7 Tổng quan tài liệu [12, 53].

Nghiên cứu động vật biến đổi gen chủ yếu hướng đến các tính trạng liên quan đến khả năng kháng bệnh, cải thiện chất lượng thịt, chất lượng sữa; bổ sung thành phần dinh dưỡng, sinh dược vào thịt hoặc sữa, cải thiện chất lượng lông, đẩy nhanh tốc độ tăng trưởng [12].1: Một số loại cây trồng, động vật biến đổi gen ứng dụng trong nông nhiệp, thực phẩm Tính trạng/tác Loài Gene chuyển Nguồn cho gen dụng Thực vật Đậu Cp4 epsps Agrobacterium Kháng thuốc diệt cỏ nành tumefaciens strain CP4 Glyphosate Bắp CryA Bacillus thuringiensis Kháng côn trùng Gạo Crt1/Psy1/pmi Pantoea ananatis/Zea Giàu vitamin A mays/Escherichia coli Bông S4-HrA Nicotiana tabacum cv. Kháng thuốc diệt cỏ Xanthi Sulfonylurea Khoai CryA Bacillus thuringiensis Kháng côn trùng tây Táo Gen ức chế PGAS Malus domestica Chống hóa nâu sau PPO khi cắt Cà pg Lycopersicon esculentum Chín chậm chua Động vật (*) Heo Mx1 Chuột(*) Kháng cúm Bò Gen chuyển hóa Giun tròn(*) Cải thiện chất lượng Omega 3 sữa Gà Gen mã hóa Virus(*) Kháng bệnh Glycoprotein alv6 Cá da Gen mã hóa Côn trùng(*) Kháng bệnh trơn Cercopin B (*)Công trình nghiên cứu nguồn gốc cho gen chưa được công bố cụ thể loài, dòng sinh vật cho gen [7, 13]. GMO ứng dụng trong xử lý môi trường Các chất như Toluen, chloride hữu cơ, các hợp chất hydrocarbon vòng thơm, polychlorinated biphenyls (PCBs), polyaromatic hydrocarbons (PAHs), thuốc trừ 8 Tổng quan tài liệu sâu, thuốc diệt cỏ, các hợp chất hydrocarbons chứa liên kết bền, dioxin, kim loại nặng (Cd, Hg, Pb)… tạo ra từ hoạt động nông nghiệp, công nghiệp, sinh hoạt của con người, là những chất ô nhiễm khó phân hủy, không hoặc ít chuyển hóa được trong chu trình sinh địa hóa vật chất tự nhiên. Chúng tích lũy ngày càng nhiều trong môi trường sống đe dọa trực tiếp đến sức khỏe con người và hệ sinh thái.

Nhiều biện pháp xử lý ô nhiễm đã được sử dụng, trong đó, biện pháp xử lý sinh học như sử dụng vi sinh vật biến đổi gen là hướng ứng dụng hiệu quả, thân thiện môi trường và triển vọng nhất. Nguyên tắc là tạo ra vi sinh vật biến đổi gen xử lý môi trường, được tiếp cận theo các hướng sau: Phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật từ những môi trường sống cực đoan về nguồn dinh dưỡng như nồng độ quá cao hoặc quá thấp, cực đoan về pH, độ mặn, áp suất và nhiệt độ… làm vật chủ, biến nạp các gen mã hóa cho các enzyme chuyển hóa chất ô nhiễm như Catechol 1,2-dioxygenase, toluen dioxygenase-iron- sulfur, Benzene dioxygenase, naphthalene dioxygenase, dioxin dioxygenase…từ các nguồn cho gen khác không sống được trong môi trường cực đoan [14]. Phân lập, tuyển chọn nguồn gen mã hóa cho protein phân hủy độc chất từ các chủng vi sinh vật bản địa trong môi trường ô nhiễm, gây đột biến tạo ra phiên bản gen mới mã hóa cho sản phẩm có hoạt tính mạnh hơn (enzyme có ái lực cao hơn, đặc hiệu hơn…), hoặc gây đột biến enzyme chủ chốt trong con đường chuyển hóa sinh học của chủng tự nhiên giúp tăng cường biểu hiện protein mục tiêu nâng cao hiệu suất chuyển hóa chất ô nhiễm [14]. Tuy không trực tiếp xử lý chất ô nhiễm như vi sinh vật biến đổi gen, nhưng việc canh tác cây trồng biến đổi gen cũng gián tiếp giảm thiểu phát thải chất ô nhiễm ra môi trường.

Theo thống kê của ISAAA, từ 1996 đến 2016, canh tác cây trồng biến đổi gen đã cắt giảm hơn 583,5 triệu tấn thuốc trừ sâu, giảm tiêu thụ năng lượng hóa thạch sử dụng trong nông nghiệp thông qua đó giảm phát thải lượng khí CO2 tương đương lượng thải ra của 16,75 triệu xe ô tô [9]. 9 Tổng quan tài liệu Bảng 1.2: Một số chủng vi sinh vật biến đổi gen sử dụng trong xử lý ô nhiễm Chủng Gen chuyển Nguồn cho gen Ứng dụng Tác giả E.