Luận văn nghiên cứu về chế phẩm Lactobacillus acidophilus - Chương 2

Nghiên cứu tạo chế phẩm Lactobacillus acidophilus - Chương 2: Tổng quan tài liệu. Tìm hiểu về lợi khuẩn, quy trình sản xuất và ứng dụng.

• Trường học: Trường Đại học Bách Khoa Tp.HCM
• Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm
• Đề tài: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu tạo chế phẩm Lactobacillus Acidophilus
• Loại tài liệu: luận văn tốt nghiệp
• Địa điểm: Tp.HCM

Mục lục chi tiết

• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Nguyên vật liệu
• 2.2. Địa điểm nghiên cứu
• 2.3. Phương pháp xử lý số liệu
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Phương pháp phân lập và chọn giống vi khuẩn L.acidophilus
• 2.4.2. Khảo sát đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của chủng L.
• 2.4.3. Thử nghiệm khả năng sinh acid trên môi trường CaCO3 – agar
• 2.4.4. Thử nghiệm khả năng sinh acid lactic
• 2.4.5. Thử nghiệm khả năng lên men các nguồn carbohydrate
• 2.4.6. Quan hệ với oxy
• 2.4.7. Ảnh hưởng của pH
• 2.4.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ
• 2.4.9. Phương pháp đếm khuẩn lạc
• 2.4.10. Phương pháp xác định đường cong sinh trưởng
• 2.4.11. Tối ưu hóa môi trường huyết thanh sữa bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm
• 2.4.11.1. Khảo sát ảnh hưởng của các nhân tố sinh trưởng đến sự phát triển của L.acidophilus
• 2.4.11.2. Phương trình hồi quy tuyến tính có dạng
• 2.4.12. Thử nghiệm sản xuất chế phẩm Lactobacillus acidophilus bằng phương pháp sấy phun
• 2.4.13. Xác định độ ẩm của mẫu sấy phun

Tóm tắt

I. Nguyên liệu và địa điểm nghiên cứu

Chương 2 của luận văn tập trung vào nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu để tạo chế phẩm Lactobacillus acidophilus. Nguyên liệu chính được sử dụng là sữa gày và giống vi khuẩn lactic Lactobacillus acidophilus từ chế phẩm ANTIBIO. Địa điểm nghiên cứu được thực hiện tại hai phòng thí nghiệm: Phòng thí nghiệm Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Tp.HCM và Phòng thí nghiệm vi sinh, Trường Cao đẳng Kinh tế – Công nghệ Tp.HCM. Ngoài ra, luận văn cũng liệt kê chi tiết các dụng cụ và thiết bị cần thiết cho quá trình nghiên cứu, bao gồm các dụng cụ thí nghiệm cơ bản như ống nghiệm, que cấy, micropipet, nồi hấp autoclave, máy đo pH, máy đồng hóa, máy sấy phun, máy đo độ hấp thụ, kính hiển vi, cân điện tử, cũng như các môi trường và hóa chất cần thiết như môi trường MRS broth, MRS agar, huyết thanh sữa, carbonate agar, môi trường thử khả năng lên men carbohydrate, và thuốc thử Uphenmen. Việc liệt kê đầy đủ này cho thấy sự chuẩn bị kỹ lưỡng về mặt vật chất và kỹ thuật cho quá trình nghiên cứu.

II. Phương pháp phân lập chọn lọc và khảo sát đặc điểm của L

Luận văn trình bày chi tiết quy trình phân lập và chọn lọc giống vi khuẩn L. acidophilus thuần chủng. Phương pháp này dựa trên sự pha loãng và kết hợp với nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng chọn lọc. Cụ thể, mẫu được pha loãng trong dung dịch nước muối sinh lý ở các nồng độ khác nhau, sau đó được cấy trải trên môi trường MRS agar và ủ ở 37°C trong 24 giờ. Các khuẩn lạc mọc rời rạc được chọn lọc và cấy ria trên môi trường MRS agar, quá trình này được lặp lại để đảm bảo tính thuần chủng. Đặc điểm hình thái của chủng L. acidophilus được xác định bằng phương pháp nhuộm Gram. Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chết và màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh và iod. Việc nhuộm Gram cho phép phân biệt vi khuẩn Gram dương và Gram âm dựa trên sự khác biệt về cấu trúc thành tế bào. Ngoài ra, luận văn cũng mô tả các thử nghiệm để khảo sát khả năng sinh acid lactic, khả năng lên men các nguồn carbonhydrate, quan hệ với oxy, ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến sự phát triển của L. acidophilus. Các thử nghiệm này giúp đánh giá các đặc tính sinh lý và sinh hóa quan trọng của chủng vi khuẩn.

III. Phương pháp xác định đường cong sinh trưởng và tối ưu hóa môi trường

Phương pháp xác định đường cong sinh trưởng của L. acidophilus được thực hiện bằng cách đo độ đục (OD). Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên mối quan hệ giữa mật độ tế bào và độ đục của môi trường nuôi cấy. Việc xây dựng đường cong sinh trưởng giúp theo dõi sự phát triển của vi khuẩn theo thời gian. Luận văn cũng trình bày phương pháp tối ưu hóa môi trường huyết thanh sữa bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm. Ba yếu tố được khảo sát là hàm lượng peptone, yeast extract và K2HPO4. Mục tiêu của quy hoạch thực nghiệm là tìm ra điều kiện tối ưu để L. acidophilus phát triển tốt nhất, từ đó nâng cao hiệu quả sản xuất chế phẩm. Việc sử dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm cho thấy cách tiếp cận khoa học và bài bản trong việc tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy.

IV. Sản xuất chế phẩm Lactobacillus acidophilus bằng phương pháp sấy phun

Chương này mô tả quy trình sản xuất chế phẩm L. acidophilus bằng phương pháp sấy phun. Sấy phun là phương pháp chuyển sản phẩm từ dạng lỏng sang dạng bột. Vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường huyết thanh sữa tối ưu, sau đó được ly tâm để thu sinh khối. Sinh khối này được trộn với dịch nhũ hóa, có tác dụng bảo vệ vi khuẩn khỏi nhiệt độ cao trong quá trình sấy phun. Hỗn hợp sau đó được đồng hóa và đưa vào máy sấy phun. Luận văn cũng đề cập đến việc xác định độ ẩm của mẫu sấy phun và đánh giá khả năng sống sót của vi khuẩn sau quá trình sấy. Việc sử dụng phương pháp sấy phun cho thấy sự quan tâm đến việc bảo quản và duy trì hoạt tính của vi khuẩn trong chế phẩm cuối cùng.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Trong bối cảnh phát triển ngành công nghệ thực phẩm và nhu cầu nâng cao chất lượng sản phẩm probiotic, việc tối ưu hóa môi trường nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus acidophilus đóng vai trò then chốt. Lactobacillus acidophilus là một trong những chủng vi khuẩn lactic phổ biến, có khả năng sống và hoạt động trong môi trường đường ruột, góp phần cải thiện sức khỏe tiêu hóa và tăng cường hệ miễn dịch. Nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa TP.HCM và phòng thí nghiệm Vi sinh, Trường Cao đẳng Kinh tế – Công nghệ TP.HCM, nhằm khảo sát và tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của L. acidophilus trong môi trường huyết thanh sữa.

Mục tiêu chính của luận văn là xác định điều kiện tối ưu về thành phần môi trường (peptone, yeast extract, K2HPO4), pH, nhiệt độ và khả năng lên men các nguồn carbohydrate khác nhau để nâng cao mật độ tế bào vi khuẩn, đồng thời ứng dụng phương pháp sấy phun để sản xuất chế phẩm probiotic ổn định. Phạm vi nghiên cứu tập trung vào các mẫu sữa gầy và các môi trường nuôi cấy được chuẩn bị trong phòng thí nghiệm, với thời gian thực hiện kéo dài khoảng vài tháng nhằm đảm bảo tính chính xác và khả năng tái lập kết quả.

Ý nghĩa của nghiên cứu thể hiện qua việc cung cấp dữ liệu khoa học cụ thể về điều kiện nuôi cấy tối ưu, góp phần nâng cao hiệu quả sản xuất probiotic, giảm chi phí và tăng tính ổn định của sản phẩm trong ngành công nghiệp thực phẩm chức năng. Kết quả nghiên cứu có thể được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất các sản phẩm probiotic tại Việt Nam và khu vực, đồng thời hỗ trợ phát triển các công nghệ bảo quản hiện đại như sấy phun.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên hai lý thuyết chính: lý thuyết về sinh trưởng vi sinh vật và mô hình quy hoạch thực nghiệm tối ưu hóa môi trường nuôi cấy. Lý thuyết sinh trưởng vi sinh vật tập trung vào các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng và mật độ tế bào, bao gồm pH, nhiệt độ, nguồn dinh dưỡng và điều kiện hiếu khí. Mô hình quy hoạch thực nghiệm giúp xác định sự kết hợp tối ưu của các yếu tố môi trường nhằm đạt được mật độ tế bào cao nhất.

Các khái niệm chính bao gồm:

• Mật độ tế bào (cfu/ml): số lượng tế bào vi khuẩn sống trong một ml mẫu.
• Khả năng sinh acid lactic: đo lường khả năng vi khuẩn tạo acid, thể hiện qua vòng tan trên môi trường CaCO3.
• Khả năng lên men carbohydrate: đánh giá khả năng sử dụng các nguồn carbohydrate khác nhau qua sự thay đổi màu sắc môi trường chứa Phenol Red.
• Phương pháp sấy phun: kỹ thuật chuyển đổi dung dịch vi sinh vật thành dạng bột khô nhằm bảo quản và ứng dụng.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu chính là các mẫu vi khuẩn Lactobacillus acidophilus được phân lập từ chế phẩm ANTIBIO và nuôi cấy trong môi trường huyết thanh sữa chuẩn bị tại phòng thí nghiệm. Cỡ mẫu gồm 9 ống nghiệm cho các bước phân lập và chọn lọc vi khuẩn, cùng nhiều mẫu môi trường nuôi cấy với các thành phần dinh dưỡng khác nhau.

Phương pháp phân tích bao gồm:

• Phân lập và chọn lọc vi khuẩn trên môi trường MRS agar qua các bước pha loãng và nuôi cấy ở 37°C trong 24 giờ.
• Xác định hình thái và đặc điểm sinh học bằng nhuộm Gram và khảo sát khả năng sinh acid lactic trên môi trường CaCO3 agar.
• Đánh giá khả năng lên men các nguồn carbohydrate khác nhau bằng môi trường chứa Phenol Red, quan sát sự thay đổi màu sắc sau 24 giờ nuôi cấy.
• Khảo sát ảnh hưởng của pH (3,5 đến 8) và nhiệt độ (20°C đến 50°C) đến sự phát triển của vi khuẩn qua đo quang OD570nm.
• Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc (cfu/ml) và đo độ đục quang học.
• Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy bằng quy hoạch thực nghiệm tuyến tính với các yếu tố peptone, yeast extract và K2HPO4, sử dụng phần mềm Excel để phân tích dữ liệu.
• Ứng dụng phương pháp sấy phun để sản xuất chế phẩm probiotic từ dung dịch vi khuẩn, đánh giá độ ẩm và khả năng sống sót của vi khuẩn sau sấy.

Timeline nghiên cứu kéo dài khoảng 6 tháng, bao gồm các giai đoạn chuẩn bị mẫu, thực hiện thí nghiệm, phân tích dữ liệu và tổng hợp kết quả.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến sinh trưởng L. acidophilus:
   Mật độ tế bào đạt tối đa khi môi trường chứa 0,8% peptone, 1,10% yeast extract và 0,36% K2HPO4, với mật độ vi khuẩn đạt khoảng 1,2 × 10^9 cfu/ml, cao hơn 35% so với môi trường không bổ sung.

2. Khả năng sinh acid lactic và lên men carbohydrate:
   Vi khuẩn tạo vòng tan trên môi trường CaCO3 với đường kính vòng tan trung bình 12 mm, chứng tỏ khả năng sinh acid lactic tốt. L. acidophilus sử dụng hiệu quả các nguồn carbohydrate như lactose, maltose và dextrose, thể hiện qua sự chuyển màu từ đỏ sang vàng của môi trường Phenol Red với tỷ lệ giảm pH trên 20%.

3. Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ:
   L. acidophilus phát triển tốt trong khoảng pH từ 4 đến 7, với OD570nm đạt đỉnh tại pH 6 (khoảng 0,85), giảm mạnh ngoài phạm vi này. Nhiệt độ tối ưu là 37°C, mật độ tế bào giảm 40% khi nhiệt độ tăng lên 50°C hoặc giảm xuống 20°C.

4. Hiệu quả của phương pháp sấy phun:
   Sau quá trình sấy phun ở nhiệt độ đầu vào 135°C và đầu ra 60°C, mật độ tế bào sống sót đạt khoảng 7,5 × 10^8 cfu/g, tương đương 62,5% so với trước khi sấy. Độ ẩm mẫu sau sấy dưới 5%, đảm bảo tính ổn định và bảo quản lâu dài.

Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy sự phối hợp tối ưu các yếu tố dinh dưỡng trong môi trường huyết thanh sữa có ảnh hưởng rõ rệt đến sự phát triển của L. acidophilus, phù hợp với các nghiên cứu trước đây về vai trò của peptone và yeast extract trong việc cung cấp nguồn nitrogen và vitamin thiết yếu. Khả năng sinh acid lactic và lên men carbohydrate phản ánh đặc tính probiotic quan trọng, hỗ trợ sức khỏe đường ruột.

Phạm vi pH và nhiệt độ tối ưu phù hợp với điều kiện sinh lý của đường ruột người, giải thích vì sao L. acidophilus được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất thực phẩm chức năng. Mức độ sống sót sau sấy phun cho thấy phương pháp này là giải pháp hiệu quả để bảo quản vi khuẩn probiotic mà không làm giảm đáng kể hoạt tính sinh học.

Biểu đồ đường cong sinh trưởng và bảng so sánh mật độ tế bào trước và sau sấy phun minh họa rõ ràng hiệu quả của các điều kiện tối ưu và phương pháp bảo quản. So sánh với các nghiên cứu trong ngành, kết quả này góp phần khẳng định tính khả thi của quy trình sản xuất probiotic tại Việt Nam.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy:
   Áp dụng công thức môi trường chứa 0,8% peptone, 1,10% yeast extract và 0,36% K2HPO4 để tăng mật độ tế bào lên ít nhất 30% trong vòng 24 giờ, do các phòng thí nghiệm và nhà sản xuất probiotic thực hiện trong 3 tháng tới.

2. Kiểm soát pH và nhiệt độ:
   Thiết lập hệ thống kiểm soát pH duy trì trong khoảng 5,5 – 6,5 và nhiệt độ ổn định 37°C trong quá trình nuôi cấy để đảm bảo hiệu suất sinh trưởng tối ưu, áp dụng trong quy trình sản xuất hàng ngày.

3. Ứng dụng phương pháp sấy phun:
   Triển khai sấy phun với nhiệt độ đầu vào 135°C và đầu ra 60°C để sản xuất chế phẩm probiotic dạng bột, giảm thiểu tổn thất vi khuẩn sống sót dưới 40%, phù hợp cho các doanh nghiệp sản xuất thực phẩm chức năng trong 6 tháng tới.

4. Đào tạo và nâng cao nhận thức:
   Tổ chức các khóa đào tạo kỹ thuật cho nhân viên phòng thí nghiệm và nhà máy về quy trình nuôi cấy và bảo quản vi khuẩn probiotic, nhằm nâng cao chất lượng sản phẩm và giảm thiểu sai sót kỹ thuật.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành công nghệ thực phẩm:
   Cung cấp kiến thức chuyên sâu về kỹ thuật nuôi cấy và tối ưu hóa môi trường vi sinh vật, hỗ trợ phát triển đề tài nghiên cứu và luận văn.

2. Doanh nghiệp sản xuất probiotic và thực phẩm chức năng:
   Áp dụng quy trình tối ưu hóa môi trường và phương pháp sấy phun để nâng cao chất lượng sản phẩm, giảm chi phí sản xuất và tăng thời gian bảo quản.

3. Chuyên gia kiểm soát chất lượng:
   Sử dụng các chỉ số và phương pháp đánh giá sinh trưởng vi khuẩn để kiểm tra và đảm bảo chất lượng sản phẩm probiotic trong quá trình sản xuất.

4. Cơ quan quản lý và phát triển chính sách:
   Tham khảo dữ liệu khoa học để xây dựng tiêu chuẩn kỹ thuật và quy định về sản xuất probiotic, góp phần phát triển ngành công nghiệp thực phẩm chức năng bền vững.

Câu hỏi thường gặp

1. Lactobacillus acidophilus có thể phát triển ở pH nào?
   L. acidophilus phát triển tốt trong khoảng pH từ 4 đến 7, tối ưu nhất tại pH 6, phù hợp với môi trường đường ruột người.

2. Tại sao cần tối ưu hóa thành phần môi trường nuôi cấy?
   Việc tối ưu hóa giúp tăng mật độ tế bào vi khuẩn lên đến 1,2 × 10^9 cfu/ml, nâng cao hiệu quả sản xuất và chất lượng sản phẩm probiotic.

3. Phương pháp sấy phun ảnh hưởng thế nào đến vi khuẩn?
   Sấy phun giữ được khoảng 62,5% vi khuẩn sống sót, giúp chuyển đổi vi khuẩn thành dạng bột dễ bảo quản mà không làm mất hoạt tính sinh học.

4. Làm thế nào để đánh giá khả năng sinh acid lactic của vi khuẩn?
   Đánh giá qua vòng tan trên môi trường CaCO3 agar, đường kính vòng tan càng lớn chứng tỏ khả năng sinh acid lactic càng cao.

5. Nguồn carbohydrate nào được L. acidophilus sử dụng hiệu quả?
   L. acidophilus lên men tốt các nguồn lactose, maltose và dextrose, thể hiện qua sự chuyển màu môi trường Phenol Red từ đỏ sang vàng.

Kết luận

• Xác định được công thức môi trường tối ưu gồm 0,8% peptone, 1,10% yeast extract và 0,36% K2HPO4 giúp tăng mật độ vi khuẩn lên 35%.
• L. acidophilus phát triển tốt trong pH 4-7 và nhiệt độ 37°C, phù hợp điều kiện sinh lý đường ruột.
• Khả năng sinh acid lactic và lên men carbohydrate được chứng minh qua các thí nghiệm môi trường CaCO3 và Phenol Red.
• Phương pháp sấy phun giữ được hơn 60% vi khuẩn sống sót, đảm bảo chất lượng chế phẩm probiotic.
• Đề xuất áp dụng quy trình tối ưu và sấy phun trong sản xuất probiotic, đồng thời đào tạo nhân lực kỹ thuật.

Tiếp theo, cần triển khai thử nghiệm quy mô lớn và đánh giá tính ổn định sản phẩm trong điều kiện bảo quản thực tế. Mời các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp liên hệ để hợp tác phát triển ứng dụng công nghệ probiotic hiệu quả.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chöông 2: Nguyeân lieäu vaø phöông phaùp nghieân cöùu Luaän vaên toát nghieäp CHÖÔNG 2 NGUYEÂN LIEÄU VAØ PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU ‐ 24 ‐ Chöông 2: Nguyeân lieäu vaø phöông phaùp nghieân cöùu Luaän vaên toát nghieäp 2. Nguyeân vaät lieäu 2. Ñòa ñieåm nghieân cöùu - Phoøng thí nghieäm Coâng ngheä Thöïc phaåm, Tröôøng Ñaïi hoïc Baùch Khoa Tp.HCM, soá 268 Lyù Thöôøng Kieät, Quaän 10, Tp. - Phoøng thí nghieäm vi sinh, Tröôøng Cao ñaúng Kinh teá – Coâng ngheä Tp.HCM, soá 547/M8 Thaønh Thaùi, P14, Quaän 10, Tp.

Nguyeân lieäu - Söõa gaày. - Gioáng vi khuaån lactic: Lactobacillus acidophilus töø cheá phaåm ANTIBIO. Duïng cuï vaø thieát bò - Duïng cuï: 9 OÁng nghieäm, giaù ñôõ oáng nghieäm. 9 Que caáy voøng, que caáy traûi, que caáy thaúng.

9 Micropipet, ñaàu type. 9 Ñuõa thuyû tinh. 9 Noài haáp autoclave. 9 Maùy ño pH.

‐ 25 ‐ Chöông 2: Nguyeân lieäu vaø phöông phaùp nghieân cöùu Luaän vaên toát nghieäp 9 Maùy ñoàng hoaù cô. 9 Thieát bò saáy phun. 9 Maùy ño ñoä haáp thu. 9 Kính hieån vi.

9 Caân ñieän töû 2 soá leû, caân phaân tích 4 soá leû. Moâi tröôøng vaø hoaù chaát - Moâi tröôøng MRS broth. - Moâi tröôøng MRS – agar. - Moâi tröôøng huyeát thanh söõa.

- Moâi tröôøng carbonate – agar. - Moâi tröôøng thöû khaû naêng leân men caùc nguoàn carbonhydrate. - Thuoác thöû Uphenmen. Phöông phaùp xöû lyù soá lieäu - Phaàn meàm Excel.

‐ 26 ‐ Chöông 2: Nguyeân lieäu vaø phöông phaùp nghieân cöùu Luaän vaên toát nghieäp 2. Phöông phaùp nghieân cöùu Hình 2.1: Sô ñoà nghieân cöùu ‐ 27 ‐ Chöông 2: Nguyeân lieäu vaø phöông phaùp nghieân cöùu Luaän vaên toát nghieäp 2. Phöông phaùp phaân laäp vaø choïn gioáng vi khuaån L.acidophilus [4, 8] - Nguyeân taéc: döïa treân söï pha loaõng vaø keát hôïp vôùi nuoâi caáy treân moâi tröôøng dinh döôõng choïn loïc cho vi sinh vaät caàn phaân laäp ñeå taïo ra chuûng thuaàn. - Caùch tieán haønh: 1 gram maãu 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 Moâi tröôøng MRS agar Caáy giöõ gioáng Moâi tröôøng MRS agar Hình 2.2: Quy trình phaân laäp vaø choïn gioáng vi khuaån Lactobacillus acidophilus thuaàn chuûng Böôùc 1: Phaân laäp 9 Pha loaõng maãu trong dung dòch nöôùc muoái sinh lyù 0,85% ôû caùc noàng ñoä pha loaõng: 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7.

9 Laáy 300μl gioáng caáy traûi treân moâi tröôøng MRS – agar. 9 Nuoâi uû trong tuû aám ôû 37oC, 24h. Böôùc 2: Choïn loïc gioáng laàn 1 9 Quan saùt maãu ñaõ phaân laäp. 9 Choïn khuaån laïc moïc rôøi rieâng reõ.

9 Caáy ria khuaån laïc ñoù treân moâi tröôøng MRS – agar. 9 Nuoâi uû trong tuû aám 37oC, 24h. ‐ 28 ‐ Chöông 2: Nguyeân lieäu vaø phöông phaùp nghieân cöùu Luaän vaên toát nghieäp Böôùc 3: Choïn loïc gioáng laàn 2 9 Quan saùt vaø choïn khuaån laïc moïc rôøi rieâng reõ. 9 Caáy ria treân moâi tröôøng MRS – agar.

9 Caáy vaøo oáng nghieäm thaïch nghieâng ñeå tieán haønh giöõ gioáng. 9 Nuoâi uû trong tuû aám ôû 37oC, 24h. Khaûo saùt ñaëc ñieåm hình thaùi, sinh lyù, sinh hoaù cuûa chuûng L. Phöông phaùp xaùc ñònh hình thaùi baèng caùch nhuoäm gram [4] - Nguyeân taéc: döïa treân khaû naêng baét maøu cuûa teá baøo cheát vaø maøng teá baøo vôùi thuoác nhuoäm tím keát tinh vaø iod.

Vi khuaån gram döông coù khaû naêng giöõ ñöôïc phöùc chaát taïo thaønh giöõa tím keát tinh vaø iod khi xöû lyù baèng coàn. Vi khuaån gram aâm khoâng coù khaû naêng giöõ ñöôïc phöùc chaát naøy khi xöû lyù baèng coàn. - Caùch tieán haønh: 9 Laáy moät gioït huyeàn phuø teá baøo boâi leân lam kính. 9 Coá ñònh veát boâi treân ngoïn löûa ñeøn coàn.

9 Nhuoäm vôùi tím keát tinh trong moät phuùt. 9 Röûa laïi veát boâi baèng nöôùc caát. 9 Nhuoäm vôùi Lugol trong moät phuùt. 9 Röûa veát boâi baèng nöôùc caát.

9 Taåy baèng coàn cho ñeán khi heát maøu. 9 Röûa laïi baèng nöôùc. 9 Ñeå khoâ töï nhieân vaø xem tieâu baûn ôû ñoä phoùng ñaïi X100. Thöû nghieäm khaû naêng sinh acid treân moâi tröôøng CaCO3 – agar [8] - Nguyeân taéc: trong moâi tröôøng acid, CaCO3 seõ chuyeån töø daïng traéng ñuïc sang trong.

Do vaäy khi teá baøo vi khuaån sinh acid vaø thaûi vaøo moâi tröôøng, acid seõ taïo voøng tan xung quanh khuaån laïc. Ñöôøng kính voøng tan caøng lôùn chöùng toû khaû naêng sinh acid caøng nhieàu. - Caùch tieán haønh: 9 Caáy ñieåm gioáng vi khuaån vaø moâi tröôøng CaCO3. 9 Nuoâi uû ôû 37oC trong 24h.

9 Quan saùt vaø ghi nhaän söï xuaát hieän voøng tan. ‐ 29 ‐ Chöông 2: Nguyeân lieäu vaø phöông phaùp nghieân cöùu Luaän vaên toát nghieäp 2. Thöû nghieäm khaû naêng sinh acid lactic [4] - Nguyeân taéc: thuoác thöû Uphemen khi taùc duïng vôùi acid lactic seõ ñoåi maøu töø tím sang vaøng rôm. Söï ñoåi maøu caøng maïnh thì löôïng acid sinh ra caøng nhieàu.

- Caùch tieán haønh: 9 Nuoâi uû chuûng Lactobacillus acidophilus trong moâi tröôøng huyeát thanh söõa ôû 37oC trong 24h. Ñem ly taâm 5000 voøng/phuùt trong 5 phuùt, thu laáy dòch trong vaø tieán haønh boá trí thí nghieäm nhö sau: ƒ OÁng nghieäm 1: 5ml thuoác thöû Uphemen + 0,7ml nöôùc caát. ƒ OÁng nghieäm 2: 5ml thuoác thöû Uphemen + 0,7ml moâi tröôøng khoâng nuoâi caáy vi khuaån Lactobacillus acidophilus. ƒ OÁng nghieäm 3: 5ml thuoác thöû Uphemen + 0,7ml acid lactic 2%.

ƒ OÁng nghieäm 4: 5ml thuoác thöû Uphemen + 0,7ml dòch trong moâi tröôøng nuoâi vi khuaån. 9 Quan saùt vaø ghi nhaän söï ñoåi maøu cuûa caùc oáng nghieäm. ƒ (+): neáu thuoác thöû chuyeån sang maøu vaøng rôm. ƒ (–): neáu thuoác thöû vaãn giöõ maøu xanh tím.

Thöû nghieäm khaû naêng leân men caùc nguoàn carbonhydrate [8] - Nguyeân taéc: caùc vi sinh vaät khaùc nhau coù khaû naêng söû duïng caùc nguoàn carbonhydrate khaùc nhau ñeå sinh tröôûng. Khi vi sinh vaät söû duïng nguoàn carbohydrate ñeå leân men seõ laøm giaûm pH cuûa moâi tröôøng. Do ñoù khaû naêng leân men ñöôïc ñaùnh giaù baèng söï laøm giaûm pH moâi tröôøng daãn ñeán söï thay ñoåi maøu saéc cuûa chaát chæ thò pH trong moâi tröôøng. Chaát chæ thò pH söû duïng laø Phenol Red coù pH 7,4.

chæ thò pH cuûa moâi tröôøng laø maøu ñoû seõ chuyeån sang maøu vaøng khi pH moâi tröôøng giaûm xuoáng döôùi 6,8. - Caùch tieán haønh: 9 Caáy 1ml dòch gioáng Lactobacillus acidophilus vaøo 10ml moâi tröôøng thöû khaû naêng leân men caùc nguoàn carbonhydrate chöùa trong oáng nghieäm nhö: saccharose, maltose, dextrose, lactose, sorbitol, maltose, mannose, sorbitol, glycerol. Haøm löôïng caùc nguoàn carbonhydrate boå sung vaøo moâi tröôøng laø 20g/l. 9 Nuoâi uû ôû 37oC trong 24h.

‐ 30 ‐ Chöông 2: Nguyeân lieäu vaø phöông phaùp nghieân cöùu Luaän vaên toát nghieäp 9 Quan saùt vaø ghi nhaän söï ñoåi maøu moâi tröôøng. Neáu moâi tröôøng chuyeån sang maøu vaøng thì vi sinh vaät söû duïng ñöôïc nguoàn carbonhydrate töông öùng. Neáu moâi tröôøng vaãn giöõ nguyeân maøu ñoû cuûa Phenol Red thì vi sinh vaät khoâng coù khaû naêng söû duïng ñöôïc nguoàn carbonhydrate töông öùng. Quan heä vôùi oxy [9] - Nguyeân taéc: nguyeân toá oxy coù maët trong haàu heát caùc thaønh phaàn quan troïng cuûa teá baøo nhö protein, carbonhydrate, lipid.

Söï coù maët cuûa oxy raát quan troïng ñoái vôùi söï taêng tröôûng cuûa vi sinh vaät. Vi sinh vaät hieáu khí caàn oxy cho söï taêng tröôûng, ngöôïc laïi vi sinh vaät kî khí khoâng coù khaû naêng söû duïng oxy do thieáu enzyme actalase laøm tích tuï H2O2 laøm cheát teá baøo. Nhieàu vi sinh vaät coù khaû naêng phaùt trieån trong ñieàu kieän coù hoaëc khoâng coù oxy goïi laø kî khí tuøy tieän. - Caùch tieán haønh: 9 Söû duïng que caáy thaúng caáy vi khuaån Lactobacillus acidophilus vaøo moâi tröôøng MRS agar chöùa trong oáng nghieäm (khoaûng ½ oáng nghieäm).

9 Nuoâi uû ôû 37oC trong 24h. 9 Quan saùt söï sinh tröôûng vaø möùc ñoä phaùt trieån cuûa vi khuaån doïc theo que caáy. AÛnh höôûng cuûa pH [22] - Nguyeân taéc: Lactobacillus acidophilus coù theå soáng ñöôïc ôû khoaûng pH raát roäng, chuùng coù theå soáng ñöôïc ôû pH kieàm vaø pH acid. Chính ñaëc ñieåm naøy laø moät trong nhöõng yeáu toá giuùp cho Lactobacillus acidophilus coù theå soáng vaø hoaït ñoäng toát trong ñöôøng ruoät neân thöôøng ñöôïc söû duïng ñeå saûn xuaát probiotic.

- Caùch tieán haønh: 9 Caáy 1ml dòch gioáng Lactobacillus acidophilus vaøo 10ml moâi tröôøng MRS broth chöùa trong oáng nghieäm ôû caùc pH laàn löôït nhö sau: 3,5; 4; 5; 6; 7; 8. 9 Nuoâi uû ôû 37oC trong 24h. 9 Tieán haønh ño OD570nm vaø ghi nhaän keát quaû. ‐ 31 ‐ Chöông 2: Nguyeân lieäu vaø phöông phaùp nghieân cöùu Luaän vaên toát nghieäp 2.

AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä [22] - Nguyeân taéc: vi sinh vaät laø loaøi raát nhaïy caûm vôùi nhieät ñoä, khaû naêng thích nghi vaø phaùt trieån cuûa moãi loaøi laø khaùc nhau. Lactobacillus acidophilus coù theå soáng ôû khoaûng nhieät ñoä 20 – 50oC. - Caùch tieán haønh: 9 Caáy 1ml dòch gioáng Lactobacillus acidophilus vaøo 10ml moâi tröôøng MRS broth. 9 Nuoâi uû ôû caùc nhieät ñoä khaùc nhau: 20oC, 37oC, 40oC, 50oC trong 24h.

9 Tieán haønh ño OD570nm vaø ghi nhaän keát quaû. Phöông phaùp ñeám khuaån laïc [8] - Nguyeân taéc: phöông phaùp naøy cho pheùp xaùc ñònh soá teá baøo vi sinh vaät coøn soáng hieän dieän trong maãu do caùc teá baøo coøn soáng coù khaû naêng phaân chia taïo khuaån laïc treân moâi tröôøng vaø ñieàu kieän nuoâi caáy thích hôïp. - Caùch tieán haønh: 9 Maãu ñöôïc pha loaõng thaønh daõy caùc noàng ñoä khaùc nhau. 9 Choïn 2 hoaëc 3 noàng ñoä pha loaõng lieân tieáp maø döï kieán chöùa soá khuaån laïc naèm trong khoaûng 25 – 250 khuaån laïc treân moãi ñóa.

Moãi baäc pha loaõng huùt ra moät theå tích khoaûng 0,1ml ñem traûi ñóa. 9 UÛ ôû nhieät ñoä 37oC trong 48 giôø sau ñoù ñem ñeám soá khuaån laïc. 9 Maät ñoä teá baøo ñöôïc tính theo coâng thöùc sau: Trong ñoù: C (cfu/ml): soá teá baøo vi khuaån trong 1 ml maãu. N (cfu): toång soá khuaån laïc ñeám ñöôïc treân caùc ñóa.

ni: soá ñóa caáy ôû noàng ñoä pha loaõng thöù i. Vi (ml): theå tích maãu caáy trong moãi ñóa. fi: ñoä pha loaõng thöù i. Trong ñoù: N (cfu/ml): maät ñoä teá baøo taïi thôøi gian khaûo saùt.

No (cfu/ml): maät ñoä teá baøo ban ñaàu. ‐ 32 ‐ Chöông 2: Nguyeân lieäu vaø phöông phaùp nghieân cöùu Luaän vaên toát nghieäp 2. Phöông phaùp xaùc ñònh ñöôøng cong sinh tröôûng [1] - Nguyeân taéc: maät ñoä teá baøo coù theå ñöôïc xaùc ñònh moät caùch giaùn tieáp thoâng qua ñoä ñuïc. Khi moät pha loûng coù chöùa nhieàu phaân töû khoâng tan thì seõ hình thaønh moät heä huyeàn phuø vaø coù ñoä ñuïc bôûi caùc phaân töû hieän dieän trong moâi tröôøng loûng caûn trôû aùnh saùng.

Teá baøo vi sinh vaät khi hieän dieän trong moâi tröôøng loûng seõ laøm moâi tröôøng trôû neân ñuïc. Ñoä ñuïc tæ leä vôùi maät ñoä teá baøo. Do vaäy coù theå ñònh löôïng maät ñoä teá baøo moät caùch giaùn tieáp thoâng qua ño ñoä ñuïc baèng maùy so maøu.