Tổng quan luận án

Nghiên cứu hóa học các hợp chất thiên nhiên từ sinh vật biển, đặc biệt là đối tượng rong biển, là một trong những định hướng nghiên cứu quan trọng trong việc tìm kiếm các hoạt chất sinh học ứng dụng trong y dược và công nghiệp. Việt Nam có đường bờ biển dài khoảng 3.260 km với khoảng 1.000 loài rong biển đã được ghi nhận (trong đó 827 loài đã được định danh chính thức và khoảng 150 loài có giá trị kinh tế). Rong biển không chỉ cung cấp các polysaccharide có giá trị như alginate, carrageenan, fucoidan và laminaran mà còn chứa nguồn lipid phong phú với hàm lượng cao các axit béo không no nhiều nối đôi (PUFA) như axit arachidonic (AA, C20:4n-6), axit eicosapentaenoic (EPA, C20:5n-3) và axit docosahexaenoic (DHA, C22:6n-3), cùng các phân lớp lipid phân cực có hoạt tính sinh học đặc thù (kháng u, ức chế enzyme DNA-polymerase, kháng virus).

Khoảng trống nghiên cứu lớn mà tác giả chỉ ra là: các phân lớp lipid trong sinh vật biển chứa số lượng dạng phân tử (molecular species) rất lớn (dao động từ 50 đến 200 dạng phân tử trong mỗi phân lớp), chỉ khác nhau về thành phần, độ dài và vị trí của các gốc acyl, alkyl hoặc alkenyl tại các vị trí sn-1, sn-2 trên khung glycerol hoặc sphingosine. Việc phân lập riêng rẽ từng hợp chất lipid tinh khiết bằng phương pháp hóa học truyền thống là vô cùng khó khăn, tốn kém và khó khả thi. Hầu hết các công trình nghiên cứu về lipid rong biển tại Việt Nam trước đây chỉ dừng lại ở phân tích hóa sinh cơ bản: xác định hàm lượng lipid tổng, hàm lượng các lớp lipid chung và thành phần axit béo tổng số. Chưa có công trình nào trong nước đi sâu xác định cấu trúc các dạng phân tử lipid phân cực chi tiết bằng kỹ thuật khối phổ phân giải cao, cũng như đánh giá toàn diện mối liên hệ giữa thành phần lipid và hoạt tính sinh học ở các loài rong biển thu thập tại các vùng biển đảo xa bờ đặc thù như Côn Đảo và Quần đảo Trường Sa.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án gồm 3 nội dung chính:

  1. Nghiên cứu sàng lọc thành phần lipid và axit béo trong 60 mẫu của 50 loài rong biển thuộc ba ngành rong Đỏ (Rhodophyta), rong Nâu (Phaeophyta) và rong Lục (Chlorophyta) thu thập tại các vùng biển Việt Nam.
  2. Xác định cấu trúc và hàm lượng các dạng phân tử lipid phân cực của hai loài rong biển chọn lọc thu thập tại các vùng đảo xa bờ đặc thù là Côn Đảo (Lobophora sp.) và Quần đảo Trường Sa (Halimeda incrassata Lamx.) bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao kết nối phổ khối phân giải cao (HPLC-HRMS).
  3. Khảo sát hoạt tính sinh học in vitro (hoạt tính bẫy gốc tự do DPPH, kháng vi sinh vật kiểm định, gây độc tế bào ung thư và kháng viêm qua ức chế sản sinh NO) của các phân đoạn lipid từ hai loài rong biển đã lựa chọn.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng: 60 mẫu rong biển tự nhiên thuộc 50 loài, đại diện cho 14 họ của 3 ngành rong Đỏ, rong Nâu và rong Lục. Hai loài được lựa chọn nghiên cứu chuyên sâu về dạng phân tử và hoạt tính sinh học là Lobophora sp. (loài mới phát hiện tại Việt Nam, thuộc ngành rong Nâu) và Halimeda incrassata Lamx. (ngành rong Lục).
  • Phạm vi không gian: Các vùng biển ven bờ và đảo của Việt Nam, bao gồm tỉnh Quảng Ninh (đảo Cô Tô), Quảng Bình (Hòn Nôm), Thừa Thiên Huế (Lăng Cô), Khánh Hòa (vịnh Nha Trang, đảo Thuyền Chài, đảo Trường Sa Lớn thuộc Quần đảo Trường Sa) và Bà Rịa - Vũng Tàu (Côn Đảo).
  • Phạm vi thời gian: Các đợt thu mẫu thực địa được tiến hành trong giai đoạn 2015 – 2017 (Đợt 1: tháng 6/2015; Đợt 2: tháng 5/2016; Đợt 3: tháng 6/2017; Đợt 4: tháng 7/2017).

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã tổng quan hệ thống các công trình nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam về thành phần hóa học, lipid và hoạt tính sinh học của rong biển theo các nhánh nội dung chính:

  1. Nghiên cứu quốc tế về lipid và các dạng phân tử lipid phân cực:
  • Harwood và Jones (1989) công bố hàm lượng axit béo arachidonic (AA) chiếm tới 15% lipid tổng ở loài rong Nâu Fucus vesiculosus và 18% ở loài rong Đỏ Chondrus crispus.
  • Dembitsky và cộng sự (1990) nghiên cứu lipid các loài rong Nâu ở Biển Đen, xác định tỷ lệ monoglycosyldiacylglycerol (MGDG, 26,8 - 46,5%), diglycosyldiacylglycerol (DGDG, 19,6 - 44,1%), sulphoquinovosyldiacylglycerol (SQDG, 17,5 - 51,7%) và các phospholipid chính (PC, PG, PE).
  • Waldemar và cộng sự (1993) khảo sát lipid của hơn 100 loài thuộc 16 họ rong Nâu bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC), chỉ ra sự phân bố của phosphatidylcholine (PC) và diacylglycerylhydroxymethyltrimethyl-β-alanine (DGTA) có ý nghĩa như dấu hiệu hóa phân loại học.
  • Khotimchenko (2002) khảo sát hàm lượng lipid tổng và axit béo của rong biển Thái Bình Dương, chỉ ra sự hiện diện của AA ở 7/7 loài rong Đỏ (5,3 - 23,4%), 9/9 loài rong Nâu (7,9 - 18,6%) và 3/3 loài rong Lục (0,3 - 1,2%).
  • Ohta và cộng sự chứng minh sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG) phân lập từ loài rong Đỏ Gigartina tenella có khả năng ức chế DNA-polymerase dạng α, β và terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) ở động vật có vú. Wang và cộng sự (2007) phân lập SQDG từ loài rong Lục Caulerpa racemosa có hoạt tính ức chế virus HSV-2 với giá trị $\text{IC}_{50} = 15\ \mu\text{g/ml}$.
  • Melha Kendel và cộng sự (2015) nghiên cứu lipid của Ulva armoricana và Solieria chordalis, xác định MGDG và DGDG có hoạt tính chống tăng sinh trên dòng tế bào ung thư NSCLC-N6 với $\text{IC}_{50}$ lần lượt là $23\ \mu\text{g/ml}$ và $24\ \mu\text{g/ml}$.
  • Masaki Honda và cộng sự (2016) nghiên cứu glycerolipid trong loài Gracilaria vermiculophylla, xác định các phân tử glycerolipid chính chứa gốc 20:4n-6/20:4n-6 và 20:4n-6/16:0 đóng vai trò cơ chất cho quá trình chuyển hóa thành prostaglandin.
  • Costa và cộng sự (2017, 2019) sử dụng phương pháp khối phổ phân giải cao HILIC-MS và MS/MS xác định 147 dạng phân tử trong chi Gracilaria và 187 dạng phân tử trong loài Fucus vesiculosus, kết hợp phân tích cấu tử chính (PCA) để chỉ ra sự phân nhóm lipid theo mùa.
  • Các nghiên cứu về chi Lobophora và Halimeda: Castro và cộng sự phân tích polysaccharide sulfat từ Lobophora variegata có hoạt tính độc tế bào HT-29; Stephan Kremb và cộng sự chứng minh dịch chiết Lobophora variegata ức chế sự xâm nhập của virus HIV-1; Vieira và cộng sự (2017, 2019) tổng kết 49 công trình với 22 hợp chất tinh khiết từ L. variegata; Paul và cộng sự phân lập halimedatrial từ Halimeda incrassata và H. scabra có hoạt tính ức chế phân bào; Rivero (2003), Alexis (2011), Ariana (2012) và Nor Afifah Supardy (2011) công bố hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ thần kinh và chống xơ vữa động mạch của các loài thuộc chi Halimeda.
  1. Nghiên cứu trong nước về thành phần hóa học và lipid rong biển:
  • Lâm Ngọc Trâm và cộng sự (1991) khảo sát thành phần hóa học rong biển Phú Yên, Khánh Hòa; Huỳnh Quang Năng, Bùi Minh Lý và cộng sự (2004) nghiên cứu carrageenan từ các loài Kappaphycus và Eucheuma; đề tài cấp Nhà nước KC.15 nghiên cứu chế phẩm SALAMIN hỗ trợ điều trị ung thư từ rong biển.
  • Nguyễn Duy Nhứt và cộng sự (2008) nghiên cứu công nghệ chiết tách fucoidan quy mô pilot; Trần Vĩnh Thiện và cộng sự (2010) nghiên cứu cấu trúc alginate; Phạm Đức Thịnh (2015), Võ Mai Như Hiếu (2016) và Bùi Văn Nguyên (2018) nghiên cứu cấu trúc polysaccharide, fucoidan và các hợp chất phenolic từ các loài rong Nâu Việt Nam.
  • Lê Tất Thành, Phạm Quốc Long và cộng sự (2011 đến nay) khảo sát lipid trên 70 mẫu rong Đỏ Việt Nam (hàm lượng lipid đạt 0,12 - 1,39% khối lượng tươi), xác định 12 axit béo chính, sử dụng PCA phân biệt 3 họ Gracilariaceae, Hypneaceae, Ceramiaceae, phát hiện prostaglandin PGE2 và PGE3 trong loài Gracilaria vermiculophylla.

Vị trí của luận án: Kế thừa các kết quả sàng lọc hóa sinh truyền thống, luận án là công trình đầu tiên tại Việt Nam tiếp cận phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối khối phổ phân giải cao (HPLC-HRMS trên hệ thống LCMS-IT-TOF) để giải mã toàn diện các dạng phân tử lipid phân cực (phospholipid, glycolipid, betaine lipid) của hai loài rong biển đặc thù vùng đảo xa bờ (Lobophora sp. tại Côn Đảo và Halimeda incrassata Lamx. tại Quần đảo Trường Sa), kết hợp đánh giá hoạt tính sinh học định hướng ứng dụng dược liệu và bảo tồn tài nguyên biển đảo.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án dựa trên cơ sở hóa sinh và hóa học cấu trúc lipid:

  • Phân loại lipid theo cấu trúc khung liên kết (dạng glycerin và dạng sphingosine). Lipid trung tính gồm hydrocacbon (HC), sáp (W), sterol (ST, tiêu biểu là fucosterol trong rong Nâu), axit béo tự do (FFA), triacylglycerol (TG), diacylglycerol (DG), monoalkyldiacylglycerol (MADG).
  • Lipid phân cực (Pol) gồm 3 phân lớp chính:
    • Glycolipid: monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), digalactosyldiacylglycerol (DGDG), sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG).
    • Phospholipid: phosphatic acid (PA), phosphatidylglycerol (PG), phosphatidylcholine (PC), phosphatidylinositol (PI), phosphatidylethanolamine (PE), phosphatidylserine (PS).
    • Betaine lipid: diacylglycerylhydroxymethyl-N,N,N-trimethyl-β-alanine (DGTA) và diacylglyceryl-N,N,N-trimethylhomoserine (DGTS).
  • Danh pháp và quy tắc cấu trúc axit béo: axit béo no, axit béo không no một nối đôi (oleic 18:1n-9), axit béo không no nhiều nối đôi họ omega-3 (EPA 20:5n-3, DHA 22:6n-3) và họ omega-6 (AA 20:4n-6, GLA 18:3n-6).

Phương pháp thực nghiệm và kỹ thuật phân tích:

Hạng mục phân tích Kỹ thuật / Thiết bị thực nghiệm Điều kiện / Quy trình xử lý
Chiết xuất lipid tổng Phương pháp Bligh & Dyer cải tiến kết hợp siêu âm Dung môi $\text{CHCl}_3/\text{MeOH}$ (tỷ lệ 2:1, v/v), siêu âm 3 lần $\times$ 30 phút trên máy Elmasonic S100H (37 kHz), loại màu bằng sắc ký cột silica gel (cỡ hạt 0,040 - 0,063 mm).
Phân tích các lớp chất lipid Sắc ký lớp mỏng (TLC) định lượng trên máy quét mật độ quang Bản mỏng tráng sẵn Sorbfil ($6\text{ cm} \times 6\text{ cm}$, LB Nga). Hệ dung môi lipid trung tính: n-hexan/dietyl ete/axit axetic (85:15:1); hệ lipid phân cực: $\text{CHCl}_3/\text{MeOH}/\text{CH}_3\text{COOH}$ (2:1:0.1). Hiện màu bằng $\text{H}_2\text{SO}_4\ 10%$, quét trên máy Epson Perfection 2400 PHOTO, tính toán bằng phần mềm Sorbfil TLC Videodensitometer.
Thành phần axit béo Sắc ký khí (GC) và sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) Chuyển vị este hóa sang dạng FAME bằng $\text{H}_2\text{SO}_4\ 2%/\text{MeOH}$ ở $80^\circ\text{C}$ trong 2 giờ. Máy Shimadzu GC-2010 và GCMS-QP5050A (nhiệt độ lò $160 - 240^\circ\text{C}$, tốc độ $2^\circ\text{C/phút}$, khí mang He $20\text{ ml/phút}$). Tính chỉ số thời gian lưu tương đương (ECL) dựa trên C16:0 và C18:0, tra cứu thư viện phổ NIST.
Xử lý thống kê đa biến Phân tích cấu tử chính (PCA) Phần mềm SAS-JMP Statistical Discovery Pro phiên bản 13.2.1 để phân nhóm dữ liệu thành phần axit béo và phân loại mẫu.
Xác định dạng phân tử lipid phân cực Sắc ký lỏng hiệu năng cao kết nối khối phổ phân giải cao (HPLC-HRMS) Hệ thống Shimadzu LCMS-IT-TOF, cột phân tích Shim-Pack diol ($50\text{ mm} \times 4,6\text{ mm}$, hạt $5\ \mu\text{m}$). Dung môi A: n-hexan/2-propanol/axit formic/triethylamine (82/17/1/0,08); Dung môi B: 2-propanol/$\text{H}_2\text{O}$/axit formic/triethylamine (85/14/1/0,08). Chế độ ion hóa ESI chuyển đổi đồng thời ion dương (+4,5 kV) và ion âm (-3,5 kV), dải quét m/z 100 - 1200, khí va chạm Argon (0,003 Pa), phân tích mảnh $\text{MS}^n$ ($n=1-4$) trên phần mềm Shimadzu LC-MS (v.361).
Hoạt tính bẫy gốc tự do Thử nghiệm DPPH in vitro Đo độ hấp thụ quang phổ ở bước sóng 515 nm trên đầu đọc máy ELISA theo phương pháp Brand-Williams và cộng sự.
Hoạt tính kháng vi sinh vật Phương pháp khuếch tán đĩa thạch Thực hiện theo quy trình chuẩn của Vlietinck A. trên các chủng vi khuẩn và nấm kiểm định.
Hoạt tính độc tế bào ung thư Phép thử SRB (Sulforhodamine B) in vitro Đo mật độ quang học (OD) của protein tế bào nhuộm màu SRB trên các dòng tế bào ung thư theo phương pháp của Monks A. (2011).
Hoạt tính kháng viêm Đo khả năng ức chế sinh NO Kích thích tế bào RAW 264.7 bằng LPS, định lượng NO tạo thành bằng thuốc thử Griess (Promega, USA) theo phương pháp của Liao H., Combet S.

Nguồn tư liệu và mẫu vật: 60 mẫu rong biển được thu thập trực tiếp ngoài thực địa tại 5 vùng biển/tỉnh của Việt Nam, phân loại và định danh hình thái học bởi PGS. Đàm Đức Tiến. Mẫu tiêu bản khô và ướt được lưu giữ chính thức tại Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên và Viện Tài nguyên & Môi trường Biển (Hải Phòng).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan về rong biển và lipid rong biển

Chương này tổng kết toàn diện cơ sở lý luận về phân loại học rong biển, đặc điểm sinh học và sinh thái phân bố của các loài rong biển tại Việt Nam. Tác giả phân tích cấu trúc hóa học và tiềm năng ứng dụng của các hợp chất thiên nhiên biển chính:

  • Nhóm đường đơn (monosaccharide) tiêu biểu là mannitol (hàm lượng ở vùng biển phía Nam cao hơn phía Bắc, tăng cao vào mùa hè) được ứng dụng trong dược phẩm và công nghiệp thực phẩm.
  • Nhóm polysaccharide mạch cao gồm: laminaran (chống đông tụ máu, tăng cường miễn dịch, bảo vệ cơ thể trước bức xạ), agar (tạo gel, môi trường nuôi cấy vi sinh), alginate (tẩy xạ kim loại nặng như strontium, chống oxy hóa), carrageenan (chất tạo gel từ rong Đỏ), và fucoidan (polysaccharide sulfat hóa từ rong Nâu có tác dụng ức chế tế bào ung thư, kháng virus, kháng đông máu).
  • Trình bày chi tiết lý thuyết cấu trúc phân tử lipid: phân loại lipid trên cơ sở khung glycerin (triglyceride, diacylglycerol, monoalkyldiacylglycerol, phospholipid, glycolipid) và khung sphingosine (ceramide, sphingolipid); vai trò sinh học của các axit béo không no thiết yếu họ omega-3 (EPA, DHA) và omega-6 (AA).
  • Tổng kết tình hình nghiên cứu lipid rong biển trên thế giới và ở Việt Nam; nguyên lý hoạt động của thiết bị khối phổ bẫy ion tứ cực kết hợp thời gian bay (LCMS-IT-TOF) và khả năng ứng dụng trong việc giải mã cấu trúc dạng phân tử lipid phức tạp bằng kỹ thuật phân mảnh ion đa bậc ($\text{MS}^n$).

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết danh mục mẫu, địa điểm, thời gian thu thập và các phương pháp nghiên cứu:

  • Thống kê chi tiết 60 mẫu rong biển thuộc 50 loài, phân bổ trong 14 họ:
    • Ngành rong Đỏ (Rhodophyta): 20 mẫu, thuộc các họ Hypneaceae (các loài Hypnea panosa, H. valentiae, H. nidulans, H. fragelliformis), Gracilariaceae (Gracilaria salicornia, G. tenuistipitata, G. arcuata), Phyllophoraceae (Ahnfeltiopsis divaricata), Galaxauraceae (Galaxaura fastigiata), Rhodomelaceae (Palisada parvipapillata, Acanthophora spicifera, Laurencia obtusa), Schizymeniaceae (Titanophora pulchra).
    • Ngành rong Nâu (Phaeophyta): 31 mẫu, thuộc các họ Dictyotaceae (Stypopodium flabelliforme, Spatoglossum vietnamense, Dictyopteris jamaicensis, Lobophora sp., Padina australis, Spatoglossum pacificum, Dictyota indica), Sargassaceae (18 mẫu đại diện cho các loài thuộc chi Sargassum như S. binderi, S. echinocarpum, S. ilicifolium, S. polycystum, S. heterocystum, S. mcclurei, S. paniculatum, S. feldmanii, S. angustifolium, S. incanum, S. longifructum, S. crassifolium, S. tortile, S. glaucescens, S. congkinhii, S. gracile và loài Turbinaria ornata), Scytosiphonaceae (Chnoospora implexa).
    • Ngành rong Lục (Chlorophyta): 9 mẫu, thuộc các họ Ulvaceae (Ulva compressa, Ulva fasciata), Caulerpaceae (Caulerpa racemosa, C. sertularioides), Halimedaceae (Halimeda discoidea, Halimeda incrassata), Cladophoraceae (Chaetomorpha capillaris), Valoniaceae (Valonia fastigiata).
  • Quy trình thu gom mẫu vùng triều và dưới triều bằng thiết bị lặn SCUBA, chụp ảnh dưới nước; quy trình xử lý sạch mẫu bằng nước biển và nước ngọt, bảo quản lạnh sâu ở $-20^\circ\text{C}$ và $-47^\circ\text{C}$.
  • Thiết lập quy trình chiết xuất lipid tổng bằng phương pháp Bligh & Dyer cải tiến có hỗ trợ sóng siêu âm, sắc ký cột loại bỏ sắc tố quang hợp, phương pháp metyl hóa axit béo và các phép thử hoạt tính sinh học in vitro.

Chương 3: Thực nghiệm

Chương 3 trình bày chi tiết các thông số kỹ thuật thực nghiệm, quy trình thao tác và phương pháp phân tích dữ liệu:

  • Chiết tách định lượng: Xử lý 50 g mẫu rong tươi, xay nhỏ, chiết bằng $150\text{ ml}\ \text{CHCl}_3/\text{MeOH}$ (2:1, v/v), siêu âm 3 lần (30 phút/lần, tần số 37 kHz), lọc dịch chiết, chiết bã lần hai với $50\text{ ml}\ \text{CHCl}_3$, tách pha với $40\text{ ml}\ \text{H}_2\text{O}$, làm khan pha hữu cơ bằng $\text{Na}_2\text{SO}_4$, cô quay chân không trên máy Eyela N1300, cân phân tích Sartorius (độ chính xác $10^{-4}\text{ g}$), lặp lại 3 lần lấy giá trị trung bình.
  • Metyl hóa và chạy GC/GC-MS: Lấy 10 mg lipid tổng ủ với $2\text{ ml}\ \text{H}_2\text{SO}4\ 2%/\text{CH}3\text{OH}$ ở $80^\circ\text{C}$ trong 2 giờ, chiết FAME bằng n-hexan, làm sạch qua bản mỏng TLC (hexan:dietyl ete 95:5). Phân tích FAME trên máy Shimadzu GC-2010 và GCMS-QP5050A, tính giá trị ECL theo công thức: $$\text{ECL} = \frac{2(\lg \text{RT}x - \lg \text{RT}{16:0})}{\lg \text{RT}{18:0} - \lg \text{RT}{16:0}} \pm 16$$
  • Phân tích HPLC-HRMS trên cột Shim-Pack diol: Thiết lập khoảng thời gian lưu ($\text{R}_t$) và thứ tự xuất hiện đặc trưng của từng nhóm lipid phân cực làm cơ sở khoanh vùng nhận diện:
Phân lớp lipid Nhóm chất lipid Khoảng thời gian lưu $\text{R}_t$ (phút)
Phospholipid Phosphatic acid (PA) 3,5 - 5,6
Phosphatidylglycerol (PG) 5,4 - 6,8
Phosphatidylcholine (PC) 7,5 - 11,0
Phosphatidylinositol (PI) 16,5 - 20,0
Glycolipid Monogalactosyldiacylglycerol (MGDG) 2,5 - 3,5
Digalactosyldiacylglycerol (DGDG) 8,5 - 14,0
Sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG) 10,0 - 16,0
Betaine lipid Diacylglyceryl-N,N,N-trimethylhomoserine (DGTS) 3,5 - 5,5
Diacylglycerylhydroxymethyltrimethyl-β-alanine (DGTA) 4,5 - 7,0
  • Phương pháp xác định cấu trúc dạng phân tử: Sử dụng 5 dấu hiệu nhận dạng:
    1. Thời gian lưu chuẩn trên cột diol.
    2. Sự xuất hiện của ion phân tử âm $[\text{M}-\text{H}]^-$ hoặc ion cộng $[\text{M}+\text{adduct}]^-$ trên Event 3; ion dương $[\text{M}+\text{H}]^+$ hoặc $[\text{M}+\text{Na}]^+$ trên Event 1.
    3. Quy tắc nitrogen đối với khối lượng ion.
    4. Vùng khối lượng phân tử đặc trưng theo cấu trúc khung đuôi kỵ nước.
    5. Công thức phân tử và sự phân mảnh đặc trưng của các gốc axit béo trên phổ $\text{MS}^2$, $\text{MS}^3$.
    • Ví dụ minh chứng trong văn bản:
      • Dạng phân tử PA trong loài rong Nâu Lobophora sp. chỉ có 01 dạng duy nhất tại $\text{R}t = 4,37\text{ phút}$: PA 40:8 với $[\text{M}-\text{H}]^-$ tại $m/z\ 743,4609$, mảnh $\text{MS}^2$ tại $m/z\ 457,2260\ [\text{M}-\text{H}-\text{C}{20}\text{H}{30}\text{O}]^-$, $439,2215\ [\text{M}-\text{H}-\text{C}{20}\text{H}{32}\text{O}2]^-$ và $303,2243\ [\text{C}{20}\text{H}{31}\text{O}_2]^-$. Trong khi đó loài rong Lục Halimeda incrassata không có dạng phân tử PA.
      • Dạng phân tử PG trong loài Lobophora sp. xác định được 22 dạng phân tử (từ PG 30:1, PG 30:0, PG 32:2, PG 32:1, PG 32:0, PG 34:4, PG 34:3, PG 34:2, PG 34:1, PG 36:6, PG 36:5 đến PG 36:4) với đầy đủ dữ kiện thời gian lưu, khối lượng ion $[\text{M}-\text{H}]^-$ và các mảnh phân cắt ion $\text{MS}^2$.

Chương 4: Kết quả và thảo luận

Chương này tổng hợp các kết quả thực nghiệm đạt được:

  • Kết quả sàng lọc hàm lượng lipid tổng và các lớp chất lipid ở 60 mẫu rong biển: Đánh giá sự biến thiên hàm lượng lipid theo ngành, loài và vùng địa lý; xác định tỷ lệ các lớp chất lipid trung tính và lipid phân cực qua phân tích sắc ký bản mỏng (TLC-Videodensitometer).
  • Thành phần và hàm lượng các axit béo: Phân tích phổ GC và GC-MS xác định sự phân bố của các axit béo bão hòa (C14:0, C16:0, C18:0), axit béo không no một nối đôi (C16:1n-7, C18:1n-9, C18:1n-7) và các axit béo không no đa nối đôi thiết yếu (C18:2n-6, C18:3n-3, C20:4n-6, C20:5n-3, C22:6n-3).
  • Kết quả phân tích cấu tử chính (PCA): Ứng dụng phần mềm SAS-JMP để phân nhóm 60 mẫu rong biển dựa trên bộ dữ liệu thành phần axit béo, xác định các nhóm loài có tính chất hóa sinh gần gũi, hỗ trợ công tác hóa phân loại học rong biển Việt Nam.
  • Kết quả phân tích dạng phân tử lipid phân cực chi tiết bằng HPLC-HRMS trên hai loài chọn lọc:
    • Đối với loài rong Nâu Lobophora sp. (Côn Đảo): Xác định đầy đủ thành phần các dạng phân tử thuộc các phân lớp Phospholipid (PA, PG, PC, PI), Glycolipid (MGDG, DGDG, SQDG) và Betaine lipid (DGTA, DGTS), chứng minh sự hiện diện áp đảo của các dạng phân tử chứa axit béo không no nhiều nối đôi (đặc biệt là gốc C20:4).
    • Đối với loài rong Lục Halimeda incrassata Lamx. (Trường Sa Lớn): Xác định thành phần các dạng phân tử lipid phân cực đặc trưng, ghi nhận sự khác biệt về sự vắng mặt của phân lớp PA và đặc điểm phân bố các dạng phân tử glycolipid, betaine lipid so với ngành rong Nâu.
  • Đánh giá hoạt tính sinh học in vitro:
    • Hoạt tính bẫy gốc tự do DPPH: Phân đoạn lipid thể hiện khả năng quét gốc tự do ở các mức nồng độ khảo sát.
    • Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định: Đánh giá trên các chủng vi khuẩn Gram (+), Gram (-) và nấm men/nấm mốc.
    • Hoạt tính gây độc tế bào ung thư: Đánh giá độ nhạy trên các dòng tế bào ung thư thử nghiệm theo phương pháp SRB.
    • Hoạt tính kháng viêm: Xác định mức độ ức chế sản sinh oxit nitric (NO) trên dòng tế bào đại thực bào RAW 264.7 khi bị kích thích bởi LPS.

Kết quả và những đóng góp mới

Các đóng góp mới về mặt lý luận và khoa học:

  1. Xây dựng bộ cơ sở dữ liệu hóa sinh có hệ thống về hàm lượng lipid tổng, tỷ lệ các lớp chất lipid và thành phần axit béo chi tiết của 60 mẫu đại diện cho 50 loài rong biển thuộc 14 họ của 3 ngành rong Đỏ, rong Nâu và rong Lục tại các vùng sinh thái biển Việt Nam.
  2. Ứng dụng phương pháp phân tích cấu tử chính (PCA) trên phần mềm SAS-JMP xử lý số liệu thành phần axit béo của 60 mẫu rong biển, tạo công cụ khách quan hỗ trợ phân loại học và làm rõ mối tương quan giữa đa dạng sinh học và đa dạng hóa học của khu hệ rong biển Việt Nam.
  3. Là công trình đầu tiên ứng dụng thành công kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao kết nối phổ khối phân giải cao (HPLC-HRMS trên hệ LCMS-IT-TOF) với chế độ quét ion kép ESI (+/-) và phân mảnh $\text{MS}^n$ để nhận dạng định tính và bán định lượng hàng loạt dạng phân tử lipid phân cực (phospholipid, glycolipid, betaine lipid) mà không cần qua quy trình phân lập đơn chất phức tạp.
  4. Phát hiện và công bố bộ dữ liệu cấu trúc dạng phân tử lipid phân cực cùng hoạt tính sinh học in vitro (chống oxy hóa, kháng khuẩn, độc tế bào ung thư, kháng viêm) của hai đối tượng rong biển đặc thù vùng đảo xa bờ: loài mới Lobophora sp. (Côn Đảo) và loài Halimeda incrassata Lamx. (Quần đảo Trường Sa).

Các đóng góp về mặt thực tiễn và kiến nghị:

  • Cung cấp luận cứ khoa học phục vụ công tác quy hoạch, bảo tồn nguồn gen, nuôi trồng và khai thác bền vững tài nguyên rong biển Việt Nam.
  • Khẳng định giá trị dược liệu của lipid và các axit béo không no nhiều nối đôi từ rong biển, mở ra hướng ứng dụng các phân đoạn lipid giàu hoạt tính sinh học trong sản xuất thực phẩm chức năng và dược phẩm hỗ trợ điều trị bệnh.
  • Việc nghiên cứu và công bố các số liệu khoa học mới về mẫu sinh vật thu thập tại vùng biển Côn Đảo và Quần đảo Trường Sa góp phần bổ sung cứ liệu khoa học khẳng định chủ quyền biển đảo và toàn vẹn lãnh thổ quốc gia.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu:

  • Nghiên cứu sàng lọc tập trung trên 60 mẫu của 50 loài rong biển tự nhiên thu thập trong các đợt khảo sát từ năm 2015 đến 2017 tại một số vùng biển đại diện, chưa bao phủ toàn bộ hơn 800 loài rong biển hiện diện tại Việt Nam.
  • Việc phân tích chuyên sâu cấu trúc dạng phân tử lipid phân cực bằng HPLC-HRMS và đánh giá hoạt tính sinh học mới được thực hiện tập trung trên 2 loài đại diện chọn lọc (Lobophora sp. và Halimeda incrassata Lamx.).
  • Các phép thử hoạt tính sinh học mới được thực hiện ở quy mô in vitro, chưa triển khai các thử nghiệm cơ chế sâu hơn trên mô hình in vivo.

Hướng nghiên cứu tiếp theo:

  • Mở rộng kỹ thuật phân tích HPLC-HRMS để giải mã dạng phân tử lipid phân cực cho các loài rong biển có giá trị kinh tế và sinh khối lớn khác thuộc các chi Gracilaria, Sargassum, Ulva.
  • Nghiên cứu biến động hàm lượng lipid và thành phần dạng phân tử theo mùa vụ sinh trưởng và điều kiện môi trường nuôi trồng tại Việt Nam.
  • Triển khai thử nghiệm hoạt tính sinh học in vivo và nghiên cứu công nghệ bào chế các sản phẩm thực phẩm chức năng giàu lipid phân cực và PUFA từ nguồn nguyên liệu rong biển Việt Nam.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên khảo có giá trị cao đối với:

  • Giảng viên, nghiên cứu sinh và học viên cao học chuyên ngành Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Hóa sinh học biển, Dược liệu học và Sinh học thực vật biển.
  • Các nhà nghiên cứu phân loại sinh vật biển trong việc ứng dụng phương pháp hóa phân loại học (chemotaxonomy) và phân tích thống kê đa biến (PCA) để hỗ trợ phân định loài.
  • Các kỹ thuật viên và chuyên viên phân tích phổ khối: quy trình phân tích dạng phân tử lipid phân cực trên hệ thống LCMS-IT-TOF với cột Diol, các khoảng thời gian lưu chuẩn, quy tắc nhận diện ion và cơ chế phân mảnh $\text{MS}^n$ tại Chương 3 là quy trình thực nghiệm có tính ứng dụng thực tế cao.
  • Các nhà hoạch định chính sách quản lý tài nguyên biển đảo, các viện nghiên cứu và doanh nghiệp phát triển sản phẩm chăm sóc sức khỏe từ dược liệu biển.

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án đã khảo sát tổng cộng bao nhiêu mẫu rong biển và thuộc những nhóm phân loại nào?
Luận án đã thu thập và khảo sát 60 mẫu rong biển tự nhiên thuộc 50 loài, đại diện cho 14 họ của cả 3 ngành rong chính ở Việt Nam gồm: ngành rong Đỏ (Rhodophyta - 20 mẫu), ngành rong Nâu (Phaeophyta - 31 mẫu) và ngành rong Lục (Chlorophyta - 9 mẫu).

2. Hai loài rong biển nào được tác giả lựa chọn để nghiên cứu chuyên sâu về cấu trúc dạng phân tử lipid phân cực và hoạt tính sinh học? Lý do lựa chọn là gì?
Hai loài được lựa chọn là loài rong Nâu Lobophora sp. (thu tại Côn Đảo ở độ sâu 3-5 m trên nền san hô chết) và loài rong Lục Halimeda incrassata Lamx. (thu tại đảo Trường Sa Lớn thuộc Quần đảo Trường Sa). Lý do lựa chọn: đây là hai loài đại diện cho các vùng đảo xa bờ đặc thù của Việt Nam; Lobophora sp. là loài thứ hai thuộc chi Lobophora và là loài mới được phát hiện lần đầu tại Việt Nam; Halimeda incrassata là loài thực vật biển có khả năng tạo rạn $\text{CaCO}_3$ cao (35-45%) và trên thế giới đang được quan tâm nghiên cứu về hoạt tính sinh học, nhưng cả hai loài đều chưa từng có công bố nào về thành phần dạng phân tử lipid phân cực.

3. Kỹ thuật khối phổ nào được sử dụng để xác định các dạng phân tử lipid phân cực trong luận án?
Tác giả sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao kết nối phổ khối phân giải cao (HPLC-HRMS) trên thiết bị LCMS-IT-TOF của hãng Shimadzu (kết hợp công nghệ bẫy ion tứ cực QIT và thời gian bay TOF), sử dụng cột Shim-Pack diol ($50\text{ mm} \times 4,6\text{ mm}$, cỡ hạt $5\ \mu\text{m}$), hoạt động ở chế độ ion hóa phun mù điện tử (ESI) với khả năng nhận dạng đồng thời ion dương và ion âm, phân mảnh $\text{MS}^n$ ($n=1-4$) để xác định công thức phân tử và vị trí liên kết của các gốc acyl.

4. Dấu hiệu thực nghiệm để nhận dạng phân lớp Phosphatic acid (PA) trên hệ thống LCMS-IT-TOF trong luận án là gì?
Để nhận dạng dạng phân tử PA, tác giả căn cứ vào 5 dấu hiệu: (i) Thời gian lưu $\text{R}_t$ trên cột diol nằm trong khoảng 3,5 - 5,6 phút; (ii) Xuất hiện ion âm $[\text{M}-\text{H}]^-$ trên Event 3 với giá trị $m/z$ là số lẻ theo quy tắc nitrogen; (iii) Khối lượng phân tử nằm trong khoảng $m/z\ 600 - 1000$; (iv) Công thức phân tử có dạng $-\text{O}_8\text{P}$ hoặc $-\text{O}_7\text{P}$; (v) Phổ phân mảnh $\text{MS}^2$ cho các mảnh ion mất gốc axit béo đặc trưng.

5. Hoạt tính sinh học in vitro của các phân đoạn lipid từ hai loài rong biển chọn lọc được đánh giá qua những mô hình thử nghiệm nào?
Được đánh giá qua 4 mô hình thử nghiệm in vitro tiêu chuẩn: (1) Hoạt tính bẫy gốc tự do DPPH đo ở bước sóng 515 nm; (2) Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định theo phương pháp khuếch tán đĩa thạch; (3) Hoạt tính gây độc tế bào ung thư theo phương pháp đo protein tổng số bằng nhuộm Sulforhodamine B (SRB); (4) Hoạt tính kháng viêm thông qua khả năng ức chế sản sinh oxit nitric (NO) trên dòng tế bào đại thực bào RAW 264.7 được kích thích bởi LPS.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Phạm Thu Huế đã hoàn thành công trình nghiên cứu hệ thống về thành phần hóa sinh và hoạt tính sinh học của lipid trên 60 mẫu thuộc 50 loài rong biển Việt Nam. Luận án đã ứng dụng thành công kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối khối phổ phân giải cao (HPLC-HRMS trên hệ LCMS-IT-TOF) để giải mã cấu trúc các dạng phân tử lipid phân cực của loài mới Lobophora sp. thu tại Côn Đảo và loài Halimeda incrassata Lamx. thu tại Quần đảo Trường Sa. Các kết quả đạt được cung cấp nguồn dữ liệu khoa học thực nghiệm có độ tin cậy cao, đóng góp quan trọng cho lĩnh vực hóa học các hợp chất thiên nhiên biển, hóa phân loại học và định hướng sử dụng hiệu quả, bền vững tài nguyên sinh vật biển Việt Nam.