MỞ ĐẦU Ngành chăn nuôi heo Việt Nam là một trong những ngành quan trọng trong nông nghiệp, có vai trò đảm bảo an ninh thực phẩm cho đất nước. Thời gian qua, chăn nuôi heo của Việt Nam gặp không ít khó khăn, thách thức về dịch bệnh, cạnh tranh thương mại. Theo Bộ NN&PTNT, tính đến cuối tháng 9/2019, dịch tả heo Châu Phi đã lan ra 63/63 tỉnh thành trong cả nước, với hơn 5 triệu con heo phải tiêu hủy. Các triệu chứng bệnh dịch tả heo Châu Phi thường được ghi nhận như sốt, giảm ăn, sụt cân, nôn mửa, tiêu chảy, táo bón, xuất huyết, …Các triệu chứng bệnh này thường liên quan đến sự rối loạn tiêu hóa, một nguyên nhân lớn dẫn đến việc heo bệnh suy giảm thể trạng, khiến bệnh nặng dẫn đến tử vong [1].
Song song đó, một vấn đề ngành chăn nuôi heo ở Việt Nam hiện nay đang phải đối mặt là vấn đề lạm dụng kháng sinh trong chăn nuôi. Kháng sinh sử dụng trong chăn nuôi ở nước ta sử dụng với ba mục đích chính là trị bệnh, phòng bệnh và kích thích tăng trưởng. Tuy nhiên, do những quan ngại về an toàn thực phẩm và sức khỏe con người, Bộ NN&PTNT đã ban hành quy định về các loại kháng sinh được sử dụng, bị hạn chế hay cấm sử dụng trong chăn nuôi. Những vấn đề nêu trên chính là thách thức và cũng là cơ hội để ngành chăn nuôi heo vượt qua và phát triển theo hướng hiện đại, bền vững, phù hợp và đáp ứng được yêu cầu chung của thế giới.
Hướng quan tâm mới của ngành chăn nuôi nước ta hiện nay là tìm kiếm các giải pháp thay thế kháng sinh và đem lại hiệu quả trong việc phòng và điều trị bệnh cho vật nuôi. Một trong số đó là ứng dụng probiotic trong chăn nuôi. Probiotic là các VSV sống khi đưa vào cơ thể theo đường tiêu hóa với số lượng đủ sẽ đem lại sức khỏe tốt cho vật chủ. Probiotic hiện nay đang được hướng đến là chất bổ trợ giúp tăng cường sức khỏe, kích thích tăng trưởng tự nhiên của vật nuôi.
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra hiệu quả của probiotic trong việc cân bằng hệ vi sinh đường ruột, đồng thời giúp vật nuôi tăng cường hệ miễn dịch [2]. Trong bối cảnh dịch tả heo Châu Phi diễn biến phức tạp, vẫn chưa có vaccine và thuốc để phòng và đặc trị cho heo; với các triệu chứng rối loạn tiêu hóa, khiến heo suy giảm thể trọng và tử vong. Hệ thống miễn dịch suy giảm cũng liên quan đến việc tăng tính nhạy cảm với 2 các mầm bệnh, các vi sinh vật gây bệnh cơ hội, hoặc bao gồm cả dịch tả heo Châu Phi [3]. Do đó, một khía cạnh có thể tiếp cận là ứng dụng probiotic nhằm ổn định hệ tiêu hóa và tăng cường hệ miễn dịch của heo.
Các nghiên cứu đã chứng minh việc sử dụng probiotic phân lập cùng đối tượng giúp probiotic thích nghi tốt hơn với điều kiện đường tiêu hóa của vật chủ. Vì vậy, từ những vấn đề trên, đề tài “Phân lập, tuyển chọn các chủng probiotic từ heo rừng có khả năng ức chế Escherichia coli và Salmonella typhimurium và đánh giá đáp ứng sinh miễn dịch của chúng trên mô hình tế bào Caco-2”, nhằm sàng lọc, tuyển chọn và xác định đặc tính của các chủng probiotic tiềm năng; đồng thời đánh giá hiệu quả ức chế VSV gây bệnh và khả năng điều hòa đáp ứng miễn dịch của probiotic này trên mô hình tế bào biểu mô ruột. Với mục tiêu trên, đề tài được tiến hành với các nội dung sau: - Phân lập các chủng VSV từ các nguồn mẫu heo khác nhau. - Đánh giá khả năng ức chế E.
typhimurium của các chủng phân lập được. - Xác định yếu tố của các chủng VSV tiềm năng có tác dụng ức chế lên E. - Xác định đặc tính của các chủng tiềm năng. - Đánh giá khả năng ức chế sự bám dính của vi khuẩn gây bệnh trên mô hình tế bào biểu mô ruột của chủng VSV tiềm năng.
- Đánh giá mức độ đáp ứng miễn dịch của tế bào biểu mô ruột đối với chủng VSV tiềm năng. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Probiotic trong chăn nuôi 1. Khái niệm và lịch sử hình thành Từ “probiotic” có nguồn gốc từ tiếng latin “pro” và tiếng Hy Lạp “βιοσ” – có nghĩa là sự sống được giới thiệu lần đầu tiên vào năm 1953 bởi nhà khoa học người Đức – Werner Kollath, để chỉ “các chất cần thiết cho sự phát triển cuộc sống một cách khỏe mạnh”.
Đến năm 1965, thuật ngữ này được hai nhà khoa học Lilly và Stillwell sử dụng trong bối cảnh khác để chỉ “các chất được tiết ra bởi một sinh vật có thể kích thích sự phát triển của sinh vật khác”. Tiếp đến năm 1992, probiotic được nhà khoa học Fuller định nghĩa lại là “một loại thức ăn bổ sung VSV sống có tác động có lợi đến vật nuôi bằng cách cải thiện sự cân bằng VSV đường ruột của vật chủ” [4]. Lịch sử đã ghi nhận việc con người biết sử dụng VSV để lên men sữa, như sữa lên men được vẽ trong các bức tranh của người Ai Cập cổ, hay “sữa yak lên men” trong những chuyến đi xa của người du mục ở Tây Tạng. Tuy nhiên, mãi đến những năm 1900, nhà khoa học người Nga đạt giải Nobel – Elie Metchnikoff đã kết luận ảnh hưởng của việc tăng tuổi thọ của người dân Bulgaria khi họ sử dụng sản phẩm sữa chua lên men là do tác động của probiotic chứ không phải do kháng sinh, ông cũng nói rằng “sự phụ thuộc của VSV đường ruột vào thực phẩm giúp chúng ta có thể áp dụng các biện pháp để thay đổi hệ vi khuẩn trong cơ thể, thay thế VSV có hại bằng VSV hữu ích”.
Câu nói này đã mô tả một cách rõ ràng về khái niệm probiotic [4]. Năm 1906, Henry Tissier đã phân lập được vi khuẩn Bifidobacterium từ trẻ sơ sinh và ông tuyên bố vi khuẩn này có thể thay thế vi khuẩn gây bệnh trong ruột [5]. Những khám phá này là nền tảng để nghiên cứu VSV giúp tăng cường sức khỏe và nghiên cứu các vai trò của chúng trong việc ngăn ngừa bệnh tật. Trong những năm 1950 – 1980, các nghiên cứu về probiotic chủ yếu tập trung vào sàng lọc các chủng lợi khuẩn tiềm năng phân lập trong tự nhiên, hoặc từ vật chủ là con người, đồng thời xác định các cơ chế tác động của chúng.
Đây cũng là giai đoạn bùng nổ các nghiên cứu về chế phẩm sinh học men vi sinh. Sau đó, sự gia tăng nhanh chóng số lượng các công bố về men vi sinh (từ 176 công bố năm 2000 đến 1476 công bố năm 2014) [5]. Số lượng các công bố khoa học về men vi sinh từ năm 1950 - 2014 Đường nét liền: số lượng các công bố khoa học; đường đứt nét: các thử nghiệm ngẫu nhiên có đối chứng; theo thập kỉ (1950-1990) hoặc theo năm (từ năm 2000). Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (FAO/WHO) đã định nghĩa probiotics là những VSV sống, với số lượng phù hợp giúp cải thiện sức khỏe của vật chủ, đồng thời phải an toàn con người và động vật (FAO, 2001).
Probiotic ngày nay càng được sử dụng rộng rãi, ngành công nghiệp sản xuất probiotic đang phát triển mạnh mẽ. Tính đến năm 2018, quy mô thị trường của các chế phẩm vi sinh trên toàn cầu ước tính đạt 48,38 tỷ USD [6]. Nó được thúc đẩy bởi xu hướng ngày càng tăng của người tiêu dùng đối với việc chăm sóc sức khỏe bằng các chế độ ăn uống bổ sung lợi khuẩn. Các chủng probiotic phổ biến sử dụng trong chăn nuôi Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều loài VSV được nghiên cứu và thương mại hóa với định hướng bổ sung trong thức ăn cho vật nuôi.
Các chủng này thường được phân lập từ đường ruột của vật nuôi và được lựa chọn dựa trên các tiêu chí khác nhau như khả năng chịu được axit dạ dày và muối mật, khả năng bám dính trên ruột hoặc khả năng đối kháng VSV gây bệnh [7]. Nhiều loại chế phẩm thương mại có chứa các loại VSV khác nhau; nguồn gốc, đặc tính và phương thức hoạt động của các loài VSV này cũng khác nhau dẫn đến sự khác biệt về hiệu quả của chế phẩm.1 trình bày các VSV thường được sử dụng trong thức ăn chăn nuôi [7]. Một số chủng vi sinh vật thường dùng trong thức ăn chăn nuôi Chi Loài B. Propionibacterium shermanii Saccharomyces S.
Nguồn phân lập các chủng probiotic Vi sinh vật có mặt ở khắp mọi nơi trên Trái Đất, ở các môi trường sống khác nhau (đất, nước, không khí, .) và cả môi trường sinh vật sống. Do đó, nguồn phân lập VSV rất đa dạng. Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu phân lập VSV từ các nguồn khác nhau và sàng lọc các đặc tính mong muốn nhằm tìm ra các VSV có lợi. + Sữa và các sản phẩm từ sữa: quá trình lên men sữa đã có lịch sử lâu đời, các loại sữa lên men truyền thống này chứa thành phần phức tạp của các loài LAB.
Đã có 148 chủng LAB đã được phân lập từ Kurut - một loại sữa yak lên men tự nhiên truyền thống từ Trung Quốc, trong đó L. delbrueckii subsp bulgaricus và Streptococcus thermophilus là những quần thể VSV chiếm ưu thế [7]. Bên cạnh đó, ngày nay người ta đã tìm ra trong sữa mẹ có chứa như Lactobacilli, Enterococci, Lactococci và Bifidobacteria, và việc uống sữa mẹ giúp hỗ trợ ưu thế của vi khuẩn Bifidobacteria và Lactobacilli trong hệ VSV đường ruột của trẻ sơ sinh [8]. + Thực phẩm lên men: đây thường là các sản phẩm truyền thống, đa dạng về nguyên liệu và thành phần, tùy vào văn hóa và truyền thống của địa phương; do đó, chúng rất đa dạng về VSV và là nguồn phân lập rất tiềm năng.
Nhiều chủng thuộc nhóm LAB được phân lập từ nguồn như cá (mắm), nem chua, đậu tương lên men,… [9]. + Một số loại rau và trái cây như thanh long, sầu riêng, gừng, đu đủ, khế, ổi,… đã được sàng lọc tìm LAB có lợi, có khả năng sản xuất bacteriocin, hydrogen peroxide, các axit hữu cơ,…[10]. + Nguồn phân lập tiềm năng nhất được cho là từ đường ruột của động vật. Các chủng probiotic đã được phân lập từ đường tiêu hóa của gia cầm, heo, động vật nhai lại và của người như probiotic được phân lập từ phân su của trẻ sơ sinh [7] … + Ngoài ra, các nhà khoa học còn phân lập được các chủng vi khuẩn có lợi từ các nguồn độc đáo khác như trong mật ong và ruột của chúng [11] hoặc chủng B.
pumilus WIT 588 phân lập từ nước biển cho thấy khả năng ức chế E.