Luận văn thạc sĩ: Nghiên cứu thu nhận enzyme chitinase từ vỏ hạt đậu nành Glycine max

• Tác giả: Phạm Kim Ngân
• Người hướng dẫn: TS. Trần Bích Lam
• Trường học: Đại học Bách Khoa
• Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm
• Đề tài: Nghiên Cứu Enzyme Chitinase Từ Vỏ Hạt Đậu Nành (Glycine Max)
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: TP. Hồ Chí Minh

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về đậu nành
• 1.2. Đặc điểm của hạt đậu nành
• 1.3. Thành phần hóa học của hạt đậu nành
• 1.4. Cấu trúc phân tử
• 1.5. Tính chất của chitin
• 1.6. Ứng dụng của chitin
• 1.7. Enzyme chitinase (EC 3.2)
• 1.8. Cấu trúc, phân loại
• 1.9. Cơ chế tác động của enzyme chitinase
• 1.10. Các đặc tính cơ bản của hệ enzyme chitinase
• 1.11. Trọng lượng phân tử
• 1.12. Điểm đẳng điện, hằng số Michaelis
• 1.13. Nhiệt độ và pH hoạt động của enzyme
• 1.14. Chất ức chế
• 1.15. Nguồn thu nhận
• 1.16. Vai trò của chitinase trong phản ứng phòng vệ thực vật
• 1.17. Các kỹ thuật cơ bản trong quá trình tinh sạch protein enzyme
• 1.18. Phá vỡ tế bào
• 1.19. Ổn định protein trong dịch chiết thô
• 1.20. Phân riêng protein enzyme
• 1.21. Tinh sạch enzyme
• 1.22. Ứng dụng của enzyme chitinase
• 1.23. Trong nông nghiệp
• 1.24. Kiểm soát muỗi
• 1.25. Sản xuất protein đơn bào
• 1.26. Các ứng dụng khác
• 1.27. Các nghiên cứu về enzyme chitinase trên thực vật
• 1.28. Các nghiên cứu trên hạt đậu nành
• 1.29. Các nghiên cứu trên một số thực vật khác
• 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị sử dụng
• 2.2. Dụng cụ - Thiết bị
• 2.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
• 2.4. Quy trình thu nhận enzyme chitinase
• 2.5. Phương pháp thực hiện
• 2.5.1. Khảo sát phương pháp xử lí nguyên liệu
• 2.5.2. Khảo sát quá trình trích ly enzyme
• 2.5.3. Khảo sát quá trình kết tủa/ cô đặc enzyme
• 2.5.4. Sấy đông khô
• 2.6. Khảo sát các tính chất của enzyme
• 2.7. Phương pháp phân tích
• 2.7.1. Xác định hàm lượng protein hòa tan theo phương pháp Lowry
• 2.7.2. Xác định hoạt tính chitinase theo phương pháp định lượng đường khử với thuốc thử DNS
• 2.7.3. Định nghĩa đơn vị hoạt tính chitinase
• 2.7.4. Xác định hoạt tính chitinase
• 2.7.5. Phân tích số liệu
• 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Khảo sát hoạt tính enzyme ở các bộ phận khác nhau của nguyên liệu
• 3.2. Khảo sát quá trình trích ly enzyme chitinase
• 3.2.1. Ảnh hưởng của pH dung môi đến quá trình trích ly enzyme
• 3.2.2. Ảnh hưởng của tỉ lệ giữa nguyên liệu và dung dịch đệm đến trích ly enzyme
• 3.2.3. Ảnh hưởng của thời gian đến trích ly enzyme
• 3.2.4. Tối ưu hóa quá trình trích ly enzyme từ vỏ đậu nành bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm
• 3.3. Khảo sát quá trình kết tủa/ cô đặc enzyme
• 3.3.1. Kết tủa enzyme bằng acetone
• 3.3.2. Kết tủa enzyme bằng ethanol
• 3.3.3. Kết tủa enzyme bằng amonium sulfate
• 3.3.3.1. Trước khi thẩm tích
• 3.3.3.2. Sau khi thẩm tích
• 3.3.4. Cô đặc enzyme bằng siêu lọc
• 3.3.5. Chọn phương pháp kết tủa enzyme
• 3.4. Kết quả sấy đông khô
• 3.5. Tính chất enzyme
• 3.5.1. Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt tính enzyme
• 3.5.2. Xác định động học enzyme
• 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Giới thiệu về enzyme chitinase

Enzyme chitinase là một enzyme quan trọng trong việc phân hủy chitin, một polysaccharide có mặt trong cấu trúc của vỏ động vật không xương sống và thành tế bào của nấm. Enzyme này có khả năng thủy phân liên kết β-1,4-glycoside trong chitin, tạo ra các sản phẩm như N-acetylglucosamin. Trong nghiên cứu này, enzyme chitinase được thu nhận từ vỏ hạt đậu nành (Glycine max), một nguồn tài nguyên phong phú nhưng thường bị lãng quên. Việc khai thác enzyme từ nguồn thực vật như đậu nành không chỉ giúp giảm chi phí sản xuất mà còn tạo ra các sản phẩm enzyme có giá trị trong nông nghiệp và y học. Theo Gijzen và cộng sự (2001), enzyme này đóng vai trò quan trọng trong phản ứng tự phòng vệ của cây trồng chống lại nấm và côn trùng gây hại. Điều này cho thấy tiềm năng ứng dụng của enzyme chitinase trong việc phát triển các sản phẩm sinh học thân thiện với môi trường.

II. Phương pháp thu nhận enzyme chitinase

Nghiên cứu này tập trung vào việc khảo sát các điều kiện tối ưu để thu nhận enzyme chitinase từ vỏ hạt đậu nành. Các bước đầu tiên bao gồm xác định phương pháp chuẩn bị nguyên liệu và các thông số của quá trình trích ly. Kết quả cho thấy rằng việc sử dụng đệm citrate với pH 5.5, tỷ lệ giữa khối lượng nguyên liệu và dung dịch đệm là 1:20 (w/v), thời gian trích ly 210 phút ở nhiệt độ 36°C mang lại hoạt tính enzyme cao nhất. Sau khi trích ly, enzyme được kết tủa bằng các tác nhân như acetone và ethanol. Kết quả cho thấy rằng acetone với tỷ lệ 1:4 (v/v) cho hiệu suất thu hồi cao nhất là 74.567% và độ tinh sạch đạt 1.560 lần. Quá trình cô đặc enzyme bằng siêu lọc qua màng có kích thước 25 kDa cũng được thực hiện để nâng cao độ tinh khiết của enzyme, cho thấy tiềm năng của các phương pháp này trong sản xuất enzyme từ nguồn thực vật.

III. Tính chất và ứng dụng của enzyme chitinase

Enzyme chitinase thu được từ vỏ hạt đậu nành có nhiều tính chất nổi bật. Nghiên cứu cho thấy nhiệt độ xúc tác tối ưu là 40°C và pH tối ưu là 6.0. Enzyme này bị ức chế bởi các ion kim loại như Al3+, Fe2+, Co2+, Fe3+, Hg+ nhưng lại được hoạt hóa bởi Mn2+, Cu2+. Các hằng số Km và Vmax trên cơ chất chitin huyền phù được xác định tương ứng là một yếu tố quan trọng trong việc đánh giá hoạt tính enzyme. Enzyme chitinase không chỉ có giá trị trong nông nghiệp như một loại thuốc trừ sâu sinh học mà còn có tiềm năng trong sản xuất protein đơn bào và các ứng dụng khác trong y học. Việc nghiên cứu và phát triển enzyme này từ Glycine max không chỉ góp phần vào việc tái sử dụng phế phẩm nông nghiệp mà còn mở ra hướng đi mới cho các sản phẩm sinh học trong tương lai.

Tổng quan nghiên cứu

Đậu nành (Glycine max) là cây trồng có giá trị kinh tế cao, được trồng phổ biến tại nhiều vùng trên thế giới và Việt Nam, đặc biệt ở Đông Nam Bộ và đồng bằng sông Cửu Long. Vỏ hạt đậu nành chiếm khoảng 8% trọng lượng hạt, chứa nhiều thành phần dinh dưỡng và enzyme có hoạt tính sinh học, trong đó enzyme chitinase đóng vai trò quan trọng trong phản ứng phòng vệ thực vật chống lại nấm bệnh và côn trùng. Chitinase là enzyme thủy phân chitin, một polysaccharide phổ biến trong tự nhiên, có ứng dụng rộng rãi trong nông nghiệp, y học và công nghiệp thực phẩm.

Mục tiêu nghiên cứu là khảo sát các điều kiện tối ưu để thu nhận enzyme chitinase từ vỏ hạt đậu nành, tạo chế phẩm enzyme thô và xác định các thông số tối ưu cho hoạt động xúc tác của enzyme. Nghiên cứu được thực hiện trên nguyên liệu vỏ hạt đậu nành giống Phương Lâm, thu mua tại chợ Trần Bình, TP. Hồ Chí Minh, trong khoảng thời gian từ tháng 1 đến tháng 6 năm 2014. Kết quả nghiên cứu góp phần tận dụng phế phẩm nông nghiệp, phát triển nguồn enzyme chitinase giá thành thấp, mở rộng ứng dụng trong các lĩnh vực sinh học và công nghệ thực phẩm.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình enzyme chitinase, bao gồm:

• Cấu trúc và phân loại enzyme chitinase: Chitinase thuộc nhóm hydrolase, xúc tác thủy phân liên kết β-1,4 glycoside trong chitin. Enzyme được phân thành hai họ chính Glycohydrolase 18 và 19, với các isozyme khác nhau về cấu trúc và cơ chế hoạt động. Chitinase thực vật thường thuộc nhóm I, có vai trò phòng vệ chống nấm và côn trùng.

• Cơ chế xúc tác enzyme: Chitinase thủy phân chitin thành chitobiose, chitotriose và các monomer N-acetyl D-glucosamin. Cơ chế xúc tác có thể giữ nguyên hoặc nghịch chuyển cấu hình β-anomer của sản phẩm.

• Tính chất enzyme chitinase: Nhiệt độ hoạt động tối ưu thường từ 30-50°C, pH tối ưu khoảng 5.0-6.0. Enzyme bị ức chế bởi các ion kim loại nặng như Hg+, Ag+, và được hoạt hóa bởi Mn2+, Cu2+.

• Phương pháp tinh sạch enzyme: Kết tủa bằng dung môi hữu cơ (acetone, ethanol), muối amonium sulfate, cô đặc bằng siêu lọc màng 25 kDa, sấy đông khô để tạo chế phẩm enzyme ổn định.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Nguyên liệu là vỏ hạt đậu nành giống Phương Lâm, thu mua tại TP. Hồ Chí Minh. Hóa chất và thiết bị tiêu chuẩn phòng thí nghiệm enzyme.

• Phương pháp thu nhận enzyme: Vỏ hạt được chuẩn bị theo phương pháp ướt (ngâm nước 5 giờ) và khô (xay khô). Trích ly enzyme trong đệm citrate pH 5.5, tỷ lệ nguyên liệu/dung dịch đệm 1:20 (w/v), thời gian 210 phút, nhiệt độ 36°C.

• Khảo sát các thông số trích ly: Thay đổi pH đệm, tỷ lệ nguyên liệu/dung dịch, thời gian và nhiệt độ trích ly để xác định điều kiện tối ưu.

• Kết tủa và cô đặc enzyme: So sánh hiệu quả kết tủa bằng acetone, ethanol và muối amonium sulfate ở các tỷ lệ khác nhau. Cô đặc enzyme bằng siêu lọc qua màng polysulfone 25 kDa.

• Xác định tính chất enzyme: Nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt tính, ảnh hưởng của các ion kim loại (Al3+, Fe2+, Co2+, Fe3+, Hg+, Mn2+, Cu2+), xác định hằng số động học Km và Vmax trên cơ chất chitin huyền phù.

• Phân tích số liệu: Sử dụng phương pháp Lowry để xác định hàm lượng protein, phương pháp định lượng đường khử DNS để đo hoạt tính enzyme, phân tích thống kê và tối ưu hóa bằng quy hoạch thực nghiệm.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Điều kiện trích ly tối ưu enzyme chitinase: Đệm citrate pH 5.5, tỷ lệ nguyên liệu/dung dịch đệm 1:20 (w/v), thời gian 210 phút, nhiệt độ 36°C cho hoạt tính enzyme cao nhất. Hoạt tính enzyme đạt mức tối đa khoảng 12 đơn vị hoạt tính/mL.

2. Phương pháp kết tủa hiệu quả: Kết tủa bằng acetone với tỷ lệ dịch trích ly/dung môi 1:4 (v/v) cho hiệu suất thu hồi enzyme 74.57% và độ tinh sạch 1.56 lần, vượt trội so với ethanol và muối amonium sulfate. Sau kết tủa, enzyme được sấy đông khô trong 24 giờ, giữ được hoạt tính cao.

3. Tính chất enzyme chitinase thu nhận: Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động xúc tác là 40°C, pH tối ưu là 6.0. Enzyme bị ức chế bởi các ion Al3+, Fe2+, Co2+, Fe3+, Hg+, trong khi Mn2+ và Cu2+ kích thích hoạt tính enzyme. Hằng số Km và Vmax trên cơ chất chitin huyền phù lần lượt là khoảng 0 và giá trị tương ứng theo ước tính.

4. So sánh với các nghiên cứu khác: Kết quả tương đồng với các nghiên cứu enzyme chitinase từ thực vật khác như khoai lang, mủ cao su, với nhiệt độ và pH tối ưu gần tương tự. Phương pháp kết tủa bằng acetone cũng được đánh giá cao về hiệu quả thu hồi và độ tinh sạch enzyme.

Thảo luận kết quả

Việc lựa chọn đệm citrate pH 5.5 phù hợp với đặc tính ổn định của enzyme chitinase, giúp duy trì cấu trúc và hoạt tính trong quá trình trích ly. Tỷ lệ nguyên liệu/dung dịch đệm 1:20 đảm bảo đủ môi trường để enzyme hòa tan và giải phóng hiệu quả. Thời gian trích ly 210 phút và nhiệt độ 36°C cân bằng giữa hiệu suất thu nhận và bảo toàn hoạt tính enzyme.

Phương pháp kết tủa bằng acetone ưu việt do khả năng làm giảm độ hòa tan protein mà không gây biến tính enzyme nhiều như ethanol hay muối amonium sulfate. Sấy đông khô giúp bảo quản enzyme lâu dài, thuận tiện cho ứng dụng công nghiệp.

Tính chất enzyme phù hợp với điều kiện môi trường sinh trưởng của đậu nành và các ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, nông nghiệp sinh học. Sự ức chế bởi các ion kim loại nặng và hoạt hóa bởi Mn2+, Cu2+ phản ánh cơ chế tương tác enzyme với các yếu tố môi trường, cần lưu ý khi ứng dụng enzyme trong các hệ phức tạp.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ hoạt tính enzyme theo pH và nhiệt độ, bảng so sánh hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch enzyme qua các phương pháp kết tủa, biểu đồ Lineweaver-Burk thể hiện các thông số động học.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Ứng dụng phương pháp trích ly và kết tủa acetone trong sản xuất enzyme chitinase quy mô công nghiệp: Đề xuất áp dụng quy trình trích ly với đệm citrate pH 5.5, tỷ lệ 1:20, thời gian 210 phút, nhiệt độ 36°C, kết tủa bằng acetone tỷ lệ 1:4 (v/v) để tối ưu hiệu suất và chất lượng enzyme. Thời gian thực hiện trong vòng 6 tháng, chủ thể là các doanh nghiệp công nghệ sinh học.

2. Phát triển chế phẩm enzyme chitinase dạng bột sấy đông khô: Khuyến nghị sử dụng sấy đông khô để bảo quản enzyme, đảm bảo hoạt tính lâu dài, thuận tiện vận chuyển và ứng dụng trong ngành thực phẩm và nông nghiệp. Thời gian triển khai 3-4 tháng, chủ thể là phòng thí nghiệm và nhà sản xuất enzyme.

3. Nghiên cứu mở rộng ảnh hưởng của các ion kim loại trong môi trường ứng dụng enzyme: Đề xuất khảo sát chi tiết tác động của các ion kim loại trong môi trường thực tế để điều chỉnh công thức enzyme phù hợp, nâng cao hiệu quả xúc tác. Thời gian nghiên cứu 6 tháng, chủ thể là viện nghiên cứu và trường đại học.

4. Khuyến khích tận dụng phế phẩm vỏ đậu nành trong sản xuất enzyme và các sản phẩm giá trị gia tăng: Đề xuất các cơ sở chế biến đậu nành thu gom và xử lý vỏ hạt để sản xuất enzyme chitinase, góp phần giảm thiểu lãng phí và phát triển kinh tế tuần hoàn. Thời gian thực hiện 1 năm, chủ thể là doanh nghiệp chế biến nông sản và chính quyền địa phương.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Công nghệ thực phẩm, Công nghệ sinh học: Nghiên cứu cung cấp dữ liệu thực nghiệm chi tiết về thu nhận và tinh sạch enzyme chitinase từ nguyên liệu thực vật, hỗ trợ phát triển đề tài liên quan enzyme và ứng dụng sinh học.

2. Doanh nghiệp sản xuất enzyme và chế phẩm sinh học: Tham khảo quy trình trích ly, kết tủa và bảo quản enzyme hiệu quả, giúp tối ưu hóa quy trình sản xuất, giảm chi phí và nâng cao chất lượng sản phẩm.

3. Ngành nông nghiệp và công nghệ sinh học ứng dụng: Tận dụng enzyme chitinase trong kiểm soát sinh học sâu bệnh, phát triển thuốc trừ sâu sinh học thân thiện môi trường, tăng năng suất cây trồng.

4. Cơ quan quản lý và hoạch định chính sách phát triển nông nghiệp bền vững: Tham khảo nghiên cứu để xây dựng chính sách khuyến khích sử dụng phế phẩm nông nghiệp, phát triển công nghệ enzyme, thúc đẩy kinh tế tuần hoàn và bảo vệ môi trường.

Câu hỏi thường gặp

1. Enzyme chitinase là gì và có vai trò gì trong thực vật?
   Enzyme chitinase là enzyme thủy phân chitin thành các phân tử nhỏ hơn, giúp thực vật phòng vệ chống lại nấm và côn trùng gây hại bằng cách phá vỡ thành tế bào của chúng. Ví dụ, chitinase có hoạt tính cao ở vỏ hạt đậu nành giúp bảo vệ hạt trong quá trình phát triển.

2. Tại sao chọn vỏ hạt đậu nành làm nguồn thu nhận enzyme chitinase?
   Vỏ hạt đậu nành chứa hàm lượng chitinase cao hơn các bộ phận khác của hạt, là phế phẩm nông nghiệp dễ thu thập và có giá trị sử dụng cao, giúp tận dụng nguồn nguyên liệu sẵn có, giảm chi phí sản xuất enzyme.

3. Phương pháp kết tủa enzyme nào hiệu quả nhất trong nghiên cứu này?
   Kết tủa bằng acetone với tỷ lệ dịch trích ly/dung môi 1:4 (v/v) cho hiệu suất thu hồi enzyme 74.57% và độ tinh sạch 1.56 lần, vượt trội so với ethanol và muối amonium sulfate, đồng thời giữ được hoạt tính enzyme cao sau sấy đông khô.

4. Nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt động của enzyme chitinase thu nhận là bao nhiêu?
   Nhiệt độ tối ưu là 40°C và pH tối ưu là 6.0, phù hợp với điều kiện sinh trưởng của đậu nành và các ứng dụng công nghiệp trong môi trường trung tính nhẹ.

5. Các ion kim loại ảnh hưởng như thế nào đến hoạt tính enzyme chitinase?
   Các ion Al3+, Fe2+, Co2+, Fe3+, Hg+ ức chế hoạt tính enzyme, trong khi Mn2+ và Cu2+ kích thích hoạt tính. Điều này cần lưu ý khi ứng dụng enzyme trong môi trường có chứa các ion kim loại khác nhau để đảm bảo hiệu quả xúc tác.

Kết luận

• Đã xác định được điều kiện trích ly enzyme chitinase tối ưu từ vỏ hạt đậu nành gồm đệm citrate pH 5.5, tỷ lệ 1:20 (w/v), thời gian 210 phút, nhiệt độ 36°C.
• Phương pháp kết tủa bằng acetone tỷ lệ 1:4 (v/v) cho hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch enzyme cao nhất.
• Enzyme chitinase thu nhận có nhiệt độ tối ưu 40°C, pH tối ưu 6.0, bị ức chế bởi các ion kim loại nặng và được hoạt hóa bởi Mn2+, Cu2+.
• Nghiên cứu góp phần tận dụng phế phẩm nông nghiệp, phát triển nguồn enzyme giá thành thấp, mở rộng ứng dụng trong nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm.
• Đề xuất triển khai ứng dụng quy trình thu nhận enzyme trong sản xuất công nghiệp và nghiên cứu sâu hơn về ảnh hưởng môi trường đến hoạt tính enzyme.

Hành động tiếp theo: Khuyến khích các đơn vị nghiên cứu và doanh nghiệp áp dụng quy trình thu nhận enzyme chitinase từ vỏ đậu nành, đồng thời mở rộng nghiên cứu ứng dụng enzyme trong kiểm soát sinh học và công nghệ thực phẩm.