Nghiên cứu khả năng ức chế biofilm và độc lực của Staphylococcus aureus từ cao chiết tô mộc

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu công nghệ sinh học nghiên cứu khả năng ức chế hình thành biofilm và độc lực ở staphylococcus aureus, đánh giá hiện trạng, phân tích vấn đề, đề xuất

• Tác giả: Nguyễn Bảo Nghi
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Lệ Thủy
• Trường học: Trường Đại Học Bách Khoa
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Tác Dụng Của Cao Chiết Tô Mộc Trong Việc Ức Chế Biofilm Và Độc Lực Của Staphylococcus Aureus
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• TÓM TẮT
• SUMMARY
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. MỤC LỤC
• 1.1. DANH MỤC BẢNG
• 1.2. DANH MỤC HÌNH
• 1.3. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• 1.4. MỞ ĐẦU
• 1.5. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.5.1. Giới thiệu về Staphylococcus aureus
• 1.5.2. Khả năng gây bệnh và độc tố liên quan của S.
• 1.5.3. Tình trạng kháng kháng sinh của S.
• 1.5.4. Cơ chế kháng kháng sinh của S.
• 1.5.5. Cơ chế kháng kháng sinh nội sinh
• 1.5.6. Cơ chế kháng kháng sinh thu nhận
• 1.5.7. Sự hình thành và vai trò của màng sinh học đối với S.
• 1.5.8. Giới thiệu về biofilm và vai trò với S.
• 1.5.9. Quá trình hình thành biofilm và các yếu tố độc lực
• 1.5.10. Các con đường điều hòa liên quan đến sự hình thành biofilm
• 1.5.11. Các yếu tố điều hòa chính liên quan đến sự hình thành biofilm và độc lực ở S.
• 1.5.12. Các yếu tố điều hòa khác liên quan đến sự hình thành biofilm
• 1.5.13. Các bệnh nhiễm trùng liên quan đến biofilm S.
• 1.5.14. Ứng dụng dược liệu trong ức chế hình biofilm ở vi khuẩn
• 1.5.15. Giới thiệu về cây Tô Mộc
• 1.6. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.6.1. Vật liệu nghiên cứu
• 1.6.2. Cao chiết Tô mộc
• 1.6.3. Chủng vi khuẩn nghiên cứu
• 1.6.4. Hóa chất sử dụng cho nghiên cứu
• 1.6.5. Phương pháp nghiên cứu
• 1.6.5.1. Đánh giá khả năng ức chế S. aureus của cao chiết Tô mộc
• 1.6.5.2. Đánh giá khả năng ức chế hình thành biofilm của cao chiết Tô mộc
• 1.6.5.3. Xác định con đường ức chế biofilm của cao chiết tiềm năng
• 1.6.5.4. Xác định thành phần EPS trong biofilm
• 1.6.5.5. Xác định eDNA và protein trong biofilm
• 1.6.5.6. Kiểm tra sự biểu hiện của gen liên quan đến sự hình thành biofilm
• 1.6.5.7. Đánh giá tác động của cao chiết Tô mộc lên độc lực của S.
• 1.6.5.8. Đánh giá khả năng tan huyết
• 1.6.5.9. Đánh giá khả năng ức chế lan tỏa khuẩn lạc (colony spreading) của cao chiết Tô mộc
• 1.6.5.10. Đánh giá khả năng phân giải lipid
• 1.6.5.11. Đánh giá khả năng sinh sắc tố
• 1.6.5.12. Đánh giá biểu hiện gen độc lực
• 1.7. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 1.7.1. Đánh giá khả năng ức chế S. aureus của cao chiết Tô mộc
• 1.7.2. Đánh giá khả năng ức chế và cơ chế tác động của cao chiết Tô mộc lên sự hình thành biofilm của S.
• 1.7.3. Khả năng ức chế hình thành biofilm của các cao chiết Tô mộc
• 1.7.4. Đánh giá các thành phần biofilm sau khi được xử lí với cao chiết
• 1.7.5. Kết quả đánh giá hiểu hiện gen liên quan đến hình thành biofilm
• 1.7.6. Kết quả đánh giá khả năng ức chế độc lực và cơ chế tác động của cao chiết Tô mộc lên S.
• 1.7.7. Kết quả đánh giá hiện tượng liên quan đến độc lực ở S.
• 1.7.8. Đánh giá biểu hiện gen liên quan độc lực ở MW2
• 1.8. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus, hay còn gọi là tụ cầu vàng, là một trong những vi khuẩn Gram dương phổ biến nhất gây bệnh ở người. Chúng thường hiện diện trên da và niêm mạc của cơ thể, nhưng khi xâm nhập vào các mô hoặc máu, chúng có thể gây ra nhiều bệnh lý nghiêm trọng như nhiễm trùng da, viêm phổi, và nhiễm khuẩn huyết. Đặc biệt, S. aureus có khả năng hình thành biofilm, làm cho việc điều trị trở nên khó khăn hơn do tính kháng kháng sinh ngày càng gia tăng. Theo nghiên cứu, sự hình thành biofilm không chỉ giúp vi khuẩn tồn tại trong môi trường khắc nghiệt mà còn góp phần vào khả năng gây bệnh của chúng. Việc tìm kiếm các phương pháp điều trị hiệu quả nhằm ức chế biofilm và độc lực của S. aureus là rất cần thiết, đặc biệt là trong bối cảnh hiện nay khi mà các chủng vi khuẩn kháng thuốc ngày càng gia tăng.

II. Tác dụng của cao chiết Tô mộc

Cao chiết Tô mộc (Caesalpinia sappan L.) được nghiên cứu về khả năng ức chế sự hình thành biofilm và độc lực của S. aureus. Nghiên cứu cho thấy, cao chiết Tô mộc có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn với giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) là 125 µg/mL. Điều này cho thấy cao chiết Tô mộc có thể được xem như một hợp chất diệt khuẩn. Đặc biệt, khi áp dụng ở nồng độ MIC, khả năng hình thành biofilm của S. aureus giảm xuống chỉ còn 20% so với nhóm đối chứng. Điều này khẳng định tác động mạnh mẽ của cao chiết Tô mộc trong việc ức chế sự hình thành biofilm và làm giảm độc lực của vi khuẩn, mở ra hướng đi mới trong điều trị các bệnh nhiễm trùng do S. aureus gây ra.

III. Cơ chế tác động của cao chiết Tô mộc

Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng cao chiết Tô mộc tác động lên yếu tố điều hòa SigB của S. aureus, dẫn đến sự giảm thiểu đáng kể của DNA ngoại bào (eDNA) trong chất nền của biofilm. Sự thiếu hụt eDNA ảnh hưởng trực tiếp đến cấu trúc và tính toàn vẹn của biofilm, từ đó làm giảm khả năng gây bệnh của vi khuẩn. Bên cạnh đó, cao chiết còn ức chế các gen liên quan đến độc lực như hld và psm, góp phần làm giảm khả năng lan tỏa khuẩn lạc và hoạt tính lipase của S. aureus. Điều này cho thấy cao chiết Tô mộc không chỉ có khả năng ức chế sự hình thành biofilm mà còn làm giảm độc lực của vi khuẩn một cách hiệu quả.

IV. Ý nghĩa và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu về tác dụng của cao chiết Tô mộc trong việc ức chế biofilm và độc lực của S. aureus mang lại nhiều ý nghĩa quan trọng. Đầu tiên, nghiên cứu này mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các liệu pháp điều trị nhiễm trùng do S. aureus, đặc biệt là trong bối cảnh kháng kháng sinh ngày càng gia tăng. Thứ hai, việc sử dụng các chiết xuất từ thực vật như Tô mộc có thể giảm thiểu tác dụng phụ so với các loại thuốc kháng sinh truyền thống. Cuối cùng, nghiên cứu này không chỉ có giá trị trong lĩnh vực y học mà còn có thể thúc đẩy việc nghiên cứu và phát triển các sản phẩm dược phẩm từ thiên nhiên, góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Staphylococcus aureus là một trong những tác nhân gây bệnh nguy hiểm, đặc biệt khi hình thành biofilm, làm tăng khả năng kháng thuốc và độc lực, gây khó khăn trong điều trị các bệnh nhiễm trùng. Tỷ lệ tử vong do nhiễm trùng MRSA (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus) cao, đồng thời chi phí điều trị tăng đáng kể, gây gánh nặng cho hệ thống y tế. Biofilm giúp vi khuẩn chống chịu với kháng sinh và hệ miễn dịch, làm tăng nguy cơ tái nhiễm và nhiễm trùng mãn tính. Do đó, việc tìm kiếm các hợp chất có khả năng ức chế hình thành biofilm và giảm độc lực của S. aureus là rất cần thiết.

Luận văn này tập trung nghiên cứu khả năng ức chế hình thành biofilm và độc lực của cao chiết Tô mộc (Caesalpina sappan L.) trên S. aureus. Nghiên cứu sử dụng hai loại cao chiết với dung môi dichloromethane (TMA) và methanol (TMB), đánh giá khả năng ức chế vi khuẩn, hình thành biofilm, độc lực và cơ chế điều hòa gen liên quan. Thời gian nghiên cứu từ tháng 9/2021 đến tháng 6/2022 tại Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG TP. HCM và Trung tâm Công nghệ sinh học TP. HCM.

Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong phát triển các liệu pháp điều trị thay thế kháng sinh, góp phần giảm thiểu tình trạng kháng thuốc và nâng cao hiệu quả điều trị các bệnh nhiễm trùng do S. aureus gây ra, đặc biệt là các nhiễm trùng liên quan đến biofilm.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình về sự hình thành biofilm và độc lực của S. aureus, bao gồm:

• Biofilm và các thành phần cấu tạo: Biofilm là cộng đồng vi khuẩn bám dính trên bề mặt, được bao quanh bởi chất nền ngoại bào (EPS) gồm polysaccharide, protein và DNA ngoại bào (eDNA). eDNA đóng vai trò quan trọng trong cấu trúc và sự ổn định của biofilm.

• Các yếu tố điều hòa gen: Yếu tố sigma σB (sigB), hệ thống điều hòa cảm ứng mật độ Agr (accessory gene regulator), và SarA là các yếu tố điều hòa chính ảnh hưởng đến sự hình thành biofilm và biểu hiện độc lực. SigB kích hoạt SarA và ức chế Agr trong giai đoạn hình thành biofilm, trong khi Agr điều hòa các yếu tố độc lực như hemolysin, lipase và PSM (phenol-soluble modulins).

• Cơ chế độc lực của S. aureus: Bao gồm khả năng tan huyết (hemolysin), phân giải lipid (lipase), lan tỏa khuẩn lạc (colony spreading) và sinh sắc tố staphyloxanthin, góp phần vào khả năng xâm nhập và gây bệnh.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Sử dụng hai chủng vi khuẩn S. aureus ATCC 25923 (đánh giá biofilm) và MW2 (MRSA, đánh giá độc lực). Cao chiết Tô mộc được chuẩn bị từ gỗ Tô mộc bằng dung môi dichloromethane (TMA) và methanol (TMB).

• Phương pháp phân tích:

  • Xác định MIC và MBC của cao chiết trên S. aureus theo phương pháp pha loãng vi thể.
  • Đánh giá khả năng ức chế hình thành biofilm bằng phương pháp nhuộm Crystal violet ở các nồng độ MIC, 1/2 MIC và 1/5 MIC, khảo sát ở 24 và 48 giờ.
  • Xác định thành phần biofilm (PIA, eDNA, protein) bằng nhuộm WGA, định lượng PicoGreen và Bradford.
  • Đánh giá biểu hiện gen liên quan đến biofilm và độc lực (sigB, sarA, agrA, hld, psm, cidA, icaABCD, spa) bằng qPCR.
  • Đánh giá các chỉ số độc lực: khả năng tan huyết (CAMP test), lan tỏa khuẩn lạc, hoạt tính lipase và sinh sắc tố.

• Timeline nghiên cứu: Từ tháng 9/2021 đến tháng 6/2022, các thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Trung tâm Công nghệ sinh học TP. HCM.

• Cỡ mẫu và chọn mẫu: Mỗi thí nghiệm được lặp lại ít nhất 3 lần để đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của kết quả.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Khả năng ức chế vi khuẩn: Hai cao chiết TMA và TMB có giá trị MIC và MBC đồng nhất là 125 µg/mL, với tỷ lệ MBC/MIC ≤ 4, cho thấy cả hai đều có tác dụng diệt khuẩn trên S. aureus.

2. Ức chế hình thành biofilm: Ở nồng độ MIC, khả năng hình thành biofilm giảm xuống còn khoảng 20% so với nhóm không xử lý tại cả 24 và 48 giờ. Ở 1/2 MIC, biofilm giảm khoảng 50%, còn ở 1/5 MIC, mức ức chế giảm còn khoảng 20%, tức hơn 80% biofilm vẫn được hình thành.

3. Thay đổi thành phần biofilm: Định lượng eDNA trong chất nền biofilm giảm đáng kể khi xử lý với cao chiết, trong khi protein và PIA không thay đổi nhiều. Điều này cho thấy eDNA là thành phần bị ảnh hưởng chính, làm suy yếu cấu trúc biofilm.

4. Biểu hiện gen: Mức độ biểu hiện gen sigB giảm rõ rệt ở nhóm xử lý cao chiết so với đối chứng, đồng thời các gen độc lực hld và psm cũng giảm biểu hiện, cho thấy cao chiết tác động lên yếu tố điều hòa SigB, từ đó làm giảm hình thành biofilm và độc lực.

5. Ức chế độc lực: Cao chiết TMA và TMB làm giảm khả năng tan huyết delta, giảm lan tỏa khuẩn lạc, giảm hoạt tính lipase và giảm sinh sắc tố staphyloxanthin ở nồng độ 1/2 MIC và 1/5 MIC. Hiệu quả ức chế của TMA được ghi nhận cao hơn TMB ở cùng nồng độ.

Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy cao chiết Tô mộc có khả năng ức chế hiệu quả sự phát triển và hình thành biofilm của S. aureus, chủ yếu thông qua việc giảm biểu hiện gen sigB, yếu tố điều hòa quan trọng trong đáp ứng stress và điều hòa các gen liên quan đến biofilm và độc lực. Việc giảm eDNA trong chất nền biofilm làm suy yếu cấu trúc biofilm, làm tăng khả năng tiêu diệt vi khuẩn.

So với các nghiên cứu trước đây về chiết xuất thực vật có hoạt tính kháng khuẩn và ức chế biofilm, kết quả này phù hợp với xu hướng sử dụng dược liệu làm nguồn hợp chất tiềm năng trong điều trị các nhiễm trùng do vi khuẩn đa kháng thuốc. Hiệu quả ức chế độc lực như tan huyết, lipase và sắc tố cũng góp phần làm giảm khả năng xâm nhập và gây bệnh của S. aureus.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ cột thể hiện tỷ lệ giảm biofilm theo nồng độ cao chiết, biểu đồ đường biểu diễn mức độ biểu hiện gen sigB, hld, psm, và hình ảnh đĩa thạch máu thể hiện vùng tan huyết giảm rõ rệt ở nhóm xử lý.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Phát triển thuốc điều trị mới: Khuyến nghị nghiên cứu sâu hơn về các hợp chất hoạt tính trong cao chiết Tô mộc, đặc biệt là TMA, để phát triển thuốc điều trị nhiễm trùng do S. aureus, tập trung vào ức chế biofilm và độc lực. Thời gian nghiên cứu tiếp theo khoảng 2-3 năm, chủ thể thực hiện là các viện nghiên cứu dược liệu và công ty dược.

2. Ứng dụng trong y tế dự phòng: Sử dụng cao chiết Tô mộc làm chất bổ trợ trong các sản phẩm vệ sinh y tế, thiết bị cấy ghép để ngăn ngừa hình thành biofilm, giảm nguy cơ nhiễm trùng bệnh viện. Thời gian triển khai 1-2 năm, chủ thể là bệnh viện và nhà sản xuất thiết bị y tế.

3. Nghiên cứu phối hợp với kháng sinh: Đề xuất thử nghiệm phối hợp cao chiết Tô mộc với các kháng sinh hiện có để tăng hiệu quả điều trị, giảm liều lượng kháng sinh và hạn chế kháng thuốc. Thời gian nghiên cứu 1-2 năm, chủ thể là các phòng thí nghiệm vi sinh và dược lý.

4. Đào tạo và chuyển giao công nghệ: Tổ chức các khóa đào tạo về ứng dụng dược liệu trong điều trị nhiễm trùng cho cán bộ y tế và nhà nghiên cứu, đồng thời chuyển giao công nghệ chiết xuất và ứng dụng cao chiết Tô mộc. Thời gian 1 năm, chủ thể là các trường đại học và trung tâm nghiên cứu.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Công nghệ sinh học, Dược học: Nghiên cứu cung cấp dữ liệu thực nghiệm về tác động của cao chiết thực vật lên biofilm và độc lực vi khuẩn, hỗ trợ phát triển đề tài liên quan.

2. Bác sĩ và chuyên gia y tế: Tham khảo để hiểu rõ cơ chế hình thành biofilm và độc lực của S. aureus, từ đó áp dụng các liệu pháp điều trị mới, đặc biệt trong các ca nhiễm trùng khó điều trị.

3. Doanh nghiệp dược phẩm và công nghệ sinh học: Tài liệu hữu ích cho việc phát triển sản phẩm mới dựa trên dược liệu, đặc biệt các sản phẩm kháng khuẩn, chống biofilm.

4. Cơ quan quản lý và hoạch định chính sách y tế: Cung cấp cơ sở khoa học để xây dựng chính sách khuyến khích nghiên cứu và ứng dụng dược liệu trong phòng chống kháng thuốc và nhiễm trùng bệnh viện.

Câu hỏi thường gặp

1. Cao chiết Tô mộc có tác dụng gì trên S. aureus?
   Cao chiết Tô mộc ức chế sự phát triển vi khuẩn, giảm hình thành biofilm và độc lực như tan huyết, lipase, sắc tố, chủ yếu qua tác động lên yếu tố điều hòa sigB.

2. Hai loại cao chiết TMA và TMB khác nhau thế nào?
   TMA (dichloromethane) có hiệu quả ức chế biofilm và độc lực cao hơn TMB (methanol) ở cùng nồng độ, do thành phần hoạt tính khác biệt.

3. Biofilm ảnh hưởng thế nào đến điều trị nhiễm trùng?
   Biofilm làm tăng khả năng kháng thuốc lên đến 1000 lần, bảo vệ vi khuẩn khỏi kháng sinh và hệ miễn dịch, gây khó khăn trong điều trị và dễ tái nhiễm.

4. Cơ chế ức chế biofilm của cao chiết Tô mộc là gì?
   Cao chiết làm giảm biểu hiện gen sigB, dẫn đến giảm eDNA trong chất nền biofilm, làm suy yếu cấu trúc biofilm và giảm khả năng bám dính, phát triển.

5. Có thể ứng dụng cao chiết Tô mộc trong thực tế không?
   Có thể phát triển thành thuốc điều trị hoặc chất bổ trợ trong y tế dự phòng, tuy nhiên cần nghiên cứu thêm về độc tính, liều dùng và hiệu quả lâm sàng.

Kết luận

• Cao chiết Tô mộc (TMA và TMB) có khả năng ức chế vi khuẩn S. aureus với MIC và MBC là 125 µg/mL, thuộc nhóm hợp chất diệt khuẩn.
• Ức chế hình thành biofilm hiệu quả, giảm đến 80% biofilm ở nồng độ MIC, chủ yếu qua giảm eDNA và điều hòa gen sigB.
• Giảm độc lực vi khuẩn như tan huyết, lan tỏa khuẩn lạc, lipase và sắc tố, góp phần làm giảm khả năng gây bệnh.
• TMA có hiệu quả ức chế cao hơn TMB ở cùng nồng độ xử lý.
• Nghiên cứu mở hướng phát triển liệu pháp điều trị mới dựa trên dược liệu, giảm thiểu kháng thuốc và nâng cao hiệu quả điều trị nhiễm trùng do S. aureus.

Next steps: Tiếp tục phân lập, xác định hoạt chất chính trong cao chiết, thử nghiệm độc tính và hiệu quả lâm sàng. Khuyến khích hợp tác đa ngành để phát triển sản phẩm ứng dụng.

Các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp dược phẩm nên đầu tư nghiên cứu sâu hơn về cao chiết Tô mộc để khai thác tiềm năng trong điều trị các bệnh nhiễm trùng do S. aureus, góp phần giải quyết vấn đề kháng thuốc hiện nay.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Staphylococcus aureus (hay còn gọi là tụ cầu vàng) thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương. Chúng thường hiện diện trên bề mặt da của cơ thể người, là một vi khuẩn gây bệnh cơ hội khi hệ miễn dịch vật chủ bị yếu đi, hay trong quá trình phẫu thuật sử dụng các thiết bị y tế xâm lấn, hoặc do các vết thương hở. Một khi xâm nhiễm vào trong cơ thể vật chủ, chúng gây ra các bệnh như nhiễm trùng da và mô mềm nhẹ, viêm nội tâm mạc nhiễm trùng, viêm tủy xương, nhiễm khuẩn huyết và viêm phổi có nguy cơ gây tử vong [1]. Với sự xuất hiện của các chủng đa kháng kháng sinh, việc điều trị các bệnh nhiễm trùng liên quan đến S.

aureus trở nên khó khăn do phải kéo dài thời gian cũng như gia tăng chi phí điều trị các bệnh liên quan, trở thành một gánh nặng kinh tế cho bệnh nhân cũng như cho cộng đồng [2, 3]. Bên cạnh đó, việc hình thành biofilm trên S. aureus giúp cho chúng tăng khả năng chống chịu với điều kiện stress môi trường sống và các thuốc điều trị hiện nay, khiến việc tái nhiễm các tác nhân này xảy ra liên tục. Ngoài ra, việc hình thành màng sinh học (biofilm) trên các dụng cụ y tế cũng như trong quá trình xâm nhiễm vào vật chủ khiến cho việc xử lý loại bỏ hoàn toàn tác nhân gây bệnh này trở nên khó khăn [4].

Đồng thời, trong quá trình hình thành biofilm, các tác nhân gây bệnh này cũng tiết ra các chất điều hòa trong quá trình xâm nhiễm, có tác dụng như ngoại độc tố. Các yếu tố độc lực này giúp vi khuẩn xâm nhập vào vật chủ, phá vỡ lá chắn miễn dịch của vật chủ, xâm nhập mô, gây nhiễm trùng huyết và gây ra các hội chứng do độc tố tiết ra như nhiễm trùng máu, chứng sốc nhiễm độc, hội chứng da có vảy và viêm dạ dày ruột [5, 6]. Hiện nay, vẫn chưa có phương pháp điều trị hiệu quả đối với việc nhiễm trùng biofilm do S. aureus gây ra [3].

Nhiều phương pháp trị liệu thay thế thuốc kháng sinh đã và đang được nghiên cứu trong cuộc chiến chống lại tác nhân gây bệnh liên quan đến biofilm như vaccine, ứng dụng nano, CRISPRi, v. Một trong những hướng nghiên cứu được quan tâm là phát triển các chất/hợp chất từ dược liệu có khả năng ức chế quá trình hình thành biofilm và các tín hiệu điều hòa sự hình thành biofilm liên quan tới mật độ vi khuẩn (quorum sensing - QS) [8]. Khoảng 47% các loại thuốc mới có nguồn gốc từ 2 các nguồn nguyên liệu tự nhiên, cung cấp nhiều loại chất hóa học và chiết xuất có hoạt tính kháng khuẩn mạnh [9]. Có nhiều bằng chứng cho thấy các chất chiết xuất từ thực vật, phân đoạn, hoạt chất từ thực vật có khả năng được phát triển như các tác nhân ngăn chặn hoặc liệu pháp chống lại nhiễm trùng do biofilm [8, 9].

Việt Nam là nước có trữ lượng dồi dào nguồn thực vật cũng như các bài thuốc dân gian điều trị các bệnh nhiễm trùng. Trong đó Tô mộc (Caesalpinia sappan L.) được biết đến trong bài thuốc dân gian có tác dụng kháng khuẩn, kháng viêm, tẩy giun sán, kháng nấm, v. Nhiều nghiên cứu cũng đã chứng minh được tiềm năng kháng khuẩn của Tô mộc ở các cao chiết thô và hợp chất phân lập được [11, 12]. Những hạn chế của việc sử dụng kháng sinh, nhu cầu cấp thiết để phát triển các liệu pháp điều trị hiệu quả nhiễm trùng do tác nhân là S.

aureus và tiềm năng hoạt tính sinh học từ Tô mộc, là cơ sở để thực hiện đề tài “Nghiên cứu khả năng ức chế hình thành biofilm và độc lực ở Staphylococcus aureus của cao chiết Tô mộc”. Với mục đích trên, đề tài được tiến hành với các nội dung sau: - Đánh giá khả năng ức chế vi khuẩn của cao chiết Tô mộc. - Đánh giá khả năng ức chế hình thành biofilm của cao chiết trên S. - Đánh giá khả năng làm giảm độc lực của S.

aureus bằng cao chiết. - Đánh giá con đường ức chế điều hòa sự hình thành biofilm và giảm độc lực ở S. aureus của cao chiết. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.

Giới thiệu về Staphylococcus aureus S. aureus hay còn gọi là tụ cầu vàng, được bác sĩ phẫu thuật Alexander Ogston phát hiện lần đầu tiên vào năm 1880 tại Aberdeen, Scotland, được phân lập từ những bệnh nhân bị lở loét. aureus thuộc chi Staphylococcus, Firmicutes, là khuẩn gram dương, kích thước khoảng 0,8µm. Chúng có hình dạng “chuỗi nho” khi quan sát dưới kính hiển vi, sinh trưởng ở điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí; và phát triển tối ưu ở nhiệt độ 37◦C, pH 7,4 [13].

Trên đĩa thạch máu, khuẩn lạc có dạng tròn, dày và sáng với đường kính khoảng 1-2 mm. Hầu hết chúng có khả năng ly giải máu, hình thành các vòng máu bị phân giải trong suốt xung quanh khuẩn lạc khi được nuôi cấy trên đĩa thạch máu. Chúng không sinh bào tử cũng như không có các tiên mao để di chuyển, tuy nhiên chúng sở hữu lớp nhầy, có khả năng tạo ra chất màu màu vàng sáng, và có thể phân giải mannitol. Về mặt sinh hóa, chúng cho phản ứng dương với các thử nghiệm coagulase huyết tương, deoxyribonuclease và lên men đường lactose [14].

Khả năng gây bệnh và độc tố liên quan của S. aureus là một trong những tác nhân gây bệnh chính trong nhiễm trùng bệnh viện và cộng đồng [1]. Quá trình nhiễm trùng S. aureus bao gồm năm giai đoạn, đó là: (1) tiếp xúc với vi khuẩn, (2) nhiễm trùng tại chỗ, (3) lan truyền toàn thân và / hoặc nhiễm trùng huyết, (4) nhiễm trùng di căn và (5) nhiễm độc tố.

aureus thường cư trú ở vùng da và không gây nhiễm trùng trong nhiều tuần hoặc nhiều tháng nếu không xuất hiện các điều kiện thuận lợi như vết thương hở. Quá trình xâm nhiễm đến lây nhiễm xảy ra dưới một số yếu tố như nằm viện kéo dài, hệ miễn dịch bị suy yếu, quá trình phẫu thuật, sử dụng các thiết bị y tế xâm lấn và các bệnh chuyển hóa mạn tính. Các mụt nhọt ở da phát triển và xuất hiện khi vi khuẩn này xâm nhập vào trong da từ vị trí xâm nhiễm. Điều này có thể phát tán mầm bệnh hơn nữa và dẫn đến các biểu hiện lâm sàng khác nhau của các bệnh nhiễm trùng khu trú như mụn nhọt, viêm mô tế bào, bệnh chốc lở hoặc nhiễm trùng vết thương.

aureus có thể xâm nhập vào máu và lây lan đến các cơ quan khác nhau gây nhiễm trùng huyết. Sự lây lan qua đường huyết này có thể dẫn đến viêm nội tâm mạc, viêm tủy xương, viêm thận, viêm 4 khớp nhiễm trùng và các áp xe ngoài màng cứng. Ngoài nhiễm trùng máu, các hội chứng khác có thể xảy ra do ngoại độc tố của S. aureus là hội chứng sốc nhiễm độc, hội chứng da có vảy và viêm dạ dày ruột do ngộ độc thực phẩm [5].

Các bệnh nhiễm trùng do S. aureus nghiêm trọng trên lâm sàng là nhiễm trùng huyết, viêm nội tâm mạc nhiễm trùng, nhiễm trùng da và mô mềm, nhiễm trùng xương và nhiễm trùng phổi. Các nhiễm trùng lâm sàng khác là áp xe ngoài màng cứng, viêm màng não, hội chứng sốc nhiễm độc và nhiễm trùng đường tiết niệu [6]. aureus sở hữu nhiều yếu tố độc lực.

Các yếu tố độc lực này giúp vi khuẩn xâm nhập vào vật chủ, phá vỡ lá chắn miễn dịch của vật chủ, xâm nhập mô, gây nhiễm trùng huyết và gây ra các hội chứng do độc tố tiết ra [5]. Dựa trên cơ chế hoạt động và vai trò trong quá trình phát bệnh, các yếu tố độc lực của tụ cầu vàng được phân loại và trình bày trong Bảng 1. Phân loại một số độc tố và đặc điểm của chúng trong quá trình xâm nhiễm của S. aureus Yếu tố Đặc điểm, vai trò Giúp bám vào mô vật chủ Các thành phần bề Các protein bề mặt của vi khuẩn tương tác với các thành phần mặt vi sinh vật của tế bào chủ như collagen, fibronectin và fibrinogen, do đó, nhận biết các phân thúc đẩy quá trình bám vào mô chủ.

Protein A của tử kết dính trong Staphylococcus (SPA), protein bám fibronectin A và B, chất nền của vật protein bám collagen và yếu tố kết cụm (clumping factor) A chủ và B thuộc nhóm yếu tố này. Các yếu tố này cũng tham gia (MSCRAMM) vào quá trình lẩn trốn hệ thống miễn dịch của vật chủ. Phá vỡ/ trốn tránh hệ thống miễn dịch Polysaccharide Chống lại sự thực bào và tiêu diệt bởi các tế bào thực bào đa microcapsule nhân. Protein A Liên kết với phần Fc của kháng thể, ngăn cản quá trình opsonin hóa, hoạt động như siêu kháng nguyên và hạn chế phản ứng miễn dịch của vật chủ Panton-Valentine PVL được tìm thấy trong hầu hết các MRSA lây nhiễm trong leukocidin (PVL) cộng đồng (CA-MRSA).

PVL thuộc nhóm protein tạo lỗ trên màng. Nó bao gồm hai thành phần protein (LukS-PV và LukF-PV) hoạt động cùng nhau như các tiểu đơn vị và tạo thành các porin trên màng tế bào của tế bào chủ, dẫn đến rò rỉ các thành phần bên trong và làm chết tế bào. 5 Độc tố alpha Đây là ngoại độc tố vi khuẩn đầu tiên được xác định, là (alpha toxin hay nguyên nhân tạo lỗ trên màng tế bào, dẫn đến rò rỉ và làm alpha hemolysin) chết tế bào. Protein ức chế khả CHIPS là một protein ngoại bào ức chế hoạt động hóa học năng hóa ứng động của bạch cầu trung tính và bạch cầu đơn nhân.

tế bào của S. aureus (CHIPS) Xâm nhập mô Protein kết dính Một loại protein ngoại bào có khả năng bám vào chất nền của ngoại bào tế bào chủ, protein huyết tương và phân tử kết dính tế bào nội (Extracellular mô ICAM-1. Ngoài vai trò kết dính và xâm nhập, nó còn có adherence protein hoạt động điều hòa miễn dịch - Eap) Proteases, lipases, Những enzym ngoại bào này gây tổn thương mô, giúp cho tế Staphylokinase, bào vi khuẩn thâm nhập vào bên trong vật chủ nucleases, hyaluronatelyase, phospholipase C và metalloproteases (elastase). Gây độc tố Độc tố ruột S.

aureus tạo ra rất nhiều độc tố ruột là những ngoại độc tố (enterotoxin) mạnh ở đường tiêu hóa. Ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus là tình trạng nhiễm độc do tiêu thụ thực phẩm có chứa một lượng lớn độc tố ruột đã được hình thành trước. Độc tố hội chứng TSST-1 và một số độc tố ruột được gọi là siêu kháng nguyên sốc nhiễm độc -1 độc tố gây sốt. TSST-1 gây ra hội chứng sốc nhiễm độc, đặc (Toxic shock biệt ở phụ nữ đang trong thời kỳ kinh nguyệt.

syndrome toxin -1 - TSST-1) Độc tố gây bong Là các serine protease nhận biết và thủy phân một cách chọn tróc A và B lọc các protein liên kết trong da.