Luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học phân lập và sàng lọc các chủng vi nấm nội sinh có khả năng sinh tổng hợp amptothecin trên cây mẫu đơn ixora chinensis thu tại bắc giang việt nam

Luận văn thạc sĩ kỹ thuật phân tích công nghệ sinh học phân lập và sàng lọc các chủng vi nấm nội sinh có khả năng sinh tổng hợp, đánh giá thực trạng, chỉ ra hạn chế, đề xuất giải

• Tác giả: Phạm Thị Hằng
• Người hướng dẫn: TS. Trần Minh Đức
• Trường học: Trường Đại Học Lâm Nghiệp
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Phân Lập Và Sàng Lọc Các Chủng Vi Nấm Nội Sinh Có Khả Năng Sinh Tổng Hợp Camptothecin Từ Cây Mẫu Đơn (Ixora Chinensis) Tại Bắc Giang
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC TỪ VIET TAT
• DANH MỤC CÁC BANG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• 1. TỔNG QUAN VE VAN ĐÈ NGHIÊN CỨU
• 1.1. Tổng quan về hợp chất Camptothecin
• 1.1.1. Camptothecin
• 1.2. Cơ chế tác dụng của Camptothecin
• 1.3. Quá trình tổng hợp và bán tổng hop Topotecan và lrinotecan
• 1.4. Nguồn gốc và phan bỗ của các loài thực vật có chứa Camptothecin
• 1.5. Tổng quan về cây Mẫu đơn
• 1.5.1. Mô tả thực vật
• 1.5.2. Thanh phan hóa học
• 1.6. Tổng quan vi nắm nội sinh
• 1.6.1. Vì nắm nội sinh
• 1.7. Các nguén vi nắm nội sinh có khả năng sản sinh Camptothecin
• 1.8. Tổng quan VÖÌẾn men.2, Cúc nghiền cứu lên men sinh téng hợp Camplothecin
• 2. MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Mục tiêu chưng
• 2.2. Mục tiêu cụ thé
• 2.3. Nội dung nghiên cứ
• 2.4. Vật liệu nghiên cứu
• 2.4.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.4.2. Hóa chất, trang thiết bị trong nghiền cứu
• 2.5. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5.1. Định danh cây Mẫu đơn
• 2.5.2. Phân lập các chúng vi nắm nội sinh trên cây Mẫu đơn
• 2.5.3. Sang lọc các chủng vi nấm nội sinh có khả năng sinh tổng hợp Camptothecin
• 2.5.4. Định danh chủng ví nấm nội sinh có khả hy sink tổng hop Camptothecin
• 2.5.5. Lên men thu hồi Camptothecin từ Chủng vi nắm nội sinh quy mô phòng thí nghiệm
• 3. KET QUA NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUA
• 3.1. Kết quả định danh cây Mẫu don
• 3.1.1. Tách chiết DNA tổng số
• 3.1.2. Nhân vùng gen nhân (ITS) và vùng gen lục lap (rpoC1) bằng kỹ thuật PCR
• 3.1.3. Đọc trình tự và ay dựng sứ phân bại dearên đoạn trình tự ITS và rpøCl
• 3.2. Kết qua phân lập vi nắm nội sinh trên cây Mẫu don
• 3.3. Kết quả sàng lọc các chủng vi nấm nội sinh có khả năng tống hợp CPT
• 3.4. Tách chiết và định tinh Camptothecin từ chủng vi nắm nội sinh
• 3.5. Kết quả phân tích và định lượng Camptothecin bằng sắc ky hiệu năng cao (HPLC)
• 3.6. Kết quả định danh chủng vi nắm nội sinh có khả năng sinh tổng hợp
• 3.7. Kết quả lên men thu hồi Camptothecin từ chủng vi nắm nội sinh quy mô phòng thí nghiệm
• KET LUẬN VÀ ĐÈ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHU LUC

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu

Nghiên cứu này tập trung vào việc phân lập và sàng lọc các chủng vi nấm nội sinh có khả năng sinh tổng hợp Camptothecin (CPT) từ cây Mẫu đơn (Ixora chinensis) thu tại Bắc Giang. Camptothecin là một alkaloid quan trọng với khả năng chống ung thư, đã được chứng minh có hiệu quả trong việc điều trị nhiều loại ung thư khác nhau. Việc tìm kiếm nguồn CPT tự nhiên từ cây Mẫu đơn không chỉ giúp cung cấp một nguồn dược liệu tiềm năng mà còn bảo vệ sự đa dạng sinh học. Cây Mẫu đơn được biết đến với nhiều tác dụng dược lý, bao gồm cả khả năng chống ung thư, làm tăng giá trị nghiên cứu của nó trong lĩnh vực biotechnology.

1.1. Camptothecin và cơ chế tác dụng

Camptothecin (CPT) có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư bằng cách gây ra sự đứt gãy chuỗi DNA. Cơ chế tác dụng của CPT liên quan đến việc ức chế enzyme Topoisomerase I, điều này dẫn đến sự ngăn cản quá trình sao chép DNA. Các nghiên cứu cho thấy CPT có thể ức chế sự phát triển của các khối u trong mô hình động vật, mở ra triển vọng cho việc phát triển thuốc điều trị ung thư hiệu quả từ nguồn gốc tự nhiên.

1.2. Nguồn gốc và phân bố của Camptothecin

CPT lần đầu tiên được phát hiện từ cây Hy thụ và sau đó được tìm thấy trong nhiều loài thực vật khác. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng một số loài thực vật thuộc họ Rubiaceae, như Ixora chinensis, cũng có khả năng sản xuất CPT. Việc phân lập các chủng vi nấm nội sinh từ cây này có thể tạo ra một nguồn CPT bền vững, đáp ứng nhu cầu điều trị ung thư ngày càng tăng.

II. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện thông qua các bước phân lập vi nấm nội sinh, sàng lọc và xác định khả năng sinh tổng hợp CPT. Cây Mẫu đơn được thu thập từ Bắc Giang và các mẫu nấm được phân lập từ rễ, thân và lá. Các phương pháp nuôi cấy vi nấm bao gồm môi trường nuôi cấy đặc biệt để kích thích sự phát triển và sản sinh CPT. Kỹ thuật sắc ký hiệu năng cao (HPLC) được sử dụng để phân tích và định lượng hàm lượng CPT trong các mẫu nấm đã phân lập.

2.1. Phân lập vi nấm nội sinh

Việc phân lập vi nấm nội sinh từ cây Mẫu đơn được thực hiện bằng cách sử dụng các phương pháp nuôi cấy vi sinh vật trong điều kiện vô trùng. Các mẫu được xử lý để loại bỏ tạp chất và sau đó được nuôi trong các môi trường thích hợp. Kết quả phân lập cho thấy sự hiện diện của nhiều chủng nấm có khả năng sản sinh CPT, mở ra hướng nghiên cứu mới trong lĩnh vực sinh học phân tử.

2.2. Sàng lọc và xác định khả năng sinh tổng hợp Camptothecin

Sau khi phân lập, các chủng nấm được sàng lọc để xác định khả năng sinh tổng hợp CPT. Các phương pháp phân tích như sắc ký lớp mỏng (TLC) và HPLC được áp dụng để đánh giá hàm lượng CPT trong từng chủng nấm. Kết quả cho thấy một số chủng nấm có khả năng sản sinh CPT với hàm lượng đáng kể, cho thấy tiềm năng ứng dụng trong sản xuất dược phẩm.

III. Kết quả và thảo luận

Nghiên cứu đã phân lập thành công nhiều chủng vi nấm nội sinh từ cây Mẫu đơn và xác định được các chủng có khả năng sinh tổng hợp CPT. Kết quả cho thấy hàm lượng CPT thu được từ các chủng nấm này có sự khác biệt rõ rệt, với một số chủng đạt hiệu suất cao. Các kết quả này không chỉ khẳng định tiềm năng của Ixora chinensis trong việc sản xuất CPT mà còn mở ra cơ hội nghiên cứu sâu hơn về các vi nấm nội sinh khác có khả năng tương tự.

3.1. Đánh giá tiềm năng ứng dụng

Việc sử dụng vi nấm nội sinh để sản xuất CPT từ cây Mẫu đơn hứa hẹn sẽ cung cấp một nguồn dược liệu bền vững và hiệu quả cho ngành dược phẩm. Sự phát triển của công nghệ nuôi cấy và chiết xuất từ vi nấm có thể giúp giảm chi phí sản xuất và đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng về thuốc điều trị ung thư. Điều này cũng góp phần bảo vệ và duy trì sự đa dạng sinh học của các loài thực vật có giá trị.

3.2. Hướng nghiên cứu tương lai

Nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình nuôi cấy và chiết xuất CPT từ các chủng vi nấm nội sinh đã phân lập. Đồng thời, việc nghiên cứu cơ chế sinh tổng hợp CPT trong các chủng nấm này sẽ giúp hiểu rõ hơn về tiềm năng của chúng trong sản xuất dược phẩm. Hơn nữa, việc mở rộng nghiên cứu sang các loài thực vật khác cũng là một hướng đi tiềm năng để tìm kiếm nguồn CPT tự nhiên.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Ung thư hiện là một trong những căn bệnh có tỷ lệ tử vong cao và ngày càng gia tăng trên toàn cầu. Theo thống kê của Tổ chức Nghiên cứu Ung thư Quốc tế năm 2020, Việt Nam ghi nhận khoảng 182.563 ca mắc mới và 122.690 ca tử vong do ung thư, tương đương với 159 người mắc mới và 106 người tử vong trên 100.000 dân. Trong bối cảnh đó, việc tìm kiếm nguồn cung cấp thuốc chống ung thư ổn định, hiệu quả và chi phí hợp lý là nhu cầu cấp thiết. Camptothecin (CPT) là một alkaloid có hoạt tính chống ung thư mạnh, được chiết xuất chủ yếu từ cây Hy Thụ (Camptotheca acuminata) và một số loài thực vật khác, trong đó có cây Mẫu đơn (Ixora chinensis). Tuy nhiên, cây thân gỗ này phát triển chậm và phương pháp chiết xuất truyền thống không đáp ứng được nhu cầu ngày càng tăng.

Nghiên cứu tập trung vào phân lập và sàng lọc các chủng vi nấm nội sinh có khả năng sinh tổng hợp Camptothecin trên cây Mẫu đơn thu thập tại Bắc Giang, Việt Nam. Mục tiêu cụ thể là xác định các chủng vi nấm nội sinh tiềm năng, thu hồi và phân tích hàm lượng CPT trong quy mô phòng thí nghiệm. Nghiên cứu có phạm vi thực hiện từ thu thập mẫu tại xã Tiên Nha, huyện Lục Nam, tỉnh Bắc Giang, đến các bước phân lập, định danh và lên men vi nấm nội sinh trong phòng thí nghiệm. Kết quả nghiên cứu góp phần phát triển nguồn nguyên liệu sinh học bền vững cho sản xuất thuốc điều trị ung thư, đồng thời bảo tồn đa dạng sinh học vi sinh vật và thực vật tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Cơ chế tác dụng của Camptothecin: CPT ức chế enzyme topoisomerase I, ngăn cản quá trình tái xoắn DNA, gây đứt gãy chuỗi DNA và dẫn đến chết tế bào ung thư. Tuy nhiên, CPT có hạn chế về độ hòa tan và độc tính, do đó các dẫn xuất như topotecan và irinotecan được phát triển để cải thiện tính ổn định và hiệu quả điều trị.

• Vi nấm nội sinh và sản xuất chất chuyển hóa thứ cấp: Vi nấm nội sinh sống trong mô thực vật mà không gây hại, có khả năng tổng hợp các hợp chất sinh học quan trọng như CPT, taxol, vineristine. Việc khai thác vi nấm nội sinh là hướng tiếp cận mới trong sản xuất dược liệu sinh học.

• Lên men vi sinh vật: Lên men là quá trình nuôi cấy vi sinh vật để tạo ra sản phẩm trao đổi chất có giá trị. Lên men vi nấm nội sinh được tối ưu hóa để tăng năng suất CPT, sử dụng các yếu tố môi trường như nguồn cacbon, nitơ, pH, nhiệt độ và các tiền chất.

Các khái niệm chính bao gồm: Camptothecin (CPT), vi nấm nội sinh, lên men sinh tổng hợp, enzyme topoisomerase I, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), phản ứng chuỗi polymerase (PCR), và định danh gen ITS, rpoC1.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Mẫu cây Mẫu đơn được thu thập tại xã Tiên Nha, huyện Lục Nam, tỉnh Bắc Giang. Tổng cộng 3 cây được lấy mẫu các bộ phận hoa, lá, thân, rễ để phân lập vi nấm nội sinh.

• Phân lập vi nấm nội sinh: Mẫu thực vật được xử lý khử trùng bề mặt bằng ethanol 75%, NaOCl 2%, sau đó cấy trên môi trường PDA có bổ sung kháng sinh. Vi nấm phát triển được tách thuần chủng và bảo quản ở -80°C.

• Định danh thực vật và vi nấm: DNA tổng số được tách chiết từ mẫu cây và vi nấm. Vùng gen ITS và rpoC1 được nhân bản bằng PCR, sản phẩm được giải trình tự và so sánh với cơ sở dữ liệu NCBI để xác định loài. Cây phát sinh loài được xây dựng bằng phương pháp Neighbor-joining với 1000 lần bootstrap.

• Sàng lọc vi nấm sinh tổng hợp CPT: Vi nấm được nuôi cấy trong môi trường PDB, chiết xuất CPT bằng dung môi Dichloromethane: Methanol (9:1). Định tính CPT bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) và định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với bước sóng 366 nm.

• Phân tích cấu trúc: Các mẫu CPT được phân tích bằng khối phổ (MS) và cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) để xác định cấu trúc phân tử.

• Lên men quy mô phòng thí nghiệm: Chủng vi nấm nội sinh có khả năng sinh CPT cao được lên men trong bình 70 lít với điều kiện pH 5.5, nhiệt độ 28 ± 2°C, tốc độ lắc 180 rpm, sục khí 1 vvm trong 7 ngày. CPT được thu hồi và phân tích hàm lượng.

• Cỡ mẫu và timeline: Tổng cộng 22 chủng vi nấm nội sinh được phân lập từ 3 cây Mẫu đơn. Nghiên cứu thực hiện trong khoảng thời gian từ thu thập mẫu đến phân tích lên men trong phòng thí nghiệm, kéo dài khoảng 1 năm.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Định danh cây Mẫu đơn: DNA tổng số tách chiết có độ tinh sạch cao (A260/280 ~1.85), vùng gen ITS (~600 bp) và rpoC1 (~450 bp) được nhân bản thành công. Cây phát sinh loài cho thấy mẫu thuộc chi Ixora với độ tin cậy bootstrap trên 80%.

2. Phân lập vi nấm nội sinh: Từ 3 cây Mẫu đơn, phân lập được 22 chủng vi nấm nội sinh đa dạng từ các bộ phận hoa, lá, thân, rễ. Các chủng có hình thái khuẩn lạc khác nhau, thể hiện sự phong phú sinh học.

3. Sàng lọc và định tính CPT: Qua sắc ký lớp mỏng TLC và sắc ký lỏng HPLC, một số chủng vi nấm nội sinh cho thấy khả năng sinh tổng hợp CPT với hàm lượng dao động từ vài đến hàng chục mg/l trong môi trường nuôi cấy. Ví dụ, chủng I3R2 đạt hàm lượng CPT khoảng 5,5 µg/g trọng lượng nấm khô.

4. Lên men quy mô phòng thí nghiệm: Chủng vi nấm nội sinh được lên men trong bình 70 lít thu được hàm lượng CPT tối đa sau 7 ngày nuôi cấy, đạt khoảng 12,45 µg/g trọng lượng nấm khô, tăng gần 2,3 lần so với nuôi cấy bình lắc 500 ml.

Thảo luận kết quả

Kết quả định danh cây Mẫu đơn phù hợp với mô tả thực vật học và các nghiên cứu trước đây, khẳng định tính chính xác của mẫu nghiên cứu. Việc phân lập 22 chủng vi nấm nội sinh đa dạng từ các bộ phận khác nhau của cây cho thấy môi trường sống phong phú và tiềm năng sinh học cao của cây Mẫu đơn tại Bắc Giang.

Khả năng sinh tổng hợp CPT của các chủng vi nấm nội sinh được xác nhận bằng các phương pháp sắc ký và khối phổ, phù hợp với các nghiên cứu quốc tế về vi nấm nội sinh sản xuất hợp chất chống ung thư. Hàm lượng CPT thu được trong nghiên cứu tương đương hoặc cao hơn một số nghiên cứu trước, chứng tỏ tiềm năng ứng dụng trong sản xuất dược liệu sinh học.

Lên men quy mô phòng thí nghiệm cho thấy việc tối ưu điều kiện nuôi cấy và mở rộng quy mô có thể nâng cao năng suất CPT, góp phần giải quyết hạn chế về nguồn cung CPT từ thực vật truyền thống. Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ so sánh hàm lượng CPT giữa các chủng vi nấm và các điều kiện lên men khác nhau, giúp minh họa hiệu quả của quy trình.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Tăng cường nghiên cứu và phát triển quy trình lên men vi nấm nội sinh nhằm tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy (pH, nhiệt độ, nguồn dinh dưỡng) để nâng cao năng suất CPT, đặt mục tiêu tăng ít nhất 30% hàm lượng CPT trong vòng 12 tháng. Chủ thể thực hiện: các viện nghiên cứu công nghệ sinh học.

2. Xây dựng quy trình sản xuất CPT quy mô công nghiệp dựa trên chủng vi nấm nội sinh ưu việt, đảm bảo tính ổn định và hiệu quả kinh tế, triển khai thử nghiệm pilot trong 18 tháng tới. Chủ thể thực hiện: doanh nghiệp công nghệ sinh học phối hợp với viện nghiên cứu.

3. Phát triển bộ sưu tập vi nấm nội sinh đa dạng từ các loài thực vật có tiềm năng sinh CPT tại Việt Nam để mở rộng nguồn gen và tăng khả năng tìm kiếm chủng ưu tú, thực hiện trong 2 năm. Chủ thể thực hiện: các trung tâm bảo tồn và nghiên cứu sinh học.

4. Đào tạo và nâng cao năng lực cho cán bộ nghiên cứu và kỹ thuật viên về kỹ thuật phân lập, định danh và lên men vi nấm nội sinh, nhằm đảm bảo chất lượng và hiệu quả nghiên cứu, tổ chức các khóa đào tạo định kỳ hàng năm. Chủ thể thực hiện: các trường đại học và viện nghiên cứu.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành công nghệ sinh học, dược học: Nghiên cứu cung cấp phương pháp phân lập, định danh và lên men vi nấm nội sinh, hỗ trợ phát triển các đề tài liên quan đến sản xuất dược liệu sinh học.

2. Doanh nghiệp công nghệ sinh học và dược phẩm: Tham khảo quy trình lên men và thu hồi CPT từ vi nấm nội sinh để ứng dụng sản xuất thuốc chống ung thư, giảm chi phí và tăng tính bền vững.

3. Cơ quan quản lý và hoạch định chính sách y tế, nông nghiệp: Cung cấp cơ sở khoa học cho việc phát triển nguồn nguyên liệu sinh học trong điều trị ung thư, đồng thời bảo tồn đa dạng sinh học.

4. Các tổ chức bảo tồn tài nguyên sinh vật và môi trường: Nghiên cứu giúp hiểu rõ vai trò của vi nấm nội sinh trong hệ sinh thái thực vật, hỗ trợ công tác bảo tồn và phát triển bền vững.

Câu hỏi thường gặp

1. Camptothecin là gì và tại sao nó quan trọng trong điều trị ung thư?
   Camptothecin là một alkaloid có khả năng ức chế enzyme topoisomerase I, ngăn cản quá trình tái xoắn DNA, từ đó gây chết tế bào ung thư. Nó được sử dụng làm cơ sở để phát triển các thuốc chống ung thư như topotecan và irinotecan.

2. Tại sao nghiên cứu vi nấm nội sinh lại được quan tâm trong sản xuất Camptothecin?
   Vi nấm nội sinh có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất sinh học quan trọng như CPT, giúp khắc phục hạn chế về nguồn cung từ thực vật, giảm chi phí và tăng tính bền vững trong sản xuất dược liệu.

3. Phương pháp phân lập và định danh vi nấm nội sinh được thực hiện như thế nào?
   Mẫu thực vật được xử lý khử trùng bề mặt, cấy trên môi trường PDA để phân lập vi nấm. DNA của vi nấm được tách chiết, nhân bản vùng gen ITS và rpoC1 bằng PCR, sau đó giải trình tự và so sánh với cơ sở dữ liệu để xác định loài.

4. Lên men vi nấm nội sinh có thể nâng cao năng suất Camptothecin như thế nào?
   Lên men trong điều kiện tối ưu (pH, nhiệt độ, nguồn dinh dưỡng) và quy mô lớn giúp tăng sinh khối vi nấm và sản xuất CPT, từ đó nâng cao hàm lượng CPT thu được so với nuôi cấy nhỏ lẻ.

5. Nghiên cứu này có thể ứng dụng thực tiễn ra sao?
   Kết quả nghiên cứu cung cấp quy trình và chủng vi nấm nội sinh tiềm năng để phát triển sản xuất CPT quy mô công nghiệp, góp phần cung cấp thuốc chống ung thư hiệu quả và bền vững tại Việt Nam.

Kết luận

• Đã phân lập và định danh thành công cây Mẫu đơn (Ixora chinensis) thu tại Bắc Giang bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen ITS, rpoC1.
• Phân lập được 22 chủng vi nấm nội sinh đa dạng từ các bộ phận của cây Mẫu đơn, trong đó một số chủng có khả năng sinh tổng hợp Camptothecin với hàm lượng đáng kể.
• Lên men quy mô phòng thí nghiệm cho thấy khả năng thu hồi CPT tăng gần 2,3 lần so với nuôi cấy nhỏ, chứng minh tiềm năng ứng dụng công nghiệp.
• Nghiên cứu góp phần phát triển nguồn nguyên liệu sinh học bền vững cho sản xuất thuốc điều trị ung thư, đồng thời bảo tồn đa dạng sinh học vi sinh vật tại Việt Nam.
• Đề xuất tiếp tục tối ưu quy trình lên men, mở rộng bộ sưu tập vi nấm nội sinh và phát triển sản xuất quy mô công nghiệp trong các bước tiếp theo.

Luận văn này là tài liệu tham khảo quý giá cho các nhà nghiên cứu, doanh nghiệp và cơ quan quản lý trong lĩnh vực công nghệ sinh học và dược phẩm. Để biết thêm chi tiết và hợp tác nghiên cứu, vui lòng liên hệ với Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TONG QUAN VE VAN DE NGHIÊN CỨU 1. Tổng quan về hợp chất Camptothecin 1-1-1. Camptothecin Camptothecin (CPT) là một alkaloid có cấu trúc vòng ngũ giác phẳng (Hình 1.1), được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1966 bởi Wall và cộng sự. Cũng trong năm 1966, cấu trúc của CPT được xác định bằng cách sử dụng kết hợp phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân và tia X-ray [27].

CPT ức chế hoàn toàn sự tăng trưởng và tái phát ung thư ở một số bệnh ung thư như dai trang, pl i, vú, da đầy, buồng trúng và khối tác tinh ở đô hình chuột [16}, Ngoài ra, CPT cũ 1g cho thấy hoạt tính kháng khối u mạnh trong các bệnh nhân ung thư đường tiêu hóa [32]. Cấu trúc phân tử cũa CPT và dang hydroxyacid vòng mở [27] 1. Cơ chế tác dụng của Camptothecin 'Vào đầu những năm 1970, các nghiên cứu ban đầu kiểm tra cơ chế hoạt động của CPT cho thấy rằng CPT có khả năng gây ức chế hoàn toàn quá trình sinh tổng hợp deoxyribonucle \cid (DNA) và acid ribonucleic (RNA) (Hình 1. Trong mô hình này, CPT giúp én định phức hợp DNA-Topo I thông, thường thông qua các liên kết hydro, dẫn đến quá tình tổng hợp DNA bị ức chế hoàn toàn [23].

Sự tương tác của phức hợp trên làm ngăn cản sự phân tích của Topo I và các sợi DNA, dẫn đến các sợi DNA đã được tháo xoắn. không có khả năng xoắn trở lại, hình thành chuỗi DNA mạch đôi bi đứt gay. “Một hoặc nhiễu điểm đứt gay làm kích hoạt các phản ứng nội bào khác dẫn đến việc bắt giữ chu ky tế bào trong pha G2 va làm chết tế bào [7, 8, 55]. Cơ chế gây độc tế bào của CPT [11] ‘Tuy nhiên, việc sử dụng rộng rãi CPT trong trị liệu bị cản trở bởi khả ‘nang hòa tan thấp trong nước và nhanh bị mắt hoạt tính do bị thủy phân vòng lactone ở ngay trong điều kiện pH sinh lý, cũng như độc tính đáng kể.

Muối natri của CPT đã được đề xuất là dạng thuốc dễ hòa tan hơn. chất có cấu trúc tương tự CPT đã được phát triển thông qua việc thay đổi cấu trúc của CPT với mục đích tăng tính tan của CPT và sự ổn định của vòng lactone nhằm nâng cao hoạt tinh và kha năng ứng dụng trong điều trị CPT. Hai trong số chúng đã được thương mại hóa là topotecan (Hycamtin) và irinotecan (Camptosar, CPT-11) lần lượt bởi GlaxoSmithKline và Pharmacia thiện là Pfizer) [47] (Hình 1. Cấu trúc phân tử của topotecan và irinotecan [47] 1.

Quá trình tổng hợp và bản tổng hợp Topotecan và Irinotecan đơn giản hóa quy trình phức tạp và đồi hôi về mặt kỹ thuật của việc tổng hợp toàn phần các dẫn xuất của CPT, các dạng thuốc này có thé được điều chế bằng các lộ trình bán tông hợp ngắn bắt đầu từ CPT tự nhiên. Ví dụ, SmithKline Beecham đã phát triển tổng hợp topotecan từ 10-hydroxy- CPT (Hình 1.4), Chất trung gian này thu được với hiệu suất 91% trong quá. trình oxy hóa-khử hai bước liên quan đến quá trình hydro hóa một phần chất trung gian tetrahydroquinoline được xúc tác Pt ban đầu và quá tình oxy hóa tiếp theo của nó với việc sử dụng Phl(OAc); [59]. Ngưng tụ 10-hydroxy-CPT.

với formaldehyde và dimeiylamine hoặc hiệu quả hơn với N,N- dimetymethyleneimfflằm clorua (Si hình thành tối thiển sản phẩm phụ 10- hydroxymethyl không mong muốn) [56] đã cho ra topotecan với năng suất tố wa =>. CT ORY ot GOyaƒ Con đường bán tổng hợp thành irinotecan là do nhóm Sawada phát triển năm 1991 (Hình 1.5) [43, 44], Bước quan trọng của quá tình này dựa trên việc bổ sung gốc etyl (được tao tại dl đi phản ứng của propanal, FeSO, và H:O› trong môi trường axit trong nước) một cách chọn lọc ở vị 7 của CPT. Điều nảy đại diện cho một phản ứng liên quan đền việc bổ sung gốc. carbon vào các dị hợp chất thơm th điện tử như pyridine và quinoline, nó đặc bi hữu ích trong việc thay đổi vị trong CPT.

Quá trình oxy hóa theo của 7-ethy-CPT thành N-oxit tương ứng, sau đó là quá trình hydroxyl hóa quang hóa dẫn đến 7-cthyl-10-hydroxyCPT (SN-38) với hiệu xuất tổng thể là 49%. Axyl hóa S -38 bằng [1 bipiperidinyl]-1'-cacbonyl chloride trong pyridin hoặc bằng 1.4-bipiperidin/COCI: đã tạo ra irinotecan với hiệu suất 80% [14, 43, 44]. Quá tình bán tong hợp Irinotecan [25] Các dẫn xuất CPT biến đổi ở vòng quinoline nhận được sự quan tâm lớn nhờ các wu việt mà nó mang lại như tăng khả năng hòa tan, cải thiện hoạt tính và giảm các tác dung phụ. Topotecan được cải thiện tính tan nhờ việc thay thé một amin bậc ba ở vị trí 9, trong khi irinotecan được bổ sung gốc hydroxyl tại vị trí C10.

Ngoài ra, các dẫn xuất như SN-38, 9-aminoCPT, 9- nitroCPT (rubitecan) cũng cải thiện tinh tan đáng kế nhờ những biển đổi trong vòng quinoline [24, 38] 1. Nguồn gốc và phân bồ của các loài thực vật có chứa Camptothecin CPT lần đầu tiên được tim thấy vả xác định đặc tính từ loài c: Hy thụ vào năm 1966 do nhóm nghiên cứu của Wall ở phía Nam Trung Quốc và Tay Tang [27] và tiếp tục được tim thấy trong loài cây thuốc khác đó là cị Căn đậu Øphiorrhiza mungos L. (Rubiaceae) vào năm 1976 ở Nam A và Đông Nam A [20|. Tir năm 1977 - 1996, CPT được tìm thấy trong bảy loài thực vật thuộc.

các họ khác nhau, bao gồm họ Trúc đảo (Apocynaceae), họ Thụ Đảo (leacinaceae) và họ Cà phê (Rubiaceae). Trong đó Nothapodytes collina C. Wu (leacinaceae), Nothapodytes obscuva C. Wu (Ieacinaceae), Nothapodytes obtusifolia (Mert.) RA-Howard (Ieacinaceae) và Nothapodytes tomentosa CY.

Trong đó gần 1/2 số loài thực. vật sinh CPT thuộc họ Thụ dio và 28% thuộc họ Cà phê. Các loài thực vật được phân bố chủ yếu ở các nước Đông Nam A, đặc biệt là miễn Nam Trung Quốc và An Độ [35], 1 Tổng quan về cây Mẫu đơn. Mô tả thực vật Hình L6.

chinensis Cay Mẫu đơn có tên khoa học là Ixora chinensis một loài thực vật có hoa thuộc họ Cà phê - Rubiaceae với khoảng 500 loài trong chỉ Ixora và thường được gội là "santan: na" ở Philippines. Cay Millon là một loại cây bụi mọc thẳng, nhẫn cao từ 1,5 - 3 m. Lá mọc đối, không cuồng, hình trứng thuôn dài đến hình elip, dài từ 7 - 13 cm, nhọn ở cä hai dau, mọc đối với các cuống lá ngắn. Hoa rất nhiều, mọc thành.

cụm đây đặc, hình cầu gai, đường kính từ 6 - 12 cm, màu cam nhạt, đỏ, vàng hoặc trắng, Đài hoa ngắn và tù. Tràng hoa màu hồng hoặc hơi đỏ, dài 2 - 2,5 em, với các thy tròn đài 5 - 7 mm [I3] 1. Thành phần hóa hoc “Theo kết qua báo cáo của các nhà khoa học Trung Quốc đã tìm ra 7 hop chất được phát hiện tir cây Mẫu don, và được xác định là D-mannitol (1), axit stearic (2), 1,5-cyclooctadiene (3), ƒ-sitosterol (4), (10E) -9-oxooctadee-10- en-12 -axit ynoic (5), axit azelaic (6) và axit dihydromasticadienolic (7) [41] 1. Tác dụng được lý ‘Theo truyề thống, cây được sử dụng để điều trị tăng huyết áp, thấp khớp, áp xe, vết bằm tim và vết thương.

Nó cũng cổ lợi cho tủy xương và mang thai tử cung. Các axit béo được tìm thấy trong dầu hạt của Mẫu đơn là axit ixoric và axit crepenynic. Ở Philippines, một phương pháp chữa bệnh truyền thống được sử dụng từ những bông hoa tươi được cho là một phương. thuốc chống lại bệnh lao phổi và băng huyết.

Dich chiết từ lá hoặc hoa được. sử dụng để chống lại bệnh đau đầu. Người Mã Lai sử dụng nước sắc rễ sau khi sinh con trong khi người Indonesia dùng nước sắc rễ để điều trị rối loạn. phế quản và nước s ie hoa để điều trị chứng v6 kinh và tăng huy: ấp.

6 Việt Nam rễ, thân, lá và hoa được dùng chữa kinh nguyệt không đều, cao huyết áp, ho lao, ho ra máu, thấp khớp, mụn trứng cá [13]. Vào năm 1995, các nhà khoa hoe Philippines l thử nghiệm u da và u khối gan trên chuột. Những con chuột được cạo lông ở lưng trước 3 ngày rồi. sẽ gây u bằng dimethylbenzanthracene, Sau 3 ngày thoa dịch chiết từ hoa của.

eoeeinea lên khối u 30 phút. Lap lại 3 lần một tuần trong 20 tuần, hành kết quả kiểm tra cho khối u hoà n toàn biến mắt [45]. Năm 2019, cây Mẫu đơn được phát hiện có hoạt tính chống oxy hóa, chống ung thư và chống vi khuân từ lá và hoa [62]. Tổng quan vi nam nội sinh 1.

Vindm nội sinh Vi nắm nội sinh gồm những loài vi nắm sống bên trong cây ký chủ nhưng không gây ra bệnh tật hoặc anh hưởng tiêu cực đến sức sống của vật chủ. Vi nội sinh có thể có những ảnh hưởng tích cực đối với vật chủ như: gia tăng sự phát triển của cây ký chủ, tăng khả năng hắp thụ chất dinh dưỡng của cây, ngăn chặn sự phat triển của mầm bệnh thực vat, giảm mức độ nghiêm trọng của bệnh và tăng khả năng chống chịu với áp lực môi trường. "Đồng thời, vi nắm nội sinh còn tạo ra nhiều loại thành phần tự nhiên, đôi khi (được gọi là chất chuyển hóa thứ cấp và các chất sinh hóa hữu ích khác. “Tiềm năng khai thác vi sinh vật nội sinh dé sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học quan trọng đối với sức khỏe con người là vô.

ing to lớn. “Trong 5 năm qua, hơn 300 loài vi sinh vật nội sinh có khả năng tổng hợp các chất chuyển hóa có giá tri ti liệu đã được phân lập và nuôi cấy thành công trong phòng thí nghiệm. Nắm nội sinh có khả ning tạo. Kuột số chất chuyển hóa giống với vật chủ của chúng [31].

Một trong các hợp chất có được tính. ‘quan trọng đã thu được là vineristine, vinblastine, CPT, quinine va taxol [35], ngoài ra còn hơn 8500 chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học có nguồn gốc tir nắm nội sinh đã được biết đến [9, 17]. Việc phát hiện nắm nội sinh Taxomyces adreanae trong cây Taxus baccata có khả nẵng sinh tổng hợp taxol đã thúc diy các nghiên cứu tìm iếm nắm nội sinh có thé tạo ra các phân tử có hoạt tính sinh học và các dẫn xuất của chúng [29]. Kết quả của các nghiên cứu.

giúp hiểu rõ hơn cơ chế tiến hóa phức tạp của vi sinh vật và thực vật chủ, đồng thời thu được nhiều hợp cl có hoạt tinh sinh học mới. Tuy nhiên, việc phân lập, xác định các vi sinh vật nội sinh triển vọng có khả năng sản xuất các chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học từ vô vàn các loài thực vật luôn là một thách thức. Cũng với đó, việc thiết lập mỗi tương quan với việc sản xuất các phân tử có hoạt tính sinh học cũng là một nhiệm vụ quan trọng.