Luận văn thạc sĩ: Nghiên cứu thu nhận enzyme chitinase từ vỏ hạt đậu nành Glycine max

Nghiên cứu thu nhận enzyme chitinase từ vỏ hạt đậu nành Glycine max trong luận văn thạc sĩ công nghệ thực phẩm, mang lại ứng dụng tiềm năng.

• Tác giả: Phạm Kim Ngân
• Người hướng dẫn: TS. Trần Bích Lam
• Trường học: Đại học Bách Khoa
• Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm
• Đề tài: Nghiên Cứu Enzyme Chitinase Từ Vỏ Hạt Đậu Nành (Glycine Max)
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: TP. Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về đậu nành
• 1.2. Đặc điểm của hạt đậu nành
• 1.3. Thành phần hóa học của hạt đậu nành
• 1.4. Cấu trúc phân tử
• 1.5. Tính chất của chitin
• 1.6. Ứng dụng của chitin
• 1.7. Enzyme chitinase (EC 3.2)
• 1.8. Cấu trúc, phân loại
• 1.9. Cơ chế tác động của enzyme chitinase
• 1.10. Các đặc tính cơ bản của hệ enzyme chitinase
• 1.11. Trọng lượng phân tử
• 1.12. Điểm đẳng điện, hằng số Michaelis
• 1.13. Nhiệt độ và pH hoạt động của enzyme
• 1.14. Chất ức chế
• 1.15. Nguồn thu nhận
• 1.16. Vai trò của chitinase trong phản ứng phòng vệ thực vật
• 1.17. Các kỹ thuật cơ bản trong quá trình tinh sạch protein enzyme
• 1.18. Phá vỡ tế bào
• 1.19. Ổn định protein trong dịch chiết thô
• 1.20. Phân riêng protein enzyme
• 1.21. Tinh sạch enzyme
• 1.22. Ứng dụng của enzyme chitinase
• 1.23. Trong nông nghiệp
• 1.24. Kiểm soát muỗi
• 1.25. Sản xuất protein đơn bào
• 1.26. Các ứng dụng khác
• 1.27. Các nghiên cứu về enzyme chitinase trên thực vật
• 1.28. Các nghiên cứu trên hạt đậu nành
• 1.29. Các nghiên cứu trên một số thực vật khác
• 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị sử dụng
• 2.2. Dụng cụ - Thiết bị
• 2.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
• 2.4. Quy trình thu nhận enzyme chitinase
• 2.5. Phương pháp thực hiện
• 2.5.1. Khảo sát phương pháp xử lí nguyên liệu
• 2.5.2. Khảo sát quá trình trích ly enzyme
• 2.5.3. Khảo sát quá trình kết tủa/ cô đặc enzyme
• 2.5.4. Sấy đông khô
• 2.6. Khảo sát các tính chất của enzyme
• 2.7. Phương pháp phân tích
• 2.7.1. Xác định hàm lượng protein hòa tan theo phương pháp Lowry
• 2.7.2. Xác định hoạt tính chitinase theo phương pháp định lượng đường khử với thuốc thử DNS
• 2.7.3. Định nghĩa đơn vị hoạt tính chitinase
• 2.7.4. Xác định hoạt tính chitinase
• 2.7.5. Phân tích số liệu
• 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Khảo sát hoạt tính enzyme ở các bộ phận khác nhau của nguyên liệu
• 3.2. Khảo sát quá trình trích ly enzyme chitinase
• 3.2.1. Ảnh hưởng của pH dung môi đến quá trình trích ly enzyme
• 3.2.2. Ảnh hưởng của tỉ lệ giữa nguyên liệu và dung dịch đệm đến trích ly enzyme
• 3.2.3. Ảnh hưởng của thời gian đến trích ly enzyme
• 3.2.4. Tối ưu hóa quá trình trích ly enzyme từ vỏ đậu nành bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm
• 3.3. Khảo sát quá trình kết tủa/ cô đặc enzyme
• 3.3.1. Kết tủa enzyme bằng acetone
• 3.3.2. Kết tủa enzyme bằng ethanol
• 3.3.3. Kết tủa enzyme bằng amonium sulfate
• 3.3.3.1. Trước khi thẩm tích
• 3.3.3.2. Sau khi thẩm tích
• 3.3.4. Cô đặc enzyme bằng siêu lọc
• 3.3.5. Chọn phương pháp kết tủa enzyme
• 3.4. Kết quả sấy đông khô
• 3.5. Tính chất enzyme
• 3.5.1. Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt tính enzyme
• 3.5.2. Xác định động học enzyme
• 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về enzyme chitinase

Enzyme chitinase là một enzyme quan trọng trong việc phân hủy chitin, một polysaccharide có mặt trong cấu trúc của vỏ động vật không xương sống và thành tế bào của nấm. Enzyme này có khả năng thủy phân liên kết β-1,4-glycoside trong chitin, tạo ra các sản phẩm như N-acetylglucosamin. Trong nghiên cứu này, enzyme chitinase được thu nhận từ vỏ hạt đậu nành (Glycine max), một nguồn tài nguyên phong phú nhưng thường bị lãng quên. Việc khai thác enzyme từ nguồn thực vật như đậu nành không chỉ giúp giảm chi phí sản xuất mà còn tạo ra các sản phẩm enzyme có giá trị trong nông nghiệp và y học. Theo Gijzen và cộng sự (2001), enzyme này đóng vai trò quan trọng trong phản ứng tự phòng vệ của cây trồng chống lại nấm và côn trùng gây hại. Điều này cho thấy tiềm năng ứng dụng của enzyme chitinase trong việc phát triển các sản phẩm sinh học thân thiện với môi trường.

II. Phương pháp thu nhận enzyme chitinase

Nghiên cứu này tập trung vào việc khảo sát các điều kiện tối ưu để thu nhận enzyme chitinase từ vỏ hạt đậu nành. Các bước đầu tiên bao gồm xác định phương pháp chuẩn bị nguyên liệu và các thông số của quá trình trích ly. Kết quả cho thấy rằng việc sử dụng đệm citrate với pH 5.5, tỷ lệ giữa khối lượng nguyên liệu và dung dịch đệm là 1:20 (w/v), thời gian trích ly 210 phút ở nhiệt độ 36°C mang lại hoạt tính enzyme cao nhất. Sau khi trích ly, enzyme được kết tủa bằng các tác nhân như acetone và ethanol. Kết quả cho thấy rằng acetone với tỷ lệ 1:4 (v/v) cho hiệu suất thu hồi cao nhất là 74.567% và độ tinh sạch đạt 1.560 lần. Quá trình cô đặc enzyme bằng siêu lọc qua màng có kích thước 25 kDa cũng được thực hiện để nâng cao độ tinh khiết của enzyme, cho thấy tiềm năng của các phương pháp này trong sản xuất enzyme từ nguồn thực vật.

III. Tính chất và ứng dụng của enzyme chitinase

Enzyme chitinase thu được từ vỏ hạt đậu nành có nhiều tính chất nổi bật. Nghiên cứu cho thấy nhiệt độ xúc tác tối ưu là 40°C và pH tối ưu là 6.0. Enzyme này bị ức chế bởi các ion kim loại như Al3+, Fe2+, Co2+, Fe3+, Hg+ nhưng lại được hoạt hóa bởi Mn2+, Cu2+. Các hằng số Km và Vmax trên cơ chất chitin huyền phù được xác định tương ứng là một yếu tố quan trọng trong việc đánh giá hoạt tính enzyme. Enzyme chitinase không chỉ có giá trị trong nông nghiệp như một loại thuốc trừ sâu sinh học mà còn có tiềm năng trong sản xuất protein đơn bào và các ứng dụng khác trong y học. Việc nghiên cứu và phát triển enzyme này từ Glycine max không chỉ góp phần vào việc tái sử dụng phế phẩm nông nghiệp mà còn mở ra hướng đi mới cho các sản phẩm sinh học trong tương lai.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Đậu nành (Glycine max) là cây trồng có giá trị kinh tế cao, được trồng phổ biến tại nhiều vùng trên thế giới và Việt Nam, đặc biệt ở Đông Nam Bộ và đồng bằng sông Cửu Long. Vỏ hạt đậu nành chiếm khoảng 8% trọng lượng hạt, chứa nhiều thành phần dinh dưỡng và enzyme có hoạt tính sinh học, trong đó enzyme chitinase đóng vai trò quan trọng trong phản ứng phòng vệ thực vật chống lại nấm bệnh và côn trùng. Chitinase là enzyme thủy phân chitin, một polysaccharide phổ biến trong tự nhiên, có ứng dụng rộng rãi trong nông nghiệp, y học và công nghiệp thực phẩm.

Mục tiêu nghiên cứu là khảo sát các điều kiện tối ưu để thu nhận enzyme chitinase từ vỏ hạt đậu nành, tạo chế phẩm enzyme thô và xác định các thông số tối ưu cho hoạt động xúc tác của enzyme. Nghiên cứu được thực hiện trên nguyên liệu vỏ hạt đậu nành giống Phương Lâm, thu mua tại chợ Trần Bình, TP. Hồ Chí Minh, trong khoảng thời gian từ tháng 1 đến tháng 6 năm 2014. Kết quả nghiên cứu góp phần tận dụng phế phẩm nông nghiệp, phát triển nguồn enzyme chitinase giá thành thấp, mở rộng ứng dụng trong các lĩnh vực sinh học và công nghệ thực phẩm.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình enzyme chitinase, bao gồm:

• Cấu trúc và phân loại enzyme chitinase: Chitinase thuộc nhóm hydrolase, xúc tác thủy phân liên kết β-1,4 glycoside trong chitin. Enzyme được phân thành hai họ chính Glycohydrolase 18 và 19, với các isozyme khác nhau về cấu trúc và cơ chế hoạt động. Chitinase thực vật thường thuộc nhóm I, có vai trò phòng vệ chống nấm và côn trùng.

• Cơ chế xúc tác enzyme: Chitinase thủy phân chitin thành chitobiose, chitotriose và các monomer N-acetyl D-glucosamin. Cơ chế xúc tác có thể giữ nguyên hoặc nghịch chuyển cấu hình β-anomer của sản phẩm.

• Tính chất enzyme chitinase: Nhiệt độ hoạt động tối ưu thường từ 30-50°C, pH tối ưu khoảng 5.0-6.0. Enzyme bị ức chế bởi các ion kim loại nặng như Hg+, Ag+, và được hoạt hóa bởi Mn2+, Cu2+.

• Phương pháp tinh sạch enzyme: Kết tủa bằng dung môi hữu cơ (acetone, ethanol), muối amonium sulfate, cô đặc bằng siêu lọc màng 25 kDa, sấy đông khô để tạo chế phẩm enzyme ổn định.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Nguyên liệu là vỏ hạt đậu nành giống Phương Lâm, thu mua tại TP. Hồ Chí Minh. Hóa chất và thiết bị tiêu chuẩn phòng thí nghiệm enzyme.

• Phương pháp thu nhận enzyme: Vỏ hạt được chuẩn bị theo phương pháp ướt (ngâm nước 5 giờ) và khô (xay khô). Trích ly enzyme trong đệm citrate pH 5.5, tỷ lệ nguyên liệu/dung dịch đệm 1:20 (w/v), thời gian 210 phút, nhiệt độ 36°C.

• Khảo sát các thông số trích ly: Thay đổi pH đệm, tỷ lệ nguyên liệu/dung dịch, thời gian và nhiệt độ trích ly để xác định điều kiện tối ưu.

• Kết tủa và cô đặc enzyme: So sánh hiệu quả kết tủa bằng acetone, ethanol và muối amonium sulfate ở các tỷ lệ khác nhau. Cô đặc enzyme bằng siêu lọc qua màng polysulfone 25 kDa.

• Xác định tính chất enzyme: Nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt tính, ảnh hưởng của các ion kim loại (Al3+, Fe2+, Co2+, Fe3+, Hg+, Mn2+, Cu2+), xác định hằng số động học Km và Vmax trên cơ chất chitin huyền phù.

• Phân tích số liệu: Sử dụng phương pháp Lowry để xác định hàm lượng protein, phương pháp định lượng đường khử DNS để đo hoạt tính enzyme, phân tích thống kê và tối ưu hóa bằng quy hoạch thực nghiệm.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Điều kiện trích ly tối ưu enzyme chitinase: Đệm citrate pH 5.5, tỷ lệ nguyên liệu/dung dịch đệm 1:20 (w/v), thời gian 210 phút, nhiệt độ 36°C cho hoạt tính enzyme cao nhất. Hoạt tính enzyme đạt mức tối đa khoảng 12 đơn vị hoạt tính/mL.

2. Phương pháp kết tủa hiệu quả: Kết tủa bằng acetone với tỷ lệ dịch trích ly/dung môi 1:4 (v/v) cho hiệu suất thu hồi enzyme 74.57% và độ tinh sạch 1.56 lần, vượt trội so với ethanol và muối amonium sulfate. Sau kết tủa, enzyme được sấy đông khô trong 24 giờ, giữ được hoạt tính cao.

3. Tính chất enzyme chitinase thu nhận: Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động xúc tác là 40°C, pH tối ưu là 6.0. Enzyme bị ức chế bởi các ion Al3+, Fe2+, Co2+, Fe3+, Hg+, trong khi Mn2+ và Cu2+ kích thích hoạt tính enzyme. Hằng số Km và Vmax trên cơ chất chitin huyền phù lần lượt là khoảng 0 và giá trị tương ứng theo ước tính.

4. So sánh với các nghiên cứu khác: Kết quả tương đồng với các nghiên cứu enzyme chitinase từ thực vật khác như khoai lang, mủ cao su, với nhiệt độ và pH tối ưu gần tương tự. Phương pháp kết tủa bằng acetone cũng được đánh giá cao về hiệu quả thu hồi và độ tinh sạch enzyme.

Thảo luận kết quả

Việc lựa chọn đệm citrate pH 5.5 phù hợp với đặc tính ổn định của enzyme chitinase, giúp duy trì cấu trúc và hoạt tính trong quá trình trích ly. Tỷ lệ nguyên liệu/dung dịch đệm 1:20 đảm bảo đủ môi trường để enzyme hòa tan và giải phóng hiệu quả. Thời gian trích ly 210 phút và nhiệt độ 36°C cân bằng giữa hiệu suất thu nhận và bảo toàn hoạt tính enzyme.

Phương pháp kết tủa bằng acetone ưu việt do khả năng làm giảm độ hòa tan protein mà không gây biến tính enzyme nhiều như ethanol hay muối amonium sulfate. Sấy đông khô giúp bảo quản enzyme lâu dài, thuận tiện cho ứng dụng công nghiệp.

Tính chất enzyme phù hợp với điều kiện môi trường sinh trưởng của đậu nành và các ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, nông nghiệp sinh học. Sự ức chế bởi các ion kim loại nặng và hoạt hóa bởi Mn2+, Cu2+ phản ánh cơ chế tương tác enzyme với các yếu tố môi trường, cần lưu ý khi ứng dụng enzyme trong các hệ phức tạp.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ hoạt tính enzyme theo pH và nhiệt độ, bảng so sánh hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch enzyme qua các phương pháp kết tủa, biểu đồ Lineweaver-Burk thể hiện các thông số động học.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Ứng dụng phương pháp trích ly và kết tủa acetone trong sản xuất enzyme chitinase quy mô công nghiệp: Đề xuất áp dụng quy trình trích ly với đệm citrate pH 5.5, tỷ lệ 1:20, thời gian 210 phút, nhiệt độ 36°C, kết tủa bằng acetone tỷ lệ 1:4 (v/v) để tối ưu hiệu suất và chất lượng enzyme. Thời gian thực hiện trong vòng 6 tháng, chủ thể là các doanh nghiệp công nghệ sinh học.

2. Phát triển chế phẩm enzyme chitinase dạng bột sấy đông khô: Khuyến nghị sử dụng sấy đông khô để bảo quản enzyme, đảm bảo hoạt tính lâu dài, thuận tiện vận chuyển và ứng dụng trong ngành thực phẩm và nông nghiệp. Thời gian triển khai 3-4 tháng, chủ thể là phòng thí nghiệm và nhà sản xuất enzyme.

3. Nghiên cứu mở rộng ảnh hưởng của các ion kim loại trong môi trường ứng dụng enzyme: Đề xuất khảo sát chi tiết tác động của các ion kim loại trong môi trường thực tế để điều chỉnh công thức enzyme phù hợp, nâng cao hiệu quả xúc tác. Thời gian nghiên cứu 6 tháng, chủ thể là viện nghiên cứu và trường đại học.

4. Khuyến khích tận dụng phế phẩm vỏ đậu nành trong sản xuất enzyme và các sản phẩm giá trị gia tăng: Đề xuất các cơ sở chế biến đậu nành thu gom và xử lý vỏ hạt để sản xuất enzyme chitinase, góp phần giảm thiểu lãng phí và phát triển kinh tế tuần hoàn. Thời gian thực hiện 1 năm, chủ thể là doanh nghiệp chế biến nông sản và chính quyền địa phương.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Công nghệ thực phẩm, Công nghệ sinh học: Nghiên cứu cung cấp dữ liệu thực nghiệm chi tiết về thu nhận và tinh sạch enzyme chitinase từ nguyên liệu thực vật, hỗ trợ phát triển đề tài liên quan enzyme và ứng dụng sinh học.

2. Doanh nghiệp sản xuất enzyme và chế phẩm sinh học: Tham khảo quy trình trích ly, kết tủa và bảo quản enzyme hiệu quả, giúp tối ưu hóa quy trình sản xuất, giảm chi phí và nâng cao chất lượng sản phẩm.

3. Ngành nông nghiệp và công nghệ sinh học ứng dụng: Tận dụng enzyme chitinase trong kiểm soát sinh học sâu bệnh, phát triển thuốc trừ sâu sinh học thân thiện môi trường, tăng năng suất cây trồng.

4. Cơ quan quản lý và hoạch định chính sách phát triển nông nghiệp bền vững: Tham khảo nghiên cứu để xây dựng chính sách khuyến khích sử dụng phế phẩm nông nghiệp, phát triển công nghệ enzyme, thúc đẩy kinh tế tuần hoàn và bảo vệ môi trường.

Câu hỏi thường gặp

1. Enzyme chitinase là gì và có vai trò gì trong thực vật?
   Enzyme chitinase là enzyme thủy phân chitin thành các phân tử nhỏ hơn, giúp thực vật phòng vệ chống lại nấm và côn trùng gây hại bằng cách phá vỡ thành tế bào của chúng. Ví dụ, chitinase có hoạt tính cao ở vỏ hạt đậu nành giúp bảo vệ hạt trong quá trình phát triển.

2. Tại sao chọn vỏ hạt đậu nành làm nguồn thu nhận enzyme chitinase?
   Vỏ hạt đậu nành chứa hàm lượng chitinase cao hơn các bộ phận khác của hạt, là phế phẩm nông nghiệp dễ thu thập và có giá trị sử dụng cao, giúp tận dụng nguồn nguyên liệu sẵn có, giảm chi phí sản xuất enzyme.

3. Phương pháp kết tủa enzyme nào hiệu quả nhất trong nghiên cứu này?
   Kết tủa bằng acetone với tỷ lệ dịch trích ly/dung môi 1:4 (v/v) cho hiệu suất thu hồi enzyme 74.57% và độ tinh sạch 1.56 lần, vượt trội so với ethanol và muối amonium sulfate, đồng thời giữ được hoạt tính enzyme cao sau sấy đông khô.

4. Nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt động của enzyme chitinase thu nhận là bao nhiêu?
   Nhiệt độ tối ưu là 40°C và pH tối ưu là 6.0, phù hợp với điều kiện sinh trưởng của đậu nành và các ứng dụng công nghiệp trong môi trường trung tính nhẹ.

5. Các ion kim loại ảnh hưởng như thế nào đến hoạt tính enzyme chitinase?
   Các ion Al3+, Fe2+, Co2+, Fe3+, Hg+ ức chế hoạt tính enzyme, trong khi Mn2+ và Cu2+ kích thích hoạt tính. Điều này cần lưu ý khi ứng dụng enzyme trong môi trường có chứa các ion kim loại khác nhau để đảm bảo hiệu quả xúc tác.

Kết luận

• Đã xác định được điều kiện trích ly enzyme chitinase tối ưu từ vỏ hạt đậu nành gồm đệm citrate pH 5.5, tỷ lệ 1:20 (w/v), thời gian 210 phút, nhiệt độ 36°C.
• Phương pháp kết tủa bằng acetone tỷ lệ 1:4 (v/v) cho hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch enzyme cao nhất.
• Enzyme chitinase thu nhận có nhiệt độ tối ưu 40°C, pH tối ưu 6.0, bị ức chế bởi các ion kim loại nặng và được hoạt hóa bởi Mn2+, Cu2+.
• Nghiên cứu góp phần tận dụng phế phẩm nông nghiệp, phát triển nguồn enzyme giá thành thấp, mở rộng ứng dụng trong nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm.
• Đề xuất triển khai ứng dụng quy trình thu nhận enzyme trong sản xuất công nghiệp và nghiên cứu sâu hơn về ảnh hưởng môi trường đến hoạt tính enzyme.

Hành động tiếp theo: Khuyến khích các đơn vị nghiên cứu và doanh nghiệp áp dụng quy trình thu nhận enzyme chitinase từ vỏ đậu nành, đồng thời mở rộng nghiên cứu ứng dụng enzyme trong kiểm soát sinh học và công nghệ thực phẩm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về đậu nành Đậu nành thuộc chi Glycine, họ đậu Leguninosae, họ phụ cánh bướm Papilionoideae và bộ Phaseoleae, có tên khoa học là Glycine max (L) Merr. là cây trồng cạn, ngắn ngày có nguồn gốc từ Đông Á. Thân cây mảnh, cao từ 0.9m, có lông, cành hướng lên phía trên. Lá mọc cách, có 3 lá chét hình trái xoan, mũi lá gần nhọn không đều ở gốc.

Hoa có màu trắng hay tím xếp thành chùm ở nách cành. Quả thõng, hình lưỡi liềm, gân bị ép, trên quả có nhiều lông màu vàng, thắt lại ở giữa (Trần Văn Điền, 2007). Trên thế giới, đậu nành là cây trồng lấy hạt quan trọng, đứng hàng thứ 4 sau cây lúa mì, lúa nước và ngô; tập trung nhiều nhất ở châu Mỹ (trên 70%) tiếp đến là châu Á. Trong nước, đậu nành cũng là cây trồng phổ biến, tập trung nhiều ở Đông Nam Bộ, miền núi Bắc Bộ, đồng bằng sông Hồng, đồng bằng sông Cửu Long.1 Đặc điểm của hạt đậu nành Hạt đậu nành có nhiều hình dạng và màu sắc khác nhau như: hình tròn, hình bầu dục, tròn dẹt.; màu vàng, đỏ, xanh lục, nâu đen.

Trong đó, giống đậu nành màu vàng có giá trị thương phẩm cao. Kích thước của hạt cũng khác nhau tùy loại giống, trung bình có trọng lượng từ 150-300gram/1000 hạt. Hạt đậu nành gồm 3 bộ phận chính là: vỏ hạt, phôi và tử diệp (Trần Văn Điền, 2007). Chồi mầm Vỏ ngoài Trụ trên lá mầm Rốn hạt Tử diệp Lỗ noãn Trụ dưới lá mầm Rễ mầm Hình 1.1: Hạt đậu nành 4 1.1 Vỏ hạt Vỏ hạt đậu nành chiếm khoảng 8% tổng trọng lượng hạt với các thành phần được thể hiện ở bảng 1.1: Thành phần chính trong vỏ hạt đậu nành (trên 100g) Thành phần Số lượng Tham khảo Protein 9g Liu, 1997 Fat (total lipid) 21.0 g Liu, 1997 Carbohydrates 21 g Liu, 1997 Fiber 65 g Cole et al., 1999 Isoflavones 90-600 µg Phommalth et al., 2008 Trypsin inhibitors 44 mg/g Sessa & Wolf, 2001 Phytic acid 0.50 g/100g Lehrfeld, 1989; Sutardi & Buckle, 1985 Saponins 0 Anderson & Wolf, 1995 Isoflavones 0.20 mg/g Eldridge & Kwolek, 1983 Nguồn: Tổng hợp bởi O’Bryan và cộng sự (2014) Vỏ hạt có chức năng bảo vệ phôi và các thành phần bên trong, đảm bảo cho sự nẩy mầm của phôi, chúng gồm nhiều lớp tế bào, thể hiện ở hình 1.

Ngoài cùng là lớp sáp không ngấm nước. Kế tiếp là lớp tế bào rào, macrosclereids, các tế nào này có vách dày, thon dài và vuông góc với bề mặt của hạt, đóng vai trò quan trọng cho sự cứng chắc của vỏ hạt. Bên trong lớp tế bào rào là lớp tế bào đồng hồ cát (hourglass), osteosclereids, lớp tế bào này lớn hơn các lớp tế bào lân cận, khoảng gian bào rộng. Các tế bào có không bào lớn và chứa nhiều loại protein đặc biệt là peroxidase (5% tổng protein hòa tan) (Gijzen và cộng sự, 1993).

Cũng như các tế bào rào, vách tế bào đồng hồ cát cũng có vai trò trong tạo độ cứng chắc cho vỏ hạt. Tiếp giáp với lớp tế bào đồng hồ cát là nhu mô bên trong, hình thành bởi 6-8 lớp mỏng, các tế bào nhu mô được kéo dài, chúng phân bố đều khắp các vỏ hạt, 5 ngoại trừ ở rốn. Trong lớp hạt trưởng thành, khi phôi được mở rộng lớp nhu mô thường bị chèn ép (Miller và cộng sự, 1999). Ngay sau lớp nhu mô của vỏ hạt là lớp tế bào aleurone và lớp nhu mô của nội nhũ.2: Cấu trúc của vỏ hạt đậu nành (Carlson và Lersten, 1987) cut: lớp cu-tin; pal (palisade): tế bào rào; hyp: các tế bào đồng hồ cát (hourglass) của hạ bì; int sp: khoảng gian bào; par: tế bào nhu mô; al: tế bào aleurone; par end: tế bào nhu mô của nội nhũ.2 Phôi Phôi chiếm 2% trọng lượng hạt, chứa hai lá mầm, trụ trên lá mầm, trụ dưới lá mầm và rễ, có chức năng hấp thu dinh dưỡng và nẩy chồi.3 Tử diệp Tử diệp chiếm 90% trọng lượng hạt, hình thẳng tới hình ovan, chứa lượng protein và lipid cao nhất trong toàn hạt, có thể ảnh hưởng tới quá trình trao đổi chất và lượng nước trong phôi.

Tử diệp có chức năng dự trữ và cung cấp dinh dưỡng cho phôi.2 Thành phần hóa học của hạt đậu nành Đậu nành là loại hạt có hàm lượng dinh dưỡng cao, giàu protein, glucid, lipid, muối khoáng và vitamin (Nguyễn Danh Đông, 1982; Ngô Thế Dân và cộng sự, 1999).2: Thành phần hóa học của hạt đậu nành. Tỷ lệ Protein Lipid Tro Carbohydate Thành phần (%) (%) (%) (%) (%) Hạt đậu nành nguyên 100 40 20 4.9 35 Tử diệp 90 43 23 5 29 Vỏ hạt 8 8.4 43 Nguồn: Cheftel và cộng sự (1985) - Protein: hàm lượng protein trong hạt trung bình khoảng 40% với các loại acid amin cân đối, hơi thiếu methionine và tryptophane; trong thành phần protein đậu nành, globulin chiếm 85-95%, còn lại là albumin, prolamin và glutelin. - Glucid: chiếm khoảng 35% khối lượng khô của hạt, phần lớn là cellulose, hemicellulose, tinh bột và một lượng nhỏ đường. - Lipid: chiếm khoảng 20% khối lượng khô hạt, lipid của đậu nành chứa một tỉ lệ cao các acid béo không no (khoảng 60-70% lượng acid béo của hạt) gồm linoleic (52-65%), oleic (25-36%), linolenic (2-3%).

- Chất khoáng và vitamin: thành phần khoáng chiếm 5% trọng lượng khô của hạt. Trong đó đáng chú ý nhất là canxi, photpho, mangan, kẽm, sắt. Ngoài ra, còn có các vitamin quan trọng khác như PP, A, E, K, D, C. Với thành phần giàu các chất dinh dưỡng, hạt đậu nành chủ yếu được ứng dụng trong lĩnh vực thực phẩm tạo ra nhiều sản phẩm có giá trị cao như: sữa đậu nành, đậu hủ, tương, chao, dầu nành, sản xuất các chất phụ gia cho thực phẩm.

các phụ phẩm của ngành chế biến đậu nành được sử dụng làm thức ăn gia súc có giá trị dinh dưỡng khá cao.2 Chitin Chitin là polyme sinh học rất phổ biến và là nguồn tài nguyên tái tạo dồi dào nhất sau cellulose (Deshpande, 1986). Trong tự nhiên chitin tồn tại ở cả động vật, thực vật và vi sinh vật. Trong giới động vật, nó là thành phần cấu trúc quan trọng trong vỏ của hầu hết các động vật không xương sống như động vật chân đốt, thân mềm, giun đốt dưới dạng phức hợp với các thành phần khác như chất béo, canxi 7 cacbonate, protein và các chất màu, hàm lượng chiếm khá cao từ 14-35% trọng lượng khô (Joiles và Muzzaralli, 1999). Trong giới thực vật, chitin ít được tìm thấy, chỉ có ở một số tảo Chlorophiceae.

Ở vi sinh vật, chitin nằm trong thành tế bào của nấm sợi, nấm men và vi khuẩn (Hirano and Nagano, 1989; Wang, 1992). Trong nấm, chitin kết hợp với polysaccharide khác, chẳng hạn như cellulose, glucan, mannan và polygalactosamine.1 Cấu trúc phân tử Chitin (C8H13NO5)n là một polysaccharide mạch thẳng gồm các đơn vị là N- acetyl D-glucosamin liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4 glycoside (Cabib, 1987).3: Cấu trúc của chitin Về cấu trúc lập thể, chitin có 3 dạng: α, β, γ. Sự khác nhau này thể hiện ở cách sắp xếp các chuỗi. Chuỗi α-chitin xếp xuôi, ngược xen kẽ nhau, đây là dạng phổ biến nhất trong tự nhiên, nó có mặt trong vỏ tôm, cua, trong các loài nhuyễn thể, trong dây chằng cũng như biểu bì của các loại côn trùng; hiếm hơn là dạng β-chitin, các chuỗi sắp xếp theo một chiều nhất định, được tìm thấy trong protein của mực ống; còn γ -chitin thì rất hiếm, các cặp chuỗi xếp cùng chiều so le với một chuỗi ngược chiều trong cấu trúc (Đinh Minh Hiệp, 2001).

α-chitin β-chitin γ-chitin Hình 1.4: Trình tự sắp xếp các chuỗi của α, β, γ – chitin 8 1.2 Tính chất của chitin Trong tự nhiên, chitin tồn tại ở dạng tinh thể, là chất rắn màu trắng, không tan trong nước, dung dịch kiềm hoặc acid loãng, các dung môi hữu cơ như ete, rượu. và thuốc thử Schweitzer; nhưng có thể tan trong một số dung dịch như HCl đậm đặc, HNO3, acid fomic khan và một số muối trung tính.3 Ứng dụng của chitin Trong nông nghiệp, chitin và dẫn xuất của nó, chitosan, được sử dụng nhằm bảo vệ cây trồng, chống sâu bệnh; thúc đẩy chất đối kháng vi sinh vật, kiểm soát sinh học. Nó là chất cảm ứng tốt cho cơ chế phòng vệ thực vật, việc bổ sung chitin vào đất làm tăng mật độ của các vi sinh vật chứa enzym chitinase (chitinolytic organisms), phá hủy trứng và lớp biểu bì của tuyến trùng non có chitin trong thành phần của chúng (Gooday, 1990). Chitin cũng hỗ trợ các mối quan hệ cộng sinh có lợi thực vật-vi sinh vật; điều hòa sinh trưởng và phát triển thực vật, nó cũng được đánh giá là một loại phân bón sinh học có thể cải thiện năng suất cây trồng.

Trong công nghiệp, chitin có thể tạo lớp màng ăn được hoặc là chất phụ gia làm dày và ổn định thực phẩm, có thể tạo độ bền dai cho thực phẩm thay thế một số chất không cho phép như hàn the. Chitin cũng hoạt động như một chất kết dính trong vải nhuộm. Ngoài ra, xử lí nước thải cũng là một trong những ứng dụng quan trọng của chitin. Trong y học, chitin được sử dụng để làm chỉ phẫu thuật, miếng xốp phân hủy sinh học, băng; nó cũng được báo cáo là có một số tính chất khác thường đẩy nhanh lành vết thương ở người.

Oligosaccharide chitin, là các đoạn mạch ngắn của chitin, được báo cáo là có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, hạ huyết áp, thuốc chống ung thư (Patil và cộng sự, 2000, Purwani và cộng sự, 2004). Các đơn phân của chitin là N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc) và glucosamine (GlcN), là những tác nhân chữa bệnh viêm khớp xương mãn tính, viêm ruột và viêm dạ dày. Trong hóa sinh, chitin được sử dụng làm chất mang trong cố định enzyme hay cố định tế bào (Trần Đình Toại và cộng sự, 2008).3 Enzyme chitinase (EC 3.1 Định nghĩa Chitinase [poly β-1,4-(2-acetamido-2-deoxy)-D-glucosid glucanohydrolase] thuộc nhóm enzyme hydrolase, xúc tác cho quá trình thủy phân chitin thành các chitobiose hay chitotriose thông qua việc phân cắt liên kết β-1,4-glycoside giữa C1 và C4 của hai phân tử N-acetylglucosamine trong chitin.5: Vị trí phân cắt của enzym chitinase Chitinase được tạo ra từ nhiều sinh vật, từ những loài có thành phần cấu trúc là chitin đến những loài không có chitin. Ở những sinh vật chứa chitin, chitinase đóng vai trò chính trong quá trình phát sinh hình thái và phân chia tế bào.

Vi khuẩn tổng hợp chitinase để phân giải chitin tạo ra nguồn carbon. Ở thực vật và động vật, chitinase nằm trong hệ thống chống lại các tác nhân gây bệnh như nấm bằng cách phá vỡ thành tế bào chứa chitin của nấm. Chân khớp và nấm, chitinase có vai trò trong sự phân chia tế bào để tăng trưởng và được tạo thành trong suốt quá trình sinh trưởng của nấm.