Tổng quan nghiên cứu

Ung thư hiện là một trong những căn bệnh có tỷ lệ tử vong cao và ngày càng gia tăng trên toàn cầu. Theo thống kê của Tổ chức Nghiên cứu Ung thư Quốc tế năm 2020, Việt Nam ghi nhận khoảng 182.563 ca mắc mới và 122.690 ca tử vong do ung thư, tương đương với 159 người mắc mới và 106 người tử vong trên 100.000 dân. Trong bối cảnh đó, việc tìm kiếm nguồn cung cấp thuốc chống ung thư ổn định, hiệu quả và chi phí hợp lý là nhu cầu cấp thiết. Camptothecin (CPT) là một alkaloid có hoạt tính chống ung thư mạnh, được chiết xuất chủ yếu từ cây Hy Thụ (Camptotheca acuminata) và một số loài thực vật khác, trong đó có cây Mẫu đơn (Ixora chinensis). Tuy nhiên, cây thân gỗ này phát triển chậm và phương pháp chiết xuất truyền thống không đáp ứng được nhu cầu ngày càng tăng.

Nghiên cứu tập trung vào phân lập và sàng lọc các chủng vi nấm nội sinh có khả năng sinh tổng hợp Camptothecin trên cây Mẫu đơn thu thập tại Bắc Giang, Việt Nam. Mục tiêu cụ thể là xác định các chủng vi nấm nội sinh tiềm năng, thu hồi và phân tích hàm lượng CPT trong quy mô phòng thí nghiệm. Nghiên cứu có phạm vi thực hiện từ thu thập mẫu tại xã Tiên Nha, huyện Lục Nam, tỉnh Bắc Giang, đến các bước phân lập, định danh và lên men vi nấm nội sinh trong phòng thí nghiệm. Kết quả nghiên cứu góp phần phát triển nguồn nguyên liệu sinh học bền vững cho sản xuất thuốc điều trị ung thư, đồng thời bảo tồn đa dạng sinh học vi sinh vật và thực vật tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

  • Cơ chế tác dụng của Camptothecin: CPT ức chế enzyme topoisomerase I, ngăn cản quá trình tái xoắn DNA, gây đứt gãy chuỗi DNA và dẫn đến chết tế bào ung thư. Tuy nhiên, CPT có hạn chế về độ hòa tan và độc tính, do đó các dẫn xuất như topotecan và irinotecan được phát triển để cải thiện tính ổn định và hiệu quả điều trị.

  • Vi nấm nội sinh và sản xuất chất chuyển hóa thứ cấp: Vi nấm nội sinh sống trong mô thực vật mà không gây hại, có khả năng tổng hợp các hợp chất sinh học quan trọng như CPT, taxol, vineristine. Việc khai thác vi nấm nội sinh là hướng tiếp cận mới trong sản xuất dược liệu sinh học.

  • Lên men vi sinh vật: Lên men là quá trình nuôi cấy vi sinh vật để tạo ra sản phẩm trao đổi chất có giá trị. Lên men vi nấm nội sinh được tối ưu hóa để tăng năng suất CPT, sử dụng các yếu tố môi trường như nguồn cacbon, nitơ, pH, nhiệt độ và các tiền chất.

Các khái niệm chính bao gồm: Camptothecin (CPT), vi nấm nội sinh, lên men sinh tổng hợp, enzyme topoisomerase I, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), phản ứng chuỗi polymerase (PCR), và định danh gen ITS, rpoC1.

Phương pháp nghiên cứu

  • Nguồn dữ liệu: Mẫu cây Mẫu đơn được thu thập tại xã Tiên Nha, huyện Lục Nam, tỉnh Bắc Giang. Tổng cộng 3 cây được lấy mẫu các bộ phận hoa, lá, thân, rễ để phân lập vi nấm nội sinh.

  • Phân lập vi nấm nội sinh: Mẫu thực vật được xử lý khử trùng bề mặt bằng ethanol 75%, NaOCl 2%, sau đó cấy trên môi trường PDA có bổ sung kháng sinh. Vi nấm phát triển được tách thuần chủng và bảo quản ở -80°C.

  • Định danh thực vật và vi nấm: DNA tổng số được tách chiết từ mẫu cây và vi nấm. Vùng gen ITS và rpoC1 được nhân bản bằng PCR, sản phẩm được giải trình tự và so sánh với cơ sở dữ liệu NCBI để xác định loài. Cây phát sinh loài được xây dựng bằng phương pháp Neighbor-joining với 1000 lần bootstrap.

  • Sàng lọc vi nấm sinh tổng hợp CPT: Vi nấm được nuôi cấy trong môi trường PDB, chiết xuất CPT bằng dung môi Dichloromethane: Methanol (9:1). Định tính CPT bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) và định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với bước sóng 366 nm.

  • Phân tích cấu trúc: Các mẫu CPT được phân tích bằng khối phổ (MS) và cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) để xác định cấu trúc phân tử.

  • Lên men quy mô phòng thí nghiệm: Chủng vi nấm nội sinh có khả năng sinh CPT cao được lên men trong bình 70 lít với điều kiện pH 5.5, nhiệt độ 28 ± 2°C, tốc độ lắc 180 rpm, sục khí 1 vvm trong 7 ngày. CPT được thu hồi và phân tích hàm lượng.

  • Cỡ mẫu và timeline: Tổng cộng 22 chủng vi nấm nội sinh được phân lập từ 3 cây Mẫu đơn. Nghiên cứu thực hiện trong khoảng thời gian từ thu thập mẫu đến phân tích lên men trong phòng thí nghiệm, kéo dài khoảng 1 năm.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Định danh cây Mẫu đơn: DNA tổng số tách chiết có độ tinh sạch cao (A260/280 ~1.85), vùng gen ITS (~600 bp) và rpoC1 (~450 bp) được nhân bản thành công. Cây phát sinh loài cho thấy mẫu thuộc chi Ixora với độ tin cậy bootstrap trên 80%.

  2. Phân lập vi nấm nội sinh: Từ 3 cây Mẫu đơn, phân lập được 22 chủng vi nấm nội sinh đa dạng từ các bộ phận hoa, lá, thân, rễ. Các chủng có hình thái khuẩn lạc khác nhau, thể hiện sự phong phú sinh học.

  3. Sàng lọc và định tính CPT: Qua sắc ký lớp mỏng TLC và sắc ký lỏng HPLC, một số chủng vi nấm nội sinh cho thấy khả năng sinh tổng hợp CPT với hàm lượng dao động từ vài đến hàng chục mg/l trong môi trường nuôi cấy. Ví dụ, chủng I3R2 đạt hàm lượng CPT khoảng 5,5 µg/g trọng lượng nấm khô.

  4. Lên men quy mô phòng thí nghiệm: Chủng vi nấm nội sinh được lên men trong bình 70 lít thu được hàm lượng CPT tối đa sau 7 ngày nuôi cấy, đạt khoảng 12,45 µg/g trọng lượng nấm khô, tăng gần 2,3 lần so với nuôi cấy bình lắc 500 ml.

Thảo luận kết quả

Kết quả định danh cây Mẫu đơn phù hợp với mô tả thực vật học và các nghiên cứu trước đây, khẳng định tính chính xác của mẫu nghiên cứu. Việc phân lập 22 chủng vi nấm nội sinh đa dạng từ các bộ phận khác nhau của cây cho thấy môi trường sống phong phú và tiềm năng sinh học cao của cây Mẫu đơn tại Bắc Giang.

Khả năng sinh tổng hợp CPT của các chủng vi nấm nội sinh được xác nhận bằng các phương pháp sắc ký và khối phổ, phù hợp với các nghiên cứu quốc tế về vi nấm nội sinh sản xuất hợp chất chống ung thư. Hàm lượng CPT thu được trong nghiên cứu tương đương hoặc cao hơn một số nghiên cứu trước, chứng tỏ tiềm năng ứng dụng trong sản xuất dược liệu sinh học.

Lên men quy mô phòng thí nghiệm cho thấy việc tối ưu điều kiện nuôi cấy và mở rộng quy mô có thể nâng cao năng suất CPT, góp phần giải quyết hạn chế về nguồn cung CPT từ thực vật truyền thống. Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ so sánh hàm lượng CPT giữa các chủng vi nấm và các điều kiện lên men khác nhau, giúp minh họa hiệu quả của quy trình.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Tăng cường nghiên cứu và phát triển quy trình lên men vi nấm nội sinh nhằm tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy (pH, nhiệt độ, nguồn dinh dưỡng) để nâng cao năng suất CPT, đặt mục tiêu tăng ít nhất 30% hàm lượng CPT trong vòng 12 tháng. Chủ thể thực hiện: các viện nghiên cứu công nghệ sinh học.

  2. Xây dựng quy trình sản xuất CPT quy mô công nghiệp dựa trên chủng vi nấm nội sinh ưu việt, đảm bảo tính ổn định và hiệu quả kinh tế, triển khai thử nghiệm pilot trong 18 tháng tới. Chủ thể thực hiện: doanh nghiệp công nghệ sinh học phối hợp với viện nghiên cứu.

  3. Phát triển bộ sưu tập vi nấm nội sinh đa dạng từ các loài thực vật có tiềm năng sinh CPT tại Việt Nam để mở rộng nguồn gen và tăng khả năng tìm kiếm chủng ưu tú, thực hiện trong 2 năm. Chủ thể thực hiện: các trung tâm bảo tồn và nghiên cứu sinh học.

  4. Đào tạo và nâng cao năng lực cho cán bộ nghiên cứu và kỹ thuật viên về kỹ thuật phân lập, định danh và lên men vi nấm nội sinh, nhằm đảm bảo chất lượng và hiệu quả nghiên cứu, tổ chức các khóa đào tạo định kỳ hàng năm. Chủ thể thực hiện: các trường đại học và viện nghiên cứu.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành công nghệ sinh học, dược học: Nghiên cứu cung cấp phương pháp phân lập, định danh và lên men vi nấm nội sinh, hỗ trợ phát triển các đề tài liên quan đến sản xuất dược liệu sinh học.

  2. Doanh nghiệp công nghệ sinh học và dược phẩm: Tham khảo quy trình lên men và thu hồi CPT từ vi nấm nội sinh để ứng dụng sản xuất thuốc chống ung thư, giảm chi phí và tăng tính bền vững.

  3. Cơ quan quản lý và hoạch định chính sách y tế, nông nghiệp: Cung cấp cơ sở khoa học cho việc phát triển nguồn nguyên liệu sinh học trong điều trị ung thư, đồng thời bảo tồn đa dạng sinh học.

  4. Các tổ chức bảo tồn tài nguyên sinh vật và môi trường: Nghiên cứu giúp hiểu rõ vai trò của vi nấm nội sinh trong hệ sinh thái thực vật, hỗ trợ công tác bảo tồn và phát triển bền vững.

Câu hỏi thường gặp

  1. Camptothecin là gì và tại sao nó quan trọng trong điều trị ung thư?
    Camptothecin là một alkaloid có khả năng ức chế enzyme topoisomerase I, ngăn cản quá trình tái xoắn DNA, từ đó gây chết tế bào ung thư. Nó được sử dụng làm cơ sở để phát triển các thuốc chống ung thư như topotecan và irinotecan.

  2. Tại sao nghiên cứu vi nấm nội sinh lại được quan tâm trong sản xuất Camptothecin?
    Vi nấm nội sinh có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất sinh học quan trọng như CPT, giúp khắc phục hạn chế về nguồn cung từ thực vật, giảm chi phí và tăng tính bền vững trong sản xuất dược liệu.

  3. Phương pháp phân lập và định danh vi nấm nội sinh được thực hiện như thế nào?
    Mẫu thực vật được xử lý khử trùng bề mặt, cấy trên môi trường PDA để phân lập vi nấm. DNA của vi nấm được tách chiết, nhân bản vùng gen ITS và rpoC1 bằng PCR, sau đó giải trình tự và so sánh với cơ sở dữ liệu để xác định loài.

  4. Lên men vi nấm nội sinh có thể nâng cao năng suất Camptothecin như thế nào?
    Lên men trong điều kiện tối ưu (pH, nhiệt độ, nguồn dinh dưỡng) và quy mô lớn giúp tăng sinh khối vi nấm và sản xuất CPT, từ đó nâng cao hàm lượng CPT thu được so với nuôi cấy nhỏ lẻ.

  5. Nghiên cứu này có thể ứng dụng thực tiễn ra sao?
    Kết quả nghiên cứu cung cấp quy trình và chủng vi nấm nội sinh tiềm năng để phát triển sản xuất CPT quy mô công nghiệp, góp phần cung cấp thuốc chống ung thư hiệu quả và bền vững tại Việt Nam.

Kết luận

  • Đã phân lập và định danh thành công cây Mẫu đơn (Ixora chinensis) thu tại Bắc Giang bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen ITS, rpoC1.
  • Phân lập được 22 chủng vi nấm nội sinh đa dạng từ các bộ phận của cây Mẫu đơn, trong đó một số chủng có khả năng sinh tổng hợp Camptothecin với hàm lượng đáng kể.
  • Lên men quy mô phòng thí nghiệm cho thấy khả năng thu hồi CPT tăng gần 2,3 lần so với nuôi cấy nhỏ, chứng minh tiềm năng ứng dụng công nghiệp.
  • Nghiên cứu góp phần phát triển nguồn nguyên liệu sinh học bền vững cho sản xuất thuốc điều trị ung thư, đồng thời bảo tồn đa dạng sinh học vi sinh vật tại Việt Nam.
  • Đề xuất tiếp tục tối ưu quy trình lên men, mở rộng bộ sưu tập vi nấm nội sinh và phát triển sản xuất quy mô công nghiệp trong các bước tiếp theo.

Luận văn này là tài liệu tham khảo quý giá cho các nhà nghiên cứu, doanh nghiệp và cơ quan quản lý trong lĩnh vực công nghệ sinh học và dược phẩm. Để biết thêm chi tiết và hợp tác nghiên cứu, vui lòng liên hệ với Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.