Luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học xây dựng phương pháp multiplexpcr sàng lọc phát hiện thành phần biến đổi gen gm trong sản phẩm có nguồn gốc từ đậu nành và bắp

Luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học nghiên cứu phương pháp multiplex PCR phát hiện biến đổi gen trong sản phẩm từ đậu nành và bắp.

• Tác giả: Nguyễn Phan Viễn Phương
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Tiến Dũng
• Trường học: Trường Đại Học Bách Khoa
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Xây Dựng Phương Pháp Multiplex-PCR Sàng Lọc Phát Hiện Thành Phần Biến Đổi Gen (GM) Trong Sản Phẩm Có Nguồn Gốc Từ Đậu Nành Và Bắp
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• TÓM TẮT
• ABSTRACT
• LỜI CAM ĐOAN
• DANH MỤC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ
• DANH MỤC HÌNH
• BẢNG CÁC TỪ VIẾT TẮT
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về GMO, lược sử hình thành và phát triển
• 1.1.1. Giới thiệu về GMO
• 1.1.2. Lược sử hình thành, phát triển
• 1.1.3. Xu hướng ứng dụng GMO
• 1.2. Tình hình cây trồng biến đổi gen (GMC) tại Việt Nam và trên thế giới
• 1.2.1. Trên thế giới
• 1.2.2. Tại Việt Nam
• 1.3. Các quy định kiểm soát GMC trên thế giới và Việt Nam
• 1.3.1. An ninh sinh học liên quan đến GMO
• 1.3.2. Quy định về sử dụng sản phẩm GMC tại một số nước trên thế giới
• 1.3.3. Quy định về sử dụng sản phẩm GMC tại Việt Nam
• 1.4. Các phương pháp phân tích GMO trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi
• 1.4.1. Phương pháp phân tích GMO dựa trên protein
• 1.4.2. Phương pháp phân tích GMO dựa trên DNA
• 1.5. Các nghiên cứu trong nước và trên thế giới về GMO
• 1.6. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài
• 1.6.1. Tính cấp thiết, ý nghĩa của đề tài
• 1.6.2. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.6.3. Nội dung nghiên cứu của đề tài
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Mẫu thử nghiệm
• 2.2. Hóa chất tách chiết
• 2.3. Hóa chất cho phản ứng Multiplex PCR (Promega)
• 2.4. Kit thương mại đối chứng
• 2.5. Hóa chất cho điện di sản phẩm PCR
• 2.6. Thiết bị và dụng cụ chính
• 2.7. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát
• 2.8. Bố trí thí nghiệm
• 2.8.1. Nghiên cứu xây dựng phương pháp
• 2.8.2. Đề xuất phương pháp
• 2.8.3. Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp
• 2.8.4. So sánh độ tương đồng với kit thương mại
• 2.8.5. Khảo sát thực tế hiện trạng sử dụng GMOs trên địa bàn TP.
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
• 3.1. Kết quả nghiên cứu xây dựng phương pháp
• 3.1.1. Kết quả khảo sát tính chuyên biệt của các cặp mồi sử dụng
• 3.1.2. Kết quả tối ưu hóa các thông số kỹ thuật của phương pháp
• 3.1.3. Đề xuất phương pháp
• 3.2. Kết quả xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp
• 3.2.1. Giới hạn phát hiện của phương pháp Triplex-PCR (LOD95)
• 3.2.2. Xác nhận các thông số kỹ thuật về độ chính xác, độ nhạy, độ đặc hiệu, tỉ lệ dương tính giả, tỉ lệ âm tính giả của phương pháp triplex-PCR
• 3.2.3. Thử nghiệm độ ổn định của phương pháp triplex-PCR
• 3.3. So sánh độ tương đồng phương pháp triplex-PCR với kit thương mại
• 3.4. Khảo sát thực tế hiện trạng sử dụng GMOs trên địa bàn TP.
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO - PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về phương pháp multiplex PCR phát hiện GM

Phương pháp multiplex PCR là một kỹ thuật tiên tiến trong phân tích gen, cho phép phát hiện nhiều trình tự gen cùng một lúc. Kỹ thuật này đặc biệt hữu ích trong việc xác định sự hiện diện của gen biến đổi trong các sản phẩm thực phẩm như đậu nành và bắp. Việc áp dụng multiplex PCR giúp tiết kiệm thời gian và chi phí so với các phương pháp truyền thống. Nghiên cứu này sẽ trình bày chi tiết về quy trình và ứng dụng của phương pháp này trong việc phát hiện GM.

1.1. Định nghĩa và nguyên lý hoạt động của multiplex PCR

Multiplex PCR là một phương pháp cho phép khuếch đại nhiều đoạn DNA trong cùng một phản ứng. Nguyên lý hoạt động dựa trên việc sử dụng nhiều cặp mồi khác nhau, mỗi cặp mồi sẽ nhắm đến một trình tự gen cụ thể. Điều này giúp phát hiện đồng thời nhiều gen trong một mẫu, tăng độ chính xác và hiệu quả của quá trình phân tích.

1.2. Lợi ích của việc sử dụng multiplex PCR trong phát hiện GM

Việc sử dụng multiplex PCR mang lại nhiều lợi ích, bao gồm khả năng phát hiện nhanh chóng và chính xác các thành phần biến đổi gen trong sản phẩm thực phẩm. Phương pháp này giúp giảm thiểu thời gian phân tích và chi phí, đồng thời tăng cường độ tin cậy của kết quả. Điều này rất quan trọng trong bối cảnh an toàn thực phẩm và kiểm soát chất lượng sản phẩm.

II. Thách thức trong việc phát hiện GM trong sản phẩm đậu nành và bắp

Mặc dù phương pháp multiplex PCR mang lại nhiều lợi ích, nhưng vẫn tồn tại một số thách thức trong việc phát hiện GM trong sản phẩm đậu nành và bắp. Các vấn đề như độ nhạy của phương pháp, sự hiện diện của các chất ức chế trong mẫu, và sự biến đổi của các trình tự gen có thể ảnh hưởng đến kết quả phân tích. Nghiên cứu này sẽ phân tích các thách thức và đề xuất giải pháp để cải thiện độ chính xác của phương pháp.

2.1. Độ nhạy và độ đặc hiệu của multiplex PCR

Độ nhạy và độ đặc hiệu là hai yếu tố quan trọng trong việc đánh giá hiệu quả của multiplex PCR. Độ nhạy liên quan đến khả năng phát hiện các gen biến đổi ở nồng độ thấp, trong khi độ đặc hiệu đảm bảo rằng phương pháp không phát hiện nhầm các gen không phải biến đổi. Cần tối ưu hóa các điều kiện phản ứng để đạt được cả hai yếu tố này.

2.2. Ảnh hưởng của chất ức chế trong mẫu

Sự hiện diện của các chất ức chế trong mẫu có thể làm giảm hiệu quả của phản ứng PCR. Các chất này có thể đến từ môi trường hoặc quá trình chế biến sản phẩm. Việc xác định và loại bỏ các chất ức chế là cần thiết để đảm bảo độ chính xác của kết quả phân tích.

III. Quy trình multiplex PCR trong phát hiện GM

Quy trình multiplex PCR bao gồm nhiều bước từ chuẩn bị mẫu đến phân tích kết quả. Đầu tiên, DNA được tách chiết từ mẫu đậu nành hoặc bắp. Sau đó, các cặp mồi được thiết kế để nhắm đến các trình tự gen cụ thể. Cuối cùng, sản phẩm PCR được phân tích để xác định sự hiện diện của gen biến đổi. Nghiên cứu này sẽ trình bày chi tiết từng bước trong quy trình.

3.1. Tách chiết DNA từ mẫu thực phẩm

Quá trình tách chiết DNA là bước đầu tiên và quan trọng trong multiplex PCR. Các phương pháp tách chiết khác nhau có thể ảnh hưởng đến chất lượng và số lượng DNA thu được. Cần lựa chọn phương pháp tách chiết phù hợp để đảm bảo DNA đủ lượng và chất lượng cho phản ứng PCR.

3.2. Thiết kế cặp mồi cho multiplex PCR

Thiết kế cặp mồi là bước quan trọng trong multiplex PCR. Cặp mồi cần được thiết kế sao cho có độ đặc hiệu cao với trình tự gen mục tiêu và không gây ra phản ứng chéo. Việc tối ưu hóa nồng độ mồi và nhiệt độ bắt cặp cũng rất cần thiết để đạt được kết quả tốt nhất.

IV. Ứng dụng thực tiễn của multiplex PCR trong phát hiện GM

Multiplex PCR đã được áp dụng rộng rãi trong việc phát hiện GM trong các sản phẩm thực phẩm như đậu nành và bắp. Kết quả từ các nghiên cứu cho thấy phương pháp này có độ chính xác cao và có thể phát hiện được nồng độ thấp của gen biến đổi. Nghiên cứu này sẽ trình bày các ứng dụng thực tiễn và kết quả đạt được từ việc sử dụng multiplex PCR.

4.1. Kết quả nghiên cứu từ ứng dụng multiplex PCR

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng multiplex PCR có thể phát hiện đồng thời nhiều trình tự gen trong sản phẩm thực phẩm. Kết quả cho thấy phương pháp này có độ nhạy cao, có thể phát hiện gen biến đổi ở nồng độ thấp, từ đó giúp đảm bảo an toàn thực phẩm.

4.2. So sánh với các phương pháp khác

So với các phương pháp phân tích khác, multiplex PCR cho thấy ưu điểm vượt trội về thời gian và chi phí. Phương pháp này không chỉ tiết kiệm thời gian mà còn giảm thiểu sai sót trong quá trình phân tích, từ đó nâng cao độ tin cậy của kết quả.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của multiplex PCR

Multiplex PCR là một phương pháp hứa hẹn trong việc phát hiện GM trong sản phẩm đậu nành và bắp. Với những lợi ích vượt trội về độ nhạy và độ chính xác, phương pháp này có thể trở thành tiêu chuẩn trong phân tích thực phẩm trong tương lai. Nghiên cứu này sẽ tóm tắt những kết luận chính và đề xuất hướng phát triển tiếp theo cho phương pháp multiplex PCR.

5.1. Tóm tắt kết quả nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu cho thấy multiplex PCR là một công cụ hiệu quả trong việc phát hiện gen biến đổi. Phương pháp này đã chứng minh được tính khả thi và độ tin cậy trong phân tích thực phẩm, góp phần nâng cao an toàn thực phẩm.

5.2. Hướng phát triển trong tương lai

Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu và phát triển các kỹ thuật multiplex PCR để cải thiện độ nhạy và độ đặc hiệu. Việc áp dụng công nghệ mới và tối ưu hóa quy trình sẽ giúp nâng cao hiệu quả của phương pháp này trong việc phát hiện GM.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học nông nghiệp đã đưa diện tích cây trồng biến đổi gen toàn cầu chạm mốc 191,7 triệu hecta vào năm 2018, tăng gấp 113 lần so với giai đoạn sơ khởi năm 1996. Tại Việt Nam, nhu cầu nhập khẩu nguyên liệu phục vụ sản xuất thức ăn chăn nuôi và chế biến thực phẩm rất lớn, điển hình với hơn 8 triệu tấn bắp và 1,542 triệu tấn đậu nành được nhập khẩu trong giai đoạn 2016-2017. Sự gia tăng nhanh chóng của các mặt hàng nông sản biến đổi gen đòi hỏi một hành lang kiểm soát an toàn sinh học chặt chẽ. Cụ thể, Thông tư liên tịch số 45/2015/TTLT-BNNPTNT-BKHCN quy định bắt buộc ghi nhãn đối với thực phẩm bao gói chứa thành phần biến đổi gen vượt quá 5% tổng nguyên liệu.

Tuy nhiên, các quy trình phân tích phổ biến hiện nay theo tiêu chuẩn ISO 21569:2005 chủ yếu là kỹ thuật monoplex PCR đơn lẻ, gây tiêu tốn nhiều thời gian, nhân lực và chi phí khi phải thực hiện nhiều phản ứng riêng biệt. Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn đó, luận văn thạc sĩ chuyên ngành Công nghệ Sinh học tại Trường Đại học Bách Khoa - Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh đã thực hiện đề tài nhằm xây dựng và tối ưu hóa phương pháp Triplex-PCR sàng lọc nhanh sinh vật biến đổi gen trong đậu nành và bắp.

Nghiên cứu được triển khai từ tháng 02/2019 đến tháng 12/2019 tại Thành phố Hồ Chí Minh. Mục tiêu trọng tâm là thiết lập một phản ứng khuếch đại đồng thời ba trình tự đích gồm hai yếu tố chuyển gen phổ biến là promoter P-35S, terminator T-Nos và một trình tự nội chuẩn đặc hiệu loài là gen Lectin đối với đậu nành hoặc gen Zein đối với bắp. Quy trình hoàn thiện mang lại ý nghĩa kinh tế - kỹ thuật vượt bậc khi giúp giảm hơn 50% chi phí hóa chất, rút ngắn 60% thời gian phân tích và đạt độ nhạy phát hiện vượt trội ở mức 0,1% đối với đậu nành và 0,042% đối với bắp.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng lý thuyết sinh học phân tử hiện đại về phản ứng khuếch đại chuỗi polymerase đa mồi. Mô hình nghiên cứu vận dụng chiến lược phân tích an toàn sinh học ba cấp độ gồm: sàng lọc định tính diện rộng, định danh sự kiện chuyển gen và định lượng tỷ lệ biến đổi gen.

Bốn khái niệm khoa học cốt lõi chi phối toàn bộ quy trình nghiên cứu bao gồm:

• Trình tự chỉ thị biến đổi gen phổ quát: Promoter P-35S có nguồn gốc từ virus khảm súp lơ (Cauliflower Mosaic Virus) và Terminator T-Nos có nguồn gốc từ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Hai nhân tố này hiện diện trong hơn 90% các giống cây trồng biến đổi gen đã được thương mại hóa trên thế giới.
• Trình tự gen nội chuẩn đặc hiệu loài: Gen Lectin đặc hiệu cho hệ gen cây đậu nành (Glycine max) và gen Zein đặc hiệu cho hệ gen cây bắp (Zea mays), đóng vai trò kiểm chứng chất lượng tách chiết DNA và loại trừ hiện tượng âm tính giả.
• Giới hạn phát hiện phương pháp LOD95: Nồng độ hoặc tỷ lệ phần trăm vật liệu biến đổi gen thấp nhất trong mẫu thử mà phương pháp có thể phát hiện được với xác suất tin cậy đạt 95%.
• Chỉ số đánh giá độ tương đồng Cohen's Kappa: Thước đo thống kê dùng để kiểm định mức độ phù hợp và độ tin cậy giữa phương pháp nghiên cứu mới và bộ kit xét nghiệm chuẩn quốc tế.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu và vật liệu nghiên cứu bao gồm hệ thống mẫu chuẩn European Reference Material (ERM) do Ủy ban Tiêu chuẩn Châu Âu cung cấp cùng với 42 mẫu thực phẩm, thức ăn chăn nuôi thực tế thu thập trên thị trường Thành phố Hồ Chí Minh. Cỡ mẫu 42 mẫu thực tế được thu thập theo phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên phân tầng nhằm bao quát toàn diện ba nhóm ma trận: nguyên liệu hạt thô, bột ngũ cốc và các sản phẩm chế biến sâu qua nhiệt độ.

Lý do lựa chọn phương pháp phân tích Triplex-PCR dựa trên DNA là vì DNA có độ bền nhiệt cao hơn hẳn protein, không bị biến tính hoàn toàn qua các công đoạn chế biến công nghiệp, đồng thời cho phép phát hiện các cấu trúc promoter và terminator không biểu hiện thành kháng nguyên protein. Quy trình tách chiết DNA sử dụng hệ hóa chất tinh sạch từ trường Wizard Magnetic DNA Purification System for food nhằm loại bỏ triệt để các chất ức chế PCR như polyphenol và polysaccharide.

Quá trình tối ưu hóa phản ứng được thực hiện thông qua khảo sát gradient nhiệt độ bắt cặp từ nhiệt độ tối thiểu đến nhiệt độ tối đa trong biên độ dao động 5 độ C, đồng thời tinh chỉnh tỷ lệ nồng độ các cặp mồi trong tổng thể tích phản ứng 25 microliter. Độ tin cậy của phương pháp được xác nhận thông qua việc đối chiếu song song với bộ kit thương mại SureFood GMO SCREEN 35S+NOS+FMV từ hãng R-Biopharm. Timeline nghiên cứu được thực hiện đồng bộ trong 10 tháng với các giai đoạn thiết kế mồi, tối ưu chu nhiệt, đánh giá thông số kỹ thuật và khảo sát thực địa.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã ghi nhận bốn phát hiện khoa học và kỹ thuật mang tính thực tiễn cao:

• Thứ nhất, xác lập thành công các thông số kỹ thuật tối ưu cho phản ứng Triplex-PCR với nhiệt độ bắt cặp mồi khuôn chuẩn xác ở 59 độ C và tỷ lệ nồng độ mồi cân bằng là 0,09 : 0,09 : 0,09 micromol/L. Tỷ lệ này đảm bảo cả ba đoạn gen mục tiêu được khuếch đại đồng đều mà không tạo ra hiện tượng cạnh tranh mồi hay xuất hiện primer-dimer không mong muốn.
• Thứ hai, phương pháp đạt giới hạn phát hiện LOD95 ấn tượng ở mức 0,1% đối với hàm lượng đậu nành biến đổi gen và 0,042% đối với bắp biến đổi gen. Ngưỡng phát hiện này nhạy hơn gấp 50 đến 100 lần so với quy định dán nhãn 5% của Việt Nam và thấp hơn đáng kể so với ngưỡng 0,9% của Liên minh Châu Âu.
• Thứ ba, kết quả xác nhận giá trị sử dụng trên các mẫu kiểm chứng nội bộ cho thấy các thông số kỹ thuật bao gồm độ chính xác, độ nhạy chẩn đoán và độ đặc hiệu phân tích đều đạt tuyệt đối 100%, tỷ lệ dương tính giả và âm tính giả ghi nhận bằng 0%.
• Thứ tư, trong thử nghiệm đối chứng trên 42 mẫu thực tế với kit thương mại SureFood GMO SCREEN, phương pháp Triplex-PCR đạt độ tương thích rất cao với hệ số Kappa đạt 0,69 trên nền mẫu đậu nành và đạt 0,90 trên nền mẫu bắp.

Thảo luận kết quả

Hiệu quả khuếch đại đồng thời ba phân đoạn DNA phụ thuộc chặt chẽ vào việc cân bằng động học phản ứng. Ở nhiệt độ bắt cặp 59 độ C, tính đặc hiệu của các cặp mồi đạt mức tối đa, loại bỏ hoàn toàn các vạch phụ không đặc hiệu. Toàn bộ dữ liệu tối ưu hóa nhiệt độ và nồng độ mồi có thể được trực quan hóa rõ nét thông qua biểu đồ điện di gel agarose 2% với các vạch sáng rõ ràng tương ứng với các kích thước phân đoạn gen chuẩn. Song song đó, bảng ma trận phân loại kết quả phân tích 42 mẫu thực địa cho thấy sự trùng khớp gần như tuyệt đối giữa kỹ thuật Triplex-PCR tự xây dựng và bộ kit Realtime PCR ngoại nhập.

Khi so sánh với các nghiên cứu trước đây tại Việt Nam vốn chủ yếu phát triển các quy trình monoplex PCR đơn lẻ chỉ nhận diện một nhân tố chuyển gen, phương pháp Triplex-PCR này mang lại bước tiến vượt bậc về năng suất thử nghiệm. Mặc dù hệ số Kappa trên nền mẫu đậu nành đạt 0,69 thấp hơn một chút so với nền mẫu bắp đạt 0,90 do một số sản phẩm đậu nành chế biến bị phân mảnh DNA sâu, phương pháp vẫn chứng minh tính tương thích xuất sắc trên các mẫu nguyên liệu và thực phẩm thông thường. Điều này khẳng định quy trình hoàn toàn đủ năng lực thay thế các bộ kit nhập khẩu đắt tiền tại các phòng kiểm nghiệm trong nước.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên kết quả thực nghiệm vững chắc, bốn giải pháp trọng tâm được đề xuất nhằm đưa quy trình vào ứng dụng thực tế:

• Tiêu chuẩn hóa quy trình kỹ thuật: Ban giám đốc Trung tâm Chất lượng Nông lâm Thủy sản vùng 4 cùng các phòng kiểm nghiệm sinh học cần ban hành Tiêu chuẩn cơ sở áp dụng phương pháp Triplex-PCR này trong thời gian 6 tháng tới, hoàn thiện hồ sơ đăng ký công nhận đạt chuẩn ISO/IEC 17025 đối với chỉ tiêu sàng lọc GMO.
• Tăng cường kiểm soát nông sản nhập khẩu: Cục Bảo vệ Thực vật phối hợp cùng Tổng cục Hải quan triển khai xét nghiệm định kỳ bằng phương pháp này tại các cảng nhập khẩu lớn, đặt mục tiêu tầm soát 100% các lô hàng bắp và đậu nành nhập khẩu từ các quốc gia châu Mỹ trong giai đoạn năm 2021-2022.
• Siết chặt công tác thanh tra ghi nhãn hàng hóa: Chi cục An toàn vệ sinh thực phẩm và Quản lý thị trường các địa phương chủ động lấy mẫu giám sát thực phẩm lưu thông, xử lý nghiêm các cơ sở vi phạm ngưỡng ghi nhãn 5% theo Thông tư liên tịch 45/2015, thực hiện báo cáo định kỳ hàng quý.
• Mở rộng năng lực nghiên cứu công nghệ: Các viện nghiên cứu và trường đại học cần tiếp tục phát triển hệ thống PCR đa mồi từ Triplex lên Tetraplex hoặc Hexaplex trong giai đoạn 2021-2023, tích hợp thêm các chỉ thị promoter P-FMV và các sự kiện biến đổi gen chuyên biệt như GTS 40-3-2, MON810 và Bt11.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung nghiên cứu mang giá trị thực tiễn và học thuật sâu sắc, đặc biệt hữu ích cho 4 nhóm đối tượng sau:

• Chuyên viên kiểm nghiệm tại các trung tâm thử nghiệm và viện nghiên cứu: Giúp kỹ thuật viên nắm vững các bước tối ưu hóa phản ứng PCR đa mồi, áp dụng trực tiếp quy trình để tiết kiệm 50% chi phí hóa chất so với phương pháp PCR đơn thông thường.
• Doanh nghiệp sản xuất, chế biến thực phẩm và thức ăn chăn nuôi: Giúp bộ phận quản lý chất lượng (QA/QC) xây dựng quy trình tự kiểm soát nguyên liệu đầu vào từ bắp và đậu nành, đảm bảo tuân thủ nghiêm ngặt quy định dán nhãn 5% để phòng tránh rủi ro pháp lý và thu hồi sản phẩm.
• Cơ quan quản lý nhà nước về an toàn thực phẩm và an toàn sinh học: Cung cấp cơ sở khoa học và số liệu thực chứng phục vụ công tác xây dựng chính sách, thẩm định hồ sơ cấp phép và thanh tra chất lượng nông sản biến đổi gen lưu thông trên thị trường.
• Giảng viên, học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Công nghệ Sinh học: Đóng vai trò là tài liệu tham khảo chuẩn mực về phương pháp thiết kế nghiên cứu thực nghiệm, kỹ thuật tách chiết DNA thực phẩm và phương pháp đánh giá độ tương đồng bằng thống kê Kappa.

Câu hỏi thường gặp

Phương pháp Triplex-PCR trong luận văn phát hiện đồng thời những trình tự gen nào?

Phương pháp khuếch đại đồng thời ba trình tự đích trong một phản ứng gồm: promoter P-35S từ Cauliflower Mosaic Virus, terminator T-Nos từ Agrobacterium tumefaciens và gen nội chuẩn đặc hiệu loài là Lectin cho đậu nành hoặc Zein cho bắp. Hai nhân tố P-35S và T-Nos hiện diện trong hơn 90% cây trồng chuyển gen thương mại.

Giới hạn phát hiện của phương pháp có đáp ứng được quy định dán nhãn tại Việt Nam không?

Phương pháp đạt giới hạn phát hiện LOD95 ở mức 0,1% đối với đậu nành và 0,042% đối với bắp. Mức phát hiện này nhạy hơn rất nhiều so với quy định dán nhãn bắt buộc 5% của Thông tư liên tịch số 45/2015/TTLT-BNNPTNT-BKHCN, hoàn toàn đáp ứng xuất sắc các tiêu chuẩn kiểm soát an toàn sinh học khắt khe nhất.

Tại sao cần tích hợp gen nội chuẩn Lectin và Zein trong phản ứng sàng lọc?

Việc tích hợp gen đặc hiệu loài Lectin hoặc Zein giúp kiểm soát chất lượng của toàn bộ quá trình tách chiết DNA. Nếu phản ứng không xuất hiện vạch của gen nội chuẩn, mẫu thử có thể bị ức chế phản ứng hoặc DNA bị phân hủy, từ đó ngăn chặn hoàn toàn nguy cơ kết luận âm tính giả.

Hệ số tương đồng Kappa giữa phương pháp Triplex-PCR và kit SureFood GMO SCREEN có ý nghĩa gì?

Hệ số Kappa đạt 0,69 đối với đậu nành và 0,90 đối với bắp thể hiện mức độ tương đồng từ đáng kể đến gần như tuyệt đối giữa hai phương pháp. Kết quả này chứng minh phương pháp tự xây dựng có độ tin cậy tương đương với các bộ kit Realtime PCR thương mại đắt tiền của châu Âu trên 42 mẫu thực tế.

Phương pháp này có thể áp dụng cho các sản phẩm đậu nành và bắp đã qua chế biến sâu không?

Phương pháp sử dụng quy trình tách chiết tinh sạch bằng hạt từ Wizard Magnetic giúp loại bỏ tạp chất và các đoạn khuếch đại ngắn, cho phép phát hiện tốt vật liệu di truyền trong các sản phẩm dạng bột, sữa đậu nành và bánh ngũ cốc, ngoại trừ các mẫu bị thủy phân hoặc xử lý nhiệt quá khắc nghiệt làm đứt gãy hoàn toàn DNA.

Kết luận

• Xây dựng thành công quy trình Triplex-PCR sàng lọc đồng thời ba trình tự gen P-35S, T-Nos và Lectin hoặc Zein trong cùng một phản ứng duy nhất.
• Tối ưu hóa hoàn chỉnh các thông số kỹ thuật tại nhiệt độ bắt cặp 59 độ C và tỷ lệ nồng độ mồi 0,09 : 0,09 : 0,09 micromol/L.
• Đạt giới hạn phát hiện LOD95 xuất sắc ở mức 0,1% đối với đậu nành và 0,042% đối với bắp, độ đặc hiệu và độ nhạy đạt 100%.
• Kiểm chứng độ tương đồng cao trên 42 mẫu thực tế so với kit thương mại SureFood GMO SCREEN với hệ số Kappa đạt từ 0,69 đến 0,90.
• Tiết kiệm hơn 50% chi phí phân tích và giảm 60% thời gian thực nghiệm so với phương pháp monoplex PCR truyền thống.

Luận văn đã đóng góp một công cụ sàng lọc sinh học phân tử có độ chính xác cao, chi phí hợp lý và khả năng ứng dụng rộng rãi cho các đơn vị kiểm nghiệm tại Việt Nam. Trong giai đoạn tiếp theo, các phòng thí nghiệm cần sớm triển khai áp dụng quy trình vào hệ thống phân tích thường quy nhằm nâng cao hiệu quả quản lý an toàn sinh học đối với nông sản biến đổi gen.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về GMO, lược sử hình thành và phát triển 1. Giới thiệu về GMO Sinh vật biến đổi gen (GMO-GeneticallyModified Orgarnisms) hay còn được gọi với tên sinh vật chuyển gen (Transgenic Orgarnisms) là những sinh vật có vật liệu di truyền được biến đổi bằng kỹ thuật gen, trong đó, phiên bản gen gốc được tăng cường hoặc ức chế hoặc loại bỏ (knocked out) ở mức độ biểu hiện hoặc bị thay thế bởi gen có nguồn gốc từ sinh vật khác quy định các tính trạng phục vụ cho lợi ích của con người nhằm mục đích làm thực phẩm, dược phẩm, nông nghiệp, xử lý môi trường…Các tính trạng này không thể xuất hiện thông qua tái tổ hợp tự nhiên hoặc giao phối [31]. Quá trình từ lúc nghiên cứu, khảo nghiệm đến lúc cấp phép và công bố một giống GMO đảm bảo an toàn sinh học đủ điều kiện sử dụng làm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi được gọi là một sự kiện chuyển gen (Event).

Mỗi sự kiện chuyển gen sau khi cấp phép sẽ được cấp mã số sự kiện giống như giấy chứng minh nhân dân của con người cho mỗi giống GMO.Ví dụ: sự kiện đậu nành GST 40-3-2, sự kiện bắp MON 810, bắp Bt11xGA21…Thông tin cơ bản về mỗi sự kiện có thể tra cứu trên Website của tổ chức quốc tế về tiếp thu các ứng dụng công nghệ sinh học trong nông nghiệp (ISAAA). Lược sử hình thành, phát triển Trong lịch sử nông nghiệp, từ xa xưa cho đến thời điểm hiện tại, con người đã và đang đạt được nhiều thành tựu nổi bật nhờ vào kỹ thuật di truyền chọn giống dựa trên nguyên tắc góp nhặt, lựa chọn cho các cá thể mang các đột biến tự nhiên biểu hiện tính trạng mong muốn giao phối với nhau qua một hoặc nhiều thế hệ để tạo ra giống mới có biến đổi về mặt di truyền. Tuy nhiên, các giống này vẫn không được xem là GMO bởi vẫn chưa phá vỡ được ranh giới di truyền giữa các loài. Năm 1973, Herbert Boyer và Stanley Cohen, bằng kỹ thuật tái tổ hợp DNA đã tạo sinh vật biến đổi gen đầu tiên đó là chủng vi khuẩn kháng kháng sinh nhờ được 5 Tổng quan tài liệu nhận gen kháng từ chủng vi khuẩn khác.

Sự kiện này đặt nền móng đầu tiên cho kỹ thuật di truyền hiện đại, cũng là thời điểm đánh dấu cho sự hình thành và bùng nổ của GMO. Các năm sau đó các sinh vật biến đổi gen lần lượt ra đời bằng kỹ thuật di truyền và các sự kiện liên quan liên tiếp diễn ra [51, 52], không ngừng phát triển: Năm 1974, Rudolf Jaenisch và Beatrice Mintz tạo ra mô hình chuột khảm trong nghiên cứu ung thư, được xem là động vật biến đổi gen đầu tiên. Năm 1980, Tòa án tối cao Hoa Kỳ cấp bảng quyền sáng chế cho chủng vi khuẩn biến đổi gen có khả năng chuyển hóa Hydrocarbon trong dầu thô giúp giải quyết sự cố tràn dầu cho công ty General Electric. Sự kiện này là một sự khích lệ to lớn đối với các công ty công nghệ sinh học trong việc nghiên cứu ứng dụng GMO.

Năm 1982, FDA cấp phép lưu hành sinh dược Humulin, tên thương mại của Insulin người sản xuất bởi vi khuẩn Escherichia coli tái tổ hợp. Năm 1992, Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ cấp phép cho cây trồng chuyển gen đầu tiên là cà chua FLAVR SAVR. Năm 1995, Cục bảo vệ môi sinh Hoa Kỳ cấp phép cho giống bắp chuyển gen kháng côn trùng. Năm 1996, Monsanto công bố giống đậu nành biến đổi gen kháng thuốc diệt cỏ gốc Glyphosate đầu tiên với tên thương mại Roundup Ready.

Năm 2000, Ingo Potrykus và Peter Beyer tạo ra giống gạo GMO giàu vitamin A với tên gọi Golden Rice. Năm 2009, Atryn, tên thương mại của sinh dược Anticoagulant Antithrombin dùng chữa trị bệnh rối loạn đông máu được sản xuất từ sữa dê biến đổi gen được FDA cấp phép lưu hành. Năm Theo báo cáo thường niên mới nhất về hiện trạng thương mại hóa cây trồng biến đổi gen 2018 của tổ chức quốc tế về tiếp thu các ứng dụng công nghệ sinh học trong nông nghiệp (ISAAA), số lượng giống cây trồng biến đổi gen không ngừng tăng về số lượng và chủng loại theo năm tháng. Hoa Kỳ, quốc gia công nhận 6 Tổng quan tài liệu nhiều sự kiện biến đổi gen nhất thế giới, đã cấp phép lên đến 544 sự kiện biến đổi gen.

Cũng theo thống kê này, ba loại cây trồng GMO có diện tích canh tác lớn nhất trên thế giới lần lượt là đậu nành (50%), bắp (30,7%) và bông (13%) [8]. Xu hướng ứng dụng GMO Qua lược sử hình thành và phát triển GMO, có thể thấy GMO đầu tiên được tạo ra với mục đích phục vụ nghiên cứu. Theo thời gian, với sự phát triển của kỹ thuật sinh học phân tử và nhu cầu ứng dụng thực tiễn trong nhiều lĩnh vực khác nhau đã làm cho GMO không ngừng gia tăng về số lượng và chủng loại. Trong đó, nông nghiệp, y dược, thực phẩm và xử lý môi trường là những hướng ứng dụng chủ đạo của GMO.

GMO ứng dụng trong nông nghiệp, thực phẩm Theo dự đoán của FAO, dân số thế giới sẽ đạt 9 tỷ người vào 2050, đòi hỏi sản lượng nông nghiệp phải tăng 70% trong giai đoạn từ 2005 đến 2050 mới đáp ứng được nhu cầu lương thực [11]. Mục tiêu này phải đạt được trong bối cảnh diện tích đất và mặt nước phục vụ nông nghiệp ngày càng giảm. Biến đổi khí hậu làm gia tăng hạn hán, lũ lụt, xâm nhập mặn; tình hình sâu bệnh, ký sinh trùng, cỏ dại kháng thuốc ngày càng tăng. Thực trạng khó khăn vừa nêu là động lực nghiên cứu, ứng dụng và phát triển cây trồng biến đổi gen, cây GM truyền thống chủ yếu mang tính trạng kháng côn trùng, kháng thuốc diệt cỏ hoặc mang cùng lúc cả hai tính trạng kháng (cây trồng mang tính trạng này chiếm 3,7% tổng diện tích trồng cây biến đổi gen trên toàn thế giới vào năm 2014 [11]).

Các công trình nghiên cứu hiện tại và trong tương lai đang hướng đến việc tạo ra các giống cây trồng chịu hạn/mặn, kháng bệnh, năng suất cao, hàm lượng vitamin, hàm lượng dinh dưỡng cao [11]. Khi nói đến GMO ứng dụng trong nông nghiệp, thực phẩm, chúng ta thường nói và biết nhiều về cây trồng. Vì đến thời điểm hiện tại, động vật biến đổi gen vẫn đang bị kiểm soát chặt chẽ, các nghiên cứu vẫn còn đang trong giai đoạn khảo nghiệm. Chỉ duy nhất giống cá hồi biến đổi gen AquAdvantage được FDA cấp phép nuôi trồng với điều kiện kiểm soát ngặt ngèo nhằm ngăn chặn giống cá này phát tán ra môi trường tự nhiên, được mua bán làm thực phẩm nhưng chỉ giới hạn ở thị trường Mỹ 7 Tổng quan tài liệu [12, 53].

Nghiên cứu động vật biến đổi gen chủ yếu hướng đến các tính trạng liên quan đến khả năng kháng bệnh, cải thiện chất lượng thịt, chất lượng sữa; bổ sung thành phần dinh dưỡng, sinh dược vào thịt hoặc sữa, cải thiện chất lượng lông, đẩy nhanh tốc độ tăng trưởng [12].1: Một số loại cây trồng, động vật biến đổi gen ứng dụng trong nông nhiệp, thực phẩm Tính trạng/tác Loài Gene chuyển Nguồn cho gen dụng Thực vật Đậu Cp4 epsps Agrobacterium Kháng thuốc diệt cỏ nành tumefaciens strain CP4 Glyphosate Bắp CryA Bacillus thuringiensis Kháng côn trùng Gạo Crt1/Psy1/pmi Pantoea ananatis/Zea Giàu vitamin A mays/Escherichia coli Bông S4-HrA Nicotiana tabacum cv. Kháng thuốc diệt cỏ Xanthi Sulfonylurea Khoai CryA Bacillus thuringiensis Kháng côn trùng tây Táo Gen ức chế PGAS Malus domestica Chống hóa nâu sau PPO khi cắt Cà pg Lycopersicon esculentum Chín chậm chua Động vật (*) Heo Mx1 Chuột(*) Kháng cúm Bò Gen chuyển hóa Giun tròn(*) Cải thiện chất lượng Omega 3 sữa Gà Gen mã hóa Virus(*) Kháng bệnh Glycoprotein alv6 Cá da Gen mã hóa Côn trùng(*) Kháng bệnh trơn Cercopin B (*)Công trình nghiên cứu nguồn gốc cho gen chưa được công bố cụ thể loài, dòng sinh vật cho gen [7, 13]. GMO ứng dụng trong xử lý môi trường Các chất như Toluen, chloride hữu cơ, các hợp chất hydrocarbon vòng thơm, polychlorinated biphenyls (PCBs), polyaromatic hydrocarbons (PAHs), thuốc trừ 8 Tổng quan tài liệu sâu, thuốc diệt cỏ, các hợp chất hydrocarbons chứa liên kết bền, dioxin, kim loại nặng (Cd, Hg, Pb)… tạo ra từ hoạt động nông nghiệp, công nghiệp, sinh hoạt của con người, là những chất ô nhiễm khó phân hủy, không hoặc ít chuyển hóa được trong chu trình sinh địa hóa vật chất tự nhiên. Chúng tích lũy ngày càng nhiều trong môi trường sống đe dọa trực tiếp đến sức khỏe con người và hệ sinh thái.

Nhiều biện pháp xử lý ô nhiễm đã được sử dụng, trong đó, biện pháp xử lý sinh học như sử dụng vi sinh vật biến đổi gen là hướng ứng dụng hiệu quả, thân thiện môi trường và triển vọng nhất. Nguyên tắc là tạo ra vi sinh vật biến đổi gen xử lý môi trường, được tiếp cận theo các hướng sau: Phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật từ những môi trường sống cực đoan về nguồn dinh dưỡng như nồng độ quá cao hoặc quá thấp, cực đoan về pH, độ mặn, áp suất và nhiệt độ… làm vật chủ, biến nạp các gen mã hóa cho các enzyme chuyển hóa chất ô nhiễm như Catechol 1,2-dioxygenase, toluen dioxygenase-iron- sulfur, Benzene dioxygenase, naphthalene dioxygenase, dioxin dioxygenase…từ các nguồn cho gen khác không sống được trong môi trường cực đoan [14]. Phân lập, tuyển chọn nguồn gen mã hóa cho protein phân hủy độc chất từ các chủng vi sinh vật bản địa trong môi trường ô nhiễm, gây đột biến tạo ra phiên bản gen mới mã hóa cho sản phẩm có hoạt tính mạnh hơn (enzyme có ái lực cao hơn, đặc hiệu hơn…), hoặc gây đột biến enzyme chủ chốt trong con đường chuyển hóa sinh học của chủng tự nhiên giúp tăng cường biểu hiện protein mục tiêu nâng cao hiệu suất chuyển hóa chất ô nhiễm [14]. Tuy không trực tiếp xử lý chất ô nhiễm như vi sinh vật biến đổi gen, nhưng việc canh tác cây trồng biến đổi gen cũng gián tiếp giảm thiểu phát thải chất ô nhiễm ra môi trường.

Theo thống kê của ISAAA, từ 1996 đến 2016, canh tác cây trồng biến đổi gen đã cắt giảm hơn 583,5 triệu tấn thuốc trừ sâu, giảm tiêu thụ năng lượng hóa thạch sử dụng trong nông nghiệp thông qua đó giảm phát thải lượng khí CO2 tương đương lượng thải ra của 16,75 triệu xe ô tô [9]. 9 Tổng quan tài liệu Bảng 1.2: Một số chủng vi sinh vật biến đổi gen sử dụng trong xử lý ô nhiễm Chủng Gen chuyển Nguồn cho gen Ứng dụng Tác giả E.