Tổng quan nghiên cứu

Ngành chăn nuôi heo tại Việt Nam đóng vai trò quan trọng trong đảm bảo an ninh thực phẩm, tuy nhiên đang đối mặt với nhiều thách thức như dịch bệnh và lạm dụng kháng sinh. Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, dịch tả heo Châu Phi đã lan rộng ra toàn quốc, gây thiệt hại hơn 5 triệu con heo phải tiêu hủy tính đến cuối năm 2019. Các triệu chứng bệnh thường liên quan đến rối loạn tiêu hóa, làm suy giảm thể trạng và tăng nguy cơ tử vong. Song song đó, việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi với mục đích trị bệnh, phòng bệnh và kích thích tăng trưởng đang bị kiểm soát chặt chẽ do lo ngại về an toàn thực phẩm và sức khỏe cộng đồng.

Trong bối cảnh đó, probiotic được xem là giải pháp thay thế tiềm năng nhằm cải thiện sức khỏe đường ruột và tăng cường hệ miễn dịch cho heo. Probiotic là các vi sinh vật sống khi đưa vào cơ thể với số lượng đủ sẽ mang lại lợi ích sức khỏe cho vật chủ, đặc biệt là trong việc cân bằng hệ vi sinh đường ruột và ức chế vi sinh vật gây bệnh. Nghiên cứu này tập trung phân lập và tuyển chọn các chủng probiotic từ heo rừng, một đối tượng có hệ vi sinh vật đường ruột đa dạng và khỏe mạnh hơn heo nhà, nhằm tìm ra các chủng có khả năng ức chế Escherichia coli và Salmonella typhimurium – hai tác nhân gây bệnh đường ruột phổ biến.

Mục tiêu chính của luận văn là sàng lọc các chủng vi sinh vật từ mẫu phân và ruột heo rừng, đánh giá khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh, xác định đặc tính probiotic và đánh giá đáp ứng miễn dịch trên mô hình tế bào biểu mô ruột Caco-2. Nghiên cứu được thực hiện trong khoảng thời gian từ tháng 11/2020 đến tháng 06/2022 tại Trường Đại học Bách Khoa – Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh và Trung tâm Công nghệ Sinh học TP. Hồ Chí Minh. Kết quả nghiên cứu góp phần phát triển các chế phẩm probiotic an toàn, hiệu quả, hỗ trợ ngành chăn nuôi heo phát triển bền vững, giảm thiểu sử dụng kháng sinh và nâng cao sức khỏe vật nuôi.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

  • Lý thuyết về probiotic và cơ chế tác động: Probiotic là vi sinh vật sống có lợi, giúp cân bằng hệ vi sinh đường ruột, ức chế vi khuẩn gây bệnh thông qua cạnh tranh bám dính, sản xuất các chất kháng khuẩn như axit hữu cơ, bacteriocins, và điều chỉnh phản ứng miễn dịch của vật chủ. Các cơ chế này bao gồm điều chỉnh hệ vi sinh vật, tăng cường hàng rào niêm mạc ruột, giảm viêm và tăng cường miễn dịch bẩm sinh và thu được.

  • Mô hình tế bào Caco-2: Dòng tế bào ung thư biểu mô ruột người Caco-2 được sử dụng làm mô hình in vitro để đánh giá khả năng bám dính của probiotic, ức chế sự bám dính của vi khuẩn gây bệnh và điều chỉnh biểu hiện các cytokine tiền viêm như IL-6, TNF-α khi tế bào bị kích thích bởi lipopolysaccharide (LPS).

  • Khái niệm về đặc tính probiotic: Bao gồm khả năng chịu được điều kiện axit (pH 4) và muối mật (0,3%), không gây tan huyết (an toàn), khả năng bám dính trên tế bào biểu mô ruột, tính kháng kháng sinh phù hợp và khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh.

Phương pháp nghiên cứu

  • Nguồn dữ liệu: 47 chủng vi sinh vật lactic acid bacteria (LAB) được phân lập từ 6 mẫu phân và ruột của heo rừng thuần, heo rừng lai và heo nhà tại các tỉnh Đắk Lắk, Bình Dương, Bình Phước và Đồng Nai.

  • Phương pháp phân tích:

    • Phân lập trên môi trường MRS agar, quan sát hình thái khuẩn lạc và nhuộm Gram.
    • Đánh giá khả năng ức chế E. coli ATCC 25922 và Salmonella typhimurium ATCC 14028 bằng phương pháp đĩa thạch hai lớp (spot-on-lawn).
    • Xác định yếu tố ức chế vi khuẩn gây bệnh qua phương pháp khuếch tán giếng thạch, loại bỏ ảnh hưởng của axit và protein bằng xử lý pH và enzyme proteinase K.
    • Đánh giá đặc tính probiotic: khả năng chịu axit pH 4 trong 4 giờ, chịu muối mật 0,3% trong 3 giờ, thử nghiệm tan huyết trên môi trường thạch máu cừu, khả năng bám dính trên tế bào Caco-2, ức chế sự bám dính của E. coli trên mô hình tế bào, và tính nhạy cảm với các kháng sinh phổ biến.
    • Định danh chủng tiềm năng bằng giải trình tự vùng 16S rRNA và so sánh với cơ sở dữ liệu NCBI.
    • Đánh giá đáp ứng miễn dịch của tế bào Caco-2 qua biểu hiện gen cytokine tiền viêm IL-6, TNF-α, IL-8 bằng Real-time PCR sau kích thích LPS và xử lý với probiotic.

  • Timeline nghiên cứu: Thu thập mẫu và phân lập từ tháng 11/2020 đến 03/2021; các thí nghiệm tuyển chọn, đánh giá đặc tính và phân tích miễn dịch thực hiện từ 04/2021 đến 06/2022.

  • Cỡ mẫu và chọn mẫu: 47 chủng LAB được chọn từ các mẫu đại diện của heo rừng và heo nhà khỏe mạnh, không có biểu hiện bệnh, nhằm đảm bảo tính đại diện và độ tin cậy của kết quả.

  • Phân tích thống kê: Sử dụng phần mềm GraphPad Prism, phân tích phương sai (ANOVA) và so sánh đa nhóm theo phương pháp Dunnett’s multiple comparisons, dữ liệu trình bày dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Phân lập và sàng lọc chủng probiotic:

    • Từ 47 chủng LAB phân lập, có 15 chủng thể hiện khả năng ức chế E. coli, trong đó 5 chủng có khả năng ức chế mạnh cả E. coli và Salmonella typhimurium.
    • Đường kính vùng ức chế của các chủng tiềm năng với E. coli dao động từ 15,33 mm đến 20,33 mm, với Salmonella từ 6,00 mm đến 9,00 mm.
    • 5 chủng tiềm năng được chọn gồm các chủng có ký hiệu 12, 18, 22, 23, 27.

  2. Xác định yếu tố ức chế vi khuẩn gây bệnh:

    • Yếu tố axit và protein trong dịch nuôi cấy của các chủng tiềm năng đóng vai trò quan trọng trong khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh.
    • Khi điều chỉnh pH dịch nuôi cấy lên 6,5 hoặc xử lý proteinase K, khả năng ức chế giảm rõ rệt, chứng tỏ axit hữu cơ và bacteriocins là các yếu tố chính.

  3. Đặc tính probiotic của các chủng tiềm năng:

    • Các chủng có khả năng chịu được điều kiện axit pH 4 trong 4 giờ và muối mật 0,3% trong 3 giờ với tỷ lệ sống sót trên 80%.
    • Tất cả các chủng đều không gây tan huyết, đảm bảo tính an toàn.
    • Chủng Pediococcus pentosaceus 27 có khả năng bám dính cao trên tế bào Caco-2 với tỷ lệ bám dính khoảng 45%, vượt trội so với các chủng khác.
    • Các chủng tiềm năng ức chế đáng kể sự bám dính của E. coli trên mô hình tế bào Caco-2, giảm từ 30% đến 60% tùy nghiệm thức (cạnh tranh, thay thế, ức chế).

  4. Khả năng điều chỉnh đáp ứng miễn dịch:

    • Khi tế bào Caco-2 bị kích thích bởi LPS, biểu hiện gen IL-6 và TNF-α tăng cao.
    • Xử lý đồng thời với các chủng probiotic tiềm năng làm giảm đáng kể biểu hiện IL-6 và TNF-α (giảm khoảng 40-50%), cho thấy khả năng điều hòa phản ứng viêm.
    • Biểu hiện IL-8 không thay đổi đáng kể, phù hợp với vai trò kiểm soát viêm mà không làm suy giảm miễn dịch.

Thảo luận kết quả

Kết quả phân lập và tuyển chọn các chủng probiotic từ heo rừng cho thấy nguồn vi sinh vật từ vật chủ tự nhiên có tiềm năng cao trong việc tìm kiếm các chủng có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh đường ruột. Việc xác định yếu tố axit và protein trong dịch nuôi cấy phù hợp với các nghiên cứu trước đây về vai trò của axit lactic và bacteriocins trong việc ức chế vi khuẩn gây bệnh.

Khả năng chịu axit và muối mật của các chủng tiềm năng đảm bảo chúng có thể tồn tại và phát triển trong môi trường đường tiêu hóa heo. Đặc biệt, khả năng bám dính cao của Pediococcus pentosaceus 27 giúp chủng này cạnh tranh hiệu quả với vi khuẩn gây bệnh trên bề mặt tế bào biểu mô ruột, từ đó giảm thiểu sự xâm nhập và gây bệnh.

Khả năng điều chỉnh biểu hiện cytokine tiền viêm IL-6 và TNF-α cho thấy probiotic không chỉ có tác dụng kháng khuẩn mà còn có vai trò điều hòa miễn dịch, giảm viêm đường ruột, góp phần cải thiện sức khỏe vật nuôi. Kết quả này tương đồng với các nghiên cứu quốc tế về tác dụng của probiotic trong việc giảm viêm và tăng cường hàng rào niêm mạc ruột.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ đường kính vùng ức chế vi khuẩn, biểu đồ tỷ lệ bám dính trên tế bào Caco-2 và biểu đồ biểu hiện gen cytokine để minh họa rõ ràng hiệu quả của các chủng probiotic tiềm năng.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Phát triển chế phẩm probiotic từ các chủng tiềm năng: Tập trung nghiên cứu sâu hơn và phát triển các chế phẩm probiotic dựa trên các chủng Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus pentosaceus và Weissella confusa đã được xác định, nhằm ứng dụng trong thức ăn chăn nuôi heo. Thời gian thực hiện trong 1-2 năm, do các đơn vị nghiên cứu và doanh nghiệp chăn nuôi phối hợp.

  2. Đánh giá hiệu quả in vivo: Tiến hành thử nghiệm trên heo trong điều kiện thực tế để đánh giá khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh, cải thiện sức khỏe đường ruột và tăng cường miễn dịch. Mục tiêu giảm tỷ lệ tiêu chảy và sử dụng kháng sinh trong vòng 12 tháng, do các trung tâm nghiên cứu và trang trại thực hiện.

  3. Xây dựng quy trình sản xuất và bảo quản: Thiết lập quy trình sản xuất probiotic đảm bảo tính ổn định, hiệu quả và an toàn, đồng thời nghiên cứu các phương pháp bảo quản phù hợp để duy trì hoạt tính vi sinh vật. Thời gian 6-12 tháng, do các phòng thí nghiệm công nghệ sinh học đảm nhiệm.

  4. Tuyên truyền và đào tạo: Tổ chức các chương trình tập huấn, hội thảo cho người chăn nuôi về lợi ích và cách sử dụng probiotic đúng cách nhằm giảm thiểu lạm dụng kháng sinh, nâng cao hiệu quả chăn nuôi bền vững. Thời gian triển khai liên tục, do các cơ quan quản lý nông nghiệp và các tổ chức đào tạo phối hợp.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành công nghệ sinh học, vi sinh vật: Luận văn cung cấp dữ liệu thực nghiệm chi tiết về phân lập, tuyển chọn và đánh giá probiotic, giúp mở rộng kiến thức và ứng dụng trong nghiên cứu khoa học.

  2. Doanh nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi và chế phẩm sinh học: Thông tin về các chủng probiotic tiềm năng và đặc tính sinh học giúp phát triển sản phẩm mới, nâng cao chất lượng thức ăn và giảm thiểu sử dụng kháng sinh.

  3. Người chăn nuôi heo: Hiểu rõ về lợi ích của probiotic trong việc phòng ngừa bệnh đường ruột, tăng cường miễn dịch và cải thiện năng suất chăn nuôi, từ đó áp dụng hiệu quả trong thực tế.

  4. Cơ quan quản lý và chính sách nông nghiệp: Cung cấp cơ sở khoa học để xây dựng các chính sách khuyến khích sử dụng probiotic, giảm thiểu kháng sinh trong chăn nuôi, hướng tới phát triển ngành chăn nuôi bền vững và an toàn thực phẩm.

Câu hỏi thường gặp

  1. Probiotic là gì và tại sao lại quan trọng trong chăn nuôi heo?
    Probiotic là các vi sinh vật sống có lợi giúp cân bằng hệ vi sinh đường ruột, ức chế vi khuẩn gây bệnh và tăng cường miễn dịch cho heo. Chúng giúp giảm tiêu chảy, cải thiện tiêu hóa và giảm sự phụ thuộc vào kháng sinh.

  2. Tại sao chọn phân lập probiotic từ heo rừng mà không phải heo nhà?
    Heo rừng có hệ vi sinh vật đường ruột đa dạng và khỏe mạnh hơn do sống trong môi trường tự nhiên, ít tiếp xúc với kháng sinh và hóa chất, nên các chủng probiotic phân lập từ heo rừng có khả năng thích nghi và hiệu quả cao hơn khi sử dụng cho heo nhà.

  3. Các tiêu chí chính để đánh giá một chủng probiotic là gì?
    Bao gồm khả năng chịu axit và muối mật, không gây tan huyết (an toàn), khả năng bám dính trên tế bào biểu mô ruột, khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh và tính nhạy cảm với kháng sinh.

  4. Mô hình tế bào Caco-2 có vai trò gì trong nghiên cứu này?
    Mô hình tế bào Caco-2 được sử dụng để đánh giá khả năng bám dính của probiotic, ức chế sự bám dính của vi khuẩn gây bệnh và điều chỉnh biểu hiện các cytokine miễn dịch, giúp mô phỏng môi trường ruột người và động vật.

  5. Làm thế nào probiotic giúp điều chỉnh đáp ứng miễn dịch của heo?
    Probiotic giảm biểu hiện các cytokine tiền viêm như IL-6 và TNF-α, giúp giảm viêm ruột, đồng thời tăng cường hàng rào niêm mạc và kích thích sản xuất kháng thể IgA, từ đó nâng cao khả năng phòng vệ của hệ miễn dịch đường ruột.

Kết luận

  • Đã phân lập thành công 47 chủng vi khuẩn lactic acid từ mẫu phân và ruột heo rừng, trong đó 5 chủng có khả năng ức chế mạnh E. coli và Salmonella typhimurium.
  • Các yếu tố axit hữu cơ và protein trong dịch nuôi cấy đóng vai trò quan trọng trong khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh.
  • Chủng Pediococcus pentosaceus 27 nổi bật với khả năng bám dính cao trên tế bào Caco-2 và ức chế sự bám dính của E. coli.
  • Các chủng probiotic tiềm năng có khả năng điều chỉnh đáp ứng miễn dịch, giảm biểu hiện cytokine tiền viêm IL-6 và TNF-α trên mô hình tế bào ruột.
  • Nghiên cứu mở ra hướng phát triển các chế phẩm probiotic an toàn, hiệu quả cho ngành chăn nuôi heo, góp phần giảm sử dụng kháng sinh và nâng cao sức khỏe vật nuôi.

Next steps: Tiến hành đánh giá in vivo trên heo, phát triển quy trình sản xuất probiotic và triển khai ứng dụng thực tế trong chăn nuôi.

Call-to-action: Các nhà nghiên cứu, doanh nghiệp và người chăn nuôi nên hợp tác để phát triển và ứng dụng probiotic nhằm nâng cao hiệu quả chăn nuôi bền vững.