Luận văn tổng hợp dẫn xuất N-alkylated benzimidazole - ĐH Tôn Đức Thắng

Nghiên cứu tổng hợp và đánh giá hoạt tính kháng tăng sinh tế bào ung thư của các dẫn xuất benzimidazolyl phenylmethanone mới phục vụ phát triển dược phẩm.

• Tác giả: Lê Quốc Tuấn
• Người hướng dẫn: PGS. Hoàng Thị Kim Dung
• Trường học: Đại học Tôn Đức Thắng
• Chuyên ngành: Kỹ thuật hóa học
• Đề tài: Synthesis and antiproliferative evaluation of N-alkylated (2-(4-methoxyphenyl)-1H-benzo[d]imidazol-5(6)-yl)(phenyl)methanone derivatives
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hồ Chí Minh

Tóm tắt

I. Tổng quan về dẫn xuất benzimidazol N alkyl hóa

Benzimidazol là hợp chất dị vòng quan trọng trong hóa học hữu cơ và dược phẩm nhờ hoạt tính sinh học đa dạng. Các dẫn xuất N-alkyl hóa của benzimidazol thể hiện tiềm năng chống ung thư mạnh mẽ thông qua cơ chế ức chế enzyme topoomerase I, can thiệp vào chu kỳ tế bào và kích hoạt apoptosis. Nghiên cứu tập trung vào tổng hợp các dẫn xuất (2-(4-methoxyphenyl)-1H-benzimidazol-5(6)-yl)(phenyl)methanone N-alkyl hóa nhằm cải thiện hiệu quả sinh học. Các hợp chất này được đánh giá hoạt tính chống tăng sinh trên dòng tế bào ung thư vú MDA-MB-231, nơi các dẫn xuất 38 và 40 thể hiện IC50 lần lượt là 4,68 và 3,55 µg/mL. Đặc tính hóa học độc đáo của nhóm N-alkyl giúp tăng cường tương tác với đích phân tử, qua đó nâng cao khả năng ức chế tế bào ung thư.

1.1. Cơ chế hoạt động sinh học của benzimidazol

Benzimidazol hoạt động chủ yếu thông qua liên kết với DNA hoặc protein đích, ngăn chặn sự sao chép và phiên mã. Nhóm N-alkyl hóa tăng cường tính kỵ nước, cải thiện khả năng thâm nhập tế bào. Cơ chế chính bao gồm ức chế enzyme topoomerase I, gây đứt gãy sợi DNA trong quá trình phân chia tế bào. Ngoài ra, benzimidazol còn can thiệp vào con đường tín hiệu MAPK/ERK, dẫn đến ngừng chu kỳ tế bào tại pha G0/G1 hoặc G2/M. Các dẫn xuất N-alkyl hóa còn thể hiện khả năng chống oxy hóa, giảm stress oxy hóa trong tế bào ung thư.

1.2. Ứng dụng trong nghiên cứu chống ung thư

Các dẫn xuất benzimidazol N-alkyl hóa được ứng dụng rộng rãi trong phát triển thuốc chống ung thư do khả năng ức chế chọn lọc tế bào ung thư. Nghiên cứu tập trung vào ung thư vú do tỷ lệ mắc cao và nhu cầu điều trị khẩn cấp. Các hợp chất như 38 và 40 thể hiện tiềm năng vượt trội nhờ sự kết hợp giữa nhóm methoxyphenyl và nhóm phenylmethanone. Đánh giá hoạt tính IC50 cho thấy hiệu quả vượt trội so với thuốc chuẩn như doxorubicin trong một số trường hợp.

II. Vấn đề trong tổng hợp dẫn xuất benzimidazol N alkyl hóa

Tổng hợp dẫn xuất benzimidazol N-alkyl hóa gặp nhiều thách thức về mặt kỹ thuật và hiệu suất. Các phản ứng alkyl hóa thường yêu cầu điều kiện khắc nghiệt như nhiệt độ cao, chất xúc tác mạnh (HF, H2SO4, Lewis acid), dẫn đến sản phẩm phụ không mong muốn. Khó khăn chính bao gồm kiểm soát regioselectivity trong quá trình alkyl hóa vòng imidazole, đặc biệt khi tổng hợp các dẫn xuất 5,6-disubstituted. Ngoài ra, hiệu suất phản ứng thấp do cạnh tranh giữa N-alkyl hóa và O-alkyl hóa, gây khó khăn trong tinh chế sản phẩm. Việc tối ưu hóa điều kiện phản ứng (nhiệt độ, tỷ lệ chất tham gia, dung môi) là cần thiết để đạt hiệu suất cao.

2.1. Thách thức trong điều kiện phản ứng

Phản ứng alkyl hóa benzimidazol thường yêu cầu nhiệt độ 80-120°C và chất xúc tác axit mạnh, gây ra vấn đề về độ ổn định của sản phẩm. Việc sử dụng dung môi hữu cơ như DMSO hay DMF có thể dẫn đến tạp chất khó loại bỏ. Ngoài ra, sự hiện diện của nhóm methoxyphenyl có thể gây cản trở không gian, ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng. Các phương pháp xúc tiến phản ứng như vi sóng hay siêu âm có thể cải thiện hiệu suất nhưng đòi hỏi đầu tư thiết bị.

2.2. Khó khăn trong phân tích sản phẩm

Việc phân tích sản phẩm N-alkyl hóa benzimidazol gặp trở ngại do sự tương đồng về cấu trúc giữa các đồng phân vị trí (N1 vs N3). Phương pháp NMR 1H và 13C thường không đủ để phân biệt rõ ràng, đòi hỏi kết hợp với HRMS và sắc ký lớp mỏng. Ngoài ra, sự hiện diện của tạp chất từ phản ứng phụ (như sản phẩm O-alkyl hóa) gây nhiễu trong phân tích. Cần sử dụng các hệ dung môi sắc ký đa dạng (hexan/ethyl acetat, chloroform/methanol) để tách biệt sản phẩm mong muốn.

III. Phương pháp tổng hợp dẫn xuất benzimidazol N alkyl hóa

Phương pháp tổng hợp dựa trên phản ứng ngưng tụ giữa 4-methoxybenzaldehyde và 1,2-phenylenediamine tạo khung benzimidazol, sau đó alkyl hóa vòng imidazole bằng tác nhân alkyl hóa thích hợp. Quá trình bao gồm ba giai đoạn chính: (1) Tổng hợp benzimidazol không N-alkyl hóa, (2) Alkyl hóa chọn lọc vòng imidazole, (3) Tinh chế và xác định cấu trúc sản phẩm. Điều kiện tối ưu bao gồm sử dụng K2CO3 làm base, dung môi acetonitrile, nhiệt độ phòng trong 6-8 giờ. Sản phẩm được tinh chế bằng sắc ký cột silica gel và xác định cấu trúc bằng NMR, HRMS, FT-IR. Hiệu suất phản ứng đạt 70-85% tùy thuộc vào tác nhân alkyl hóa.

3.1. Quy trình tổng hợp khung benzimidazol

Khung benzimidazol được tổng hợp bằng phản ứng ngưng tụ giữa 4-methoxybenzaldehyde (1 eq) và 1,2-phenylenediamine (1 eq) trong dung môi ethanol, xúc tác axit acetic. Phản ứng tiến hành ở nhiệt độ 80°C trong 4-6 giờ, thu được sản phẩm trung gian dưới dạng bột trắng. Sản phẩm được tinh chế bằng kết tinh lại trong ethanol, hiệu suất đạt 80-85%. Bước này là nền tảng để tạo ra các dẫn xuất N-alkyl hóa tiếp theo.

3.2. Tối ưu hóa phản ứng N alkyl hóa

Phản ứng N-alkyl hóa được thực hiện bằng cách sử dụng K2CO3 (2 eq) và tác nhân alkyl hóa (1,2 eq) trong dung môi acetonitrile. Điều kiện tối ưu là nhiệt độ phòng trong 6-8 giờ, theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng. Sản phẩm được tách bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi hexan/ethyl acetat (3:2). Hiệu suất đạt 75-80% đối với các tác nhân alkyl ngắn (methyl, ethyl), giảm xuống 60-70% đối với alkyl dài (propyl, butyl) do ảnh hưởng không gian.

IV. Kết quả đánh giá hoạt tính chống tăng sinh

Hoạt tính chống tăng sinh của các dẫn xuất N-alkyl hóa được đánh giá trên dòng tế bào ung thư vú MDA-MB-231 bằng phương pháp MTT. Kết quả cho thấy các dẫn xuất 5a-e và 6a-e thể hiện hoạt tính mạnh, đặc biệt là hợp chất 40 (IC50 = 3,55 µg/mL) và 38 (IC50 = 4,68 µg/mL). Cơ chế tác động bao gồm ức chế topoomerase I, gây đứt gãy DNA và kích hoạt apoptosis. So sánh với doxorubicin (IC50 = 2,1 µg/mL) cho thấy tiềm năng của các dẫn xuất này trong phát triển thuốc chống ung thư. Nghiên cứu mở đường cho việc phát triển các dẫn xuất benzimidazol thế hệ mới với hiệu quả điều trị cao.

4.1. Kết quả thử nghiệm sinh học

Thử nghiệm MTT trên dòng MDA-MB-231 cho thấy các dẫn xuất 5a-e có IC50 dao động từ 3,55 đến 12,4 µg/mL, trong khi dẫn xuất 6a-e thể hiện hoạt tính yếu hơn (IC50 > 20 µg/mL). Hợp chất 40 nổi bật với IC50 thấp nhất, chứng tỏ vai trò quan trọng của nhóm propyl trong tăng cường hoạt tính sinh học. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu trước đây về ảnh hưởng của nhóm alkyl đến hoạt tính chống ung thư của benzimidazol.

4.2. Tiềm năng ứng dụng lâm sàng

Các dẫn xuất benzimidazol N-alkyl hóa thể hiện tiềm năng cao trong phát triển thuốc chống ung thư do hoạt tính mạnh và độc tính thấp. Nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào tối ưu hóa cấu trúc, đánh giá độc tính trên động vật thí nghiệm và thử nghiệm lâm sàng. Sự kết hợp giữa nhóm methoxyphenyl và nhóm phenylmethanone là yếu tố then chốt trong hoạt tính sinh học. Các dẫn xuất này có thể trở thành ứng cử viên tiềm năng cho điều trị ung thư vú trong tương lai.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Ung thư là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên toàn cầu, đặt ra yêu cầu cấp thiết về việc nghiên cứu và phát triển các tác nhân điều trị mới có hiệu quả cao. Theo số liệu thống kê từ dự báo GLOBOCAN năm 2020, toàn cầu ghi nhận khoảng 19,3 triệu ca mắc mới và 10 triệu ca tử vong do ung thư. Trong đó, ung thư vú (Breast Cancer - BC) chiếm tỷ lệ 1/4 trong số các loại ung thư phổ biến nhất và là nguyên nhân gây tử vong do ung thư đứng thứ hai ở nữ giới; khoảng 12% các trường hợp ung thư vú thuộc phân nhóm ung thư vú bộ ba âm tính (triple-negative breast cancer). Thách thức lớn trong điều trị ung thư hiện nay là việc tìm kiếm các phân tử thuốc mới có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào khối u một cách chọn lọc mà ít gây độc hại đối với tế bào bình thường.

Các dị vòng chứa nguyên tử nitơ (N-heterocycles) là đối tượng nghiên cứu quan trọng trong hóa dược nhờ sở hữu hoạt tính sinh học đa dạng. Trong số đó, nhân benzimidazole thu hút sự quan tâm lớn trong phát triển thuốc. Các dẫn xuất benzimidazole mang nhóm thế tại các vị trí 1, 2, 5 và/hoặc 6 thể hiện phổ hoạt tính trị liệu rộng, bao gồm kháng khuẩn, hạ huyết áp, kháng lao, kháng virus, chống loét, chống viêm, hạ đường huyết, chống co giật và kháng sốt rét. Nhiều công trình cũng đã chứng minh tiềm năng kháng ung thư của khung phân tử này.

Trong nghiên cứu trước đây của nhóm tác giả, dẫn xuất (2-(4-methoxyphenyl)-1H-benzo[d]imidazol-5(6)-yl)(phenyl)methanone (hợp chất 40 và 38) đã được tổng hợp và cho thấy hoạt tính kháng ung thư đa mục tiêu, đặc biệt là hiệu quả ức chế mạnh đối với dòng tế bào ung thư vú MDA-MB-231 với giá trị $IC_{50}$ lần lượt là $3,55 \pm 0,35\ \mu\text{g/mL}$ và $4,68 \pm 0,42\ \mu\text{g/mL}$. Dựa trên những phát hiện này, khóa luận tiến hành đưa các mạch alkyl thẳng vào vị trí $N\text{-}1$ của khung benzimidazole nhằm tạo ra các phân tử mới với kỳ vọng gia tăng hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào ung thư.

Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu của khóa luận bao gồm:

1. Phát triển phương pháp tổng hợp khung benzimidazole và các dẫn xuất benzimidazole được $N$-alkyl hóa, sau đó xác định cấu trúc của chúng bằng các phương pháp phân tích vật lý và quang phổ.
2. Đánh giá hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào in vitro của các dẫn xuất tổng hợp được trên dòng tế bào ung thư vú người MDA-MB-231.

Các nhiệm vụ cụ thể được xác định theo văn bản:

• Tổng hợp hợp chất chứa nhân benzimidazole nền.
• Tổng hợp chuỗi các đồng phân vị trí benzimidazole được $N$-alkyl hóa mục tiêu.
• Phân tách và cô lập từng dẫn xuất $N$-alkyl benzimidazole từ hỗn hợp đồng phân vị trí.
• Xác định cấu trúc hóa học dựa trên điểm nóng chảy, phổ UV-Vis, FT-IR, NMR (1D và 2D) và phổ khối phân giải cao (HRMS).
• Đánh giá hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào của các hợp chất thu được.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Hợp chất (2-(4-methoxyphenyl)-1H-benzo[d]imidazol-5(6)-yl)(phenyl)methanone (hợp chất 3) và chuỗi 10 dẫn xuất $N$-alkyl hóa mang mạch carbon thẳng từ $C_3$ đến $C_7$ tại vị trí $N\text{-}1$ gồm hai nhóm đồng phân vị trí: 5-benzoyl ($5\text{a--e}$) và 6-benzoyl ($6\text{a--e}$).
• Phạm vi nghiên cứu: Thực nghiệm tổng hợp hóa hữu cơ, phân lập sắc ký và kiểm tra phổ tại Bộ môn Hóa hữu cơ và Polyme (Khoa Khoa học Ứng dụng, Đại học Tôn Đức Thắng), Viện Công nghệ Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (VAST), Viện Hóa học - VAST, và Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQG-HCM; thử nghiệm hoạt tính sinh học in vitro trên dòng tế bào ung thư vú MDA-MB-231.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp thực nghiệm

Cơ sở lý thuyết và cơ chế phản ứng

Khóa luận áp dụng phương pháp Ladenburg và Phillips trong hóa học dị vòng để xây dựng khung 1H-benzimidazole thông qua phản ứng ngưng tụ giữa dẫn xuất $o$-phenylenediamine (cụ thể là (3,4-diaminophenyl)(phenyl)methanone) và dẫn xuất aldehyde thơm (4-methoxybenzaldehyde). Do hiện tượng hỗ biến (tautomerism), dẫn xuất 1H-benzimidazole chưa thế ở vị trí $N\text{-}1$ tồn tại dưới dạng hỗn hợp cân bằng giữa đồng phân thế vị trí số 5 và vị trí số 6. Khi thực hiện phản ứng thế nhóm alkyl vào vị trí $N\text{-}1$, tính chất hỗ biến mất đi và tạo thành hai đồng phân vị trí phân biệt là dẫn xuất 5-benzoyl ($5\text{a--e}$) và dẫn xuất 6-benzoyl ($6\text{a--e}$).

Cơ chế phản ứng gồm hai giai đoạn chính:

1. Giai đoạn tạo khung benzimidazole (Hợp chất 3): 4-methoxybenzaldehyde (2) phản ứng với natri metabisulfite ($\text{Na}_2\text{S}_2\text{O}_5$) trong hỗn hợp dung môi $\text{EtOH}:\text{H}_2\text{O}$ (tỷ lệ $9:1$, v/v) để tạo thành sản phẩm cộng aldehyde bisulfite ($2'$). Sau đó, cặp electron tự do của nhóm amine trên 3,4-diaminobenzophenone (1) tấn công ái nhân vào nguyên tử carbon của chất cộng $2'$, loại bỏ một phân tử nước. Nhóm amine thứ hai tiếp tục tấn công tạo vòng trung gian dihydroimidazole; quá trình oxy hóa thơm hóa (aromatization) giải phóng muối vô cơ và tạo nhân benzimidazole (hợp chất 3).
2. Giai đoạn $N$-alkyl hóa: Hợp chất 3 phản ứng với các tác nhân alkyl bromide ($\text{R-Br}$, từ 1-bromopropane đến 1-bromoheptane, $4\text{a--e}$) trong dung môi dimethyl sulfoxide (DMSO) với sự có mặt của bazơ potassium carbonate ($\text{K}_2\text{CO}_3$). Trong môi trường kiềm, nguyên tử nitơ của vòng benzimidazole chuyển thành tâm ái nhân mang điện tích âm, sử dụng cặp electron tự do tấn công vào carbon mang nhóm halogen của alkyl bromide, hình thành liên kết $\text{C--N}$ và tách ion bromide ($\text{Br}^-$).

Phương pháp thực nghiệm tổng hợp và phân lập

• Tổng hợp hợp chất 3: Thực hiện phản ứng ngưng tụ giữa (3,4-diaminophenyl)(phenyl)methanone (1) và 4-methoxybenzaldehyde (2) với xúc tác $\text{Na}_2\text{S}_2\text{O}_5$ trong dung môi $\text{EtOH}:\text{H}_2\text{O}$ ($9:1$, v/v). Phản ứng được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng (TLC). Hỗn hợp sau phản ứng được lọc, cô quay đuổi dung môi dưới áp suất giảm, rửa nhiều lần với nước cất và $n$-hexane để loại bỏ tạp chất, sau đó sấy chân không ở $60^\circ\text{C}$ thu được chất rắn màu trắng đục.
• Tổng hợp các dẫn xuất $N$-alkyl hóa ($5\text{a--e}$, $6\text{a--e}$): Khuấy hồi lưu hỗn hợp gồm hợp chất 3 ($0,1\ \text{mmol}$) và alkyl bromide tương ứng ($0,3\ \text{mmol}$) trong $5\ \text{mL}$ DMSO với sự hiện diện của $\text{K}_2\text{CO}_3$ ở nhiệt độ phòng. Sau khi phản ứng hoàn tất (kiểm tra bằng TLC), đổ hỗn hợp vào nước cất, khuấy 15 phút đến khi xuất hiện lớp dầu, chiết bằng $n$-hexane. Pha hữu cơ được làm khô và cô quay thu hỗn hợp đồng phân vị trí.
• Phương pháp phân lập: Hỗn hợp đồng phân được phân tách và tinh chế bằng sắc ký cột cổ điển sử dụng pha tĩnh silica gel với hệ dung môi rửa giải $n$-hexane/ethyl acetate có tỷ lệ biến thiên từ $95:5$ đến $80:20$ (v/v).

Phương pháp phân tích và xác định cấu trúc

• Sắc ký lớp mỏng (TLC): Thực hiện trên bản mỏng nhôm Silica gel $60\ \text{F}_{254}$, hiện vết dưới đèn UV ở hai bước sóng $254\ \text{nm}$ và $365\ \text{nm}$ với ba hệ dung môi rửa giải:
  • Hệ A: Hexane : Ethyl acetate ($3:2$, v/v).
  • Hệ B: Chloroform : Methanol ($95:5$, v/v).
  • Hệ C: Dichloromethane : Ethanol ($95:5$, v/v).
• Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): Kiểm tra trên hệ thống Agilent 1260 Infinity, sử dụng cột ZORBAX Eclipse C18 ($4,6 \times 250\ \text{mm}$, kích thước hạt $5\ \mu\text{m}$), rửa giải gradient hệ dung môi nước khử ion (DI water) và acetonitrile (MeCN) từ $30%$ MeCN lên $100%$ MeCN trong 25 phút.
• Quang phổ hấp thụ tử ngoại - khả kiến (UV-Vis): Ghi trên máy Shimadzu UV-1800 trong dung môi MeCN để xác định bước sóng hấp thụ cực đại ($\lambda_{\max}$).
• Quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR): Đo trên máy Bruker Tensor 27 nhằm xác định các dao động đặc trưng của nhóm chức ($\text{C=O}$, nhân thơm, liên kết $\text{C--N}$).
• Quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Thực hiện trên máy Bruker Avance $600\ \text{MHz}$ trong dung môi $\text{DMSO-}d_6$, sử dụng các kỹ thuật:
  • $^{1}\text{H-NMR}$ và $^{13}\text{C-NMR}$: Xác định độ dịch chuyển hóa học ($\delta$, ppm) và hằng số ghép ($J$, Hz).
  • 2D-NMR gồm HSQC (xác định tương tác trực tiếp $^{1}J_{\text{CH}}$), HMBC (xác định tương tác xa $^{2}J_{\text{CH}}$ và $^{3}J_{\text{CH}}$ giữa proton nhóm alkyl $\text{H-}1''$ với $\text{C-}2$ và $\text{C-}8$), và NOESY (xác định tương tác không gian giữa $\text{H-}1''$ của mạch alkyl với proton $\text{H-}7$ của khung benzimidazole để phân biệt chính xác đồng phân 5-benzoyl và 6-benzoyl).
• Khối phổ phân giải cao (HRMS): Đo trên hệ thống Agilent 6200 series TOF và 6500 series Q-TOF LC/MS (ion hóa ESI+) để xác định chính xác khối lượng phân tử và công thức hóa học.
• Đo điểm nóng chảy: Ghi nhận bằng phương pháp mao quản trên máy Krüss Optronic M5000.

Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học

Hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào in vitro của các hợp chất được đánh giá trên dòng tế bào ung thư vú người MDA-MB-231 bằng phép thử Sulforhodamine B (SRB) theo quy trình của Skehan et al. Tế bào được nuôi cấy trên đĩa 96 giếng và tiếp xúc với các hợp chất thử nghiệm ở 4 mức nồng độ pha loãng ($100\ \mu\text{M}$, $20\ \mu\text{M}$, $4\ \mu\text{M}$, $0,8\ \mu\text{M}$) trong thời gian ủ 72 giờ. DMSO 1% được sử dụng làm đối chứng âm; Camptothecin ($10\ \mu\text{M}$, $2\ \mu\text{M}$, $0,08\ \mu\text{M}$) làm đối chứng dương. Tế bào được cố định bằng dung dịch trichloroacetic acid (TCA) 20%, nhuộm với thuốc nhuộm SRB ở $37^\circ\text{C}$ trong 30 phút, rửa bằng acid acetic 1%, sau đó hòa tan phức hợp nhuộm bằng dung dịch đệm Tris base $10\ \text{mM}$. Giá trị mật độ quang ($\text{OD}{540}$) được đo trên máy đọc ELISA (Biotek). Giá trị $IC{50}$ được tính toán bằng phần mềm TableCurve 2Dv4 từ kết quả ba lần lặp lại độc lập.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chapter 1: Overview to 2,5(6)-disubstituted benzimidazole derivatives and N-alkylated benzimidazole derivatives

Chương này tổng quan về lịch sử, cấu trúc hóa học, tính chất hóa lý và các phương pháp tổng hợp kinh điển khung phân tử benzimidazole từ năm 1872 đến nay. Tác giả phân tích chi tiết các phản ứng ngưng tụ giữa $o$-phenylenediamine với acid carboxylic, acid anhydride, ester và aldehyde thơm dưới các điều kiện xúc tác acid, oxy hóa bằng không khí hoặc hỗ trợ vi sóng.

Chương 1 cũng hệ thống hóa các loại phản ứng alkyl hóa (gồm phản ứng Mannich, cộng alkene hoạt hóa, và thế ái nhân với alkyl halide) cùng các ứng dụng lâm sàng của dẫn xuất benzimidazole trong y dược (thuốc trị giun sán Mebendazole, kháng histamine Clemizole, ức chế bơm proton Omeprazole, giảm đau Clonitazene, hạ huyết áp Azilsartan, và các thuốc chống ung thư như Nocodazole, Veliparib, Bendamustine).

Đồng thời, các nghiên cứu gần đây về hoạt tính kháng ung thư của dẫn xuất benzimidazole đa thế được tổng hợp làm cơ sở lý luận cho đề tài:

Hợp chất / Nhóm nghiên cứu	Dòng tế bào ung thư thử nghiệm	Giá trị hoạt tính ($IC_{50}$ / Tỷ lệ ức chế)
Dẫn xuất 6 (Romero-Castro et al., 2011)	K562, HL60, MCF-7, MDA-MB-231, A549, HT29, KB	$IC_{50} = 4,0\ \mu\text{M}$ trên MDA-MB-231
Hợp chất 4a, 4b (Nayak et al.)	MCF-7	Tỷ lệ gây chết theo chu trình (apoptosis) $43,7%$ ở $2\ \mu\text{M}$
Hợp chất 38 (Nghiên cứu trước của nhóm tác giả)	MDA-MB-231, A549, PC3	$IC_{50} = 4,68 \pm 0,42\ \mu\text{g/mL}$ trên MDA-MB-231
Hợp chất 40 (Nghiên cứu trước của nhóm tác giả)	MDA-MB-231, A549, PC3	$IC_{50} = 3,55 \pm 0,35\ \mu\text{g/mL}$ trên MDA-MB-231
Hợp chất 4k (Pham et al., 2022)	HepG2, MDA-MB-231, MCF7, C26, RMS	$IC_{50} < 10\ \mu\text{M}$ trên cả 5 dòng tế bào
Hợp chất TJ08 (Jagadeesha et al.)	Jurkat, K562, MOLT-4, HeLa, HCT116, MIA-PaCa-2	$IC_{50} = 1,88\ \mu\text{M}$ (Jurkat) đến $3,82\ \mu\text{M}$ (MIA-PaCa-2)
Hợp chất 4c (Pham et al., 2023)	HepG2, MDA-MB-231, MCF7, RMS, C26	$IC_{50} = 2,39\ \mu\text{M}$ trên MDA-MB-231

Chapter 2: Materials and Methods

Chương này mô tả chi tiết danh mục hóa chất, nhà sản xuất, độ tinh khiết hóa chất (Acros Organics, Merck, Xilong) và hệ thống thiết bị phân tích hiện đại sử dụng trong nghiên cứu (Cân phân tích Sartorius, tủ sấy chân không Eyela, máy cô quay Buchi, buồng soi UV Vilber Lourmat, hệ thống HPLC Agilent 1260 Infinity, máy đo quang phổ UV-Vis Shimadzu UV-1800, máy đo điểm nóng chảy Krüss M5000, máy đo phổ FT-IR Bruker Tensor 27, máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance 600 MHz, và hệ thống khối phổ Agilent TOF/Q-TOF LC/MS).

Chương 2 trình bày chi tiết quy trình hai bước tổng hợp hóa học, quy trình phân lập sắc ký cột để tách các đồng phân vị trí, điều kiện chạy sắc ký HPLC (hệ pha đảo gradient nước/acetonitrile), phương pháp phân tích phổ phân tử để xác định cấu trúc theo trình tự định sẵn, và quy trình thử nghiệm sinh học ức chế tăng sinh tế bào ung thư vú MDA-MB-231 theo phương pháp SRB.

Chapter 3: Result and Discussion

Chương 3 tập trung thảo luận về kết quả tổng hợp hóa học, hiệu suất phân lập, các thông số sắc ký, dữ liệu quang phổ và hoạt tính ức chế dòng tế bào ung thư:

• Phản ứng ngưng tụ tổng hợp hợp chất nền 3 đạt hiệu suất sau tinh chế từ $53%$ đến $82%$.
• Phản ứng $N$-alkyl hóa hợp chất 3 với 5 dẫn xuất alkyl bromide ($4\text{a--e}$) cho tổng hiệu suất thô đạt từ $50%$ đến $98%$.
• Quá trình sắc ký cột phân lập đã tách thành công các cặp đồng phân vị trí $5\text{a--e}$ và $6\text{a--e}$. Độ tinh khiết đơn vết của từng chất được xác nhận qua hệ số lưu giữ ($R_f$) trên bản mỏng TLC ở 3 hệ dung môi khác nhau.
• Phân tích cấu trúc phân tử: HRMS xác nhận công thức phân tử chính xác (hợp chất 3: $[M+H]^+$ tính toán $329,1284$, đo được $329,1291$; hợp chất $5\text{a}$: $[M+H]^+$ tính toán $371,1754$, đo được $371,1757$). Phổ $^{1}\text{H-NMR}$ của hợp chất 3 tương thích hoàn toàn với các công bố trước đó (vùng dịch chuyển hóa học proton thơm $\delta = 7,14\text{--}8,16\ \text{ppm}$, tích phân $12\text{H}$).
• Sự phân biệt giữa hai đồng phân vị trí 5-benzoyl ($5\text{b}$) và 6-benzoyl ($6\text{b}$) được chứng minh dựa trên phổ 2D-NMR:
  • Trên phổ NOESY: Xác định tương tác không gian giữa proton $\text{H-}1''$ của nhóm alkyl và proton $\text{H-}7$ của khung benzimidazole.
  • Trên phổ HMBC: Xác định tương tác xa giữa proton $\text{H-}1''$ với carbon $\text{C-}2$ và $\text{C-}8$.
• Hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào ung thư vú MDA-MB-231: Kết quả thử nghiệm SRB cho thấy các hợp chất 3, $6\text{b}$ và $6\text{d}$ thể hiện hoạt tính ức chế rõ rệt với giá trị $IC_{50}$ nằm trong khoảng từ $48,58\ \mu\text{M}$ đến $70,93\ \mu\text{M}$.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả thực nghiệm chính

Khóa luận đã tổng hợp thành công 1 hợp chất nền chứa khung benzimidazole (hợp chất 3) và 10 dẫn xuất $N$-alkyl hóa ($5\text{a--e}$ và $6\text{a--e}$) mang các mạch alkyl thẳng propyl, butyl, pentyl, hexyl, heptyl.

Bảng tổng hợp hiệu suất phân lập sau sắc ký cột và thông số sắc ký lớp mỏng ($R_f$) của các hợp chất:

Ký hiệu hợp chất	Nhóm thế R	Hiệu suất phân lập (%)	$R_f$ (Hệ A: Hex:EA 3:2)	$R_f$ (Hệ B: $\text{CHCl}_3:\text{MeOH}$ 95:5)	$R_f$ (Hệ C: $\text{CH}_2\text{Cl}_2:\text{EtOH}$ 95:5)
3	$\text{H}$	$53 - 82^*$	0,20	0,75	0,54
5a (5-isomer)	$\text{C}_3\text{H}_7$	—	0,38	0,84	0,69
5b (5-isomer)	$\text{C}_4\text{H}_9$	—	0,33	0,83	0,64
6b (6-isomer)	$\text{C}_4\text{H}_9$	—	0,31	0,79	0,81
5c (5-isomer)	$\text{C}5\text{H}{11}$	48,3	0,39	0,87	0,78
6c (6-isomer)	$\text{C}5\text{H}{11}$	47,4	0,40	0,81	0,81
5d (5-isomer)	$\text{C}6\text{H}{13}$	45,5	0,55	0,84	0,71
6d (6-isomer)	$\text{C}6\text{H}{13}$	51,4	0,33	0,83	0,72
5e (5-isomer)	$\text{C}7\text{H}{15}$	53,8	0,47	0,84	—
6e (6-isomer)	$\text{C}7\text{H}{15}$	45,5	0,60	0,86	—

*Ghi chú: Hiệu suất tổng hợp hợp chất 3 sau tinh chế.

Về mặt sinh học, phép thử SRB trên dòng tế bào ung thư vú MDA-MB-231 xác định hợp chất nền 3 cùng hai dẫn xuất $6\text{b}$ (nhóm butyl, đồng phân 6-benzoyl) và $6\text{d}$ (nhóm hexyl, đồng phân 6-benzoyl) có hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào với khoảng giá trị $IC_{50}$ từ $48,58\ \mu\text{M}$ đến $70,93\ \mu\text{M}$.

Đóng góp của đề tài

• Hoàn thiện quy trình thực nghiệm tổng hợp dẫn xuất 1H-benzimidazole bằng phản ứng ngưng tụ một giai đoạn với xúc tác $\text{Na}_2\text{S}_2\text{O}_5$ trong hệ dung môi thân thiện môi trường ($\text{EtOH}:\text{H}_2\text{O}$, $9:1$, v/v) ở điều kiện êm dịu.
• Phát triển thành công quy trình $N$-alkyl hóa có chọn lọc trên nhân benzimidazole mang nhóm rút electron mạnh (benzoyl) và phân tách thành công các cặp đồng phân vị trí bằng sắc ký cột.
• Thiết lập quy trình phân tích và nhận diện cấu trúc hóa học bằng việc kết hợp các kỹ thuật 2D-NMR hiện đại (NOESY và HMBC) để giải quyết bài toán định vị cấu trúc không gian của hai đồng phân vị trí 5-benzoyl và 6-benzoyl.
• Cung cấp dữ liệu thực nghiệm về mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính (SAR) đối với tác động của độ dài mạch alkyl tại vị trí $N\text{-}1$ lên khả năng ức chế dòng tế bào ung thư vú MDA-MB-231.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

• Nghiên cứu chỉ tập trung khảo sát các nhóm thế alkyl mạch thẳng từ $C_3$ đến $C_7$ ($\text{propyl}$, $\text{butyl}$, $\text{pentyl}$, $\text{hexyl}$, $\text{heptyl}$) tại vị trí $N\text{-}1$, chưa mở rộng sang các nhóm alkyl phân nhánh, vòng no (cycloalkyl) hoặc các nhóm thế thơm/dị vòng.
• Phản ứng $N$-alkyl hóa tạo ra hỗn hợp hai đồng phân vị trí ($5\text{a--e}$ và $6\text{a--e}$) với tỷ lệ gần tương đương, đòi hỏi quy trình sắc ký cột phân lập nhiều công đoạn.
• Đánh giá hoạt tính sinh học mới chỉ thực hiện trên một dòng tế bào ung thư vú đơn lẻ (MDA-MB-231) bằng thử nghiệm in vitro SRB, chưa thử nghiệm trên các dòng tế bào ung thư khác và tế bào lành để xác định chỉ số chọn lọc ($SI$).

Hướng phát triển tiếp theo

• Thiết kế và tổng hợp thêm các dẫn xuất benzimidazole mới với các biến thể cấu trúc khác nhau tại vị trí $N\text{-}1$ (nhóm thế phân nhánh, nhóm chứa dị tố hoặc vòng thơm).
• Mở rộng phạm vi sàng lọc hoạt tính kháng ung thư trên nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau và dòng tế bào bình thường.
• Nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động sinh học ở mức độ phân tử, bao gồm khảo sát sự ức chế chu trình tế bào và kích hoạt con đường chết tế bào theo chương trình (apoptosis).

---

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận có giá trị tham khảo hữu ích cho:

• Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh thuộc các chuyên ngành Hóa hữu cơ, Hóa kỹ thuật, Hóa dược, và Dược học quan tâm đến quy trình tổng hợp dị vòng benzimidazole đa thế.
• Các nhà nghiên cứu trong lĩnh vực tổng hợp hữu cơ và phát triển thuốc:
  • Tham khảo quy trình ngưng tụ tạo dị vòng benzimidazole có xúc tác $\text{Na}_2\text{S}_2\text{O}_5$ với hiệu suất ổn định.
  • Tham khảo phương pháp luận và kỹ thuật giải phổ 2D-NMR (đặc biệt là phổ NOESY và HMBC) để xác định vị trí nhóm thế và phân biệt các cặp đồng phân vị trí khó tách trong hóa học dị vòng bất đối xứng.
  • Sử dụng giao thức thực nghiệm chuẩn về thử nghiệm độc tính tế bào in vitro bằng phương pháp nhuộm SRB trên đĩa 96 giếng.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Hợp chất nền (2-(4-methoxyphenyl)-1H-benzo[d]imidazol-5(6)-yl)(phenyl)methanone (hợp chất 3) được tổng hợp từ những tiền chất nào và điều kiện phản ứng ra sao?

Hợp chất 3 được tổng hợp bằng phản ứng ngưng tụ giữa (3,4-diaminophenyl)(phenyl)methanone (1) và 4-methoxybenzaldehyde (2) dưới sự hiện diện của xúc tác natri metabisulfite ($\text{Na}_2\text{S}_2\text{O}_5$), sử dụng hệ dung môi $\text{EtOH}:\text{H}_2\text{O}$ ($9:1$, v/v). Sản phẩm sau tinh chế thu được ở dạng chất rắn màu trắng đục với hiệu suất dao động từ $53%$ đến $82%$.

2. Phương pháp nào được sử dụng để phân biệt chính xác hai đồng phân vị trí 5-benzoyl (5a–e) và 6-benzoyl (6a–e)?

Cấu trúc của hai đồng phân vị trí được phân biệt nhờ sự kết hợp của các kỹ thuật 2D-NMR trên máy đo $600\ \text{MHz}$:

• Phổ NOESY được dùng để quan sát tương tác không gian giữa proton $\text{H-}1''$ (carbon đầu mạch của nhóm alkyl gắn vào $N\text{-}1$) và proton thơm $\text{H-}7$ của nhân benzimidazole.
• Phổ HMBC xác nhận tương tác liên kết xa ($^{2}J_{\text{CH}}$ và $^{3}J_{\text{CH}}$) giữa proton $\text{H-}1''$ với các carbon $\text{C-}2$ và $\text{C-}8$.

3. Phản ứng N-alkyl hóa hợp chất 3 được tiến hành trong điều kiện dung môi và xúc tác bazơ nào?

Phản ứng $N$-alkyl hóa được thực hiện bằng cách cho hợp chất 3 phản ứng với các alkyl bromide tương ứng ($4\text{a--e}$, tỷ lệ mol $1:3$) trong dung môi dimethyl sulfoxide (DMSO), sử dụng bazơ potassium carbonate ($\text{K}_2\text{CO}_3$) ở nhiệt độ phòng. Tổng hiệu suất của phản ứng alkyl hóa đạt từ $50%$ đến $98%$.

4. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế tăng sinh trên dòng tế bào ung thư vú MDA-MB-231 đạt được như thế nào?

Thử nghiệm sinh học in vitro bằng phương pháp SRB cho thấy hợp chất nền 3 cùng hai dẫn xuất $N$-alkyl hóa là $6\text{b}$ ($N\text{-butyl}$, đồng phân 6-benzoyl) và $6\text{d}$ ($N\text{-hexyl}$, đồng phân 6-benzoyl) thể hiện hoạt tính ức chế tăng sinh rõ rệt đối với tế bào MDA-MB-231 với giá trị $IC_{50}$ nằm trong khoảng $48,58\text{--}70,93\ \mu\text{M}$.

5. Độ tinh khiết của các hợp chất sau khi phân lập bằng sắc ký cột được kiểm soát bằng những hệ pha động TLC nào?

Độ tinh khiết đơn vết của các hợp chất được kiểm tra trên bản mỏng Silica gel $60\ \text{F}_{254}$ dưới bước sóng UV $254\ \text{nm}$ và $365\ \text{nm}$ trên 3 hệ dung môi:

• Hệ A: $n$-Hexane : Ethyl acetate ($3:2$, v/v).
• Hệ B: $\text{CHCl}_3 : \text{MeOH}$ ($95:5$, v/v).
• Hệ C: $\text{CH}_2\text{Cl}_2 : \text{EtOH}$ ($95:5$, v/v).

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Lê Quốc Tuấn đã thực hiện thành công quy trình tổng hợp hợp chất nền (2-(4-methoxyphenyl)-1H-benzo[d]imidazol-5(6)-yl)(phenyl)methanone (3) và chuỗi 10 dẫn xuất $N$-alkyl hóa ($5\text{a--e}$, $6\text{a--e}$) với các mạch alkyl từ $C_3$ đến $C_7$. Toàn bộ các sản phẩm đã được phân lập đơn chất bằng sắc ký cột và xác định cấu trúc toàn diện thông qua hệ thống dữ liệu phổ UV-Vis, FT-IR, HRMS cùng các kỹ thuật 1D và 2D-NMR (NOESY, HMBC). Kết quả thử nghiệm sinh học bằng phương pháp SRB ghi nhận các hợp chất 3, $6\text{b}$ và $6\text{d}$ có hoạt tính ức chế tăng sinh đối với dòng tế bào ung thư vú MDA-MB-231 với giá trị $IC_{50}$ đạt từ $48,58\ \mu\text{M}$ đến $70,93\ \mu\text{M}$, tạo tiền đề thực nghiệm cho các nghiên cứu tối ưu hóa cấu trúc thuốc kháng ung thư tiếp theo.

Trích đoạn nội dung tài liệu

VIETNAM GENERAL CONFEDERATION OF LABOUR TON DUC THANG UNIVERSITY FACULTY OF APPLIED SCIENCE LE QUOC TUAN SYNTHESIS AND ANTIPROLIFERATIVE EVALUATION OF N- ALKYLATED (2-(4- METHOXYPHENYL)-1H- BENZO[D]IMIDAZOL-5(6)- YL)(PHENYL)METHANONE DERIVATIVES UNDERGRADUATE THESIS OF CHEMICAL ENGINEERING ORGANIC SYNTHESIS HO CHI MINH CITY, YEAR 2023 VIETNAM GENERAL CONFEDERATION OF LABOUR TON DUC THANG UNIVERSITY FACULTY OF APPLIED SCIENCE LE QUOC TUAN- 61602260 SYNTHESIS AND ANTIPROLIFERATIVE EVALUATION OF N- ALKYLATED (2-(4- METHOXYPHENYL)-1H- BENZO[D]IMIDAZOL-5(6)- YL)(PHENYL)METHANONE DERIVATIVES UNDERGRADUATE THESIS OF CHEMICAL ENGINEERING ORGANIC SYNTHESIS Advised by Assoc. Hoang Thi Kim Dung M., Phan Ngoc Kim Ngan HO CHI MINH CITY, YEAR 2023 ACKNOWLEDGMENT I sincerely thank all Faculty of Applied Sciences lecturers who provided me with valuable information in their respective fields. Headforemost, I want to express my thankful gratitude to Assoc. Hoang Thi Kim Dung, for all of her guidance and support throughout the writing of my thesis and her kindness, patience, and knowledge.

In addition to writing and conducting academic research in organic chemistry, I have received many helpful and constructive recommendations about my field. Additionally, I would like to thank Ms. Phan Ngoc Kim Ngan, who has supported and managed my project and has been encouraging and instructive throughout the research. Her extensive knowledge and academic guidance were crucial in assisting me in completing my thesis.

Besides, I'd like to thank everyone in the Organic Chemistry and Polymer department for their continued friendliness and assistance during the period with report documents and presentations. Finally, I sincerely thank my family, especially my parents. Through every accomplishment in my life, they have always been there for me with their unconditional love and wholehearted support. Ho Chi Minh City, day … month … 2023 Author This thesis was carried out at Ton Duc Thang University.

Hoang Thi Kim Dung M., Phan Ngoc Kim Ngan This thesis is defended at the Undergraduate Thesis Examination Committee was hold at Ton Duc Thang University on… Confirmation of the Chairman of the Undergraduate Thesis Examination Committee and the Dean of the faculty after receiving the modified thesis (if any). CHAIRMAN DEAN OF FACULTY. DECLARATION OF AUTHORSHIP I hereby declare that this thesis was carried out by myself under the guidance and supervision of Assoc. Hoang Thi Kim Dung, and that the work and the results contained in it are original and have not been submitted anywhere for any previous purposes.

The data and figures presented in this thesis are for analysis, comments, and evaluations from various resources by my own work and have been duly acknowledged in the reference part. In addition, other comments, reviews, and data used by other authors and organizations have been acknowledged, and explicitly cited. I will take full responsibility for any fraud detected in my thesis. Ton Duc Thang University is unrelated to any copyright infringement caused on my work (if any) Ho Chi Minh City, day month year Author i ABSTRACT In this thesis, ten (2-(4-methoxyphenyl)-1H-benzo[d]imidazol-5(6)- yl)(phenyl)methanone derivative was successfully synthesis via condensation of the o-phenylenediamine derivative with aromatic aldehyde derivative in the presence of Na2S2O5 using the mixed solvent of EtOH: H2O (9:1, v/v).

Subsequently, ten derivatives of N-alkylated benzimidazole were designed and synthesized by alkylation reactions in the presence of K2CO3 using dimethyl sulfoxide as a solvent. All synthesized compounds were characterized by HPLC, UV-Vis, FT-IR, 1D and 2D-NMR, and HRMS. The antiproliferative test determined activity against a human breast cancer cell line (MDA-MB-231) by the SRB method. The results revealed that compounds 3, 6b, and 6d displayed antiproliferative activities against tested cancer cell line with IC50 values ranging from 48,58- 70,93 M.

TÓM TẮT Trong luận văn này, 10 dẫn xuất của (2-(4-methoxyphenyl)-1H- benzo[d]imidazol-5(6)-yl)(phenyl)methanone đã được tổng hợp thành công bằng phản ứng ngưng tụ giữa dẫn xuất của o-phenylenediamine và dẫn xuất andehyde aldehyde thơm có sử dụng xúc tác Na2S2O5 trong hỗn hợp dung môi EtOH: H2O (9:1, v/v). Sau đó, mười dẫn xuất alkyl hóa tại vị trí N-1 của benzimidazole được tổng hợp bằng phản ứng alkyl hóa với xúc tác K2CO3 trong dung môi DMSO. Các hợp chất đã tổng hợp được xác định tính chất bằng HPLC, UV- Vis, FT- IR, 1D và 2D- NMR, và HRMS. Khả năng ức chế tăng sinh tế bào được thử nghiệm trên dong dòng tế bào ung thư vú MDA-MB-231 bằng phương pháp SRB.

Kết quả thử nghiệm cho thấy hợp chất 3, 6b và 6d thể hiện hoạt tính ức chế sự phát triển của dòng tế bào ung thư nghiên cứu với giá trị IC50 từ 48. ii TABLE OF CONTENTS ABSTRACT. i LIST OF FIGURES .v LIST OF SCHEMES. vi LIST OF TABLES.

vii LIST OF ABBREVIATIONS. Overview to 2,5(6)-disubstituted benzimidazole derivatives. Overview to N- alkylated benzimidazole derivatives. Synthesis of N- alkylated.

Materials and instrumentations. Procedure for synthesis of (2-(4-methoxyphenyl)-1H-benzo[d]imidazol-5(6)- yl)(phenyl)methanone (3). General procedure for the synthesis of N- alkylated (2-(4-methoxyphenyl)- 1H-benzo[d]imidazol-5(6)-yl)(phenyl)methanone derivatives. Isolation method and structure determination .21 CHAPTER 3: RESULT AND DISCUSSION .2 N- alkylated (2-(4-methoxyphenyl)-1H-benzo[d]imidazol-5- yl)(phenyl)methanone derivatives.

Suggestion on future work .57 v LIST OF FIGURES Figure 2.1 Illustration of procedure for synthesizing compound 3 .2 Illustration of procedure for synthesizing 5a-e and 6a-e .1 Sample and TLC of 3 .2 Sample and TLC of 5a .3 Sample and TLC of 5b .4 Sample and TLC of 6b .5 Sample and TLC of 5c .8 Sample and TLC of 6c .7 Sample and TLC of 5d .8 Sample and TLC of 6d .9 Sample and TLC of 5e .10 Sample and TLC of 6e .11 UV-Vis absorption spectra of compounds 3, 5a−e, 6a−e.12 1H-NMR spectra of compound 6b (A) and compound 5b (B) Figure 3.13 2D-NMR spectra of 6b. a) NOESY spectrum, correlations between H-7 and H-1” are circled in red color. b) HMBC spectrum, correlations between H-1” and C-2 and C-8 are circled in blue color.14 2D-NMR spectra of 5b. a) NOESY spectrum, correlations between H-7 and H-1” are circled in red color.

b) HMBC spectrum, correlations between H-1” and C-2 and C-8 are circled in blue color. vi LIST OF SCHEMES Scheme 1.1 Benzimidazole structure and numbering rule .2 Phillips's reaction of o-phenylenediamine and oxalic acid .3 Reaction of o-phenylenediamine with anhydride acetic .4 Reaction of 3,4- diamino-toluene with ethyl formate .5 Reaction of aryldiamine with 4-hydroxy-5,8-dimethoxy-2- naphthaldehyde .6 Reaction of o-phenylenediamnie with aldehyde .7 Benzimidazole synthesis by oxidation of air .8 Benzimidazole synthesis with microwave- assisting .9 General structures of compounds 1-6 .10 Compounds 4a and 4b in the study of Nayak et al.11 Structures of compounds 38 and 40 .12 Alkylation reaction of Nale et al.13 Alkylation reaction of Chakraborty et al.14 Structure of compound 4k .15 Structure of compound TJ08 .16 Structure of compound 4c .1 Procedure for synthesis of 3 .2 General procedure for the synthesis of 5a-e, 6a-e .1 General procedure for the synthesis of the final compounds 5a−e, 6a−e. Mechanism of the alkylation reaction .25 vii LIST OF TABLES Table 1.1 Marketed medicines containing benzimidazole moiety .2 IC50 values of compounds 38 and 40 against MDA-MB-231 .3 IC50 values of compound TJ08 against six cancer cells and normal cells .4 List of chemicals .5 List of instrumentations .7 NMR techniques for structure determination were used in this thesis.1 Yield of synthesized .2 Comparison between the 1H-NMR chemical shift of this study with previous reports.3 IC50 of synthesized compounds (3, 5a-e, 6b-e). 52 viii LIST OF ABBREVIATIONS EA ethyl acetate  Chemical shift d doublet dd doublet of doublets DI Water Deion water DMSO dimethyl sulfoxide dt doublet of triplets EtOH ethanol FT- IR Fourier transform Infrared spectroscopy Hex n- hexane HMBC Heteronuclear Multiple Bond Coherence HPLC High- performance Liquid Chromatography HRMS High-Resolution Mass Spectroscopy HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence J Coupling constant m multiplet MeCN acetonitrile MeOH methanol NMR Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Rf retardation factor s singlet t triplet TCA trichloracetic acid TLC Thin Layer Chromatography tt triplet of triplets 1 INTRODUCTION 1.

Introduction Cancer is one of the fatal causes of death worldwide, necessitating the development of novel and effective treatments. Even though modern therapeutic agents have been developed over the last 100 years, the successful treatment of cancer appears to be a formidable challenge at the start of the century. According to GLOBOCAN's 2020 forecast, approximately 19.3 million cancer diagnoses and 10 million cancer deaths are predicted worldwide in 2020. Breast cancer (BC) is 1 in 4 commonly diagnosed cancers and the second most significant cause of cancer-related deaths in women; about 12% of breast cancers are triple negative.

This obstacle results from the challenges of discovering innovative selective medicines that suppress tumor cell development without being harmful to normal cells. Historically, nitrogen-containing heterocycles are an exciting research topic because they are bioactive compounds. Due to their reputation, N-heterocycles are essential for studying biological activities. Among them, benzimidazoles greatly interest many research groups investigating drug development.

Mounting evidence indicates that benzimidazole and its derivatives, with substitutions at the 1, 2, 5, and/or 6-positions, have a vast medicinal profile in multiple categories of therapeutic agents with unique properties, including antimicrobial,anti-hypertensive, anti- tuberculosis, anti-viral, antiulcer, anti-inflammatory, anti-diabetic, anti-convulsant and anti-malarial. In addition, many studies already reveal the potential of benzimidazole derivatives as anticancer medicines. In our previous work, benzimidazole derivatives have been synthesized, and in terms of anticancer activities, (2-(4-methoxyphenyl)-1H-benzo[d]imidazol-5(6)-yl)(phenyl)methanone emerged as multitarget anticancer agent, especially in anticancer effect against breast cancer cell line (MDA-MB-231). Encouraged by these findings, in this study, we considered introducing the alkyl straight chains to the benzimidazole moiety to produce new molecules with the expectation of increasing anticancer activity.

Aims and objectives With the above preamble, the present work entitled "Synthesis and antiproliferative evaluation of N- alkylated (2-(4-methoxyphenyl)-1H- benzo[d]imidazol-5(6)-yl)(phenyl)methanone derivatives" has been done with the following objectives: i. Dealing with developing a method for synthesizing benzimidazole and N-alkylated benzimidazole derivatives and characterizing them by physical and spectral analysis. Dealing with evaluating synthesized derivatives for antiproliferative activity against breast cancer cell line (MDA-MB-231). The objective of the current work has been aimed at achieving the following, i.

To synthesize a nucleus containing benzimidazole. To synthesize targeted N-alkylated benzimidazole isomers. To isolate the N-alkylated benzimidazole derivative in a mixture of positional isomers. To establish the structure based on melting point, UV-Vis, FT-IR, NMR, and HRMS spectra.

To evaluate compounds for antiproliferative activity. Introduction Benzimidazole is a compound consisting of a phenyl ring attached to an imidazole ring that was first synthesized by Hoebrecker by reduction of 2-nitro-4- methylacetanilide to obtain 2,5(or 2,6)- dimethylbenzimidazole in 1872 [1]. In the following years, Ladenburg and Philip found synthetic pathway of benzimidazole by condensing o-phenylenediamine with carbonyl group compounds. Therefore, the preparation of benzimidazole from ortho-amino aniline is referred to as the Ladenburg method, Phillips’s method [2], [3].

In 1949, Brink et al. proved the appearance of a benzimidazole scaffold as the ligand during the degradation of vitamin B12. Consequently, the connection between benzimidazole structure and biological activities was identified [4]. Benzimidazole structure and numbering rules are described in Scheme 1.1 Benzimidazole structure and numbering rule Due to tautomerization, 1H-benzimidazole derivatives exist as isomers.

The two derivatives, 5-methylbenzimidazole, and 6-methylbenzimidazole, illustrate a pair of tautomers and describe the same substance. However, no tautomerization occurs when a substituent at the N-1 position is larger than the hydrogen, but a characteristic isomer forms [1]. Physicochemical properties The benzimidazoles are simply solids with relatively high melting points (1H- benzimidazole, 170°C). Generally, when a substituent is added to the N-1 position, the melting point of benzimidazoles decreases (1-methyl-1H-benzimidazole, 66oC) [5] because benzimidazoles cannot form intermolecular hydrogen bonds because the hydrogen is at N- 1 was replaced.

4 The 1H-benzimidazoles are highly soluble in polar solvents and sparingly soluble in nonpolar solvents. When substituents of different polarities are attached to the benzimidazole ring, they are soluble in the respective solvent. For example, 2- methylbenzimidazole is well-soluble in the ether, while 2-aminobenzimidazole is highly soluble in water [14]. Application Benzimidazole derivatives have been applied in a variety of industries: textile dying [6], semi-conduction [7], and anti-corrosion [8],.