Nghiên Cứu Hóa Học Và Hoạt Tính Sinh Học Của Một Số Hợp Chất Từ Vi Nấm Biển Phân Lập Tại Miền Trung Việt Nam

Luận án tiến sĩ về hoạt tính sinh học của hợp chất tử vi nấm biển tại miền Trung Việt Nam

• Tác giả: Phan Thị Hoài Trinh
• Người hướng dẫn: PGS. Phí Quyết Tiến
• Trường học: Học Viện Khoa Học Và Công Nghệ Việt Nam
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Hóa Học Và Hoạt Tính Sinh Học Của Một Số Hợp Chất Từ Vi Nấm Biển Phân Lập Tại Miền Trung Việt Nam
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• Trang phụ bìa
• Lời cam đoan
• Lời cảm ơn
• Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt
• Danh mục các bảng
• Danh mục các hình
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU CHUNG VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ VI NẤM BIỂN
• 1.1. Các hợp chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học từ vi nấm biển
• 1.1.1. Chất kháng sinh
• 1.1.2. Chất gây độc tế bào ung thư
• 1.1.3. Chất chống oxy hóa
• 1.1.4. Chất bảo vệ tế bào thần kinh
• 1.1.5. Một số chất có hoạt tính sinh học khác
• 1.2. Đa dạng sinh học vi nấm biển
• 1.3. Một số đặc tính sinh học của vi nấm biển
• 1.4. Nghiên cứu sàng lọc vi nấm biển sinh tổng hợp hoạt chất sinh học
• 1.5. Môi trường lên men và ảnh hưởng của điều kiện lên men đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh của vi nấm biển
• 1.5.1. Đặc điểm của quá trình lên men sinh chất kháng sinh
• 1.5.2. Môi trường lên men vi nấm sinh kháng sinh
• 1.5.2.1. Lên men rắn
• 1.5.2.2. Lên men chìm
• 1.5.3. Ảnh hưởng của điều kiện lên men đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh của vi nấm biển
• 1.5.3.1. Ảnh hưởng của thời gian lên men
• 1.5.3.2. Ảnh hưởng của nồng độ muối
• 1.5.3.3. Ảnh hưởng của pH
• 1.5.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ
• 1.5.3.5. Ảnh hưởng của nguồn carbon và nitơ
• 1.6. Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc hóa học chất chuyển hóa thứ cấp từ vi nấm biển
• 1.6.1. Phân lập chất chuyển hóa thứ cấp từ vi nấm biển
• 1.6.2. Xác định cấu trúc hóa học chất chuyển hóa thứ cấp từ vi nấm biển
• 1.7. Xu hướng nghiên cứu các hoạt chất sinh học từ vi nấm biển trên thế giới và ở Việt Nam
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu và môi trường nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Phân lập vi nấm biển
• 2.2.2. Đánh giá hoạt tính kháng VSV kiểm định của các chủng vi nấm biển
• 2.2.3. Phân tích cặn chiết của các chủng vi nấm có hoạt tính kháng sinh cao
• 2.2.4. Xác định đặc điểm hình thái và phân loại vi nấm biển
• 2.2.5. Xác định điều kiện lên men rắn thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh của vi nấm biển
• 2.2.6. Phân tách các hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ vi nấm biển
• 2.2.6.1. Phân tách các hợp chất từ chủng vi nấm A.
• 2.2.6.2. Phân tách các hợp chất từ chủng vi nấm Aspergillus sp.
• 2.2.6.3. Phân tách các hợp chất từ chủng vi nấm P.
• 2.2.7. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ vi nấm biển
• 2.2.8. Xác định hoạt tính sinh học của các hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ vi nấm biển
• 2.2.8.1. Xác định hoạt tính kháng VSV kiểm định
• 2.2.8.2. Xác định hoạt tính gây độc tế bào
• 2.2.8.3. Xác định hoạt tính chống oxy hóa
• 2.2.8.4. Xác định hoạt tính bảo vệ tế bào thần kinh
• 2.2.9. Xử lý số liệu nghiên cứu
• 2.2.10. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát trong luận án
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Phân lập và sàng lọc hoạt tính kháng VSV kiểm định của vi nấm biển
• 3.1.1. Số lượng chủng vi nấm biển thu nhận theo địa điểm và nguồn phân lập
• 3.1.2. Đặc điểm hình thái của vi nấm biển
• 3.1.3. Hoạt tính kháng VSV kiểm định của vi nấm biển
• 3.2. Phân tích cặn chiết thô và xác định đặc điểm phân loại của 08 chủng vi nấm biển tuyển chọn
• 3.2.1. Phân tích cặn chiết thô của 08 chủng vi nấm biển tuyển chọn
• 3.2.2. Xác định đặc điểm hình thái và phân loại 08 chủng vi nấm biển tuyển chọn
• 3.3. Xác định điều kiện lên men rắn thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh của 03 chủng vi nấm biển tuyển chọn
• 3.3.1. Khảo sát thời gian lên men
• 3.3.2. Khảo sát nồng độ muối biển
• 3.3.3. Khảo sát pH ban đầu
• 3.4. Tách chiết, tinh sạch và xác định cấu trúc các hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ chủng vi nấm biển tuyển chọn
• 3.4.1. Tách chiết, tinh sạch và xác định cấu trúc các hợp chất từ chủng vi nấm A.
• 3.4.2. Tách chiết, tinh sạch và xác định cấu trúc các hợp chất từ chủng vi nấm Aspergillus sp.
• 3.4.3. Tách chiết, tinh sạch và xác định cấu trúc các hợp chất từ chủng vi nấm P.
• 3.5. Xác định hoạt tính sinh học của 14 hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ 03 chủng vi nấm biển tuyển chọn
• 3.5.1. Xác định hoạt tính kháng VSV kiểm định
• 3.5.2. Xác định hoạt tính gây độc tế bào
• 3.5.3. Xác định hoạt tính chống oxy hóa
• 3.5.4. Xác định hoạt tính bảo vệ tế bào thần kinh
• 4. CHƯƠNG 4: THẢO LUẬN KẾT QUẢ
• 4.1. Hình thái và hoạt tính kháng VSV kiểm định của vi nấm biển miền Trung Việt Nam
• 4.2. Đặc tính của các chủng vi nấm biển có tiềm năng sinh tổng hợp các hoạt chất sinh học
• 4.3. Điều kiện lên men rắn thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh của vi nấm biển
• 4.4. Các hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ 03 chủng vi nấm biển tuyển chọn
• 4.5. Hoạt tính sinh học của 14 hợp chất thu nhận từ 03 chủng vi nấm biển tuyển chọn
• 4.5.1. Hoạt tính kháng VSV kiểm định
• 4.5.2. Hoạt tính gây độc tế bào, chống oxy hóa và bảo vệ tế bào thần kinh
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Giới thiệu về hoạt tính sinh học từ vi nấm biển

Vi nấm biển đã được chứng minh là nguồn cung cấp phong phú các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học. Các hợp chất này không chỉ đa dạng về cấu trúc mà còn có nhiều ứng dụng trong y học, bao gồm hoạt tính kháng sinh, chống ung thư, và chống oxy hóa. Theo các nghiên cứu gần đây, vi nấm biển có khả năng sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp có giá trị cao, đặc biệt là trong việc phát triển các loại thuốc mới. Đặc biệt, nghiên cứu đã chỉ ra rằng nhiều hợp chất từ vi nấm biển có thể giúp chống lại các bệnh truyền nhiễm và các bệnh nan y mà hiện nay đang là mối đe dọa lớn đối với sức khỏe cộng đồng. Một số hợp chất nổi bật như cephalosporin C và gliotoxin đã được phát hiện từ vi nấm biển, mở ra hướng đi mới trong việc phát triển dược phẩm từ nguồn tài nguyên này.

II. Các chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học từ vi nấm biển

Nghiên cứu đã xác định được nhiều chất chuyển hóa thứ cấp từ vi nấm biển với hoạt tính sinh học khác nhau. Trong số đó, các hợp chất kháng sinh như cephalosporin C và gliotoxin nổi bật với khả năng tiêu diệt vi khuẩn. Nghiên cứu cho thấy rằng vi nấm thuộc các chi như Aspergillus và Penicillium là nguồn chính của các hợp chất này. Các hợp chất này không chỉ có tác dụng kháng khuẩn mà còn có khả năng gây độc tế bào ung thư, chống oxy hóa và bảo vệ tế bào thần kinh. Điều này cho thấy tiềm năng lớn của vi nấm biển trong việc phát triển các liệu pháp điều trị mới, đặc biệt trong bối cảnh kháng kháng sinh ngày càng gia tăng. Các nghiên cứu trong giai đoạn 2000-2010 đã công bố hàng trăm hợp chất mới từ vi nấm biển, khẳng định vị trí quan trọng của nó trong ngành dược.

III. Đánh giá hoạt tính sinh học của hợp chất tử vi nấm biển

Hoạt tính sinh học của các hợp chất tử vi từ vi nấm biển đã được đánh giá qua nhiều phương pháp khác nhau. Các nghiên cứu cho thấy rằng các hợp chất như phomaligol A2, wasabidienone E, và aspertetranone D có khả năng kháng vi sinh vật rất cao. Ngoài ra, một số hợp chất cũng cho thấy khả năng gây độc tế bào ung thư, mở ra triển vọng cho việc sử dụng chúng trong điều trị ung thư. Các thử nghiệm về hoạt tính chống oxy hóa cũng cho thấy hiệu quả tích cực, góp phần bảo vệ tế bào khỏi tổn thương do gốc tự do. Điều này cho thấy rằng việc khai thác các hợp chất từ vi nấm biển không chỉ mang lại lợi ích trong việc phát triển thuốc mới mà còn có thể ứng dụng rộng rãi trong y học hiện đại.

IV. Kết luận và hướng nghiên cứu tiếp theo

Nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các hợp chất tử vi từ vi nấm biển tại miền Trung Việt Nam đã mở ra nhiều triển vọng mới trong lĩnh vực dược phẩm. Các hợp chất mới được phát hiện không chỉ có giá trị nghiên cứu mà còn có thể ứng dụng thực tiễn trong điều trị bệnh. Việc tiếp tục khai thác và nghiên cứu các vi nấm biển khác có thể giúp phát hiện thêm nhiều hợp chất mới với hoạt tính sinh học tiềm năng. Hướng nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình chiết xuất và tinh chế các hợp chất này để nâng cao hiệu quả sử dụng trong y học. Đồng thời, cần có thêm nhiều nghiên cứu về cơ chế tác động của các hợp chất này để hiểu rõ hơn về tiềm năng ứng dụng trong điều trị bệnh.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Bệnh truyền nhiễm và các bệnh nan y tiếp tục là mối đe dọa lớn đối với sức khỏe cộng đồng. Tình trạng này trở nên phức tạp hơn tại các quốc gia đang phát triển do sự khan hiếm nguồn thuốc điều trị mới và sự gia tăng nhanh chóng của các chủng vi sinh vật kháng kháng sinh. Trong bối cảnh nguồn dược chất từ sinh vật trên cạn ngày càng cạn kiệt, các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học từ vi sinh vật biển—đặc biệt là vi nấm biển—trở thành đối tượng nghiên cứu quan trọng của ngành y dược học và công nghệ sinh học.

Hệ sinh thái biển có điều kiện sống đặc thù như độ mặn cao, áp suất lớn, nhiệt độ biến đổi và cạnh tranh sinh học gay gắt. Các đặc điểm môi trường này thúc đẩy vi nấm biển hình thành các con đường trao đổi chất đặc trưng, sản sinh các chất chuyển hóa thứ cấp có cấu trúc hóa học đa dạng và hoạt tính sinh học giá trị như kháng sinh, gây độc tế bào ung thư, chống oxy hóa và bảo vệ tế bào thần kinh.

Việt Nam sở hữu hơn 3.200 km bờ biển với hệ sinh thái biển nhiệt đới phong phú, đặc biệt là khu vực miền Trung với các rạn san hô và sinh vật biển đa dạng. Tuy nhiên, trước thời điểm nghiên cứu, phần lớn các dự án trong nước chỉ tập trung khảo sát hoạt tính sinh học từ vi khuẩn và xạ khuẩn biển; các nghiên cứu về vi nấm biển còn phân tán, chủ yếu dừng lại ở mức độ sàng lọc hoạt tính thô từ dịch chiết hoặc khảo sát trên số lượng chủng hạn chế. Khoảng trống nghiên cứu mà tác giả xác định là sự thiếu vắng một công trình nghiên cứu hệ thống từ phân lập, định danh hình thái, giải trình tự gen, tối ưu hóa điều kiện lên men rắn, đến phân tách tinh sạch, xác định cấu trúc hóa học bằng các phương pháp phổ hiện đại và đánh giá hoạt tính sinh học đa diện của các hợp chất tinh sạch từ vi nấm biển phân lập tại vùng biển miền Trung Việt Nam.

Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

Mục tiêu nghiên cứu: Thu nhận các hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ vi nấm biển phân lập ở vùng biển miền Trung và xác định một số hoạt tính sinh học (kháng sinh, gây độc tế bào, chống oxy hóa, bảo vệ tế bào thần kinh) của các hợp chất sạch thu được.

Nội dung nghiên cứu (đánh số theo văn bản):

1. Phân lập, đánh giá hoạt tính kháng sinh và tuyển chọn các chủng vi nấm biển cho nghiên cứu tiếp theo.
2. Xác định điều kiện lên men rắn thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh thô của chủng vi nấm biển tuyển chọn.
3. Phân tách, tinh sạch và xác định cấu trúc của các hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ cặn chiết lên men chủng vi nấm tuyển chọn.
4. Xác định hoạt tính sinh học của các hợp chất chuyển hóa thứ cấp tinh sạch được thu nhận trong nghiên cứu.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu:
  • 273 chủng vi nấm biển phân lập từ các mẫu trầm tích, nước biển, sinh vật biển (hải miên, san hô, rong biển) thu thập tại miền Trung Việt Nam.
  • Các hợp chất chuyển hóa thứ cấp tinh sạch phân tách từ cặn chiết lên men của các chủng vi nấm biển tuyển chọn: Aspergillus flocculosus 01NT.3, Aspergillus sp. và Penicillium chrysogenum 045-357-2.
  • Các chủng vi sinh vật kiểm định và các dòng tế bào phục vụ thử nghiệm hoạt tính sinh học: tế bào ung thư người, tế bào thần kinh chuột Neuro2a.
• Phạm vi không gian: Vùng biển miền Trung Việt Nam, tập trung tại các địa điểm lấy mẫu thuộc tỉnh Ninh Thuận, vùng biển Nha Trang (Khánh Hòa) và thành phố Đà Nẵng.
• Phạm vi thời gian và tổ chức thực hiện: Nghiên cứu được thực hiện và hoàn thành năm 2019 tại Viện Công nghệ sinh học và Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang thuộc Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước được điểm lại trong luận án

Tác giả đã hệ thống hóa các hướng nghiên cứu chuyển hóa thứ cấp và hoạt tính sinh học từ vi nấm biển trên thế giới và tại Việt Nam qua các nhóm nội dung chính:

1. Nghiên cứu chất kháng sinh từ vi nấm biển:

   • Lịch sử nghiên cứu ghi nhận công trình của Abraham vào thập niên 1950 phân lập kháng sinh β-lactam cephalosporin C từ vi nấm Cephalosporium spp. (hiện nay là Acremonium spp.) tại đảo Sardinia (Ý).
   • Cuối thập niên 1970, gliotoxin được phân lập từ Aspergillus sp. MO-10 ở vùng biển Seto.
   • Các công trình giai đoạn 2011–2018 được tổng hợp: Zheng và cộng sự (2013) phân lập 2 hợp chất mới từ Aspergillus flocculosus PT05-1 có hoạt tính kháng Enterobacter aerogenes (MIC 1,6 và 3,7 µM); Gu và cộng sự (2018) phân lập 9 alkaloid pyrrolidine từ A. flocculosus 16D-1 có khả năng kháng viêm; Chen và cộng sự (2016) phân lập chrysamide A–C từ Penicillium chrysogenum SCSIO41001 ở Ấn Độ Dương; Zhen và cộng sự (2018) phân lập chrysoxanthone A–C từ P. chrysogenum HLS111 cộng sinh hải miên Gelliodes carnosa.

2. Nghiên cứu chất gây độc tế bào ung thư:

   • Wang và cộng sự (2013) phân lập anthraquinone SZ-685C từ vi nấm Halorosellinia sp. 1403 kháng dòng tế bào ung thư vòm họng CNE2, CNE2R và các dòng ung thư vú, tuyến tiền liệt, gan.
   • Garo và cộng sự (2003) phân lập trichodermamide B từ Trichoderma virens CNL910 gây độc tế bào ung thư đại tràng.
   • Zhou và cộng sự (2013) xác định cephalimysin A từ A. fumigatus OPUST106B-5 gây độc tế bào bạch cầu P-388 và HL-60.
   • Hợp chất plinabulin (NPI-2358) phát triển từ halimide của Aspergillus sp. CNC-139 bước vào thử nghiệm lâm sàng giai đoạn 3 điều trị ung thư phổi.

3. Nghiên cứu chất chống oxy hóa và bảo vệ tế bào thần kinh:

   • Samanthi và cộng sự (2015) phân lập hai polyketide từ P. citrinum US/PA/06 bắt gốc tự do DPPH với IC50 159,7 và 68,6 µg/mL.
   • Zhao và cộng sự (2009) công bố xyloketal B từ Xylaria sp. 2508 có hoạt tính bảo vệ tế bào thần kinh trước độc tính của MPP+.
   • Các công trình khác chứng minh vai trò của neoechinulin A và axit secalonic A từ A. ochraceus trong việc cải thiện thoái hóa thần kinh trên mô hình thực nghiệm tế bào PC12 và SH-SY5Y.

4. Nghiên cứu điều kiện lên men và chiến lược khai thác:

   • So sánh hai phương thức lên men rắn (Solid State Fermentation – SSF) và lên men chìm (Submerged Fermentation – SmF). Liu và cộng sự (2015) chứng minh lên men rắn trên môi trường gạo giúp Penicillium adametzioides AS-53 sinh tổng hợp các hợp chất mới không xuất hiện trong môi trường lỏng.
   • Bode và cộng sự đề xuất chiến lược OSMAC (One-Strain-Many-Compounds) trên A. ochraceus, kích hoạt các cụm gen sinh tổng hợp im lặng (Biosynthetic Gene Clusters – BGCs) bằng cách thay đổi độ mặn, nhiệt độ, pH và môi trường nuôi cấy.
   • Nuôi cấy kết hợp: Cuvalier và cộng sự phát hiện pestalone từ Pestalotia sp. CNL-365 khi đồng nuôi cấy với vi khuẩn Gram âm CNJ-328; Frank và cộng sự (2019) thu nhận axit ochraspergillic A, B khi đồng nuôi cấy A. ochraceus với Bacillus subtilis.

5. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam:

   • Đề tài cấp Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam giai đoạn 2013–2018 khảo sát hơn 250 chủng vi khuẩn và xạ khuẩn biển (Nocardiopsis sp. G057, Streptomyces sp. G278).
   • Lê Mai Hương và cộng sự khảo sát 38 chủng vi nấm biển, phát hiện dịch chiết P. citrinum BB8 kháng vi sinh vật kiểm định.
   • Cao Ngọc Điệp (33 chủng nấm từ hải miên Kiên Giang) và Nguyễn Tấn Bình (2018) nghiên cứu chủng P. citrinum ND7a.

Vị trí và khoảng trống luận án giải quyết

Phần lớn công trình trong nước trước đó chỉ dừng lại ở khảo sát hoạt tính thô hoặc tập trung vào vi khuẩn và xạ khuẩn. Luận án của Phan Thị Hoài Trinh định vị là nghiên cứu tiếp cận toàn diện từ nguồn tài nguyên vi nấm biển miền Trung Việt Nam: thực hiện sàng lọc quy mô lớn (273 chủng), kết hợp định danh phân tử (ITS/28S rDNA), tối ưu hóa quy trình lên men rắn (SSF), phân lập và giải cấu trúc đầy đủ các hợp chất thứ cấp bằng NMR 1D/2D và ESI-MS, đồng thời kiểm tra đồng thời 4 nhóm hoạt tính sinh học.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết

• Sinh lý học chuyển hóa thứ cấp: Sự tích tụ các chất chuyển hóa thứ cấp thường diễn ra mạnh mẽ nhất ở giữa và cuối pha cân bằng của quá trình sinh trưởng vi sinh vật khi nguồn dinh dưỡng bắt đầu cạn kiệt.
• Kỹ thuật lên men rắn (SSF): Môi trường rắn ẩm (như giá thể gạo) mô phỏng cấu trúc cơ chất tự nhiên, tạo điều kiện cho hệ sợi nấm phát triển dày đặc bám trên bề mặt, giảm ức chế dị hóa và tăng sản lượng các hợp chất thứ cấp.
• Định danh phân loại học: Kết hợp phân loại hình thái đại thể/vi thể với phân loại học phân tử dựa trên vùng trình tự phiên mã nội bộ (ITS) và phân đoạn gen 28S rDNA.
• Sàng lọc hóa học: Phân tích cặn chiết thô bằng sắc ký bản mỏng (TLC) kết hợp phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ($^1\text{H}$-NMR) nhằm phát hiện sớm các tín hiệu proton vùng trường thấp (vòng thơm, olefinic) và các nhóm thế đặc trưng trước khi tách chiết phân đoạn lớn.

Phương pháp nghiên cứu thực tế

Luận án kết hợp các phương pháp thực nghiệm định lượng và phân tích cấu trúc hóa lý:

[273 chủng vi nấm biển] 
[Sàng lọc hoạt tính kháng VSV & Phân tích TLC / 1H-NMR]
[Tuyển chọn 08 chủng & Định danh phân tử ITS/28S rDNA]
[Tuyển chọn 03 chủng nghiên cứu sâu]
[Tối ưu hóa điều kiện lên men rắn SSF (thời gian, muối biển, pH)]
[Chiết Ethyl Acetate & Phân tách sắc ký (Silica gel, C18, Sephadex LH-20, HPLC)]
[Xác định cấu trúc: ESI-MS, NMR 1D & 2D (1H, 13C, COSY, HSQC, HMBC, NOESY/ROESY)]
[Thu nhận 14 hợp chất sạch (bao gồm 04 hợp chất mới)]
[Thử nghiệm hoạt tính sinh học: Kháng VSV, Độc tế bào, Chống oxy hóa, Bảo vệ tế bào thần kinh]

1. Phương pháp vi sinh và phân loại học:

   • Phân lập vi nấm biển trên môi trường thạch nước biển từ các mẫu tự nhiên.
   • Sàng lọc hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch.
   • Tách chiết ADN tổng số, thực hiện phản ứng khuếch đại chuỗi polymerase (PCR) vùng ITS và 28S rDNA, giải trình tự gen và đối chiếu cây phát sinh loài trên ngân hàng dữ liệu GenBank.

2. Phương pháp lên men rắn:

   • Nuôi cấy vi nấm trên môi trường gạo ẩm (bổ sung dịch chiết nấm men, muối biển).
   • Khảo sát các thông số đơn yếu tố: thời gian lên men (ngày), nồng độ muối biển (%), giá trị pH ban đầu nhằm xác định điều kiện tối ưu cho sự tích tụ sinh khối và hoạt tính kháng sinh thô.

3. Phương pháp hóa học và phân tách sắc ký:

   • Chiết xuất sinh khối và môi trường lên men bằng dung môi ethyl acetate.
   • Phân tách phân đoạn bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng (n-hexane, methanol 85-90%).
   • Tinh sạch các hợp chất bằng sắc ký cột cổ điển (Silica gel pha thuận, pha đảo C18, rây phân tử Sephadex LH-20) và hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) điều chế/bán điều chế với đầu dò khúc xạ (RI) hoặc đầu dò tử ngoại (UV).

4. Phương pháp phân tích quang phổ xác định cấu trúc:

   • Phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI-MS).
   • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều ($^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR) và hai chiều ($^1\text{H}$-$^1\text{H}$ COSY, HSQC, HMBC, NOESY, ROESY).
   • Phổ hấp thụ hồng ngoại (IR).
   • So sánh dữ liệu phổ với phần mềm và cơ sở dữ liệu hóa học quốc tế (SciFinder).

5. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học:

   • Kháng vi sinh vật kiểm định: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) theo tiêu chuẩn của Viện Tiêu chuẩn Lâm sàng và Xét nghiệm (CLSI) trên các chủng vi khuẩn Gram dương, Gram âm và nấm men chuẩn ATCC.
   • Gây độc tế bào ung thư: Xác định giá trị IC50 trên các dòng tế bào ung thư người (A-549, HeLa, MCF-7, HT-29, HL-60, PC-3, ACHN...).
   • Chống oxy hóa: Đo khả năng khử gốc tự do 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH).
   • Bảo vệ tế bào thần kinh: Đánh giá tỷ lệ sống sót của dòng tế bào thần kinh chuột Neuro2a chịu tác động gây độc bởi 6-hydroxydopamine (6-OHDA).

---

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu và Tổng quan tài liệu

Chương mở đầu và tổng quan tài liệu làm rõ tính cấp thiết, mục tiêu và cơ sở khoa học của việc khai thác các chất chuyển hóa thứ cấp từ vi nấm biển. Tác giả trình bày bức tranh toàn cảnh về đa dạng sinh học vi nấm biển, phân tích cấu trúc của các nhóm hợp chất chuyển hóa thứ cấp tiêu biểu đã được công bố từ các chi Penicillium, Aspergillus, Acremonium, Trichoderma. Chương này cũng phân tích sâu về động học quá trình lên men vi sinh vật, vai trò của phương pháp lên men rắn (SSF) so với lên men chìm (SmF), cũng như ảnh hưởng của các yếu tố môi trường (nhiệt độ, độ mặn, pH, nguồn dinh dưỡng carbon/nitơ) đến khả năng tổng hợp kháng sinh. Tác giả chỉ ra rằng các loài nấm Aspergillus flocculosus và Penicillium chrysogenum có nguồn gốc biển là nguồn tài nguyên dồi dào nhưng chưa được nghiên cứu chi tiết tại Việt Nam.

Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết toàn bộ trang thiết bị, hóa chất, chủng vi sinh vật chuẩn, dòng tế bào ung thư và quy trình thực nghiệm. Các quy trình từ phân lập 273 chủng nấm, quan sát hình thái, nuôi cấy, kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn thô, phân tích TLC/$^1\text{H}$-NMR được chuẩn hóa. Quy trình phân tách 14 hợp chất từ cặn chiết lên men rắn của 03 chủng nấm tuyển chọn (A. flocculosus 01NT.3, Aspergillus sp., và P. chrysogenum 045-357-2) được thiết lập thông qua hệ thống sắc ký nhiều cấp (Silica gel, Sephadex LH-20, C18, HPLC). Quy trình đo phổ NMR (1D và 2D) và các phép thử nghiệm sinh học (MIC, IC50, DPPH, Neuro2a) được trình bày với đầy đủ các công thức tính toán và xử lý số liệu.

Kết quả nghiên cứu

Chương kết quả trình bày toàn bộ số liệu thực nghiệm thu được qua các giai đoạn nghiên cứu:

1. Phân lập và sàng lọc vi nấm biển:

   • Thu nhận tổng cộng 273 chủng vi nấm biển từ 3 vùng biển: Ninh Thuận, Nha Trang và Đà Nẵng.
   • Thống kê đặc điểm hình thái khuẩn lạc của 273 chủng (hình dạng, bề mặt, độ dày, viền và màu sắc khuẩn lạc).
   • Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của 273 chủng; tuyển chọn 08 chủng vi nấm biển có hoạt tính ức chế mạnh nhất.
   • Phân tích cặn chiết thô của 08 chủng tuyển chọn bằng sắc ký bản mỏng (TLC) và phổ $^1\text{H}$-NMR cho thấy sự xuất hiện rõ nét của các tín hiệu proton vùng nhân thơm và nối đôi.
   • Định danh 08 chủng vi nấm dựa trên phân tích hình thái hiển vi và trình tự gen vùng ITS/28S rDNA.

2. Xác định điều kiện lên men rắn:

   • Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố: thời gian lên men (ngày), nồng độ muối biển (%) và pH môi trường ban đầu đối với khả năng sinh tổng hợp cặn chiết và hoạt tính kháng sinh của chủng A. flocculosus 01NT.3 cùng 02 chủng nghiên cứu sâu.

3. Phân tách, tinh sạch và xác định cấu trúc 14 hợp chất chuyển hóa thứ cấp: Từ cặn chiết ethyl acetate của 03 chủng nấm lên men trên môi trường rắn, tác giả đã tinh sạch và làm sáng tỏ cấu trúc của 14 hợp chất, trong đó có 04 hợp chất có cấu trúc mới hoàn toàn:

Ký hiệu	Tên hợp chất	Chủng vi nấm sinh tổng hợp	Tính mới về cấu trúc
(1)	phomaligol A2	Aspergillus flocculosus 01NT.3	Hợp chất mới
(2)	wasabidienone E	Aspergillus flocculosus 01NT.3	Đã biết
(3)	aspertetranone D	Aspergillus flocculosus 01NT.3	Đã biết
(4)	mactanamide	Aspergillus flocculosus 01NT.3	Đã biết
(5)	cycloechinulin	Aspergillus flocculosus 01NT.3	Đã biết
(6)	asteltoxin	Aspergillus flocculosus 01NT.3	Đã biết
(7)	ochraceopone F	Aspergillus flocculosus 01NT.3	Hợp chất mới
(8)	asterriquinone C1	Aspergillus flocculosus 01NT.3	Đã biết
(9)	dihydroaspyrone	Aspergillus sp.	Đã biết
(10)	aspilactonol F	Aspergillus sp.	Đã biết
(11)	6β,7α,14-trihydroxyconfertifolin	Aspergillus sp.	Hợp chất mới
(12)	6β,9α,14-trihydroxycinnamolide	Aspergillus sp.	Hợp chất mới
(13)	andrastin A	Penicillium chrysogenum 045-357-2	Đã biết
(14)	citreohybridonol	Penicillium chrysogenum 045-357-2	Đã biết

4. Xác định hoạt tính sinh học của các hợp chất tinh sạch:
   • Kháng vi sinh vật kiểm định: Xác định phổ kháng khuẩn và kháng nấm của 14 hợp chất trên các chủng kiểm định.
   • Gây độc tế bào ung thư: Hợp chất asterriquinone C1 (8) thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh đối với nhiều dòng tế bào ung thư thử nghiệm.
   • Chống oxy hóa: Đánh giá khả năng dập tắt gốc tự do DPPH của các hợp chất.
   • Bảo vệ tế bào thần kinh: Hợp chất mactanamide (4) ở nồng độ 1 µM và 10 µM thể hiện khả năng bảo vệ tế bào thần kinh chuột Neuro2a rõ rệt trước tác nhân gây độc tế bào 6-hydroxydopamine (6-OHDA).

Thảo luận kết quả

Tác giả so sánh, đối chiếu các kết quả thu được với các công bố quốc tế:

• Phân tích mối tương quan giữa đặc điểm hình thái và phân loại phân tử của các chủng nấm biển miền Trung Việt Nam so với các cơ sở dữ liệu chuẩn thế giới.
• Giải thích cơ chế sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp trong điều kiện lên men rắn, sự biến đổi của phổ chất khi thay đổi nồng độ muối biển và pH môi trường nuôi cấy.
• Thảo luận chi tiết về mối quan hệ cấu trúc - hoạt tính (SAR) của 14 hợp chất thu nhận, đặc biệt nhấn mạnh cấu trúc lập thể của 04 hợp chất mới (phomaligol A2, ochraceopone F, 6β,7α,14-trihydroxyconfertifolin, 6β,9α,14-trihydroxycinnamolide) và cơ chế bảo vệ thần kinh của dẫn xuất mactanamide trước tổn thương oxy hóa do 6-OHDA.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học và thực tiễn

Luận án tự công bố các đóng góp mới sau:

1. Dữ liệu hệ thống về vi nấm biển miền Trung: Cung cấp bộ cơ sở dữ liệu thực nghiệm có hệ thống đầu tiên về phân lập, đặc điểm hình thái, phân loại phân tử và sàng lọc hoạt tính kháng sinh của 273 chủng vi nấm biển phân lập từ các vùng biển Ninh Thuận, Nha Trang và Đà Nẵng.
2. Phát hiện 04 hợp chất tự nhiên có cấu trúc mới: Xác định cấu trúc hóa học hoàn chỉnh của 04 hợp chất chuyển hóa thứ cấp mới từ tự nhiên, bao gồm:
   • phomaligol A2 (1)
   • ochraceopone F (7)
   • 6β,7α,14-trihydroxyconfertifolin (11)
   • 6β,9α,14-trihydroxycinnamolide (12)
3. Tinh sạch và đánh giá hoạt tính sinh học của 14 hợp chất: Phân lập thành công 14 hợp chất tinh sạch từ 03 chủng vi nấm biển (Aspergillus flocculosus 01NT.3, Aspergillus sp., và Penicillium chrysogenum 045-357-2) và hoàn thành bộ dữ liệu hoạt tính sinh học (kháng vi sinh vật kiểm định, độc tế bào ung thư, chống oxy hóa, bảo vệ tế bào thần kinh).
4. Phát hiện hoạt tính bảo vệ thần kinh: Chứng minh hoạt tính bảo vệ tế bào thần kinh Neuro2a của hợp chất mactanamide (4) ở các nồng độ 1 µM và 10 µM trước chất độc thần kinh 6-OHDA, mở ra hướng nghiên cứu các hợp chất hỗ trợ điều trị bệnh lý thoái hóa thần kinh từ vi nấm biển.

Kiến nghị và định hướng ứng dụng

• Tận dụng quy trình lên men rắn trên môi trường giá thể gạo ẩm bổ sung muối biển làm quy trình chuẩn để nuôi cấy thu nhận các hoạt chất thứ cấp từ vi nấm biển ở quy mô phòng thí nghiệm và bán công nghiệp.
• Tiếp tục nghiên cứu sâu về độc tính học, dược động học và cơ chế tác động phân tử của các hợp chất có hoạt tính cao (đặc biệt là asterriquinone C1 và mactanamide) trên các mô hình động vật thực nghiệm (in vivo).

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của đề tài

Dựa trên phạm vi thực tế được trình bày trong luận án:

• Nghiên cứu chỉ tập trung tối ưu hóa các điều kiện lên men rắn đơn yếu tố (thời gian, độ mặn, pH) trên 03 chủng nấm tuyển chọn; chưa khảo sát mô hình tối ưu hóa đa biến hay các tổ hợp dinh dưỡng vi lượng khác.
• Việc thử nghiệm hoạt tính sinh học của 14 hợp chất tinh sạch mới dừng lại ở các mô hình sàng lọc in vitro (trên đĩa thạch, phiến nuôi cấy vi sinh và các dòng tế bào nuôi cấy); chưa tiến hành thử nghiệm trên mô hình sinh vật sống (in vivo).
• Số lượng mẫu phân lập tuy đạt 273 chủng nhưng không gian thu mẫu chỉ giới hạn tại 3 địa phương ven biển miền Trung (Ninh Thuận, Nha Trang, Đà Nẵng), chưa bao phủ toàn bộ thềm lục địa và các đảo xa bờ của Việt Nam.

Hướng nghiên cứu tiếp

• Mở rộng quy mô lấy mẫu vi nấm tại các vùng biển sâu, các rạn san hô xa bờ và các hệ sinh thái ngập mặn khác dọc bờ biển Việt Nam.
• Ứng dụng kỹ thuật tiếp cận OSMAC (One-Strain-Many-Compounds) kết hợp nuôi cấy chung (co-culture) giữa vi nấm biển với các chủng vi khuẩn biển nhằm kích hoạt các cụm gen sinh tổng hợp thứ cấp đang ở trạng thái ngủ/im lặng.
• Nghiên cứu cơ chế phân tử chi tiết và thử nghiệm tiền lâm sàng đối với các hợp chất có tiềm năng dược lý cao như mactanamide (bảo vệ thần kinh) và asterriquinone C1 (gây độc tế bào ung thư).

---

Giá trị tham khảo

Đối tượng thụ hưởng giá trị nghiên cứu

• Nghiên cứu sinh và học viên cao học: Luận án là tài liệu tham khảo cho các chuyên ngành Công nghệ sinh học, Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Vi sinh vật học biển và Dược học. Cung cấp quy trình phân lập, lên men rắn SSF, quy trình phân tách sắc ký đa cấp và phương pháp giải phổ NMR 2D đối với các hợp chất hữu cơ phức tạp.
• Giảng viên và nhà nghiên cứu: Dữ liệu hình thái, chuỗi trình tự gen ITS/28S rDNA và bảng số liệu hóa lý của 14 hợp chất là nguồn tư liệu đối chuẩn tin cậy cho các nghiên cứu về phân loại học vi nấm và hóa học biển.
• Các đơn vị phát triển dược phẩm và công nghệ sinh học biển: Cung cấp thông tin về các chủng giống vi sinh vật tiềm năng và các cấu trúc hóa học có hoạt tính ức chế vi sinh vật gây bệnh, kháng u và bảo vệ tế bào thần kinh phục vụ định hướng sàng lọc thuốc mới.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án đã phát hiện bao nhiêu hợp chất mới và đó là những hợp chất nào?

Luận án đã phân lập và xác định cấu trúc của 04 hợp chất tự nhiên mới hoàn toàn, bao gồm:

• phomaligol A2 (hợp chất 1) phân lập từ chủng Aspergillus flocculosus 01NT.3.
• ochraceopone F (hợp chất 7) phân lập từ chủng Aspergillus flocculosus 01NT.3.
• 6β,7α,14-trihydroxyconfertifolin (hợp chất 11) phân lập từ chủng Aspergillus sp.
• 6β,9α,14-trihydroxycinnamolide (hợp chất 12) phân lập từ chủng Aspergillus sp.

2. Có bao nhiêu chủng vi nấm biển được phân lập và từ những địa phương nào?

Tác giả đã phân lập được tổng cộng 273 chủng vi nấm biển từ các mẫu trầm tích, nước biển, hải miên, san hô và rong biển thu thập tại 3 khu vực thuộc miền Trung Việt Nam: tỉnh Ninh Thuận, vùng biển Nha Trang (tỉnh Khánh Hòa) và thành phố Đà Nẵng.

3. Ba chủng vi nấm biển nào được lựa chọn để nghiên cứu sâu về lên men và tách chiết hợp chất?

Dựa trên kết quả đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và phân tích cặn chiết thô bằng TLC và $^1\text{H}$-NMR, 03 chủng nấm được chọn để nghiên cứu chuyên sâu là:

1. Aspergillus flocculosus 01NT.3
2. Aspergillus sp.
3. Penicillium chrysogenum 045-357-2

4. Phương pháp lên men nào được sử dụng trong luận án và các yếu tố nào đã được khảo sát?

Luận án sử dụng phương pháp lên men rắn (Solid State Fermentation – SSF) trên môi trường giá thể gạo ẩm (RYE medium). Các yếu tố công nghệ được khảo sát ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp chất kháng sinh bao gồm: thời gian lên men (ngày), nồng độ muối biển (%) bổ sung vào cơ chất và giá trị pH ban đầu của môi trường.

5. Hợp chất nào trong nghiên cứu thể hiện hoạt tính bảo vệ tế bào thần kinh?

Hợp chất mactanamide (hợp chất 4) phân lập từ chủng vi nấm biển Aspergillus flocculosus 01NT.3 đã được chứng minh có hoạt tính bảo vệ tế bào thần kinh chuột dòng Neuro2a ở các nồng độ thử nghiệm 1 µM và 10 µM trước tác nhân gây độc tế bào thần kinh 6-hydroxydopamine (6-OHDA).

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ sinh học của Phan Thị Hoài Trinh là công trình nghiên cứu thực nghiệm toàn diện về hóa học và hoạt tính sinh học của các hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ vi nấm biển phân lập tại miền Trung Việt Nam. Từ 273 chủng vi nấm biển thu nhận, tác giả đã tuyển chọn và định danh các chủng tiềm năng, tối ưu hóa điều kiện lên men rắn và tinh sạch thành công 14 hợp chất tự nhiên, trong đó có 04 hợp chất có cấu trúc mới hoàn toàn. Các kết quả thử nghiệm sinh học đã làm sáng tỏ hoạt tính kháng vi sinh vật, gây độc tế bào ung thư và bảo vệ tế bào thần kinh của các hợp chất phân lập, đóng góp cơ sở dữ liệu khoa học cho nghiên cứu khai thác nguồn tài nguyên dược liệu biển tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Ngày nay, cùng với công cuộc phát triển kinh tế xã hội thì việc chăm sóc và bảo vệ sức khỏe cộng đồng luôn là mối quan tâm đặc biệt của mọi quốc gia trên thế giới. Mặc dù nền y học của con người đã đạt đến trình độ tiến bộ nhất định nhưng các bệnh truyền nhiễm và bệnh nan y vẫn đang diễn biến khá phức tạp và là mối đe doạ lớn đối với sức khoẻ cộng đồng. Tình trạng dịch bệnh xảy ra phổ biến ở các nước đang phát triển do sự thiếu thuốc và sự xuất hiện lan rộng của các chủng vi sinh vật gây bệnh kháng kháng sinh [1]. Vì vậy, việc nghiên cứu phát hiện các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học, đặc biệt là các hợp chất có nguồn gốc từ vi sinh vật biển đang thu hút sự quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trong nước và trên thế giới [2].

Các nhà khoa học đã chứng minh vi sinh vật biển có vai trò rất quan trọng trong quá trình trao đổi chất và phát triển của các sinh vật trong đại dương. Chính sự đa dạng của hệ sinh thái biển cùng sự khắc nghiệt của môi trường sống đã tạo nên các hợp chất tự nhiên có nguồn gốc từ vi sinh vật biển đa dạng về cấu trúc cũng như các hoạt tính sinh học [3]. Do đó, trong những năm gần đây, nhiều nhà khoa học trên thế giới đã tập trung nghiên cứu và thu nhận các sản phẩm tự nhiên từ vi sinh vật biển với mục đích phát triển chúng thành các nguồn dược liệu mới. Một số lượng lớn các công trình nghiên cứu cũng đã công nhận vi nấm biển là nguồn tiềm năng cung cấp các hợp chất với cấu trúc mới và hoạt tính sinh học có giá trị trong y học bao gồm hoạt tính kháng sinh, kháng viêm, kháng ung thư và chống oxy hoá [4].

Cụ thể, giữa năm 2000 và 2005, khoảng 100 hợp chất từ vi nấm biển được mô tả [5], đến giữa năm 2006 và 2010, có tổng số 690 hợp chất tự nhiên phân lập từ vi nấm biển được công bố [6]. Những hợp chất mới này được tạo ra chủ yếu từ các loài nấm thuộc chi Penicillium, Aspergillus và một số loài nấm thuộc các chi ít phổ biến hơn như Acremonium, Emericella, Epicoccum, Exophiala, Paraphaeospaeria, Phomosis và Halarosellinia [7]. Hệ sinh thái biển ở vùng nhiệt đới được các nhà khoa học đánh giá là rất đa dạng, đặc biệt là hệ sinh thái rạn san hô ở vùng ven biển. Trong đó, Việt Nam được biết đến là một quốc gia có chiều dài bờ biển hơn 3.200 km và sở hữu một nguồn tài 2 nguyên sinh vật phong phú và đa dạng.

Đây chính là cơ sở cho các nghiên cứu điều tra về đa dạng sinh học cũng như tiềm năng các hoạt chất sinh học từ nguồn vi nấm biển. Với mục tiêu tìm kiếm các chủng vi nấm biển có khả năng sinh các chất chuyển hoá thứ cấp có hoạt tính sinh học nhằm phát hiện nguồn dược liệu mới đóng góp một phần vào việc bảo vệ sức khỏe cộng đồng, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của một số hợp chất từ vi nấm biển phân lập tại miền Trung Việt Nam”. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài: Mục tiêu nghiên cứu: Thu nhận các hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ vi nấm biển phân lập ở vùng biển miền Trung và xác định một số hoạt tính sinh học (kháng sinh, gây độc tế bào, chống oxy hóa, bảo vệ tế bào thần kinh) của các hợp chất sạch thu được. Nội dung nghiên cứu: 1.

Phân lập, đánh giá hoạt tính kháng sinh và tuyển chọn các chủng vi nấm biển cho nghiên cứu tiếp theo. Xác định điều kiện lên men rắn thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh thô của chủng vi nấm biển tuyển chọn. Phân tách, tinh sạch và xác định cấu trúc của các hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ cặn chiết lên men chủng vi nấm tuyển chọn. Xác định hoạt tính sinh học của các hợp chất chuyển hóa thứ cấp tinh sạch được thu nhận trong nghiên cứu.

Những đóng góp mới của luận án: - Luận án là nghiên cứu mới có hệ thống về phân lập và đánh giá hoạt tính kháng sinh của các chủng vi nấm phân lập từ vùng biển miền Trung Việt Nam. - Tinh sạch và đánh giá được hoạt tính kháng sinh, gây độc tế bào ung thư, chống oxy hóa, bảo vệ tế bào thần kinh của 14 hợp chất chuyển hóa thứ cấp thu nhận được từ 3 chủng vi nấm biển Aspergillus flocculosus 01NT.3 và Penicillium chrysogenum 045-357-2, gồm: phomaligol A2 (1), wasabidienone E (2), aspertetranone D (3), mactanamide (4), cycloechinulin (5), 3 asteltoxin (6), ochraceopone F (7), asterriquinone C1 (8), dihydroaspyrone (9) và aspilactonol F (10), 6β,7α,14-trihydroxyconfertifolin (11), 6β,9α,14- trihydroxycinnamolide (12), andrastin A (13) và citreohybridonol (14). - Xác định được 4 hợp chất mới gồm phomaligol A2 (1), ochraceopone F (7), 6β,7α,14-trihydroxyconfertifolin (11), và 6β,9α,14-trihydroxycinnamolide (12). Giới thiệu chung về hoạt tính sinh học từ vi nấm biển 1.

Các chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học từ vi nấm biển 1. Chất kháng sinh Vào thập niên 50 của thế kỷ trước, nhóm nghiên cứu của Abraham đã phát hiện được hợp chất cephalosporin C có hoạt tính kháng sinh cao từ loài vi nấm Cephalosporium spp. (ngày nay là Acremonium spp.) có nguồn gốc từ vùng biển Sardinia, Ý (Hình 1. Hợp chất này chính là đại diện cho kháng sinh tự nhiên thuộc nhóm β-lactam lần đầu tiên được phân lập từ vi nấm biển.

Khám phá này đã nhanh chóng giúp cho các nhà khoa học mở ra định hướng nghiên cứu mới về các chất kháng sinh có nguồn gốc từ môi trường biển, đặc biệt là từ vi nấm biển. Đến cuối những năm 1970, hợp chất gliotoxin mới được phát hiện từ chủng vi nấm Aspergillus sp. MO-10 phân lập ở vùng biển Seto (Hình 1. Đây là một loại kháng sinh diketopiperazine lần đầu tiên thu được từ một loại vi nấm có nguồn gốc từ trầm tích biển sâu [10].

Từ đó, một số lượng lớn các sản phẩm tự nhiên mới từ vi nấm biển đã được phân lập và mô tả, chủ yếu là từ các chi Penicillium, Aspergillus, Fusarium và Cladosporium [11]. Phần lớn các chất kháng sinh (khoảng 50%) thuộc nhóm polypeptide, tiếp theo là các nhóm alkaloid, terpene và peptide chiếm 14 – 20% [12]. Cephalosporin C Gliotoxin Hình 1. Cấu trúc hóa học của chất kháng sinh cephalosporin C [8] và gliotoxin [10] Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng vi nấm biển đóng một vai trò quan trọng trong việc tạo ra các kháng sinh mới chống lại các vi sinh vật gây bệnh, đặc biệt là các vi khuẩn kháng kháng sinh đang bùng phát hiện nay [13].

Chính quá trình thích nghi với điều kiện sống khắc nghiệt của môi trường biển như độ mặn cao, dinh dưỡng thấp, 5 áp suất cao, biến đổi nhiệt độ đồng thời cạnh tranh với vi khuẩn, virus và các loại nấm khác đã tạo điều kiện để các vi sinh vật biển sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học mới, ưu việt so với vi sinh vật trên cạn [14]. Các công bố cũng cho thấy có từ 38% đến 59% các hợp chất chiết xuất từ vi nấm biển thể hiện hoạt tính kháng sinh [15, 16]. Các hợp chất tự nhiên từ vi nấm biển rất đa dạng về lớp cấu trúc và kết hợp với một loạt các nhóm thế dẫn đến hoạt tính sinh học vô cùng phong phú. Dưới đây là một số hợp chất kháng sinh mới từ các chủng vi nấm biển được công bố từ năm 2011 đến nay (Bảng 1.

Các chất kháng sinh mới được phân lập từ vi nấm biển Hợp chất Chủng vi nấm Hoạt tính kháng sinh Nguồn kháng sinh mới biển tham khảo Các hợp chất indol-alkaloid β-aflatrem Aspergillus flavus S. aureus (MIC 20,5 µM) [17] OUCMDZ-2205 Cristatumin A và D Eurotium E. aureus (MIC, [18] cristatum EN-220 64 μg/mL) Neoechinulin A Aspergillus sp. PSU-SP2/4 kháng methicillin (MRSA) (MIC 2,0 μg/mL) Stachyin B Stachybotrys sp.

epidermidis [21] MF347 (IC50; 1,42 và 1,02 μM) Các hợp chất pyridine và pyridinone Trichodin A Trichoderma sp. epidermidis [22] MF106 (IC50 lần lượt 27,05 và 24,28 µM) và Candida albicans (IC50, 25,38 μM) 5,6-dihydro-3-hydroxy- Wallemia sebi E. aerogenes (MIC 76,7 [23] 5-methylcyclopenta PXP-89 µM) pyridin-7-one Curvulamine Curvularia sp. Veillonella parvula, [24] IFB-Z10 Streptococcus sp.

Bacteroides vulgatus và Peptostreptococcus sp. (MIC 0,37 μM) Các hợp chất Piperazine/Diketopiperazine và Pyrimidine/Pyrimidinone Terremides B Aspergillus E. aerogenes (MIC 33,5 [25] terreus PT06-2 μM) 6 Dẫn xuất aroyl uridine Aspergillus S. epidermidis (MIC 12,5 [26] kipukasin H và I versicolor ATCC μM) 9577 Waikialoid A và Aspergillus sp.

albicans (IC50 lần lượt [27] waikialoid B 1,4 và 46,3 μM) Các hợp chất có chứa nitơ khác 4-methoxyl- Aspergillus S. epidermis (MIC 10 μM) [28] asperphenamate elegans ZJ-2008010 Isaridin G, Beauveria felina Escherichia coli (MIC lần [29] desmethylisaridin G và EN-135 lượt 64, 64 và 8 μg/mL) desmethylisaridin C1 Terremide A Aspergillus S. aureus (MIC 63,9 μM) [25] terreus PT06-2 Flavuside A và B Aspergillus flavus S. aureus và MRSA (MIC [30] lần lượt 15,6 và 31,2 μg/mL) Các hợp chất steroid và terpenoid Steroid A.

niger [31] PT05-1 (MIC lần lượt 3,3; 3,3 và 1,6 μM) Aspergiterpenoid A, Aspergillus sp. coli và Micrococcus [32] sydonol, và axit ZJ-2008004 tetragenus (MIC lần lượt 20 sydonic và 10 μM) Chevalone E Aspergillus S. aureus kháng methicillin [33] similanensis sp. KUFA 0013 Penicillatide A và B Penicillium sp.

aureus, Vibrio [34] anguillarum, và C. albicans 6,6′-oxybis(1,3,8- Aspergillus S. aureus [35] trihydroxy-2-((S)-1- versicolor methoxyhexyl)anthrace INF16–17 ne-9,10- dione) Penicitol D và 1-epi- P. aureus kháng methicillin [36] citrinin H1 S01-P1 (MRSA) Các Polyketide Engyodontiumone H Engyodontium E.

subtilis (MIC [37] album lần lượt 64 và 32 µg/mL) DFFSCS021 Anhydrit tubingenoic A A. tubingensis Neurospora crassa (MIC [38] OY907 330 μM) Communol A Penicillium E. aerogenes [39] commune 518 (MIC lần lượt 4,1 μM và 16,4 μM) Aspergillumarin A và B Aspergillus sp. subtilis [40] (MIC 50 µg/mL)_ Flavipesin A Aspergillus S.

[42] aerogenes (MIC lần lượt 22,5; 1,7 và 1,1 µM) Isochromophilone XI Bartalinia B. lentus và [43] robillardoides Trichophyton rubrum (MIC LF550 lần lượt 55,6; 78,4 và 41,5 μM) Isomonodictyphenone Penicillium sp. Aeromonas hydrophilia [44] MA-37 (MIC 8 μg/mL) Chrysoxanthone A–C P. Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng hầu hết các hợp chất kháng sinh mới được phát hiện chủ yếu từ các loài vi nấm thuộc chi Aspergillus và Penicillium.

Trong số các loài thuộc chi Aspergillus, A. flocculosus là loài vi nấm tương đối mới trong tự nhiên và được mô tả vào năm 2004 bởi nhóm nghiên cứu của Frisvad và Samson [47]. Mặc dù đã có nhiều công bố về đặc điểm sinh học nhưng số lượng công trình nghiên cứu về các hợp chất tự nhiên từ loài này vẫn còn hạn chế. Ở công bố đầu tiên, Zheng và các cộng sự (2013) đã phân lập được 2 hợp chất mới gồm (22R,23S)-epoxy-3β,11α,14β,16β-tetrahydroxyergosta-5,7-dien-12-one và 6-(1H- pyrrol-2-yl)hexa-1,3,5-trienyl-4-methoxy-2H-pyran-2-one từ chủng vi nấm biển A.