ĐẶT VẤN ĐỀ Cellulose là hợp chất cao phân tử sinh học (biopolymer), là thành phần hữu cơ chiếm số lượng lớn trên trái đất, có tầm quan trọng trong nền kinh tế toàn cầu, là thành phần cấu tạo chủ yếu của tế bào thực vật. Ở vi sinh vật, cellulose là sản phẩm polysaccharide ngoại bào, được gọi là Cellulose vi khuẩn hay Bacterial Cellulose. Bacterial Cellulose (BC) là sản phẩm trao đổi chất cơ bản, đồng thời là lớp màng bảo vệ của vi sinh vật, mặt khác đã có những công trình nghiên cứu cho thấy vai trò của BC còn là nguồn dự trữ năng lượng cần thiết khi điều kiện môi trường sống trở nên khắc nghiệt đối với vi sinh vật. Trong khi cellulose thực vật (PC: Plant Cellulose) đóng vai trò quan trọng tạo cấu trúc lớp vỏ của thực vật.
BC và PC có cấu trúc hóa học giống nhau nhưng tính chất vật lý và hóa học thì khác nhau [14]. Sản phẩm BC được tổng hợp bởi một số loài vi khuẩn có khả năng tạo acid acetic thuộc các chủng như Acetobacter, Rhizobium, Agrobacterium, Aerobacter, [14] Achromobacter, Azotobacter, Rhizobium, Sarcina, và Salmonella trong đó Acetobacter xylinum là là vi sinh vật được xem là giống tạo BC hiệu quả nhất, gần đây nó được xếp vào giống mới Glucoacetobacter bao gồm một số loài G. Sản xuất BC từ Acetobacter xylinum lần đầu tiên được báo vào năm 1886 bởi AJ Brown khi ông quan sát thấy rằng các tế bào Acetobacter có khả năng sản xuất cellulose với sự hiện diện của oxy và glucose [15]. BC là hợp chất tương hợp sinh học, không độc hại, có nhiều tính chất độc đáo với cấu trúc siêu mịn, xốp nên có nhiều ứng dụng trong thực tế ở nhiều lĩnh vực như: làm giấy cao cấp, tạo mặt bóng bề mặt các trang tạp chí, làm ván ép, tấm vách, tấm lót sàn, làm vải chuyên dụng chất lượng cao như đồ thể thao.
Hiện nay đã được công ty Sony sử dụng BC làm màng lọc truyền âm thanh trong kỹ thuật chế tạo tai nghe cao cấp [16, 17]. -2- Trong ngành thực phẩm, BC dùng làm thực phẩm ăn kiêng, món tráng miệng như thạch dừa (Nata-de-Coco), chất làm đặc, chất ổn định dịch huyền phù, làm màng bảo quản thực phẩm. Ngoài ra BC còn được dùng làm chất mang trong kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật [24, 51]. Trong lãnh vực y học màng BC được ứng dụng làm băng, gạc vô trùng vết thương, làm da nhân tạo, màng điều trị phỏng, và đang được nghiên cứu cho các ứng dụng đặc biệt khác như: mạch máu nhân tạo, tạo bộ khung trong cấy ghép mô sụn, làm màng vá lỗ thoát vị, màng cứng trong hộp sọ, chất thay thế mô mềm, hệ thống khung treo cổ bàng quang [16, 17, 57].
BC còn là vật liệu sinh học được ứng dụng trong ngành mỹ phẩm với vai trò chất ổn định trong kem dưỡng da, mặt nạ đắp mặt, gel vuốt tóc, làm màng lọc trong công nghệ xử lý nước thải bảo vệ môi trường. Những ứng dụng rộng rãi của chế phẩm polymer sinh học này cho thấy nhiều ưu điểm nhưng lại phụ thuộc nhiều vào quy mô sản xuất cũng như chi phí đầu tư sản xuất, nên cần có những nghiên cứu cơ bản và nghiên cứu ứng dụng để cải thiện về giống, đa dạng hóa môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy để phát triển quy trình công nghệ lên men sản xuất chế phẩm BC hiệu quả hơn. Ở nước ta việc ứng dụng sản phẩm BC còn rất hạn chế, thường chỉ được sản xuất từ nguồn nguyên liệu là nước dừa già, sản phẩm chủ yếu làm thạch dừa (Nata-de Coco) làm nguồn cung cấp thực phẩm, một số được ứng dụng thử nghiệm làm màng trị bỏng, gạc băng bó vết thương. Nhưng quy mô chỉ ở mức độ nhỏ và nguồn nguyên liệu này chưa thích ứng cho sản xuất quy mô lớn.
Cấu trúc của BC phụ thuộc chặt chẽ vào điều kiện nuôi cấy, nguồn nguyên liệu làm môi trường và phương thức nuôi cấy. Từ đó cho ta các sản phẩm BC với những thuộc tính vật lý và cấu trúc đa phân tử khác nhau dẫn đến những khả năng ứng dụng khác nhau, đáp ứng nhu cầu thực tiễn đặt ra. -3- Việc nghiên cứu ứng dụng nguồn vi sinh vật trong tự nhiên vào sản xuất sản phẩm BC sẽ mang lại hiệu quả kinh tế cao, tiết kiệm về thời gian do vi khuẩn thích nghi và tăng trưởng nhanh, tiết kiệm diện tích mặt bằng sản xuất, tiết kiệm chi phí đầu tư trang thiết bị, mặt khác quy trình sản xuất không lệ thuộc vào điều kiện thời tiết khí hậu có thể chủ động trong các khâu sản xuất [9]. Mặt khác việc nghiên cứu tận dụng tối đa các nguồn nguyên liệu sẵn có, phổ biến trong nước, các nguồn phụ phế phẩm của các quá trình sản xuất khác vào việc sản xuất BC sẽ tạo nên sự phong phú, đa dạng môi trường nguyên liệu nuôi cấy và đa dạng nguồn sản phẩm ứng dụng thực tiễn, tiết kiệm chi phí sản xuất và hạ thấp giá thành sản phẩm, tạo ra giá trị kinh tế ứng dụng hiệu quả đồng thời giải quyết được nguy cơ ô nhiễm môi trường do các chất thải từ nguồn phụ phẩm, phế phẩm công nghiệp gây ra.
Hiện nay trong bối cảnh thế giới thường xuyên có xung đột, chiến tranh, cùng với thiên tai, biến đổi khí hậu toàn cầu. Việc khai thác Cellulose từ nguồn thực vật cây trồng không còn thuận lợi do nạn phá rừng, do thiên tai, lũ lụt, nạn xói mòn bạc màu đất đai. Việc khai thác và sử dụng Cellulose từ nguồn gỗ rừng tự nhiên một cách sâu rộng sẽ dẫn đến những hậu quả của sự nóng lên toàn cầu do gia tăng khí thải CO2 dẫn đến gây hủy hoại cho môi trường tự nhiên. Mặt khác để khai thác cây trồng làm nguồn cung cấp Cellulose phải cần nhiều hơn ba mươi năm cho cây phát triển, trưởng thành, trong khi sử dụng nguồn vi khuẩn sản xuất BC chỉ trong vài ngày.
Vì vậy việc nghiên cứu ứng dụng nguồn vi sinh vật trong quá trình lên men thu nhận BC, cùng với việc nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện lên men, tối ưu hóa thành phần môi trường nuôi cấy và phương thức lên men sẽ đem lại nhiều lợi ích kinh tế, có ý nghĩa thiết thực cho xã hội và góp phần bảo vệ nguồn tài nguyên thiên nhiên. Để góp phần giải quyết những vấn đề đặt ra, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Khảo sát quá trình lên men thu nhận và tạo chế phẩm Bacterial Cellulose từ những nguồn nguyên liệu khác nhau”. -4- MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Khảo sát quá trình lên men thu nhận BC từ nhiều nguồn nguyên liệu phổ biến khác nhau, từ đó xây dựng quy trình lên men thu nhận BC hiệu quả. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Khảo sát một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn A.
- Khảo sát quá trình lên men thu nhận BC trên môi trường truyền thống (nước dừa già) và các môi trường không truyền thống (rỉ đường, nước mía, phụ phẩm từ thơm, dịch whey protein). - Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy phòng thí nghiệm: pH, nhiệt độ và thời gian. - Tối ưu hóa điều kiện dinh dưỡng căn bản: tỷ lệ Nitơ (pepton hoặc whey) và Cacbon (glucose). - Tối ưu hóa tốc độ lắc trong lên men chìm thu nhận A-BC.
- So sánh, đánh giá hiệu quả quá trình lên men tạo sản phẩm BC trên năm loại môi trường nghiên cứu. Từ đó xây dựng quy trình lên men sử dụng vi khuẩn A. xylinum BC16 thu nhận sản phẩm BC đạt hiệu quả. - Bước đầu khảo sát một số đặc tính của màng BC.
KHÁI QUÁT VỀ VI SINH VẬT TỔNG HỢP BACTERIAL CELLULOSE 2. Các vi sinh vật sinh tổng hợp BC Cellulose vi khuẩn được tổng hợp bởi một số loài vi khuẩn có khả năng tạo acid acetic trong điều kiện hiếu khí thuộc các chủng như: Acetobacter, Alcaligenes, Pseudomonas, Achromobacter, Aerobacter, Azotobacter, Rhizobium, Agrobacterium, Sarcina, Salmonella. Con đường tổng hợp và cơ chế điều hòa tổng hợp sản phẩm BC ở các loài vi khuẩn khác nhau là giống nhau, nhưng cấu trúc BC ở mỗi loài thì khác nhau [14]. Sự khác biệt đáng kể thuộc về tính hóa lý của các sản phẩm BC chủ yếu ở chiều dài của chuỗi polymer, tính kết tinh và trạng thái kết tinh của nó, từ đó xác định được các tính chất vật lý của sản phẩm như: độ bền cơ học, độ hòa tan trong các dung môi, khả năng chịu được các ảnh hưởng của các tác nhân gây biến tính [48].
Cấu trúc sản phẩm BC của một số loài vi khuẩn [14, 22]. STT Giống Cấu trúc Cellulose 1 Acetobacter Lớp màng ngoại bào tạo thành các dải 2 Achromobacter Sợi 3 Aerobacter Sợi 4 Agrobacterium Sợi ngắn 5 Alcaligen Sợi 6 Pseudomonas Các sợi không tách biệt 7 Rhizobium Sợi ngắn 8 Sarcina Cellulose dị hình 9 Zoogloea Chưa rõ cấu trúc 2. Sơ lược Vi khuẩn Acetobacter xylinum A. xylinum hiện được xem là giống vi khuẩn sinh tổng hợp BC hiệu quả nhất và được ứng dụng nhiều trong thực tế [5, 14].
Vi khuẩn là tác nhân chính của quá trình lên men acetic nên còn được gọi là vi khuẩn acetic, chúng sống phổ biến trong tự nhiên, có thể phân lập từ dấm chua, rượu bia, nước hoa quả, không khí, đất, nước [3]. -6- Phân loại Theo khóa phân loại Bergey, vi khuẩn A. xylinum thuộc: - Lớp Schizomycetes - Bộ Pseudomonadales - Bộ phụ Pseudomonadieae - Họ Pseudomonadaceae - Giống Acetobacter - Loài xylinum Đặc điểm hình thái Tế bào A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, dài khoảng 1-2 µm, Gram (-), có thể di động hoặc không di động, không sinh bào tử.
Tế bào đứng riêng lẻ, xếp đôi, hoặc kết thành chuỗi dài [18, 31]. Khuẩn lạc của A. xylinum trên môi trường thạch có dạng hình tròn, nhỏ (đường kính: 2 – 5 mm), màu trắng đục, bề mặt nhầy và trơn bóng, phần giữa khuẩn lạc lồi, dày và sẫm màu hơn các phần xung quanh, rìa mép nhẵn. Khuẩn lạc mọc riêng lẻ khi còn non, về già khuẩn lạc dính nhau từng cụm theo đường cấy.
Đặc điểm sinh lý và sinh hóa - Các đặc điểm sinh lý : A. xylinum thuộc loại vi khuẩn hiếu khí bắt buộc nên tăng trưởng ở bề mặt tiếp xúc giữa môi trường lỏng và môi trường không khí. Vi khuẩn có khả năng tạo màng cellulose khá dày và chắc trên môi trường nuôi cấy lỏng. Có giả thuyết cho rằng màng mỏng cellulose được sản xuất bởi A.
xylinum được sử dụng cho việc làm nổi các tế bào để giúp chúng có thể nhận được oxy từ môi trường không khí [34, 35, 36]. xylinum phát triển trong khoảng nhiệt độ (25 ÷ 32°C), pH khoảng từ (4,0 ÷ 6,0), nồng độ ethanol có thể lên tới 10%, pH tối ưu của chúng là 5,5 [27].
