Luận văn thạc sĩ sinh học thực nghiệm nghiên cứu phân tích phát sinh loài của một số loài vi khuẩn thuộc chi bacillus bằng kỹ thuật multilocus sequencing analysis mlsa

Luận văn thạc sĩ kỹ thuật nghiên cứu sinh học thực nghiệm nghiên cứu phân tích phát sinh loài của một số loài vi khuẩn thuộc chi, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân, đề

• Tác giả: Nguyễn Thị Thủy Tiên
• Người hướng dẫn: Ts. Lê Thị Huỳnh Trâm
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên Cứu Phát Sinh Loài Vi Khuẩn Bacillus Bằng Kỹ Thuật MLSA
• Loại tài liệu: luận văn
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỞ ĐẦU
• 2. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
• 2.1. Phương pháp phát sinh loài
• 2.2. Phân tích phát sinh loài dựa vào trình tự phân tử
• 2.3. Xây dựng cây phát sinh loài
• 2.3.1. Cây khoảng cách
• 2.3.2. Cây Likelihood
• 2.3.3. Cây Parsimony
• 3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Đối tượng nghiên cứu
• 3.2. Phương pháp nghiên cứu
• 3.2.1. Tách chiết DNA tổng số của các chủng vi khuẩn
• 3.2.2. Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của các cặp mồi rpoD, glpF, ptA, pycA và purH
• 3.2.3. Giải trình tự 6 vùng gen 16S, rpoD, glpF, ptA, pycA và purH
• 3.2.4. Phân tích trình tự
• 3.2.5. Phân tích phát sinh loài
• 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Giải trình tự và phân tích trình tự 6 vùng gen 16S rRNA, rpoD, glpF, pta, pycA và purH
• 4.2. Phân tích phát sinh loài
• 4.2.1. Phân tích phát sinh loài từ trình tự các vùng gen 16S rRNA, rpoD, glpF, ptA, pycA và purH
• 4.2.2. Khảo sát số lượng gen
• 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Tóm tắt

I. Giới thiệu về nghiên cứu

Nghiên cứu phát sinh loài vi khuẩn Bacillus bằng kỹ thuật MLSA là một lĩnh vực quan trọng trong nghiên cứu vi sinh. Chi Bacillus, với khả năng tạo bào tử và lên men, đã được công nhận với 396 loài tính đến năm 2020. Việc phân loại chính xác các loài Bacillus không chỉ có ý nghĩa trong khoa học mà còn trong ứng dụng thực tiễn trong y tế, nông nghiệp và công nghiệp. Việc sử dụng các phương pháp phân loại truyền thống như hình thái học và sinh hóa gặp nhiều khó khăn trong việc phân biệt các loài gần gũi. Do đó, việc áp dụng kỹ thuật MLSA cho phép xác định mối quan hệ tiến hóa giữa các loài dựa trên trình tự gen, mang lại độ chính xác cao hơn. Chương này sẽ trình bày lý do chọn đề tài, mục đích nghiên cứu và nội dung nghiên cứu.

II. Phương pháp phát sinh loài

Phân tích phát sinh loài là quá trình thiết lập mối quan hệ tiến hóa giữa các sinh vật. Đối với vi khuẩn Bacillus, việc sử dụng phân tích di truyền phân tử giúp xác định mối quan hệ này một cách chính xác hơn. Sự chuyển gen ngang (HGT) trong vi khuẩn đã làm cho việc xác định lịch sử phát sinh loài trở nên phức tạp. Kỹ thuật MLSA cung cấp một giải pháp khả thi bằng cách sử dụng nhiều gen giữ nhà để tạo ra cây phát sinh loài. Việc này không chỉ giúp phân loại chính xác mà còn cung cấp dữ liệu có thể tái sử dụng cho các nghiên cứu sau này. Điều này làm nổi bật tầm quan trọng của việc lựa chọn gen trong phương pháp MLSA để đạt được sự cân bằng giữa thời gian, chi phí và độ phân biệt.

III. Phân tích trình tự và xây dựng cây phát sinh loài

Quá trình xây dựng cây phát sinh loài bắt đầu bằng việc sắp xếp trình tự gen, một bước quan trọng để xác định mối quan hệ giữa các loài. Sử dụng các phần mềm như Clustal và MUSCLE, các trình tự được căn chỉnh để tối ưu hóa sự tương đồng. Sau khi có sự căn chỉnh, các phương pháp xây dựng cây như UPGMA và Neighbor-Joining được áp dụng để tạo ra cây phát sinh loài. Phân tích likelihood cũng được sử dụng để xác định cấu trúc cây có xác suất cao nhất. Điều này cho thấy rằng việc áp dụng các phương pháp phân tích hiện đại không chỉ cải thiện độ chính xác mà còn giúp tiết kiệm thời gian và tài nguyên trong nghiên cứu phát sinh loài.

IV. Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng phương pháp MLSA có thể phân biệt rõ ràng các loài trong chi Bacillus. Việc phân tích trình tự gen 16S rRNA, rpoD, glpF, ptA, pycA và purH đã chỉ ra sự khác biệt di truyền giữa các loài. Các cây phát sinh loài được xây dựng từ các trình tự này cho thấy mối quan hệ tiến hóa rõ ràng giữa các chủng Bacillus. Điều này không chỉ khẳng định hiệu quả của phương pháp MLSA mà còn mở ra hướng đi mới cho các nghiên cứu tương lai về đa dạng di truyền và phân loại vi khuẩn. Hơn nữa, nghiên cứu này cũng nhấn mạnh tầm quan trọng của việc áp dụng công nghệ sinh học trong việc phát hiện và phân loại vi khuẩn.

V. Kết luận và kiến nghị

Nghiên cứu đã chứng minh rằng kỹ thuật MLSA là một công cụ mạnh mẽ trong việc phân loại và phát sinh loài vi khuẩn Bacillus. Việc áp dụng phương pháp này không chỉ cải thiện độ chính xác trong phân loại mà còn cung cấp dữ liệu có thể tái sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. Cần có thêm các nghiên cứu mở rộng với nhiều chủng khác nhau và áp dụng các công nghệ mới để nâng cao tính hiệu quả của phương pháp này. Các nghiên cứu trong tương lai nên tập trung vào việc tối ưu hóa số lượng và loại gen sử dụng trong phương pháp MLSA để đạt được kết quả tốt nhất trong việc phân loại vi khuẩn.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Chi Bacillus là một nhóm vi khuẩn Gram dương, hình que, có khả năng tạo bào tử và lên men, với hơn 396 loài được công bố hợp lệ tính đến năm 2020. Các loài Bacillus được ứng dụng rộng rãi trong y tế, dược phẩm, nông nghiệp và công nghiệp nhờ khả năng sản xuất enzyme, kháng sinh và các chất chuyển hóa quan trọng. Tuy nhiên, việc phân loại chính xác các loài trong chi Bacillus gặp nhiều khó khăn do sự tương đồng cao về trình tự gen 16S rRNA, phương pháp truyền thống thường không phân biệt được các loài có quan hệ họ hàng gần. Mục tiêu nghiên cứu là xây dựng phương pháp định danh các loài Bacillus dựa trên kỹ thuật Multilocus Sequencing Analysis (MLSA) sử dụng trình tự ghép nối của 6 gen 16S rRNA, rpoD, glpF, pta, pycA và purH nhằm nâng cao độ phân biệt loài trong bộ sưu tập giống vi sinh vật HBCM. Nghiên cứu được thực hiện trong năm 2023 tại Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh, với ý nghĩa quan trọng trong việc cải thiện độ chính xác phân loại vi khuẩn, hỗ trợ phát triển các ứng dụng sinh học và quản lý nguồn gen vi sinh vật.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Phân tích phát sinh loài dựa trên trình tự phân tử là phương pháp chủ đạo để xác định mối quan hệ tiến hóa giữa các vi sinh vật. MLSA là kỹ thuật phân tích đa gen giữ nhà (housekeeping genes) nhằm đánh giá đa dạng di truyền và phân loại vi khuẩn đến cấp độ loài. Các gen giữ nhà được chọn phải có tính bảo tồn cao, phổ biến trong các chủng nghiên cứu và chứa đủ biến dị để phân biệt các loài gần gũi. Trong nghiên cứu này, 6 gen được lựa chọn gồm 16S rRNA (gen mã hóa tiểu đơn vị ribosome 30S), rpoD (yếu tố sigma 70), glpF (protein vận chuyển glycerol), pta (phosphate acetyltransferase), pycA (pyruvate carboxylase) và purH (enzyme AICAR transformylase). Các phương pháp xây dựng cây phát sinh loài bao gồm Neighbor-Joining (NJ), Maximum Likelihood (ML) và Maximum Parsimony (MP) được sử dụng để đánh giá mối quan hệ giữa các chủng.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu gồm 8 chủng Bacillus spp. từ bộ sưu tập HBCM và 35 chủng tham chiếu từ GenBank. DNA tổng số được tách chiết từ sinh khối nuôi cấy trong môi trường Tryptone Soya Broth (TSB) và Tryptone Soya Agar (TSA). Phản ứng PCR được tối ưu hóa với nhiệt độ bắt cặp riêng cho từng cặp mồi gen rpoD, glpF, pta, pycA, purH và 16S rRNA. Sản phẩm PCR được tinh sạch và giải trình tự bằng phương pháp Sanger. Trình tự thu được được xử lý loại bỏ đoạn kém chất lượng, căn chỉnh bằng thuật toán MUSCLE trong phần mềm MEGA 11. Phân tích đa dạng nucleotide, hàm lượng G+C và chỉ số Information Parsimony Site (IPS) được tính bằng phần mềm DnaSP. Cây phát sinh loài được xây dựng chủ yếu bằng phương pháp Neighbor-Joining với 1000 lần bootstrap để đánh giá độ tin cậy. Nghiên cứu tiến hành trong năm 2023 với quy trình chi tiết từ nuôi cấy, tách chiết DNA, PCR, giải trình tự đến phân tích dữ liệu.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Nhiệt độ bắt cặp tối ưu cho PCR: Gen purH có nhiệt độ bắt cặp tối ưu là 40,1°C, gen pycA từ 47,6°C đến 52°C, gen rpoD từ 48,1°C đến 60,1°C, gen pta là 48,5°C và gen glpF từ 57,9°C đến 60,1°C. Các nhiệt độ này đảm bảo sản phẩm PCR đặc hiệu, phù hợp cho giải trình tự.

2. Đặc điểm trình tự gen: Chiều dài gen dao động từ 720 bp (pycA) đến 1475 bp (16S rRNA). Giá trị IPS của gen 16S rRNA thấp nhất (4,27%), trong khi các gen rpoD, glpF, pta, pycA và purH có IPS lần lượt là 31,1%, 33,8%, 38,7%, 42,7% và 45,2%, cho thấy các gen này có mức độ biến dị cao hơn, phù hợp để phân biệt các loài gần gũi. Hàm lượng G+C của 16S rRNA là 54,9%, cao hơn các gen còn lại (khoảng 46-48%).

3. Phân tích phát sinh loài: Cây phát sinh loài dựa trên gen 16S rRNA chia các chủng thành 4 nhóm nhưng có giá trị bootstrap thấp (<70%) ở nhiều nhánh, không đủ tin cậy để phân biệt các loài gần gũi. Cây phát sinh từ các gen rpoD và glpF cho thấy sự phân biệt rõ ràng hơn với bootstrap đạt 100% cho một số loài như B. sonorensis, tuy nhiên các nhánh chính vẫn có giá trị bootstrap thấp. Cây từ gen pta và purH có giá trị bootstrap cao hơn, đặc biệt phân biệt tốt loài B. pumilus. Cây từ gen pycA có giá trị bootstrap thấp (58%). Kết quả cho thấy việc sử dụng riêng lẻ các gen giữ nhà không đủ để phân loại chính xác.

4. Phân tích ghép nối gen: Việc ghép nối các gen theo thứ tự 16S rRNA-rpoD, 16S rRNA-rpoD-pta, 16S rRNA-rpoD-pta-purH, 16S rRNA-rpoD-pta-purH-glpF và 16S rRNA-rpoD-pta-purH-glpF-pycA làm tăng giá trị IPS từ 12,2% đến 27,3%, đồng thời cải thiện độ tin cậy của cây phát sinh loài. Tuy nhiên, số lượng gen ghép nối quá nhiều có thể làm giảm mức độ bảo tồn và tăng chi phí, thời gian phân tích.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu khẳng định rằng gen 16S rRNA mặc dù là công cụ nền tảng trong phân loại vi khuẩn nhưng không đủ độ phân giải để phân biệt các loài Bacillus có quan hệ gần gũi do mức độ bảo tồn cao và sự chồng chéo trình tự. Các gen giữ nhà như rpoD, glpF, pta, pycA và purH có mức độ biến dị cao hơn, giúp phân biệt các loài gần nhau tốt hơn nhưng khi sử dụng riêng lẻ lại thiếu độ tin cậy do giá trị bootstrap thấp ở các nhánh chính. Việc kết hợp gen 16S rRNA với các gen giữ nhà khác trong phương pháp MLSA tạo ra sự cân bằng giữa mức độ bảo tồn và khả năng phân biệt, nâng cao độ chính xác phân loại. So sánh với các nghiên cứu trước đây cho thấy MLSA là phương pháp ưu việt hơn so với DNA-DNA hybridization và DNA fingerprinting về tính tái lập và khả năng mở rộng cho số lượng lớn chủng. Các biểu đồ cây phát sinh loài và ma trận khoảng cách nucleotide minh họa rõ sự khác biệt về độ phân giải giữa các gen và tổ hợp gen, hỗ trợ trực quan cho kết luận về hiệu quả của MLSA trong phân loại Bacillus.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Áp dụng phương pháp MLSA với bộ 6 gen: Khuyến nghị sử dụng đồng thời 6 gen 16S rRNA, rpoD, glpF, pta, pycA và purH để định danh chính xác các loài Bacillus trong bộ sưu tập vi sinh vật, nhằm tăng độ phân giải và độ tin cậy phân loại. Thời gian thực hiện dự kiến 6-8 tuần cho mỗi đợt phân tích.

2. Tối ưu hóa quy trình PCR: Đề xuất chuẩn hóa nhiệt độ bắt cặp PCR cho từng cặp mồi theo kết quả khảo sát để đảm bảo sản phẩm đặc hiệu, giảm sai số trong giải trình tự. Chủ thể thực hiện là phòng thí nghiệm phân tử tại các trung tâm nghiên cứu.

3. Xây dựng cơ sở dữ liệu trình tự gen MLSA: Thiết lập cơ sở dữ liệu trình tự gen ghép nối của các loài Bacillus phổ biến tại Việt Nam để hỗ trợ phân loại nhanh và chính xác trong tương lai, đồng thời làm nền tảng cho các nghiên cứu đa dạng sinh học. Thời gian xây dựng khoảng 12 tháng.

4. Đào tạo và chuyển giao kỹ thuật: Tổ chức các khóa đào tạo về kỹ thuật MLSA cho cán bộ nghiên cứu và kỹ thuật viên tại các viện, trường đại học nhằm nâng cao năng lực phân tích và ứng dụng phương pháp này trong nghiên cứu và công nghiệp.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu vi sinh vật học: Nghiên cứu về đa dạng và phân loại vi khuẩn, đặc biệt các loài Bacillus, sẽ được cung cấp phương pháp phân tích hiện đại, chính xác và các dữ liệu tham khảo về gen giữ nhà.

2. Chuyên gia công nghệ sinh học: Ứng dụng trong phát triển chế phẩm sinh học, enzyme, kháng sinh từ Bacillus, giúp lựa chọn chủng phù hợp dựa trên phân loại chính xác.

3. Cán bộ quản lý bộ sưu tập vi sinh vật: Hỗ trợ trong việc quản lý, phân loại và bảo tồn nguồn gen vi sinh vật, nâng cao chất lượng bộ sưu tập.

4. Sinh viên và học viên cao học: Tài liệu tham khảo về phương pháp nghiên cứu phân tích phát sinh loài, kỹ thuật giải trình tự gen và phân tích dữ liệu sinh học phân tử.

Câu hỏi thường gặp

1. MLSA là gì và tại sao lại ưu việt hơn 16S rRNA?
   MLSA là phương pháp phân tích đa gen giữ nhà nhằm phân loại vi khuẩn đến cấp độ loài bằng cách sử dụng trình tự ghép nối của nhiều gen. Nó vượt trội hơn 16S rRNA vì có độ phân giải cao hơn, giúp phân biệt các loài có quan hệ gần gũi mà 16S rRNA không thể phân biệt được do mức độ bảo tồn cao.

2. Tại sao phải chọn nhiều gen giữ nhà để phân tích?
   Việc sử dụng nhiều gen giữ nhà giúp cân bằng giữa mức độ bảo tồn và biến dị, tăng độ tin cậy và chính xác trong phân loại. Một gen đơn lẻ có thể không đủ thông tin hoặc gây mâu thuẫn trong kết quả.

3. Nhiệt độ bắt cặp PCR ảnh hưởng thế nào đến kết quả?
   Nhiệt độ bắt cặp tối ưu giúp sản phẩm PCR đặc hiệu, tránh tạo ra sản phẩm không mong muốn làm giảm chất lượng giải trình tự và ảnh hưởng đến phân tích phát sinh loài.

4. Có thể áp dụng phương pháp này cho các chi vi khuẩn khác không?
   Có, MLSA là phương pháp phổ biến và đã được áp dụng thành công cho nhiều chi vi khuẩn khác nhau nhằm phân loại và đánh giá đa dạng di truyền.

5. Thời gian và chi phí thực hiện MLSA như thế nào?
   Thời gian thực hiện khoảng 6-8 tuần tùy quy mô mẫu, chi phí phụ thuộc vào số lượng gen và mẫu phân tích, nhưng MLSA tiết kiệm hơn so với các phương pháp lai DNA-DNA truyền thống và có thể mở rộng cho số lượng lớn mẫu.

Kết luận

• Phương pháp MLSA sử dụng 6 gen giữ nhà 16S rRNA, rpoD, glpF, pta, pycA và purH cho phép phân loại chính xác các loài Bacillus có quan hệ gần gũi.
• Gen 16S rRNA có mức độ bảo tồn cao nhưng không đủ phân biệt các loài gần nhau, trong khi các gen giữ nhà khác có biến dị cao hơn, hỗ trợ phân loại chi tiết.
• Kết hợp các gen trong MLSA tạo ra cây phát sinh loài có độ tin cậy cao hơn so với phân tích gen đơn lẻ.
• Nghiên cứu đề xuất quy trình PCR tối ưu và xây dựng cơ sở dữ liệu trình tự gen để hỗ trợ phân loại vi khuẩn trong tương lai.
• Các bước tiếp theo bao gồm mở rộng số lượng chủng nghiên cứu, hoàn thiện cơ sở dữ liệu và đào tạo kỹ thuật cho cán bộ nghiên cứu nhằm ứng dụng rộng rãi MLSA trong phân loại vi sinh vật.

Hành động tiếp theo: Áp dụng phương pháp MLSA trong các dự án nghiên cứu và phát triển sản phẩm sinh học, đồng thời chia sẻ kết quả để nâng cao nhận thức và kỹ năng trong cộng đồng khoa học vi sinh.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1. Phương pháp phát sinh loài Phân tích phát sinh loài là thiết lập mối quan hệ tiến hóa giữa các gen hoặc đặc điểm của sinh vật. Và mặc dù sự sống có một nguồn gốc duy nhất và chỉ có một lịch sử tiến hóa thực sự, nhiệm vụ tái tạo lại lịch sử này có thể từ dễ dàng đến khó khăn tùy thuộc vào các đơn vị phân loại cụ thể hoặc các sinh vật được phân tích.

Những khó khăn phát sinh với việc tái tạo phát sinh loài do thực tế là hầu như tất cả các suy luận về sự tiến hóa và các mối quan hệ đều dựa trên nghiên cứu về các sinh vật hiện tại. Hiếm khi có thể lấp đầy những thiếu sót để xác minh thông tin về sự sống thực sự diễn ra như thế nào. Những vấn đề này được phóng đại ở vi khuẩn vì chúng có ít đặc điểm có thể nhìn thấy và hầu như không có hồ sơ hóa thạch. Hơn nữa, vi khuẩn thì cổ xưa và đã đa dạng hóa qua hàng tỷ năm và là đối tượng của các quá trình chuyển gen ngang (Horizontal gene transfer - HGT), có khả năng tạo ra bất kỳ đặc điểm nào trong bất kỳ dòng dõi nào và che khuất các mô hình tổ tiên truyền thống của Darwin, do đó làm cho lịch sử của chúng thậm chí còn khó xác định hơn [13].

Trong hàng trăm năm đầu tiên của ngành vi sinh học, vi khuẩn được phân loại, phân biệt và nhóm lại chủ yếu theo môi trường sống, đặc điểm sinh trưởng, thuộc tính sinh hóa và tiềm năng độc lực của chúng. Nhưng trong nửa sau của thế kỷ 20, đã có một sự thay đổi rõ rệt đối với việc sử dụng thông tin di truyền phân tử, thu được thông qua phân tích trình tự protein và axit nucleic. Điều này cung cấp ba lợi thế ngay lập tức. - Đầu tiên, các phân tích so sánh trở nên tập trung vào các ký tự được phân phối phổ biến, giúp loại bỏ các dòng được phân loại cùng nhau do thiếu các đặc điểm xác định cụ thể của chúng.

- Thứ hai, kiến thức chuyên sâu về các cơ chế vật lý mà theo đó các đại phân tử thông tin có thể thay đổi đã dẫn đến sự phát triển của các mô hình mạnh mẽ về tiến hóa trình tự. - Thứ ba, việc sử dụng các trình tự phân tử đã làm tăng đáng kể số lượng các ký tự rời rạc, theo đó các vi sinh vật có thể được so sánh với mỗi nucleotide hoặc axit amin có thể đóng vai trò là một đặc điểm thông tin [13].1 Phân tích phát sinh loài dựa vào trình tự phân tử Việc sử dụng dữ liệu trình tự phân tử để suy ra các mối quan hệ là trọng tâm về quá trình tiến hóa. Những thay đổi ở cấp độ phân tử đã được sử dụng để thiết lập phát sinh loài của nhiều loại sinh vật. Đối với vi khuẩn, đặc biệt, nơi các dấu hiệu kiểu hình cổ điển thường không hiệu quả hoặc không thực tế để nhóm các phân lập vi khuẩn, các phương pháp phát sinh loài phân tử đã mang tính cách mạng [13].

5 - Sắp xếp trình tự Điều kiện tiên quyết để tạo ra một kiểu phát sinh loài của sinh vật dựa trên trình tự phân tử là sự sắp xếp các trình tự trực giao (di truyền theo chiều dọc) gần đúng nhất với quá trình tiến hóa phân tử thực sự của chúng. Sự sắp xếp có thể được tạo bằng nhiều thuật toán, hầu hết trong số đó sử dụng một số dạng ma trận thay thế để định vị các nucleotide tương đồng hoặc axit amin để tối đa hóa số lượng vị trí giống hệt hoặc tương tự tại một vị trí nhất định. Clustal, hiện là phần mềm căn chỉnh phổ biến nhất, sử dụng ma trận IUB và ClustalW1.6 để sắp xếp DNA và ma trận PAM, BLOSUM và Gonnet để sắp xếp axit amin [13]. Khi một tập dữ liệu trình tự được đưa vào chương trình căn chỉnh, chẳng hạn như Clustal, thuật toán bắt đầu bằng cách tạo sự căn chỉnh theo cặp của tất cả các trình tự một cách độc lập.

Sau đó, thuật toán sẽ tính toán tất cả khoảng cách giữa các cặp trình tự, tạo ra một ma trận khoảng cách mà sau đó được chuyển thành biểu đồ cây (dendrogram). Như tên gọi của nó, cây này phục vụ như một hướng dẫn để bắt đầu căn chỉnh nhiều trình tự, với các trình tự giống nhau nhất được thêm vào trước, tiếp theo là bổ sung dần dần các trình tự khác nhau hơn. Loại phương pháp căn chỉnh trình tự lũy tiến theo cặp đơn giản và tương đối hiệu quả này đã được sử dụng rộng rãi trong nhiều nghiên cứu phát sinh gen, nhưng kém hiệu quả hơn đối với các bộ dữ liệu cụ thể. Điều này đã thúc đẩy sự phát triển của các thuật toán căn chỉnh cải tiến hơn, chẳng hạn như MUSCLE, T-Coffee, POA, DIALIGN, SAGA và MAFFT, hiệu quả và chính xác trong việc khôi phục các căn chỉnh tối ưu từ các bộ dữ liệu khác nhau, được thiết lập bằng cách so sánh với BAliBASE (cơ sở dữ liệu sắp xếp tham chiếu được tinh chỉnh thủ công).

Tuy nhiên, không phải tất cả các thuật toán này đều tương đương về thuật toán, chẳng hạn như MUSCLE, T-Coffee và MAFFT, thực hiện một loạt các phép toán lũy tiến, căn chỉnh và tối ưu hóa trong mỗi lần lặp lại để đảm bảo độ chính xác căn chỉnh cao hơn đáng kể. Sự liên kết tiến bộ, tinh tế được cung cấp bởi các phương pháp này là điều cần thiết để tái tạo chính xác các mối quan hệ phát sinh gen. Bất kể chương trình hoặc thuật toán được sử dụng để tạo liên kết nhiều trình tự, mỗi liên kết phải được đánh giá trước khi sử dụng để tái tạo phát sinh gen. Biến thể trình tự trên một căn chỉnh có thể không đồng nhất, dẫn đến các vùng được bảo tồn nằm xen kẽ giữa các vùng biến đổi cao.

Do sự liên kết của các vùng có thể siêu biến thường là vấn đề nên các phần này được che giấu hoặc loại bỏ tốt nhất. Điều này đặc biệt quan trọng bởi vì ngay cả những thay đổi nhỏ trong sự liên kết cũng sẽ bị nhiễu thông tin có khả năng che khuất sự phát sinh loài thực sự [13].2 Xây dựng cây phát sinh loài Khi một sự liên kết đáng tin cậy được tạo ra, nhiều phương pháp xây dựng cây có thể được sử dụng để chuyển đổi dữ liệu liên kết thành một cây phát sinh loài. Các 6 phương pháp xây dựng cây này được phân loại rộng rãi thành các phương pháp tiếp cận dựa trên khoảng cách, phân tích và xác suất [13].1 Cây khoảng cách Các cách tiếp cận dựa trên khoảng cách phân loại đại diện cụm dựa trên số lượng thay thế nucleotide hoặc axit amin giữa các trình tự. Một trong những phương pháp dựa trên khoảng cách đầu tiên và đơn giản nhất, được phát triển để tạo ra các bản sao kiểu hình, là UPGMA (Phương pháp nhóm cặp không trọng số với trung bình số học).

UPGMA sử dụng phương pháp phân cụm liên tiếp, theo đó một ma trận của tất cả các điểm tương đồng của trình tự theo cặp được tạo ra và hai đơn vị phân loại có khoảng cách nhỏ nhất được phân cụm trước. Ma trận khoảng cách được tính toán lại, coi các đơn vị phân loại đã được nhóm thành một đơn vị phân loại và đơn vị phân loại có khoảng cách nhỏ nhất tiếp theo được thêm vào cây. Điều này được lặp lại cho đến khi tất cả các đơn vị phân loại được thêm vào và một bộ phát sinh loài cuối cùng được hình thành. Do cách giải thích đơn giản này về ma trận khoảng cách và giả định về tốc độ tiến hóa không đổi (đồng hồ phân tử) cho tất cả các trình tự, UPGMA có xu hướng xây dựng các cây phát sinh loài không được hỗ trợ (unsupported phylograms).

Phương pháp Neighbor-Joining (NJ)[14], có cách tiếp cận tương tự để phân nhóm theo phân loại như UPGMA, trước tiên phân cụm các chuỗi (láng giềng) gần nhất và sau đó tính toán lại khoảng cách giữa các cặp lân cận. Do đó, NJ không gặp phải những hạn chế giống như UPGMA và đã trở thành phương pháp dựa trên khoảng cách được ưa thích để tái tạo phát sinh gen[13].2 Cây Likelihood Việc áp dụng các phương pháp likelihood để tái cấu trúc phát sinh loài đã trở nên ngày càng phổ biến, phần lớn là do độ chính xác và tính nhất quán cao hơn một chút của chúng trong việc khôi phục một phát sinh loài chính xác, và do sự gia tăng đáng kể về khả năng và tốc độ tính toán. Maximum Likelihood (ML) [15] và phương pháp tiếp cận Bayesian [16] đưa ra hai cách tiếp cận xác suất riêng biệt nhưng có liên quan để xác định kiểu phát sinh loài tốt nhất. Các phương pháp ML cố gắng xác định cấu trúc liên kết cây có xác suất cao nhất với dữ liệu chuỗi được cung cấp.

ML cần nhiều tính toán và không phù hợp với các tập dữ liệu rất lớn [13]. Phương pháp Bayesian để tái cấu trúc phát sinh loài được xem là một giải pháp thay thế lý tưởng cho phương pháp ML. Không giống như cách tiếp cận dựa trên khoảng cách, cách tiếp cận Bayes không tạo ra một cây duy nhất, nó lấy mẫu một loạt các cấu trúc liên kết cây có thể xảy ra dựa trên bộ dữ liệu và các phân bố xác suất trước (Prior probability). Bởi vì các xác suất sau đã được tính toán trong quá trình lấy mẫu, chúng được sử dụng để xác định giá trị độ tin cậy tại mỗi nút trên cây, không cần hỗ trợ thống kê thêm các giá trị như bootstrap hoặc jackknife [13].3 Cây Parsimony Các phương pháp phân tích để xây dựng cây phát sinh loài được đặt tiền đề để ủng hộ con đường tiến hóa với số lượng thay đổi ít nhất.

Không giống như các phương pháp dựa trên khoảng cách, tính phân tích dựa trên suy luận dựa trên ký tự của các kiểu phát sinh loài, sử dụng dữ liệu trình tự ở trạng thái ban đầu thay vì chuyển đổi nó thành khoảng cách. Một trong những phương pháp phân tích phổ biến hơn là Maximum Parsimony (MP)[17], một phương pháp tính toán các bước tiến hóa cho tất cả các cấu trúc liên kết có khả năng và trình bày cây có các bước tiến hóa ít nhất. Thông thường, có nhiều cây chi tiêu ngang nhau, một số có cấu trúc liên kết khác hẳn so với những cây khác.