Nghiên cứu chiết tách ecdysteroid từ thông đỏ và tác động gây lột xác trên cua Scylla paramamosain

Nghiên cứu chiết tách ecdysteroid từ thông đỏ và tác động gây lột xác trên cua Scylla paramamosain trong luận văn thạc sĩ kỹ thuật hóa học.

• Tác giả: Nguyễn Văn Trí
• Người hướng dẫn: PGS. Phạm Thành Quân
• Trường học: Đại học Bách Khoa
• Chuyên ngành: Kỹ Thuật Hóa Học
• Đề tài: Chiết Tách Ecdysteroid Từ Thông Đỏ Và Tác Động Lên Cua Scylla Paramamosain
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Tp. Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• DANH MỤC HÌNH ẢNH
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Giới thiệu chung về cây thông đỏ lá dài (Taxus wallichiana)
• 1.1.1. Đặc điểm thực vật
• 1.2. Giới thiệu về ecdysteroid
• 1.3. Giới thiệu chung về β-ecdysone
• 1.3.1. Công thức cấu tạo và danh pháp
• 1.3.2. Tính chất vật lý
• 1.3.3. Ứng dụng của β-ecdysone
• 1.4. Giới thiệu sinh lý lột xác của cua
• 1.4.1. Sinh lý lột xác của cua
• 1.4.2. Đặc điểm quá trình lột xác của cua
• 1.5. Phương pháp cô lập các hợp chất hữu cơ
• 1.5.1. Sắc ký phân bố - sắc ký cột
• 1.5.2. Phương pháp chiết lỏng – lỏng
• 2. CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM
• 2.1. Nội dung nghiên cứu
• 2.2. Vật liệu, hóa chất sử dụng
• 2.3. Quy trình thực hiện
• 2.3.1. Chiết tách, tinh sạch β-ecdysone từ cao methanol
• 2.3.2. Nghiên cứu quy trình chiết xuất ecdysteroid và chiết 500g cao ecdysteroid bán thành phẩm ở quy mô pilot
• 2.3.3. Nghiên cứu phối trộn chế phẩm chứa ecdysteroid bổ sung vào thức ăn cho cua
• 2.4. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở kiểm nghiệm cao trung gian và chế phẩm đã phối trộn
• 2.5. Khảo sát hoạt tính kích thích lột xác cua ở mô hình thí nghiệm
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Chiết tách, tinh sạch β-ecdysone từ cao tổng
• 3.1.1. Chạy cột sắc ký phân bố
• 3.1.2. Sắc ký hấp phụ cột silica gel
• 3.2. Nghiên cứu quy trình chiết xuất ecdysteroid và chiết 500 g cao ecdysteroid bán thành phẩm ở quy mô pilot
• 3.2.1. Kết quả chạy cột Diaion HP-20
• 3.2.2. Lắc phân bố với ethyl acetate
• 3.2.3. Định lượng β-ecdysone bằng phương pháp HPLC
• 3.3. Nghiên cứu phối trộn chế phẩm chứa Ecdysteroid bổ sung vào thức ăn cho cua
• 3.3.1. Phối trộn cao chứa ecdysteroid vào thành phần thức ăn cho cua
• 3.3.2. Đánh giá tính chất hóa lý của viên thức ăn thành phẩm
• 3.4. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở kiểm nghiệm cao bán thành phẩm và viên thức ăn thành phẩm có bổ sung ecdysteroid
• 3.4.1. Độ ẩm của cao bán thành phẩm và chế phẩm đã phối trộn
• 3.4.2. Định tính ecdysteroid bằng SKLM trong cao bán thành phẩm và viên thức ăn thành phẩm có bổ sung ecdysteroid
• 3.5. Khảo sát hoạt tính kích thích lột xác trên cua ở mô hình thí nghiệm
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về ecdysteroid

Ecdysteroid là hormone lột xác quan trọng trong quá trình phát triển của côn trùng, bao gồm các hợp chất như ecdysone và 20-hydroxyecdysone. Ecdysteroid đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh sự lột xác, biến thái và sinh sản của côn trùng. Bên cạnh đó, ecdysteroid cũng đã được phát hiện trong một số loài động vật giáp xác như tôm và cua. Đến nay, khoảng 2% các loài thực vật đã được nghiên cứu cho sự hiện diện của ecdysteroid, với hơn 300 hợp chất được xác định. Ecdysteroid có khả năng gây rối loạn sự phát triển của côn trùng, từ đó có thể sử dụng làm thuốc trừ sâu an toàn cho môi trường. Hơn nữa, ecdysteroid cũng cho thấy tác động tích cực lên động vật có vú, kích thích tổng hợp protein và có thể hỗ trợ trong việc điều trị một số bệnh như đái tháo đường và làm lành vết thương. Những ứng dụng này cho thấy tiềm năng to lớn của ecdysteroid trong nông nghiệp và y học.

II. Chiết tách β ecdysone từ thông đỏ

Quy trình chiết tách β-ecdysone từ cao lá thông đỏ (Taxus wallichiana) đã được thực hiện thành công. Phương pháp lắc phân bố với ethyl acetate cho hiệu suất chiết xuất cao hơn so với phương pháp chạy qua cột Diaion HP-20. Kết quả cho thấy hiệu suất chiết tách đạt 0,138%. Việc chiết xuất β-ecdysone không chỉ cung cấp nguyên liệu cho nghiên cứu mà còn mở ra cơ hội phát triển các sản phẩm bổ sung dinh dưỡng cho cua. Các tiêu chuẩn kiểm nghiệm cho cao thông đỏ và chế phẩm thức ăn chứa ecdysteroid cũng đã được xây dựng, đảm bảo chất lượng sản phẩm. Độ ẩm của cao thông đỏ không vượt quá 20%, trong khi độ ẩm thức ăn cua không quá 12%. Những tiêu chuẩn này giúp đảm bảo tính ổn định và hiệu quả của sản phẩm trong nuôi trồng thủy sản.

III. Tác động của β ecdysone lên cua Scylla paramamosain

Nghiên cứu tác động của β-ecdysone lên cua Scylla paramamosain cho thấy khả năng kích thích lột xác của cua. Khi cua được cho ăn thức ăn viên bổ sung 10 ppm β-ecdysone, thời gian lột xác diễn ra sớm hơn, tập trung và đồng loạt vào khoảng 20 ngày. Kết quả thí nghiệm cho thấy tỷ lệ sống và tỷ lệ lột vỏ của cua cao hơn so với nhóm đối chứng. Điều này chứng tỏ rằng β-ecdysone có khả năng cải thiện hiệu suất lột xác, từ đó nâng cao năng suất nuôi trồng cua. Việc sử dụng β-ecdysone trong thức ăn cho cua không chỉ giúp tăng năng suất mà còn có thể giảm thời gian nuôi, mang lại lợi ích kinh tế cho người nuôi trồng thủy sản.

IV. Đánh giá giá trị thực tiễn của nghiên cứu

Nghiên cứu về chiết tách và ứng dụng β-ecdysone từ thông đỏ không chỉ có giá trị khoa học mà còn mang lại nhiều ứng dụng thực tiễn trong ngành nuôi trồng thủy sản. Việc phát triển các sản phẩm thức ăn viên bổ sung β-ecdysone có thể giúp cải thiện hiệu suất lột xác và tăng trưởng của cua, từ đó nâng cao hiệu quả kinh tế cho người nuôi. Ngoài ra, nghiên cứu cũng mở ra hướng đi mới cho việc sử dụng các hợp chất tự nhiên trong sản xuất nông nghiệp, giúp giảm thiểu việc sử dụng hóa chất độc hại trong nông nghiệp và bảo vệ môi trường. Những kết quả này sẽ góp phần thúc đẩy nghiên cứu và phát triển trong lĩnh vực sinh học và công nghệ sinh học trong tương lai.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Nuôi trồng thủy sản giáp xác, đặc biệt là mô hình sản xuất cua lột thương phẩm (Scylla paramamosain), mang lại giá trị kinh tế vượt trội nhưng đang đối mặt với rào cản lớn về chu kỳ lột xác kéo dài và tỷ lệ hao hụt cao. Trong tự nhiên, phytoecdysteroid chỉ hiện diện ở khoảng 2% các loài thực vật với hàm lượng dao động từ 0,1% đến 3% trọng lượng khô, cao hơn gấp 1000 lần so với hàm lượng tìm thấy ở côn trùng. Nguồn hoạt chất sinh học tự nhiên này mở ra giải pháp an toàn thay thế hoàn toàn các phương pháp can thiệp cơ học như cắt cuống mắt gây tổn thương mô và tăng tỷ lệ chết ở giáp xác.

Luận văn thạc sĩ chuyên ngành Kỹ thuật Hóa học tập trung giải quyết bài toán công nghệ chiết tách hợp chất $\beta$-ecdysone từ nguồn lá cây thông đỏ lá dài (Taxus wallichiana) tại Lâm Đồng và ứng dụng vào thức ăn kích thích lột xác đồng loạt trên cua biển. Nghiên cứu thực hiện tinh chế hoạt chất từ 200 gam cao chiết ban đầu, tối ưu hóa quy trình chiết tách 500 gam cao bán thành phẩm ở quy mô pilot và tiến hành thử nghiệm sinh học trên 200 cá thể cua biển tại Cần Giờ trong thời gian từ tháng 06/2019 đến tháng 12/2020.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của công trình được thể hiện qua việc xây dựng thành công bộ tiêu chuẩn cơ sở cho cao chiết và thức ăn cốm thủy sản. Kết quả ứng dụng khẩu phần bổ sung 10 ppm $\beta$-ecdysone giúp rút ngắn thời gian lột xác của cua về mốc 20 ngày nuôi, tạo bước đột phá trong việc kiểm soát chu kỳ sinh trưởng và gia tăng tỷ lệ sống cho nghề nuôi cua lột tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu vận dụng hệ trục lý thuyết nội tiết học giáp xác và hóa học các hợp chất tự nhiên. Quá trình lột xác ở động vật giáp xác chịu sự điều hòa đối kháng giữa hai nhóm nội tiết tố: hormone ức chế lột xác MIH (Molt-Inhibiting Hormone) do phức hợp cơ quan X và tuyến xoang ở cuống mắt tiết ra, và hormone kích thích lột xác ecdysteroid do cơ quan Y ở mặt bụng sản sinh. Tỷ lệ cân bằng giữa hai hormone này trong hệ bạch huyết quyết định việc kích hoạt tiến trình thay vỏ.

Sinh lý lột xác của cua trải qua 5 giai đoạn liên tục:

• Giai đoạn A (hậu lột xác, vỏ mềm, hàm lượng nước mô chiếm 86%).
• Giai đoạn B (khoáng hóa sơ cấp vỏ mới, hàm lượng nước giảm còn 83% - 85%).
• Giai đoạn C (giai đoạn gian lột xác C1 - C4, tích lũy dinh dưỡng và canxi hóa hoàn tất, hàm lượng nước giảm xuống 60%).
• Giai đoạn D (tiền lột xác D1 - D4, tái hấp thu canxi từ vỏ cũ và hình thành lớp biểu bì mới).
• Giai đoạn E (thoát vỏ cũ và trương thể tích nhờ hấp thu nước nhanh chóng).

Hợp chất hoạt tính chính được xác định là $\beta$-ecdysone (20-hydroxyecdysone) có công thức phân tử $C_{27}H_{44}O_7$, khối lượng phân tử 480 g/mol, dạng tinh thể màu trắng có nhiệt độ nóng chảy từ 241°C đến 242,5°C. Phân tử này có khả năng gắn kết đặc hiệu với thụ thể ecdysteroid nội sinh, kích hoạt phiên mã gen tổng hợp protein và enzyme tiêu giải lớp cutin cũ.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng nguồn nguyên liệu là cao methanol từ lá thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc) được thu hái tại Lâm Đồng. Cỡ mẫu thực nghiệm sinh học gồm 200 con cua khỏe mạnh, nguyên vẹn chân càng, trọng lượng đồng đều $42 \pm 2,0$ gam/con, phân bố ngẫu nhiên theo tỷ lệ đực cái 1:1 vào 4 nghiệm thức nuôi cá thể độc lập trong hệ thống bể chứa thể tích 250 đến 500 lít, độ mặn duy trì 15‰ - 18‰ và oxy hòa tan DO $\ge 4,0$ mg/lít.

Quy trình phân tích và cô lập hợp chất bao gồm:

• Sắc ký cột phân bố sử dụng chất mang hạt nhựa xốp Diaion HP-20 với diện tích bề mặt khoảng 600 m2/g, giải ly bằng hệ dung môi nước - ethanol tăng dần nồng độ (0%, 20%, 40%, 60%).
• Phương pháp chiết lỏng - lỏng phân đoạn với dung môi ethyl acetate nhằm tối ưu hóa hiệu suất thu hồi phân đoạn phân cực trung bình chứa ecdysteroid.
• Sắc ký hấp phụ cột silica gel pha thuận với hệ dung môi dichloromethane - methanol (tỷ lệ từ 100:0 đến 85:15) để tinh sạch hoạt chất.
• Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) đầu dò UV-Vis PDA tại bước sóng 244 nm, sử dụng cột pha đảo HiQ sil C18HS ($4,6 \times 250$ mm), pha động methanol - nước (40:60), tốc độ dòng 0,5 ml/phút ở 40°C. Phương pháp HPLC được lựa chọn nhờ độ chọn lọc cao, độ phân giải sắc ký $Rs > 2,0$, loại bỏ hoàn toàn các pic tạp chất từ nền mẫu thực vật phức tạp.

Dữ liệu thực nghiệm được xử lý thống kê bằng phương pháp phân tích phương sai một yếu tố ANOVA và kiểm định khoảng Duncan ở mức ý nghĩa $p < 0,05$ trên phần mềm SPSS phiên bản 18.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình nghiên cứu thực nghiệm đã ghi nhận 4 phát hiện khoa học mang tính bước ngoặt:

Thứ nhất, phân lập thành công 10 mg hợp chất $\beta$-ecdysone tinh khiết dạng tinh thể trắng từ 200 gam cao tổng lá thông đỏ. Hoạt chất được khẳng định đồng nhất với chất chuẩn đối chứng qua sắc ký lớp mỏng trên 3 hệ dung môi khác nhau, đều cho một vết đơn duy nhất phát quang ở bước sóng tử ngoại 366 nm với giá trị $Rf \approx 0,35$.

Thứ hai, so sánh hai quy trình công nghệ chiết xuất cho thấy phương pháp lắc phân bố lỏng - lỏng bằng ethyl acetate đạt hiệu suất thu hồi $\beta$-ecdysone là 0,138% (hàm lượng trong cao ethyl acetate đạt 1,026%, nồng độ 20,738 µg/ml), vượt trội hơn 89% so với phương pháp chạy cột Diaion HP-20 chỉ đạt hiệu suất 0,073%.

Thứ ba, quy trình định lượng HPLC được thẩm định đầy đủ với hệ số tương quan tuyến tính $R^2 = 0,998$ trong khoảng nồng độ 5 - 150 µg/ml. Phương pháp đạt độ đúng cao với tỷ lệ phục hồi trung bình 99,07%, độ lặp lại có độ lệch chuẩn tương đối RSD = 1,15%, hệ số đối xứng pic As dao động 0,901 - 1,085 và độ lặp lại thời gian lưu có sai số RSD chỉ 0,84%.

Thứ tư, thử nghiệm nuôi dưỡng khẳng định nghiệm thức thức ăn viên 45% đạm bổ sung 10 ppm $\beta$-ecdysone kích thích 100% cua bước vào giai đoạn lột xác đồng loạt tập trung tại thời điểm 20 ngày nuôi, trong khi nghiệm thức đối chứng (0 ppm) có chu kỳ lột xác phân tán kéo dài đến 49 ngày (7 tuần).

Thảo luận kết quả

Hiệu suất vượt trội của phương pháp lắc phân bố ethyl acetate (0,138% so với 0,073%) bắt nguồn từ tính phân cực tương đồng giữa ethyl acetate và khung cấu trúc steroid đa hydroxyl của $\beta$-ecdysone, giúp hòa tan chọn lọc và hạn chế thất thoát hoạt chất vào pha nước so với cơ chế lưu giữ trên chất mang polymer của cột Diaion HP-20.

Về mặt sinh lý học, việc bổ sung ecdysteroid ngoại sinh qua đường tiêu hóa với hàm lượng 10 ppm đã trực tiếp nâng cao nồng độ ecdysone trong dịch thể cua. Cơ chế này nhanh chóng áp chế tín hiệu ức chế từ hormone MIH của tuyến xoang cuống mắt, thúc đẩy cua chuyển nhanh từ giai đoạn gian lột C4 sang tiền lột D1 - D4 mà không cần cắt bỏ cuống mắt. So sánh với các nghiên cứu sử dụng hormone 20E nồng độ 1 ppm trên ghẹ lột (đạt tỷ lệ lột 71% - 75% sau 20 ngày), dạng thức ăn viên nhân tạo 45% đạm trong đề tài giúp hoạt chất phân tán bền vững, giảm hao hụt do hòa tan trong môi trường nước mặn 15‰ - 18‰.

Toàn bộ dữ liệu nghiên cứu có thể được trực quan hóa thông qua:

• Đồ thị hồi quy tuyến tính biểu diễn tương quan giữa diện tích đỉnh pic và nồng độ $\beta$-ecdysone chuẩn HPLC.
• Sắc ký đồ đối chứng mẫu thử cao ethyl acetate và mẫu thêm chuẩn tại bước sóng 244,78 nm.
• Biểu đồ đường tích lũy tỷ lệ lột xác của cua theo thời gian 7 tuần nuôi giữa 4 nghiệm thức (0 ppm, 1 ppm, 5 ppm và 10 ppm).
• Bảng tổng hợp tiêu chuẩn hóa lý của chế phẩm (độ ẩm cao $\le 20%$, độ ẩm thức ăn viên $\le 12%$, hàm lượng hoạt chất sau 6 tháng bảo quản không đổi).

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên kết quả thực nghiệm, 4 giải pháp công nghệ và ứng dụng thực tiễn được đề xuất:

Thứ nhất, nâng quy mô quy trình chiết tách lỏng - lỏng bằng ethyl acetate từ pilot 500 gam lên quy mô sản xuất bán công nghiệp 50 kg nguyên liệu/mẻ trong vòng 12 tháng tới. Dây chuyền do các trung tâm chiết xuất dược liệu và viện hóa học chủ trì nhằm tối ưu hóa việc thu hồi 85% - 90% lượng dung môi hữu cơ tuần hoàn.

Thứ hai, chuẩn hóa quy trình sản xuất thức ăn viên cốm 45% đạm bổ sung 10 ppm $\beta$-ecdysone tại các doanh nghiệp thức ăn thủy sản trong lộ trình 6 đến 9 tháng. Đảm bảo các chỉ tiêu chất lượng nghiêm ngặt: độ ẩm dưới 12%, độ mịn qua rây tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam V và độ rã trong nước biển duy trì trên 2 giờ để hạn chế thất thoát hoạt chất.

Thứ ba, chuyển giao quy trình nuôi cua lột trong hộp nhựa composite cá thể (mật độ 10 con/m3 nước, sục khí duy trì oxy hòa tan DO $\ge 4,0$ mg/lít) cho các hợp tác xã và hộ nuôi thủy sản tại Cần Giờ, Cà Mau và Bến Tre. Khuyến nghị áp dụng khẩu phần 10 ppm ecdysone với lượng ăn 5% trọng lượng thân/ngày để rút ngắn chu kỳ thu hoạch đồng loạt xuống 20 ngày.

Thứ tư, cơ quan quản lý và các viện nghiên cứu cần hoàn thiện bộ tiêu chuẩn kiểm nghiệm HPLC cho các dòng thức ăn kích thích lột xác giáp xác trong thời gian 18 tháng, áp dụng ngưỡng sai số độ lặp lại RSD $\le 2,0%$ nhằm kiểm soát chất lượng thương phẩm trên thị trường.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung và số liệu của luận văn mang lại giá trị thiết thực cho 4 nhóm đối tượng:

Nhóm 1: Các kỹ sư hóa dược và công nghệ hóa chất. Nhóm này có thể khai thác chi tiết quy trình chiết xuất lỏng - lỏng với ethyl acetate, kỹ thuật sắc ký cột silica gel tỷ lệ 45:1 và phương pháp thẩm định HPLC chuẩn hóa để tinh sạch các nhóm hợp chất steroid tự nhiên từ thực vật bản địa.

Nhóm 2: Các doanh nghiệp sản xuất thức ăn và chế phẩm sinh học thủy sản. Luận văn cung cấp công thức phối trộn thức ăn viên 45% đạm chứa ecdysone vi lượng (1 - 10 ppm), bảng đánh giá độ ổn định hoạt chất sau 3 và 6 tháng cùng tiêu chuẩn độ ẩm dưới 12% để thương mại hóa dòng thức ăn chuyên biệt cho cua, tôm, ghẹ.

Nhóm 3: Kỹ thuật viên và chủ trang trại nuôi trồng thủy sản công nghệ cao. Tài liệu cung cấp thông số vận hành mô hình nuôi cua lột trong hộp cá thể, chế độ kiểm soát môi trường (độ mặn 15‰ - 18‰, DO $\ge 4,0$ mg/lít) và lịch trình cho ăn chính xác để thu hoạch cua lột đồng loạt, giảm tỷ lệ ăn lẫn nhau xuống 0%.

Nhóm 4: Học viên cao học và nhà nghiên cứu chuyên ngành Nuôi trồng Thủy sản, Sinh học biển và Dược liệu. Luận văn là tài liệu tham khảo chuyên sâu về tương tác giữa phytoecdysteroid thực vật với hệ nội tiết giáp xác, cung cấp phương pháp luận kết hợp chặt chẽ giữa kỹ thuật hóa học phân tích và sinh học thực nghiệm.

Câu hỏi thường gặp

Chiết xuất $\beta$-ecdysone từ lá cây thông đỏ có ưu điểm gì vượt trội so với nguồn côn trùng hoặc tổng hợp hóa học? Nguồn thực vật như lá thông đỏ chứa hàm lượng phytoecdysteroid từ 0,1% đến 3% trọng lượng khô, cao gấp 1000 lần so với chiết xuất từ nhộng tằm hay côn trùng. Quá trình tổng hợp hóa học ecdysteroid vô cùng phức tạp với chi phí cao, do đó chiết tách từ phụ phẩm lá thông đỏ là giải pháp kinh tế và thân thiện với môi trường.

Tại sao phương pháp lắc phân bố bằng ethyl acetate lại được ưu tiên hơn sắc ký cột Diaion HP-20 ở quy mô pilot? Thực nghiệm cho thấy phương pháp lắc phân bố ethyl acetate đạt hiệu suất thu hồi 0,138%, cao gần gấp đôi mức 0,073% của cột Diaion HP-20. Ngoài ra, kỹ thuật chiết lỏng - lỏng thao tác nhanh hơn, ít tốn kém thể tích dung môi cồn và dễ dàng mở rộng công suất pilot 500 gam mà không đòi hỏi thiết bị nhồi cột phức tạp.

Cơ chế nào giúp nồng độ 10 ppm $\beta$-ecdysone kích thích cua lột xác đồng loạt vào ngày thứ 20? Hàm lượng 10 ppm hoạt chất trong khẩu phần 45% đạm cung cấp đủ lượng steroid ngoại sinh qua thành ruột vào hệ bạch huyết. Lượng hormone này trực tiếp kích hoạt cơ quan Y và ức chế tác động của hormone MIH từ cuống mắt, đẩy nhanh giai đoạn tiền lột xác D1 - D4 diễn ra đồng đều trên toàn bộ 200 cá thể thử nghiệm.

Chế phẩm thức ăn cua chứa ecdysteroid có duy trì được hoạt tính sinh học sau thời gian bảo quản dài ngày không? Phân tích HPLC định kỳ sau 3 tháng và 6 tháng bảo quản cho thấy hàm lượng $\beta$-ecdysone trong viên thức ăn cốm không bị suy giảm đáng kể. Điều kiện cốt lõi là kiểm soát độ ẩm viên thức ăn luôn dưới 12% theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam V để ngăn ngừa quá trình thủy phân hoạt chất.

Chế phẩm ecdysteroid từ thông đỏ có thể mở rộng ứng dụng cho các đối tượng thủy sản giáp xác khác không? Hoàn toàn khả thi vì cơ chế tiếp nhận ecdysteroid ở tôm sú, tôm thẻ chân trắng và ghẹ xanh tương đồng với cua biển Scylla paramamosain. Nồng độ phối trộn có thể điều chỉnh linh hoạt từ 1 ppm đến 10 ppm tùy thuộc vào kích cỡ cá thể và chu kỳ sinh trưởng của từng loài giáp xác.

Kết luận

• Phân lập thành công 10 mg hợp chất $\beta$-ecdysone tinh khiết từ cao lá thông đỏ (Taxus wallichiana), xác định cấu trúc chuẩn hóa qua sắc ký lớp mỏng và HPLC.
• Thiết lập quy trình chiết lỏng - lỏng bằng ethyl acetate đạt hiệu suất 0,138%, tối ưu hơn phương pháp sắc ký Diaion HP-20 (0,073%) và sản xuất thành công 500 gam cao pilot.
• Xây dựng phương pháp định lượng HPLC có độ tin cậy cao với khoảng tuyến tính 5 - 150 µg/ml, tỷ lệ phục hồi 99,07% và độ lệch chuẩn lặp lại RSD 1,15%.
• Ban hành bộ tiêu chuẩn cơ sở kiểm nghiệm cho cao bán thành phẩm (độ ẩm $\le 20%$) và thức ăn viên cho cua (độ ẩm $\le 12%$, nồng độ hoạt chất $\ge 0,138%$).
• Thử nghiệm sinh học khẳng định thức ăn 45% đạm bổ sung 10 ppm $\beta$-ecdysone kích thích cua lột xác đồng loạt ở ngày thứ 20 trên quy mô 200 con.

Đóng góp lớn nhất của luận văn là hoàn thiện chuỗi công nghệ khép kín từ nguyên liệu thực vật tự nhiên đến sản phẩm thức ăn chuyên dụng kích thích lột xác cho giáp xác. Kế hoạch tiếp theo trong 12 đến 24 tháng tới là mở rộng thử nghiệm tại các vùng nuôi chuyên canh tôm cua quy mô công nghiệp. Các viện nghiên cứu, doanh nghiệp thức ăn thủy sản và trang trại hãy cùng hợp tác triển khai ứng dụng công nghệ này nhằm nâng cao giá trị gia tăng cho ngành thủy sản Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN VĂN TRÍ CHIẾT TÁCH HỢP CHẤT ECDYSTEROID TỪ THÔNG ĐỎ VÀ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GÂY LỘT XÁC TRÊN CUA (SCYLLA PARAMAMOSAIN) (Extraction Ecdysteroid compounds from Taxus wallichiana and research potential moult of crab (Scylla Paramamosain)) Chuyên ngành: Kỹ Thuật Hóa Học Mã số: 60.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP.HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2020 Công trình được hoàn thành tại: Trung Tâm Sâm và Dược Liệu Tp. HCM Cán bộ hướng dẫn khoa học 1: PGS. Phạm Thành Quân Cán bộ hướng dẫn khoa học 2: Cán bộ chấm nhận xét 1 : PGS. Bạch Long Giang Cán bộ chấm nhận xét 2 : TS.

Phan Thị Hoàng Anh Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại Học Bách Khoa, ĐHQG Tp. HCM ngày 11 tháng 01 năm 2020. Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ) 1. Chủ tịch Hội đồng: PGS.

Nguyễn Thị Phương Phong 2. Cán bộ phản biện 1: PGS. Bạch Long Giang 3. Cán bộ phản biện 2: TS.

Phan Thị Hoàng Anh 4. Ủy viên: TS. Nguyễn Thanh Tùng 5. Lê Vũ Hà Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có).

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƢỞNG KHOA KTHH ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập – Tự do – Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Nguyễn Văn Trí MSHV: 1670679 Ngày, tháng, năm sinh: 18/03/1992 Nơi sinh: Đăk Lăk Chuyên ngành: Kỹ Thuật Hóa Học Mã số: 60.01 TÊN ĐỀ TÀI: Chiết tách hợp chất ecdysteroid từ thông đỏ và nghiên cứu khả năng gây lột xác trên cua (Scylla paramamosain) I. NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: - Chiết tách, tinh sạch β-ecdysone từ cao lá thông đỏ. - Nghiên cứu quy trình chiết xuất cao giàu ecdysteroid và chiết 500 gam cao ecdysteroid bán thành phẩm ở quy mô pilot. Từ đó làm nguyên liệu bổ sung vào thức ăn viên cho cua.

- Nghiên cứu phối trộn chế phẩm thức ăn viên chứa ecdysteroid bổ sung vào thức ăn cho cua. - Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở kiểm nghiệm cao trung gian và chế phẩm thức ăn cua. - Khảo sát hoạt tính kích thích lột xác trên cua. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 02/06/2019 III.

NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 20/12/2020 IV.CÁN BỘ HƢỚNG DẪN 1: PGS. Phạm Thành Quân CÁN BỘ HƢỚNG DẪN 2: Tp. HCM, ngày 25 tháng 12 năm 2019 CÁN BỘ HƢỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO TRƢỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, con xin cảm ơn ba mẹ và anh, chị đã luôn bên con và tạo điều kiện tốt nhất để con đạt được những thành quả của ngày hôm nay. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.

Phạm Thành Quân, người thầy đã luôn tận tình hướng dẫn em thực hiện đề tài. Xin cảm ơn GS. Phan Thanh Sơn Nam, PGS. Lê Thị Hồng Nhan và các thầy cô giảng viên cao học K2016 Khoa Kỹ Thuật Hóa Học trường Đại học Bách Khoa Tp.

HCM đã dạy bảo, truyền đạt kiến thức cho em trong suốt khóa học. Bùi Thế Vinh, ThS. Lâm Bích Thảo, KS. Nguyễn Nhật Minh và các Thầy Cô, các Anh Chị em, bạn bè tại Trung tâm sâm và dược liệu Tp.

HCM, bộ môn Hóa Hữu Cơ, khoa Kỹ Thuật Hóa Học, trường Đại học Bách Khoa Tp. HCM đã giúp đỡ tôi thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn!. Nguyễn Văn Trí ii TÓM TẮT LUẬN VĂN Phân lập thành công hợp chất β-ecdysone từ cao lá thông đỏ.

Lựa chọn quy trình chiết tách ecdysteroid là lắc phân bố với ethyl acetate cho hiệu suất (0,138%) cao hơn so với chạy qua cột Diaion HP-20 (0,073%). Đã phối trộn được thức ăn cho cua dạng cốm, có sự hiện diện của ecdysteroid. Xây dựng được tiêu chuẩn cơ sở cho cao thông đỏ và chế phẩm thức ăn cua chứa ecdysteroid. Độ ẩm cao không quá 20%, độ ẩm thức ăn cua không quá 12%, nồng độ β-ecdysone trong cao không thấp hơn 0,138%.

Kết quả nuôi thí nghiệm ban đầu cho thấy khi nuôi với thức ăn viên nhân tạo 45% đạm bổ sung 10 ppm ecdysone có khả năng kích thích cua lột xác, thời gian lột xác của cua diễn ra sớm hơn, tập trung và đồng loạt vào khoảng 20 ngày. ABSTRACT β-ecdysone compound was successfully isolated from Taxus wallichiana. Liquid-liquid extraction with ethyl acetate was selected as the extraction process of ecdysteroid, which had higher efficiency (0.138%) than through the Diaion HP-20 column (0. Food for nuggets of crabs has been mixed and has the presence of ecdysteroid.

The standard for Taxus wallichiana extract and crabs’ food containing ecdysteroid has been formulated. The moisture of the extract and crabs’ food do not exceed 20% and 12%, respectively, and the concentration of β-ecdysone in the extract is not lower than 0. Preliminary experimental results showed that when crabs were fed with artificial pellets 45% protein supplemented with 10 ppm ecdysone has the ability to stimulate crab molting, crab molting time takes place earlier, focused and simultaneously at 20th day. iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam kết luận văn này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi và chưa được dùng cho bất cứ luận văn cùng cấp nào khác.

Học viên Nguyễn Văn Trí iv MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .ii LỜI CAM ĐOAN. iii MỤC LỤC .iv DANH MỤC HÌNH ẢNH .vii DANH MỤC BẢNG. viii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT.ix Chƣơng 1: TỔNG QUAN. Giới thiệu chung về cây thông đỏ lá dài (Taxus wallichiana).

Đặc điểm thực vật. Giới thiệu về ecdysteroid. Giới thiệu chung về β-ecdysone. Công thức cấu tạo và danh pháp.

Tính chất vật lý. Ứng dụng của β-ecdysone. Giới thiệu sinh lý lột xác của cua. Sinh lý lột xác của cua.

Đặc điểm quá trình lột xác của cua. Phương pháp cô lập các hợp chất hữu cơ. Sắc ký phân bố - sắc ký cột. Phương pháp chiết lỏng – lỏng.

13 v Chƣơng 2: Thực Nghiệm. Nội dung nghiên cứu. Vật liệu, hóa chất sử dụng. Quy trình thực hiện.

Chiết tách, tinh sạch β-ecdysone từ cao methanol. Nghiên cứu quy trình chiết xuất ecdysteroid và chiết 500g cao ecdysteroid bán thành phẩm ở quy mô pilot. Nghiên cứu phối trộn chế phẩm chứa ecdysteroid bổ sung vào thức ăn cho cua 21 2. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở kiểm nghiệm cao trung gian và chế phẩm đã phối trộn.

Khảo sát hoạt tính kích thích lột xác cua ở mô hình thí nghiệm. 23 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN. Chiết tách, tinh sạch β-ecdysone từ cao tổng. Chạy cột sắc ký phân bố.

Sắc ký hấp phụ cột silica gel. Nghiên cứu quy trình chiết xuất ecdysteroid và chiết 500 g cao ecdysteroid bán thành phẩm ở quy mô pilot. Kết quả chạy cột Diaion HP-20. Lắc phân bố với ethyl acetate.

Định lượng β-ecdysone bằng phương pháp HPLC. Nghiên cứu phối trộn chế phẩm chứa Ecdysteroid bổ sung vào thức ăn cho cua. Phối trộn cao chứa ecdysteroid vào thành phần thức ăn cho cua. Đánh giá tính chất hóa lý của viên thức ăn thành phẩm.

Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở kiểm nghiệm cao bán thành phẩm và viên thức ăn thành phẩm có bổ sung ecdysteroid. Độ ẩm của cao bán thành phẩm và chế phẩm đã phối trộn. Định tính ecdysteroid bằng SKLM trong cao bán thành phẩm và viên thức ăn thành phẩm có bổ sung ecdysteroid. Khảo sát hoạt tính kích thích lột xác trên cua ở mô hình thí nghiệm.

47 Chƣơng 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 53 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC. 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 60 vii DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.2 Một số công thức của ecdysteroids.3 Công thức cấu tạo của β-ecdysone.1 Quy trình tiến hành sắc ký phân bố cột A.2 Sơ đồ quy trình sắc ký hấp phụ cột B .3 Quy trình tiến hành sắc ký phân bố.4 Quy trình lắc phân đoạn với ethyl acetate .1 SKLM các phân đoạn cột A.

Hệ dung môi DCM - MeOH (80 : 20).2 SKLM phân đoạn của cột B1. Hệ dung môi DCM - MeOH (85:15).3 SKLC phân đoạn của cột B2. Hệ dung môi DCM – MeOH (85:15) .4 Kết tinh phân đoạn V .5 SKLM đối chứng kết tinh và chuẩn β-ecdysone .6 Kết quả SKLM khi lắc phân bố với ethyl acetate .7 Kết quả thẩm định độ đặc hiệu của quy trình phân tích.8 Đường chuẩn và sắc ký đồ β-ecdysone chuẩn .9 Sắc ký đồ của mẫu cao ethyl acetate .10 Sắc ký của phân đoạn 40% ethanol .11 (1)Thiết bị chiết và (2) thiết bị lắc phân đoạn .12 Mẫu cao sau khi phối trộn thức ăn và xát hạt (trước khi sấy) .13 Kết quả định tính ecdysteroid trong thức ăn cua và cao thông đỏ .14 Sắc ký đồ mẫu cao bán thành phẩm .15 Sắc ký đồ mẫu thức ăn cua .16 Thức ăn chế biến dùng cho nuôi thí nghiệm .17 Bố trí cua trong bể nuôi thí nghiệm .18 Sự tăng trưởng, tỷ lệ sống, tỷ lệ lột vỏ của cua nuôi .19 Tỷ lệ lột vỏ của cua ở các nghiệm thức theo thời gian nuôi. 52 viii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Tỉ lệ phối trộn phụ gia.

2: Kích thước cua và thức ăn bổ sung cho cua .1 Bảng số liệu kết quả chạy sắc ký cột Diaion HP-20 .2 Kết quả xác định khoảng tuyến tính .3 Kết quả thẩm định độ đúng, độ lặp lại .4 Hàm lượng β-ecdysone trong cao EtOAc .5 Hàm lượng β-ecdysone trong PĐ 40% .6 So sánh hai phương pháp chiết xuất .7 Bảng chiết cao quy mô Pilot .8 Kết quả độ ẩm của thức ăn sau khi trộn, sấy khô .9 Kết quả độ ẩm của cao bán thành phẩm và chế phẩm đã phối trộn .10 Kết quả phân tích độ tro toàn phần của cao bán thành phẩm và sản phẩm .11 Kết quả phân tích β-ecdysone trong cao MeOH thông đỏ .12 Kết quả phân tích β-ecdysone trong thức ăn .13 Kết quả phân tích β-ecdysone trong thức ăn ban đầu .14 Kết quả phân tích β-ecdysone trong thức ăn cua sau 3 tháng .15 Kết quả phân tích β-ecdysone trong thức ăn cua sau 6 tháng .16 Thành phần hóa học của các thức ăn cua (VCK) .17 Các chỉ tiêu môi trường ở các nghiệm thức trong suốt thời gian thí nghiệm .18 Tăng trưởng, tỷ lệ cua lột vỏ, tỷ lệ sống của cua nuôi ở các nghiệm thức .