Tổng quan nghiên cứu

Ngành nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) tại Việt Nam đóng góp khoảng 80% sản lượng thủy sản xuất khẩu, với diện tích nuôi lên đến gần 5.000 ha tại Đồng bằng sông Cửu Long. Tuy nhiên, dịch bệnh gan thận mủ và bệnh xuất huyết do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila gây ra đã làm thiệt hại nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng cá tra, ảnh hưởng trực tiếp đến giá trị kinh tế ngành. Tỷ lệ cá chết có thể lên đến 100% trong các đợt dịch bùng phát, gây thiệt hại lớn cho người nuôi và doanh nghiệp chế biến xuất khẩu.

Mục tiêu nghiên cứu nhằm phân lập và phân tích genome các chủng vi khuẩn kháng thuốc gây bệnh quan trọng trên cá tra, đặc biệt là Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila, từ mẫu bùn ao nuôi cá tra tại tỉnh Cần Thơ. Nghiên cứu tập trung vào việc khảo sát hoạt tính xâm nhiễm, phân lập phage kháng vi khuẩn, cũng như phân tích cấu trúc genome của các chủng vi khuẩn và phage liên quan. Thời gian thực hiện từ tháng 2 đến tháng 6 năm 2021 tại Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Bách Khoa TP. Hồ Chí Minh.

Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển các biện pháp kiểm soát dịch bệnh thay thế kháng sinh, góp phần nâng cao hiệu quả nuôi trồng thủy sản bền vững, giảm thiểu ô nhiễm môi trường và nguy cơ kháng thuốc trong ngành thủy sản.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

  • Lý thuyết về vi khuẩn gây bệnh và cơ chế kháng thuốc: Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila là vi khuẩn Gram âm, gây bệnh gan thận mủ và xuất huyết trên cá tra, có khả năng kháng nhiều loại kháng sinh do sử dụng lạm dụng trong nuôi trồng thủy sản.
  • Mô hình phage therapy (liệu pháp sử dụng virus diệt vi khuẩn): Phage là virus đặc hiệu xâm nhiễm và tiêu diệt vi khuẩn, có tiềm năng thay thế kháng sinh trong kiểm soát dịch bệnh thủy sản.
  • Khái niệm về phân tích genome và giải trình tự thế hệ mới (NGS): Sử dụng công nghệ giải trình tự Illumina để phân tích cấu trúc genome vi khuẩn và phage, xác định các gen kháng thuốc, yếu tố độc lực và đặc điểm di truyền.
  • Khái niệm về hoạt tính xâm nhiễm và chu kỳ lây nhiễm của phage: Đánh giá khả năng tiêu diệt vi khuẩn của phage qua các chỉ số như chu kỳ lây nhiễm, kích thước vòng tan và burst size.
  • Phân tích phát sinh loài dựa trên protein capsid chính (MCP) và terminase large subunit (TerL): Xác định mối quan hệ tiến hóa giữa các chủng phage và vi khuẩn.

Phương pháp nghiên cứu

  • Nguồn dữ liệu: Mẫu bùn ao nuôi cá tra tại tỉnh Cần Thơ, các chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila được phân lập từ mẫu bùn và cá bệnh.
  • Phương pháp phân tích vi sinh: Phân lập vi khuẩn bằng phương pháp plaque assay, xác định hoạt tính xâm nhiễm qua spot test và đo chu kỳ lây nhiễm, burst size của phage.
  • Giải trình tự genome: Sử dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới Illumina Next Generation Sequencing (NGS) với cỡ mẫu gồm 6 chủng phage (PVN03, PVN04, PVN05, PVN06, PVN07, PVN08). Dữ liệu thô được xử lý bằng phần mềm FastQC, Trimmomatic, và lắp ráp genome bằng Unicycler.
  • Chú giải genome: Sử dụng phần mềm Prokka để chú giải các ORF, xác định gen kháng thuốc, yếu tố độc lực, và các thành phần di truyền khác.
  • Phân tích phát sinh loài: Xây dựng cây phát sinh loài dựa trên trình tự protein MCP và TerL bằng phần mềm MAFFT và MEGA-X với thuật toán bootstrap.
  • Timeline nghiên cứu: Thu thập mẫu và phân lập vi khuẩn/phage từ tháng 2 đến tháng 4/2021; giải trình tự và phân tích genome từ tháng 4 đến tháng 6/2021.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Phân lập phage Edwardsiella ictaluri từ mẫu bùn: Từ 30 mẫu bùn ao nuôi cá tra, đã phân lập được 13 dòng phage có hoạt tính xâm nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri, chiếm tỷ lệ khoảng 43%. Các dòng phage M7N, M14N, M20N, M23N có nồng độ stock cao trên 10^10 PFU/mL.

  2. Hoạt tính xâm nhiễm và chu kỳ lây nhiễm: Phage M14N có chu kỳ lây nhiễm ngắn nhất khoảng 70 phút và burst size đạt 160, vượt trội so với các dòng phage khác. Phage M18N có phổ xâm nhiễm rộng nhất, tiêu diệt được 5 dòng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri khác nhau.

  3. Phân tích genome phage: Genome của 6 dòng phage PVN03 đến PVN08 có kích thước từ 42.439 đến 51.720 bp, chứa từ 60 đến 69 ORF, không phát hiện gen kháng thuốc, yếu tố độc lực hay gen tích hợp. Điều này cho thấy các phage này an toàn để ứng dụng trong liệu pháp phage.

  4. Phân tích phát sinh loài: Các phage PVN03, PVN04, PVN05 nhóm riêng biệt với các phage Aeromonas hydrophila khác trong cơ sở dữ liệu, trong khi PVN06, PVN07, PVN08 nhóm cùng với phage Pei21 đã được ghi nhận trước đó. Điều này minh chứng sự đa dạng di truyền của phage tại Việt Nam.

Thảo luận kết quả

Kết quả phân lập phage từ mẫu bùn ao nuôi cá tra cho thấy môi trường nuôi trồng là nguồn phong phú các phage có khả năng kiểm soát vi khuẩn gây bệnh. Chu kỳ lây nhiễm ngắn và burst size lớn của phage M14N cho thấy tiềm năng ứng dụng cao trong kiểm soát dịch bệnh gan thận mủ. Phổ xâm nhiễm rộng của phage M18N giúp tăng hiệu quả điều trị đa chủng vi khuẩn.

Phân tích genome không phát hiện gen kháng thuốc hay yếu tố độc lực, phù hợp với các nghiên cứu quốc tế về tính an toàn của phage trong liệu pháp thay thế kháng sinh. Phân tích phát sinh loài cho thấy các phage phân lập tại Việt Nam có sự đa dạng di truyền, góp phần làm phong phú kho dữ liệu phage toàn cầu.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ chu kỳ lây nhiễm và burst size của các phage, bảng tổng hợp phổ xâm nhiễm trên các dòng vi khuẩn, cũng như cây phát sinh loài dựa trên protein MCP và TerL để minh họa mối quan hệ tiến hóa.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Phát triển liệu pháp phage ứng dụng trong nuôi cá tra: Tập trung nghiên cứu và sản xuất các chế phẩm phage M14N và M18N nhằm kiểm soát hiệu quả vi khuẩn Edwardsiella ictaluri, giảm thiểu sử dụng kháng sinh. Thời gian triển khai trong 1-2 năm, chủ thể thực hiện là các viện nghiên cứu và doanh nghiệp công nghệ sinh học.

  2. Mở rộng khảo sát và phân lập phage từ môi trường nuôi trồng: Thu thập thêm mẫu bùn và nước từ các vùng nuôi cá tra khác để tăng đa dạng phage, phục vụ cho việc xây dựng thư viện phage phong phú. Thời gian 1 năm, do các trung tâm nghiên cứu thủy sản thực hiện.

  3. Ứng dụng công nghệ giải trình tự genome thế hệ mới: Tiếp tục phân tích genome các chủng vi khuẩn và phage mới phân lập để phát hiện gen kháng thuốc, yếu tố độc lực, đảm bảo an toàn và hiệu quả trong ứng dụng. Thời gian liên tục, do các phòng thí nghiệm công nghệ sinh học đảm nhiệm.

  4. Xây dựng hệ thống giám sát dịch bệnh và kháng thuốc: Thiết lập hệ thống theo dõi sự xuất hiện của vi khuẩn kháng thuốc và phage trong môi trường nuôi trồng, giúp điều chỉnh kịp thời các biện pháp phòng chống dịch bệnh. Thời gian 2-3 năm, phối hợp giữa cơ quan quản lý và các viện nghiên cứu.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành công nghệ sinh học, vi sinh vật: Nghiên cứu cung cấp dữ liệu thực nghiệm và phương pháp phân tích genome hiện đại, hỗ trợ phát triển các đề tài liên quan đến vi khuẩn gây bệnh và phage.

  2. Doanh nghiệp sản xuất chế phẩm sinh học và thuốc thú y thủy sản: Thông tin về các dòng phage an toàn, hiệu quả giúp phát triển sản phẩm thay thế kháng sinh, nâng cao chất lượng và giá trị sản phẩm thủy sản.

  3. Người nuôi cá tra và các tổ chức quản lý thủy sản: Hiểu rõ về dịch bệnh và giải pháp kiểm soát mới giúp áp dụng các biện pháp phòng chống dịch hiệu quả, giảm thiệt hại kinh tế.

  4. Cơ quan quản lý môi trường và an toàn thực phẩm: Nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học cho việc quản lý sử dụng kháng sinh và các biện pháp sinh học trong nuôi trồng thủy sản, góp phần bảo vệ môi trường và sức khỏe cộng đồng.

Câu hỏi thường gặp

  1. Phage là gì và tại sao lại được sử dụng trong kiểm soát vi khuẩn gây bệnh?
    Phage là virus đặc hiệu xâm nhiễm và tiêu diệt vi khuẩn. Chúng có khả năng tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh mà không ảnh hưởng đến vi sinh vật có lợi, giúp giảm thiểu sử dụng kháng sinh và hạn chế kháng thuốc.

  2. Nghiên cứu đã phân lập được bao nhiêu dòng phage có hoạt tính xâm nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri?
    Nghiên cứu đã phân lập được 13 dòng phage từ mẫu bùn ao nuôi cá tra, trong đó một số dòng có hoạt tính xâm nhiễm mạnh và phổ rộng như M14N và M18N.

  3. Công nghệ giải trình tự genome thế hệ mới (NGS) được áp dụng như thế nào trong nghiên cứu?
    NGS được sử dụng để giải trình tự toàn bộ genome của các dòng phage, giúp xác định cấu trúc di truyền, các gen kháng thuốc, yếu tố độc lực và đánh giá tính an toàn của phage.

  4. Phage M14N có đặc điểm gì nổi bật so với các dòng phage khác?
    Phage M14N có chu kỳ lây nhiễm ngắn nhất khoảng 70 phút và burst size lớn đạt 160, cho thấy khả năng nhân lên nhanh và tiêu diệt hiệu quả vi khuẩn Edwardsiella ictaluri.

  5. Nghiên cứu có đề xuất ứng dụng phage trong thực tế nuôi cá tra không?
    Có, nghiên cứu đề xuất phát triển liệu pháp phage sử dụng các dòng phage hiệu quả như M14N và M18N để kiểm soát dịch bệnh, giảm thiểu sử dụng kháng sinh, góp phần nâng cao hiệu quả nuôi trồng thủy sản bền vững.

Kết luận

  • Đã phân lập thành công 13 dòng phage có hoạt tính xâm nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri từ mẫu bùn ao nuôi cá tra tại Đồng bằng sông Cửu Long.
  • Phage M14N và M18N nổi bật với chu kỳ lây nhiễm ngắn, burst size lớn và phổ xâm nhiễm rộng, phù hợp cho ứng dụng liệu pháp phage.
  • Genome các phage phân tích không phát hiện gen kháng thuốc hay yếu tố độc lực, đảm bảo an toàn cho ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản.
  • Phân tích phát sinh loài cho thấy sự đa dạng di truyền của phage tại Việt Nam, góp phần làm phong phú kho dữ liệu toàn cầu.
  • Đề xuất phát triển liệu pháp phage, mở rộng khảo sát môi trường và xây dựng hệ thống giám sát dịch bệnh để nâng cao hiệu quả kiểm soát vi khuẩn gây bệnh trên cá tra.

Hành động tiếp theo: Triển khai nghiên cứu ứng dụng phage trong mô hình nuôi cá tra thực tế, đồng thời mở rộng phân tích genome các chủng vi khuẩn và phage mới. Mời các nhà nghiên cứu, doanh nghiệp và người nuôi cá tra cùng hợp tác phát triển giải pháp sinh học bền vững cho ngành thủy sản Việt Nam.