Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Lactobacillus sp có khả năng ức chế Helicobacter pylori

Luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học nghiên cứu phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Lactobacillus sp có khả năng ức chế Helicobacter pylori.

• Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Thùy Hương
• Trường học: Đại Học Quốc Gia TP. HCM
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Phân Lập, Tuyển Chọn Vi Khuẩn Lactobacillus Sp Ức Chế Helicobacter Pylori
• Loại tài liệu: luận văn
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: TP.Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• TÓM TẮT
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Vi khuẩn Helicobacter pylori
• 1.2. Vi khuẩn lactic và probiotic
• 1.2.1. Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic
• 1.2.2. Quá trình lên men lactic
• 1.2.3. Tiêu chuẩn chọn chủng vi khuẩn lactic sử dụng làm probiotic
• 1.2.4. Cơ chế kháng khuẩn của vi khuẩn lactic
• 1.2.5. Tổng quan về probiotic và Lactobacillus trong chế phẩm probiotic
• 1.2.6. Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Thời gian và địa điểm
• 2.2. Vật liệu và thiết bị sử dụng
• 2.3. Thiết kế thí nghiệm
• 2.4. Phương pháp
• 2.4.1. Thu thập mẫu và phân lập vi khuẩn Lactobacillus
• 2.4.2. Khảo sát các đặc điểm sinh học
• 2.4.3. Phương pháp nhân giống Helicobacter pylori, Lactobacillus và dưỡng dưỡng cộng sinh trưởng của Helicobacter pylori
• 2.4.4. Phương pháp khảo sát khả năng kháng Helicobacter pylori
• 2.4.5. Khảo sát tỷ lệ % của chủng vi khuẩn tuyển chọn với Helicobacter pylori
• 2.4.6. Phương pháp khảo sát hoạt tính probiotic cơ bản và định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn
• 2.4.7. Xác định số lượng tế bào bằng cách đếm số lượng các khuẩn lạc
• 2.4.8. Thử nghiệm tạo chế phẩm Lactobacillus plantarum bằng phương pháp sấy phun
• 2.4.9. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Kết quả phân lập vi khuẩn Lactobacillus
• 3.2. Xác định đường cong sinh trưởng của Helicobacter pylori và khảo sát khả năng ức chế của vi khuẩn Lactobacillus với Helicobacter pylori
• 3.3. Khảo sát hoạt tính probiotic cơ bản của chủng tuyển chọn và định danh
• 3.4. Thử nghiệm tạo chế phẩm L. plantarum và bước đầu đánh giá độ ổn định của chế phẩm
• 3.5. Ảnh hưởng của lưu lượng dịch phun
• 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy phun đầu vào
• 3.7. Tạo chế phẩm sấy phun và theo dõi chế phẩm
• 3.8. Tái khảo sát khả năng kháng Helicobacter pylori của L. plantarum sau khi tạo chế phẩm bằng phương pháp sấy phun
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về vi khuẩn Helicobacter pylori

Vi khuẩn Helicobacter pylori là một loại vi khuẩn Gram âm, có hình dạng cong hoặc hình chữ S, với kích thước từ 0.5-5 µm. H.pylori thường sống trong lớp niêm mạc dạ dày và là nguyên nhân chính gây ra viêm loét dạ dày. Vi khuẩn này có khả năng phát triển trong môi trường acid nhờ vào enzyme urease, giúp phân hủy urea thành ammoniac, tạo ra môi trường kiềm quanh nó và bảo vệ nó khỏi tác động của acid dạ dày. Điều này dẫn đến sự hình thành của các bệnh lý như viêm loét dạ dày, ung thư dạ dày và các bệnh lý tiêu hóa khác. Tỷ lệ nhiễm H.pylori trên toàn cầu rất cao, đặc biệt ở các nước đang phát triển, với tỉ lệ nhiễm có thể lên tới 70-90%. Việc điều trị nhiễm trùng do H.pylori thường sử dụng kháng sinh, nhưng hiện nay đang gặp nhiều khó khăn do tình trạng kháng thuốc gia tăng. Do đó, việc nghiên cứu và phát triển các biện pháp điều trị mới, bao gồm sử dụng các chế phẩm từ vi khuẩn probiotic, như Lactobacillus, đang trở thành một hướng đi quan trọng trong nghiên cứu y học hiện đại.

II. Vi khuẩn lactic và probiotics

Vi khuẩn lactic, hay còn gọi là LAB (Lactic Acid Bacteria), là nhóm vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, có khả năng lên men carbohydrate để sản xuất acid lactic. Nhóm này bao gồm các chi như Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc và Pediococcus. Vi khuẩn lactic thường được tìm thấy trong các sản phẩm thực phẩm lên men như sữa chua, kim chi và dưa muối. Chúng không chỉ đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men thực phẩm mà còn mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe, như cải thiện hệ tiêu hóa và tăng cường hệ miễn dịch. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng một số chủng Lactobacillus có khả năng ức chế sự phát triển của Helicobacter pylori, mở ra khả năng sử dụng chúng như một phương pháp điều trị bổ sung cho nhiễm trùng dạ dày. Việc sử dụng probiotics trong điều trị các bệnh liên quan đến H.pylori có thể giúp giảm thiểu tác dụng phụ của kháng sinh và cải thiện hiệu quả điều trị.

III. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Lactobacillus

Quá trình phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Lactobacillus từ các nguồn nguyên liệu lên men tại Việt Nam là một bước quan trọng trong nghiên cứu này. Các mẫu vi khuẩn được thu thập và nuôi cấy trong môi trường thích hợp để xác định khả năng ức chế Helicobacter pylori. Kết quả nghiên cứu cho thấy một số chủng Lactobacillus có khả năng ức chế H.pylori mạnh mẽ, với tỷ lệ ức chế lên tới 70.48%. Việc sử dụng phương pháp 16S rDNA để định danh các chủng vi khuẩn giúp xác định chính xác các chủng có khả năng kháng khuẩn tốt nhất. Những thông tin này không chỉ có giá trị trong nghiên cứu khoa học mà còn có thể được ứng dụng trong thực tiễn, như phát triển các sản phẩm probiotic mới nhằm điều trị và phòng ngừa các bệnh liên quan đến H.pylori.

IV. Thử nghiệm tạo chế phẩm probiotic

Thử nghiệm tạo chế phẩm probiotic từ các chủng Lactobacillus đã được thực hiện để đánh giá tính ổn định và hiệu quả của sản phẩm. Kết quả cho thấy chế phẩm từ Lactobacillus plantarum có khả năng sống sót tốt trong điều kiện acid của dạ dày và có thể phát huy tác dụng kháng khuẩn đối với H.pylori. Các thông số như lưu lượng phun, nhiệt độ sấy phun cũng đã được tối ưu hóa để đảm bảo chất lượng sản phẩm. Việc phát triển chế phẩm probiotic không chỉ giúp cải thiện sức khỏe đường tiêu hóa mà còn có thể đóng góp vào việc giảm thiểu tình trạng kháng thuốc do kháng sinh gây ra. Sự kết hợp giữa Lactobacillus và các phương pháp điều trị truyền thống có thể tạo ra một giải pháp hiệu quả hơn trong việc kiểm soát nhiễm trùng do H.pylori.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Viêm loét dạ dày tá tràng là một trong những bệnh lý tiêu hóa phổ biến nhất, với nguyên nhân chủ yếu do vi khuẩn Helicobacter pylori (H. pylori). Theo ước tính, hơn 50% dân số thế giới nhiễm loại vi khuẩn này, đặc biệt tỷ lệ nhiễm cao ở các nước đang phát triển, trong đó Việt Nam có tỷ lệ nhiễm lên đến khoảng 70% người lớn. Việc điều trị chủ yếu dựa vào phác đồ kháng sinh, tuy nhiên hiện nay tình trạng kháng thuốc của H. pylori ngày càng gia tăng, làm giảm hiệu quả điều trị và gây ra gánh nặng kinh tế cho xã hội.

Luận văn thạc sĩ này nhằm phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. có khả năng ức chế vi khuẩn H. pylori, đồng thời khảo sát một số hoạt tính probiotic cơ bản của các chủng tuyển chọn. Nghiên cứu được thực hiện trong khoảng thời gian từ tháng 12/2016 đến tháng 12/2017 tại phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Bách Khoa, TP. Hồ Chí Minh. Mục tiêu cụ thể là phân lập vi khuẩn Lactobacillus từ các nguồn lên men truyền thống ở Việt Nam, đánh giá khả năng ức chế H. pylori của các chủng này, xác định các đặc tính probiotic như khả năng chịu acid và muối mật, định danh chủng bằng phương pháp 16S rDNA, và thử nghiệm tạo chế phẩm probiotic bằng phương pháp sấy phun.

Nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển các chế phẩm probiotic hỗ trợ điều trị và phòng ngừa viêm loét dạ dày do H. pylori, góp phần giảm thiểu việc sử dụng kháng sinh và hạn chế tình trạng kháng thuốc. Các chỉ số đánh giá hiệu quả bao gồm tỷ lệ ức chế H. pylori đạt đến 70,48% với chủng Lactobacillus plantarum được tuyển chọn, khả năng chịu pH thấp đến 2 và muối mật 0,3%, cũng như ổn định sinh trưởng trong điều kiện sấy phun.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Vi khuẩn Helicobacter pylori: Là vi khuẩn Gram âm, hình cong hoặc chữ S, có khả năng sống trong môi trường acid dạ dày nhờ enzyme urease. H. pylori gây tổn thương niêm mạc dạ dày, dẫn đến viêm loét và tăng nguy cơ ung thư dạ dày. Tình trạng kháng kháng sinh của H. pylori đang gia tăng, làm giảm hiệu quả điều trị.

• Vi khuẩn lactic (LAB) và probiotic: LAB là nhóm vi khuẩn Gram dương, không tạo bào tử, chủ yếu lên men lactic, có mặt trong nhiều thực phẩm lên men truyền thống. Probiotic là vi sinh vật sống khi được tiêu thụ với lượng thích hợp sẽ mang lại lợi ích sức khỏe cho vật chủ. Các chủng Lactobacillus có khả năng cạnh tranh, tiết bacteriocin và acid hữu cơ để ức chế vi khuẩn gây bệnh, đồng thời chịu được môi trường acid và muối mật trong đường tiêu hóa.

• Cơ chế kháng khuẩn của Lactobacillus: Bao gồm tiết acid lactic, bacteriocin (protein có hoạt tính kháng khuẩn), cạnh tranh bám dính với vi khuẩn gây bệnh, và kích thích đáp ứng miễn dịch của vật chủ.

Các khái niệm chính gồm: H. pylori, vi khuẩn lactic, probiotic, bacteriocin, khả năng chịu acid và muối mật, phương pháp định danh 16S rDNA.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu và mẫu nghiên cứu: Mẫu vi khuẩn Lactobacillus được phân lập từ các thực phẩm lên men truyền thống như dưa chua, kim chi, kim bắp tại TP. Hồ Chí Minh. Vi khuẩn H. pylori chủng PH9 kháng clarithromycin được cung cấp từ Viện Pasteur.

• Phương pháp phân tích:

  • Phân lập vi khuẩn Lactobacillus bằng phương pháp pha loãng và nuôi cấy trên môi trường MRS.
  • Xác định hình thái, nhuộm Gram, và các đặc tính sinh hóa cơ bản.
  • Đánh giá khả năng ức chế H. pylori bằng phương pháp nuôi cấy đồng thời và trãi đĩa khuẩn lạc, đo vòng khuẩn sinh.
  • Khảo sát tỷ lệ phần trăm ức chế H. pylori ở các tỷ lệ khác nhau của vi khuẩn Lactobacillus (1-5%).
  • Kiểm tra khả năng chịu acid (pH 2-6) và muối mật (0,3% NaCl) của chủng tuyển chọn.
  • Định danh chủng vi khuẩn bằng giải trình tự gen 16S rDNA và phân tích chuỗi trên cơ sở dữ liệu NCBI.
  • Thử nghiệm tạo chế phẩm probiotic bằng phương pháp sấy phun, khảo sát ảnh hưởng của lưu lượng dòng phun (4,5-6 ml/phút) và nhiệt độ đầu vào (90-130°C) đến tỷ lệ sống sót của vi khuẩn.
  • Đánh giá độ ổn định của chế phẩm trong 12 tuần bảo quản ở nhiệt độ phòng.

• Timeline nghiên cứu: Từ tháng 12/2016 đến tháng 12/2017, thực hiện các bước phân lập, tuyển chọn, khảo sát hoạt tính, định danh và thử nghiệm tạo chế phẩm.

• Cỡ mẫu và chọn mẫu: Tổng cộng 20 chủng vi khuẩn lactic được phân lập và khảo sát, trong đó 10 chủng từ thực phẩm lên men và 10 chủng từ bộ sưu tập của bộ môn Công nghệ Sinh học.

• Phân tích số liệu: Sử dụng phần mềm Excel và SPSS để xử lý dữ liệu, tính toán tỷ lệ phần trăm ức chế, phân tích sự khác biệt và biểu diễn kết quả bằng biểu đồ và bảng số liệu.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Phân lập và đặc điểm vi khuẩn Lactobacillus
   20 chủng vi khuẩn lactic được phân lập từ các nguồn lên men truyền thống, có hình que, Gram dương, catalase âm tính, vi hiếu khí. Các chủng này phù hợp với đặc điểm sinh học của nhóm Lactobacillus.

2. Đường cong sinh trưởng của H. pylori
   H. pylori phát triển tối ưu sau 72 giờ nuôi cấy với mật độ tế bào đạt cực đại khoảng 7×10^4 CFU/ml, sau đó giảm do cạn kiệt dinh dưỡng và tích tụ sản phẩm chuyển hóa.

3. Khả năng ức chế H. pylori của các chủng Lactobacillus
   Trong 20 chủng được khảo sát, 16 chủng có khả năng ức chế H. pylori với tỷ lệ phần trăm ức chế khác nhau. Chủng L3 (Lactobacillus plantarum) có tỷ lệ ức chế cao nhất đạt 70,48% ở tỷ lệ 3% thể tích so với H. pylori. Các chủng còn lại có tỷ lệ ức chế dao động từ 20-60%. Chủng L3 cũng tạo vòng khuẩn sinh lớn nhất với đường kính 12 mm, chứng tỏ khả năng tiết chất kháng khuẩn mạnh.

4. Khả năng chịu acid và muối mật của chủng tuyển chọn L3
   Chủng L3 có khả năng sống sót tốt ở pH thấp đến 2, tỷ lệ sống sót đạt 54,54% sau 24 giờ. Ở pH 5, tỷ lệ sống sót cao nhất là 81,82%. Khả năng chịu muối mật 0,3% đạt 59,6%, cho thấy chủng có thể tồn tại trong môi trường dạ dày và ruột non.

5. Định danh chủng tuyển chọn
   Phân tích gen 16S rDNA xác định chủng L3 là Lactobacillus plantarum với độ tương đồng 100% so với dữ liệu trên NCBI.

6. Ảnh hưởng của điều kiện sấy phun đến tỷ lệ sống sót của L. plantarum
   Lưu lượng dòng phun 5 ml/phút và nhiệt độ đầu vào 100°C được xác định là điều kiện tối ưu cho quá trình sấy phun, giữ tỷ lệ sống sót của vi khuẩn cao nhất. Nhiệt độ đầu ra ổn định ở 45°C giúp giảm thiểu tổn thương tế bào vi khuẩn.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu cho thấy chủng Lactobacillus plantarum tuyển chọn có khả năng ức chế mạnh H. pylori, phù hợp với các nghiên cứu trước đây cho thấy Lactobacillus có thể tiết acid hữu cơ và bacteriocin để ức chế vi khuẩn gây bệnh. Khả năng chịu acid và muối mật của chủng L3 cho thấy probiotic này có thể sống sót qua môi trường dạ dày và ruột non, điều kiện cần thiết để phát huy tác dụng sinh học.

So sánh với các nghiên cứu quốc tế, tỷ lệ ức chế H. pylori của chủng L3 (70,48%) tương đương với các chủng Lactobacillus được báo cáo có hiệu quả kháng khuẩn cao. Việc sử dụng phương pháp sấy phun để tạo chế phẩm probiotic giúp bảo quản vi khuẩn sống lâu dài và thuận tiện trong ứng dụng thực tế.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ đường cong sinh trưởng của H. pylori, biểu đồ cột tỷ lệ ức chế của các chủng Lactobacillus, biểu đồ đường sống sót của chủng L3 ở các pH khác nhau và bảng tổng hợp điều kiện sấy phun tối ưu.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Phát triển chế phẩm probiotic từ Lactobacillus plantarum

   • Hành động: Sản xuất quy mô pilot chế phẩm probiotic dựa trên chủng L3.
   • Mục tiêu: Đạt tỷ lệ sống sót vi khuẩn > 50% sau 12 tuần bảo quản.
   • Thời gian: 12 tháng.
   • Chủ thể: Các công ty dược phẩm và thực phẩm chức năng.

2. Ứng dụng phối hợp probiotic với phác đồ điều trị kháng sinh

   • Hành động: Thử nghiệm lâm sàng phối hợp probiotic với phác đồ điều trị H. pylori để tăng hiệu quả diệt khuẩn và giảm tác dụng phụ.
   • Mục tiêu: Tăng tỷ lệ diệt H. pylori lên trên 85%.
   • Thời gian: 18-24 tháng.
   • Chủ thể: Các bệnh viện và trung tâm nghiên cứu y học.

3. Nâng cao nhận thức và đào tạo về probiotic trong điều trị viêm loét dạ dày

   • Hành động: Tổ chức hội thảo, đào tạo cho bác sĩ và dược sĩ về lợi ích và ứng dụng probiotic.
   • Mục tiêu: 80% nhân viên y tế được đào tạo trong 1 năm.
   • Thời gian: 12 tháng.
   • Chủ thể: Sở Y tế, các trường đại học y dược.

4. Mở rộng nghiên cứu phân lập và tuyển chọn các chủng probiotic khác

   • Hành động: Tiếp tục phân lập từ các nguồn thực phẩm lên men đa dạng để tìm chủng có hoạt tính kháng H. pylori cao hơn.
   • Mục tiêu: Tìm thêm ít nhất 3 chủng mới có hiệu quả tương đương hoặc cao hơn.
   • Thời gian: 24 tháng.
   • Chủ thể: Các viện nghiên cứu và trường đại học.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Công nghệ Sinh học, Vi sinh vật

   • Lợi ích: Hiểu rõ quy trình phân lập, tuyển chọn vi khuẩn probiotic và ứng dụng trong điều trị vi khuẩn gây bệnh.
   • Use case: Áp dụng phương pháp nghiên cứu tương tự cho các đề tài liên quan.

2. Bác sĩ chuyên khoa Tiêu hóa và Dược sĩ lâm sàng

   • Lợi ích: Nắm bắt xu hướng sử dụng probiotic hỗ trợ điều trị viêm loét dạ dày do H. pylori.
   • Use case: Tư vấn và phối hợp probiotic trong phác đồ điều trị.

3. Doanh nghiệp sản xuất thực phẩm chức năng và probiotic

   • Lợi ích: Tham khảo quy trình tạo chế phẩm probiotic ổn định và hiệu quả.
   • Use case: Phát triển sản phẩm mới dựa trên chủng Lactobacillus plantarum tuyển chọn.

4. Cơ quan quản lý y tế và chính sách

   • Lợi ích: Đánh giá tiềm năng probiotic trong chiến lược phòng chống kháng thuốc kháng sinh.
   • Use case: Xây dựng hướng dẫn sử dụng probiotic trong điều trị viêm loét dạ dày.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao cần tìm probiotic để ức chế H. pylori?
   Việc điều trị H. pylori bằng kháng sinh ngày càng gặp khó khăn do tình trạng kháng thuốc gia tăng. Probiotic như Lactobacillus có thể ức chế H. pylori tự nhiên, giảm tác dụng phụ và tăng hiệu quả điều trị.

2. Làm thế nào để đánh giá khả năng ức chế H. pylori của vi khuẩn lactic?
   Thường sử dụng phương pháp nuôi cấy đồng thời và trãi đĩa khuẩn lạc để đo vòng khuẩn sinh, tính tỷ lệ phần trăm ức chế dựa trên số lượng tế bào H. pylori còn sống.

3. Khả năng chịu acid và muối mật quan trọng như thế nào đối với probiotic?
   Probiotic phải sống sót qua môi trường acid dạ dày (pH ~2) và muối mật ruột để đến được ruột non, nơi phát huy tác dụng. Khả năng này quyết định hiệu quả của probiotic khi sử dụng đường uống.

4. Phương pháp sấy phun có ảnh hưởng gì đến vi khuẩn probiotic?
   Sấy phun giúp tạo chế phẩm bột dễ bảo quản nhưng nhiệt độ cao có thể làm giảm số lượng vi khuẩn sống. Do đó, cần tối ưu điều kiện sấy để giữ tỷ lệ sống sót cao.

5. Chế phẩm probiotic từ Lactobacillus plantarum có thể ứng dụng thực tế như thế nào?
   Có thể dùng làm thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị viêm loét dạ dày, phối hợp với kháng sinh để tăng hiệu quả diệt H. pylori, đồng thời cải thiện sức khỏe tiêu hóa và miễn dịch.

Kết luận

• Phân lập thành công 20 chủng vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống Việt Nam, trong đó chủng Lactobacillus plantarum (L3) có khả năng ức chế H. pylori mạnh nhất với tỷ lệ 70,48%.
• Chủng L3 có khả năng chịu acid pH 2 và muối mật 0,3%, phù hợp làm probiotic đường tiêu hóa.
• Định danh gen 16S rDNA xác nhận chủng L3 là Lactobacillus plantarum với độ tương đồng 100%.
• Điều kiện sấy phun tối ưu là lưu lượng 5 ml/phút, nhiệt độ đầu vào 100°C, đầu ra 45°C, giữ tỷ lệ sống sót vi khuẩn cao.
• Nghiên cứu mở ra hướng phát triển chế phẩm probiotic hỗ trợ điều trị viêm loét dạ dày do H. pylori, góp phần giảm thiểu kháng thuốc kháng sinh.

Next steps: Triển khai thử nghiệm lâm sàng phối hợp probiotic với phác đồ điều trị, mở rộng phân lập chủng probiotic mới, phát triển sản phẩm thương mại.

Call-to-action: Các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp nên hợp tác để ứng dụng kết quả nghiên cứu vào thực tiễn, nâng cao hiệu quả điều trị và sức khỏe cộng đồng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ÑAÏI HOÏC QUOÁC GIA TP. HCM TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC BAÙCH KHOA ÑAËNG ÑÌNH HIEÄP PHAÂN LAÄP TUYEÅN CHOÏN VI KHUAÅN LACTOBACILLUS SP. COÙ KHAÛ NAÊNG ÖÙC CHEÁ VI KHUAÅN HELICOBACTER PYLORI Chuyeân ngaønh: Coâng Ngheä Sinh Hoïc Maõ soá: 60 42 02 01 LUAÄN VAÊN THAÏC SÓ TP.Hoà Chí Minh, thaùng 7 naêm 2018 COÂNG TRÌNH ÑÖÔÏC HOAØN THAØNH TAÏI TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC BAÙCH KHOA –ÑHQG-TPHCM Caùn boä höôùng daãn khoa hoïc PGS.TS Nguyeãn Thuùy Höông Caùn boä phaûn bieän 1 PGS.TS Buøi Vaên Leä Caùn boä phaûn bieän 2 TS. Voõ Ñình Leä Taâm Luaän vaên thaïc só ñöôïc baûo veä taïi tröôøng Ñaïi Hoïc Baùch Khoa-ÑHQG Tp.HCM, ngaøy 21 thaùng 7 naêm 2018 Thaønh phaàn hoäi ñoàng ñaùnh giaù luaän vaên goàm: PGS.TS Nguyeãn Tieán Thaéng PGS.TS Buøi Vaên Leä PGS.TS Leâ Thò Thuûy Tieân TS.

Voõ Ñình Leä Taâm TS. Hoaøng Anh Hoaøng Xaùc nhaän cuûa chuû tòch hoäi ñoàng ñaùnh giaù luaän vaên vaø tröôûng khoa quaûn lyù chuyeân ngaønh sau khi luaän vaên ñaõ ñöôïc söõa chöõa CHUÛ TÒCH HOÄI ÑOÀNG TRÖÔÛNG KHOA PGS.TS Nguyeãn Tieán Thaéng GS.TS Phan Thanh Sôn Nam ÑAÏI HOÏC QUOÁC GIA TP.HCM COÄNG HOØA XAÕ HOÄI CHUÛ NGHÓA VIEÄT NAM TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC BAÙCH KHOA Ñoäc laäp - Töï do - Haïnh phuùc NHIEÄM VUÏ LUAÄN VAÊN THAÏC SÓ Hoï teân hoïc vieân: Ñaëng Ñình Hieäp MSHV: 7140860 Ngaøy, thaùng, naêm sinh: 1/4/1983 Nôi sinh: Hoà Chí Minh Chuyeân ngaønh: Coâng Ngheä Sinh Hoïc Maõ soá: 60 42 02 01 I. TEÂN ÑEÀ TAØI: Phaân laäp, tuyeån choïn vi khuaån Lactobacillus sp coù khaû naêng öùc cheá vi khuaån Helicobacter pylori II. NHIEÄM VUÏ VAØ NOÄI DUNG: x Phaân laäp vi khuaån Lactobacillus töø caùc nguoàn leân men ôû Vieät nam.

x Kieåm tra khaû naêng öùc cheá cuûa caùc chuûng Lactobacillus phaân laäp ñöôïc vôùi H.pylori, choïn ra chuûng coù khaû naêng khaùng H.pylori cao nhaát x Khaûo saùt moät soá hoaït tính probiotic cô baûn cuûa chuûng tuyeån choïn. x Ñònh danh chuûng tuyeån choïn baèng phöông phaùp 16S rDNA. x Thöû nghieäm taïo cheá phaåm probiotic cuûa chuûng tuyeån choïn vaø böôùc ñaàu ñaùnh giaù ñoä oån ñònh cuûa cheá phaåm. NGAØY GIAO NHIEÄM VUÏ 27/2/2017 IV.

NGAØY HOAØN THAØNH NHIEÄM VUÏ 30/5/2018 V. CAÙN BOÄ HÖÔÙNG DAÃN PGS.TS Nguyeãn Thuùy Höông Tp. HCM, ngaøy 31 thaùng 5 naêm 2018 CAÙN BOÄ HÖÔÙNG DAÃN CHUÛ NHIEÄM BOÄ MOÂN ÑAØO TAÏO (Hoï teân vaø chöõ kyù) (Hoï teân vaø chöõ kyù) 75ƯỞ1*.+2$ (Hoï teân vaø chöõ kyù) LÔØI CAÛM ÔN Toâi xin baøy toû loøng caùm ôn saâu saéc ñeán taát caû thaày giaùo, coâ giaùo, nhöõng ngöôøi ñaõ cho toâi kieán thöùc vaø khuyeán khích toâi trong suoát hai naêm hoïc cao hoïc ôû tröôøng ñaïi hoïc Baùch Khoa Hoà Chí Minh. Ñaëc bieät, toâi xin baøy toû loøng bieát ôn saâu saéc ñeán PGS.TS Nguyeãn Thuùy Höông, Ngöôøi ñaõ hoã trôï, ñoäng vieân, söûa baøi vaø cho toâi nhöõng lôøi khuyeân quyù giaù trong suoát quaù trình laøm ñeà taøi cao hoïc.

Hôn theá nöõa, toâi cuõng caùm ôn ñeán taát caû thaày coâ, nhaân vieân ôû phoøng thí nghieäm, ñaõ giuùp ñôõ vaø cho pheùp toâi söû duïng nhöõng trang thieát bò ôû phoøng thí nghieäm ñeå laøm ñeà taøi nghieân cöùu. Cuoái cuøng, toâi xin baøy toû loøng bieát ôn saâu saéc ñeán boá meï, gia ñình cuõng nhö cô quan ñaõ khuyeán khích, ñoäng vieân vaø taïo nhöõng ñieàu kieän toát nhaát cho toâi hoaøn thaønh ñeà taøi nghieân cöùu naøy. TOÙM TAÉT Vieâm loeùt daï daøy taù traøng laø moät trong nhöõng vaán ñeà tieâu hoùa thöôøng gaëp nhaát, nguyeân nhaân laø do lôùp nhaøy bò suy yeáu, acid baét ñaàu taán coâng nieâm maïc daï daøy vaø daãn ñeán caùc vieâm loeùt gaây ñau ñôùn, noùng raùt ôû vuøng thöôïng vò. Ngaøy nay khoa hoïc ñaõ chöùng minh thuû phaïm chính gaây ra tình traïng naøy laø do vi khuaån H.

Phöông phaùp tieâu dieät H.pylori chuû yeáu söû duïng khaùng sinh, tuy nhieân hieän nay ñaõ trôû neân thaát baïi vì H.pylori ñaõ trôû neân khaùng khaùng sinh. Vì vaäy, vieäc nghieân cöùu söû duïng cheá phaåm probiotic ñeå phoøng ngöøa vaø hoã trôï ñieàu trò vi khuaån H.pylori ñang ñöôïc caùc nhaø khoa hoïc quan taâm. Nghieân cöùu naøy ñöôïc thöïc hieän nhaèm phaân laäp vi khuaån lactic töø caùc nguoàn nguyeân lieäu leân men. Sau khi phaân laäp vaø tieán haønh khaûo saùt hoaït tính khaùng H.pylori cuûa caùc chuûng vi khuaån lactic ñöôïc phaân laäp, choïn ra chuûng vi khuaån lactic coù tyû leä phaàn traêm khaùng H.pylori cao nhaát, sau ñoù tieán haønh khaûo saùt moät soá hoaït tính probiotic cô baûn ñieån hình vaø ñònh danh chuûng vi khuaån lactic tuyeån choïn, cuoái cuøng laø böôùc ñaàu tieán haønh thöû nghieäm taïo cheá phaåm.

Keát quaû thí nghieäm ñaõ phaân laäp ñöôïc 20 chuûng vi khuaån lactic töø moät soá thöïc phaåm leân men, choïn ra ñöôïc moät chuûng laø Lactobacillus plantarum coù khaû naêng khaùng H.pylori maïnh nhaát, coù tyû leä phaàn traêm öùc cheá laø 70,48%, chòu ñöôïc caùc ñieàu kieän cöïc ñoan pH thaáp vaø muoái maät vôùi noàng ñoä 0,3%. Ñònh höôùng taïo cheá phaåm, ñeà taøi ñaõ xaùc ñònh ñöôïc moät soá thoâng soá trong quaù trình saáy phun taïo cheá phaåm ñöôïc xaùc ñònh: löu löôïng dòch phun laø 5 ml/phuùt, nhieät ñoä ñaàu vaøo cho quaù trình saáy phun laø 1000C. Qua nhöõng keát quaû nghieân cöùu treân, ta thaáy raèng L.plantarum coù ñaëc ñieåm sinh hoïc phuø hôïp vôùi vai troø laø moät probiotic, coù theå söû duïng ñeå laøm cheá phaåm probiotic vaø keát hôïpù vôùi khaùng sinh ñeå hoã trôï ngaên ngöøa H. MUÏC LUÏC LÔØI CAÙM ÔN.

TOÙM TAÉT LUAÄN VAÊN. TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU .1 Vi khuaån Helicobacter pylori. Ñaëc ñieåm vi khuaån Helicobacter pylori. Cô cheá gaây beänh cuûa Helicobacter pylori.

Helicobacter pylori khaùng khaùng sinh. Toång quan veà tình hình ñeà khaùng khaùng sinh cuûa Helicobacter pylori .Vi khuaån lactic vaø probiotic. Ñaëc ñieåm chung cuûa khuaån lactic. Quaù trình leân men lactic.

Tieâu chuaån choïn chuûng vi khuaån lactic söû duïng laøm probiotic. Cô cheá khaùng khuaån cuûa vi khuaån lactic. Toång quan veà probiotic vaø Lactobacillus trong cheá phaåm probiotic. Tình hình nghieân cöùu trong nöôùc vaø ngoaøi nöôùc.VAÄT LIEÄU VAØ PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU.1 Thôøi gian vaø ñòa ñieåm.

Vaät lieäu vaø thieát bò söû duïng. Thieát keá thí nghieäm.4 Phöông phaùp. Thu thaäp maãu vaø phaân laäp vi khuaån Lactobacillus. Khaûo saùt caùc ñaëc ñieåm sinh hoïc.

Phöông phaùp nhaân gioáng Helicobacter pylori, Lactobacillus vaø döïng ñöôøng cong sinh tröôûng cuûa Helicobacter pylori. Phöông phaùp khaûo saùt khaû naêng khaùng Helicobacter pylori. Khaûo saùt caùc tyû leä % cuûa chuûng vi khuaån tuyeån choïn vôùi Helicobacter pylori. Phöông phaùp khaûo saùt hoaït tính probiotic cô baûn vaø ñònh danh chuûng vi khuaån tuyeån choïn.

Xaùc ñònh soá löôïng teá baøo baèng caùch ñeám soá löôïng caùc khuaån laïc. Thöû nghieäm taïo cheá phaåm Lactobacillus plantarum baèng phöông phaùp saáy phun. Phöông phaùp xöû lyù soá lieäu. KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN.

Keát quaû phaân laäp vi khuaån Lactobacillus. Xaùc ñònh ñöôøng cong sinh tröôûng cuûa Helicobacter pylori vaø khaûo saùt khaû naêng öùc cheá cuûa vi khuaån Lactobacillus vôùi Helicobacter pylori. Khaûo saùt hoaït tính probiotic cô baûn cuûa chuûng tuyeån choïn vaø ñònh danh.Thöû nghieäm taïo cheá phaåm L.plantarum vaø böôùc ñaàu ñaùnh giaù ñoä oån ñònh cuûa cheá phaåm 42 3. AÛnh höôûng cuûa löu löôïng dòch phun.

AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä saáy phun ñaàu vaøo. Taïo cheá phaåm saáy phun vaø theo doõi cheá phaåm. Taùi khaûo saùt khaû naêng khaùng Helicobacter pylori cuûa L.plantarum sau khi taïo cheá phaåm baèng phöông phaùp saáy phun .45 KEÁT LUAÄN VAØ KIEÁN NGHÒ .48 TAØI LIEÄU THAM KHAÛO. DANH MUÏC CAÙC TÖØ VIEÁT TAÉT H.pylori Helicobacter pylori LAB (lactic acid bacteria) Vi khuaån lactic GRAS (Generally Recognized As safe) Ñöôïc coâng nhaän chung laø an toaøn MRS de Man, Rogosa, Sharpe sp.

(species) Loaøi OAC Omeprazol, Amoxicillin, Clarithromycin OAM Omeprazol, Amoxicillin, Metronidazol DANH MUÏC CAÙC HÌNH Hình 1.2: Sô ñoà cô cheá vieâm loeùt daï daøy do H.3: Lactobacillus casei vaø Lactobacillus bulgaricus.4: Cô cheá khaùng khuaån cuûa bacteriocin .1: Ñöôøng cong sinh tröôûng cuûa H.2: Tyû leä % öùc cheá cuûa caùc chuûng vi khuaån lactic ñoái vôùi H.3: Khaû naêng khaùng cuûa vi khuaån lactic (L3) ñoái vôùi H.4: Khaûo saùt tyû leä % cuûa chuûng vi khuaån tuyeån choïn vôùi H.5: AÛnh höôûng cuûa pH ñeán khaû naêng sinh tröôûng cuûa chuûng tuyeån choïn.6: Keát quaû ñònh danh chuûng L3 .7: Kích thöôùc haït cheá phaåm L.plantarum sau khi saáy phun.8: Hình aûnh cheá phaåm L.plantarum sau khi saáy phun. 46 DANH MUÏC CAÙC BAÛNG Baûng 1.1: Tæ leä ñeà khaùng khaùng sinh cuûa H.pylori ôû nhöõng khu vöïc khaùc nhau treân theá giôùi .2: Vi khuaån probiotic vaø tính an toaøn veà khaû naêng laây nhieãm .1: Ñaëc ñieåm hình thaùi cuûa moät soá doøng vi khuaån lactic phaân laäp .2: Toùm taét thoâng tin chuûng gioáng .3: AÛnh höôûng cuûa löu löôïng dòch phun .4: AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä saáy phun ñaàu vaøo .5: Theo doõi cheá phaåm. 47 MÔÛ ÑAÀU Vieâm loeùt daï daøy taù traøng laø moät trong nhöõng vaán ñeà tieâu hoùa thöôøng gaëp nhaát. Thoâng thöôøng, lôùp nieâm maïc beân trong cuûa daï daøy vaø ruoät non ñöôïc bao phuû bôûi moät lôùp chaát nhaøy, do ñoù baûo veä nieâm maïc traùnh ñöôïc söï taùc ñoäng cuûa acid dòch vò.

Khi lôùp nhaøy bò suy yeáu, acid baét ñaàu taán coâng nieâm maïc daï daøy vaø daãn ñeán caùc vieâm loeùt gaây ñau ñôùn, noùng raùt ôû vuøng thöôïng vò. Ngaøy nay khoa hoïc ñaõ chöùng minh thuû phaïm chính gaây ra tình traïng naøy laø do vi khuaån Helicobacter pylori. Vi khuaån naøy tieát ra nhöõng ñoäc toá laøm phaù huûy lôùp nhaøy baûo veä nieâm maïc vaø gaây vieâm loeùt [1, 2]. Phöông phaùp tieâu dieät vi khuaån H.

pylori chuû yeáu laø söû duïng khaùng sinh, tuy nhieân hieän nay ñaõ gaëp nhieàu thaát baïi bôûi vì H.pylori trôû neân khaùng vôùi nhieàu loaïi khaùng sinh. Vì vaäy, vieäc nghieân cöùu söû duïng cheá phaåm sinh hoïc probiotic vaø bacteriocin ñeå öùc cheá vi khuaån H.pylori ñang ñöôïc caùc nhaø khoa hoïc quan taâm [20]. Probiotic laø nhöõng vi sinh vaät soáng maø khi ñöôïc tieâu thuï vôùi löôïng thích hôïp seõ mang laïi nhöõng taùc ñoäng coù ích cho vaät chuû. Bacteriocin khaùc vôùi haàu heát caùc khaùng sinh duøng trong y hoïc do chuùng laø caùc phaân töû protein neân deã bò phaân huûy bôûi enzyme protease trong heä tieâu hoùa.

Bacteriocin ñöôïc taïo ra bôûi caùc loaøi Lactobacillus coù khaû naêng öùc cheá ñöôïc nhieàu loaïi vi khuaån gaây beänh [13]. Tuy nhieân, cho ñeán nay chöa coù nhieàuù nghieân cöùu söû duïng Lactobacillus sp hay bacteriocin töø Lactobacillus sp ñeå öùc cheá laïi H. Ñeà taøi “Phaân laäp, tuyeån choïn vi khuaån Lactobacillus sp coù khaû naêng öùc cheá vi khuaån Helicobacter pylori” nhaèm muïc tieâu phaân laäp, tuyeån choïn doøng Lactobacillus sp. coù khaû naêng öùc cheá laïi vi khuaån H.pylori ñeå thöû nghieäm taïo cheá phaåm sinh hoïc öùc cheá H.pylori gaây ra beänh daï daøy.

Noäi dung nghieân cöùu goàm: - Phaân laäp vi khuaån Lactobacillus töø caùc nguoàn leân men ôû Vieät nam. - Kieåm tra khaû naêng öùc cheá cuûa caùc chuûng Lactobacillus phaân laäp ñöôïc vôùi H.pylori, choïn ra chuûng coù khaû naêng khaùng H.pylori cao nhaát - Khaûo saùt moät soá hoaït tính probiotic cô baûn cuûa chuûng tuyeån choïn.