MỞ ĐẦU 1. ĐẶT VAN DE Việt Nam là một nước nhiệt đới gió mùa, rất thuận lợi cho các đối tượng vi sinh vật gây bệnh tổn tại, phát triển. Mặt khác, việc kiểm soát nhiễm khuẩn ở Việt Nam khá lỏng lẻo, chưa đồng bộ cộng với tập quán sử dụng kháng sinh thiếu hiểu biết của người dân đã tạo ra những chủng vi khuẩn đột biến, đa kháng thuốc. Trong đó, hai điển hình vi sinh vật đa kháng thuốc nguy hiểm nhất hiện nay 1a trực khuẩn mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) va tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus).
Hai chủng vi khuẩn này tuy không có bảo tử nhưng có khả năng tôn tai và thích ứng rất cao với điều kiện khắc nghiệt của môi trường. Do đó, việc sử dụng kháng sinh phố kháng khuẩn rộng thiếu kiểm soát làm cho chúng biến chủng và có khả năng dé kháng với hau hết các kháng sinh họ B-lactamins va Cephalosporins thế hệ I va II. Thêm vào đó, công tác chống nhiễm khuẩn trong các bệnh viện không thực sự tốt giúp cho các đối tượng nay tôn tai được trong điều kiện cực đoan và ngày càng độc hơn với cái tên “vi trùng bệnh viện”; là nỗi ám ảnh của các bệnh nhân có thời gian điều trị nội trú dài trên một tháng. Việc điều trị nhiễm trùng mủ xanh và tụ cầu vàng rất khó khăn và tốn kém.
Hầu hết bệnh nhân có kết quả xét nghiệm dương tính với Pseudomonas aeruginosa đều được điều trị tích cực băng kết hợp giữa một kháng sinh ho Penicillin và một kháng sinh ho Aminoglycoside. Đối voi tụ cầu vàng kháng Methicillin (Methicillin resistant Staphylococcus aureus, gọi tat là MRSA) thì trị liệu băng Vancomycin liều cao ngay từ đâu là lựa chọn can thiết. Tuy nhiên, việc điều tri không phải lúc nào cũng thành công. Một số trường hợp bệnh nhân tử vong do ba nguyên nhân sau: thứ nhất, việc điều trị không tích cực ngay từ đầu làm cho vi khuẩn biến dị đa kháng thuốc; thứ hai, đường xâm nhập của vi khuẩn (nhiễm trùng máu hay viêm màng não); thứ ba, sức dé kháng của bệnh nhân yếu dẫn đến nhiễm trùng cơ hội.
Ở nguyên nhân thứ nhất, vi khuẩn có thé biến dị thành nhiều hon một type tổn tại song song và truyền khả năng kháng thuốc qua lại lẫn nhau dẫn đến việc điều trị đi vào bé tắc và tính mạng bệnh nhân bi đe dọa. Ngoài phương pháp điều trị bệnh nhiễm băng các chất kháng sinh, có một phương pháp khác ứng dụng vi sinh vat ức chế cạnh tranh lẫn nhau để loại bỏ đối tượng vi sinh vật gây bệnh. Trong điều kiện nhất định, vi sinh vật muốn tôn tại và phát triển phải có cơ chế ức chế (sản xuất các chất kháng khuẩn, chat nhảy, các sản phẩm trao đồi chất bậc hai) và cơ chế lân at (cạnh tranh vị trí bám, khả năng tăng trưởng, khả năng chuyển hóa và hấp thụ chất dinh dưỡng) đối với các đối tượng vi sinh vật khác. Các nghiên cứu cơ bản về lý thuyết ức chế cạnh tranh giữa các vi sinh vật đã tạo tiền dé cho dé tài này.
Trong luận van, chúng tôi chỉ dừng lại ở giai đoạn “Khảo sát kha năng ức chế trực khuẩn mủ xanh và tụ cầu vàng của Bacillus subtilis”, làm tiền đề khả nang ứng dụng phương pháp điều trị nay vào lâm sàng. MỤC TIỂU CUA DE TÀI Có hai mục tiêu chính: - Tuyén chon chung Bacillus subtilis có hoạt lực ức chế trực khuẩn mủ xanh va tu cầu vàng trong điều kiện tối ưu invitro. Từ đó lựa chọn được chủng có ưu thế nhất. - Bước dau thử nghiệm trên bệnh phẩm va thu thập số liệu.
Y NGHĨA CUA DE TÀI 1. Ý nghĩa khoa học - Ap dụng lý thuyết vi sinh vật ức chế vi sinh vật trong điều kiện nhất định dé khảo sát khả năng ức chế hai đối tượng gây bệnh cho người là trực khuẩn mủ xanh va tụ cầu vàng của Bacillus subtilis. - Xác định được các điều kiện tối ưu cho quá trình ức chế. - Dự đoán được tính khả thi của quá trình ức chế và tiền thử nghiệm cận lâm sàng.
Y nghĩa thực tế Đề tài có quy mô nhỏ về nhân lực và điều kiện thực nghiệm; tuy nhiên phạm vi ứng dụng của dé tài là rat lớn (không dé cập đến ứng dụng probiotic của Bacillus subtilis): - Mở ra hướng điều trị bệnh nhiễm không dùng kháng sinh đã bị bỏ ngỏ từ thập niên 1950 đến nay. - Khả năng ứng dụng vảo các sản phẩm y tế: băng gạc (medical gauze) có tâm các sản phẩm trao đối chat của Bacillus subtilis trong điều trị vết thương ngoài da, điều trị mun. CHƯƠNG 2 — TONG QUAN TAI LIEU 2. CAC DOI TUQNG VI SINH VAT 2.
Pseudomonas aeruginosa ea BRA ate ee Mg es Se| Le St f4 §14 tá Oy SA ~ ‘ a x3 PAIS ond ‘¢« "oneyes Xa Gioi: ye Bacteria. eee aye tee “ch ee ~ a s T J 4 ; ‘ wo ‘ “7>. ‘- ha s a's 7 ` ’ “C " Ngành: Proteobacteria LỆ Vev ip Sex , (v29 “Vị kX PRED cog 's r 4w ¬ Š xi M vt ` ^ Lớp: Op: G amma Proteobacter1 Proteobacteria h 2sù¿ V2 v4} Pa meeThe SeLB H227. CÁ Xư! 2 “cew ‘ ry by“ ad `.
°> , ` 2; ¬ "12-4 x wt) OP tí ` F Bộ: Pseudomonadales ° Mon VÀ 7v, Sb th ý g Bae WA et / 45 a:,! hy Ho: Pseudomonadaceae ì GEN 2u An” Se | Zoe ee a * nA sa ss 'Á ° ` “. , 7 > Chi: : | Pseudomonas " Cot ` * nw Ae FT + ‘ * 4 s ae | ng cứ TƯỜNG: Yale y ¿ Rye wy ( Loài Pseudomonas aeruginosa ‘4% Z Tela “~~ ì = si VE # So‘ i, £ 10 : .' ; Tv rir TA rào Hy đế a * ALOT Xã v ivy xế 6 3 Hinh 2. Hinh anh vi thé Pseudomonas aeruginosa [29] Pseudomonas aeruginosa gây bệnh cho người là những trực khuẩn Gram âm, thường sống ở những nơi âm ướt như dat, nước, cây cối,. kế cả trong bệnh viện.
Trên cơ thé người, vi khuẩn này thường sống ở vùng da 4m, một số cộng sinh ở đường tiêu hóa (được phân lập trong khoảng 1/10 phân người bình thường). Ngoài ra, còn được tìm thấy trong các dung dịch nhỏ mắt, mỹ phẩm, dung dịch Phenol loãng, Benzalkinium chloride, xả bông nước Hexachlorophene, kem, nước căm hoa, bổn tắm, máy hút âm, máy thông khí, các vật dụng băng vải ở bệnh viện, trong các túi máu, huyết tương nhiễm khuẩn ở ngân hang mau,. Đặc điểm hình thái Pseudomonas aeruginosa là những trực khuẩn Gram âm, thang hay hơi cong: có khả năng di động nhờ một hay hai tiên mao ở một đâu. Kích thước 0,6x2,0 um; tuy nhiên, hình dang và kích thước của vi khuẩn có thé thay đôi trong lứa cấy gia [27].
Đặc điểm nuôi cấy Pseudomonas aeruginosa mọc dễ trên các môi trường thông thường, hiếu khí tuyệt đồi. Lứa cấy tỏa ra mùi thơm nhẹ giống như mùi nho khô, tăng trưởng tốt ở 35-42°C. Trên môi trường đặc, khóm vi khuẩn mọc det hay hơi lôi, biên không đều, có khuynh hướng mọc tràn, đặc biệt trên thạch dinh dưỡng hay Trypticase soy agar. Trên thạch máu, đa số cho tiêu huyết Bêta.
Trên thạch MC hay EMB, khóm vi khuẩn không màu do không lên men Lactose. Trong môi trường lỏng, vi khuẩn mọc làm đục va tạo một lớp váng mỏng trên bề mặt môi trường. Pseudomonas aeruginosa có thé tiết ra bỗn loại sắc tố là: Pyocyanin (màu xanh lá cây không phát huỳnh quang), Pyoverdin (màu xanh lá cây phát huỳnh quang dưới tia cực tim, còn gọi là Flourescent), Pyorubin (màu đỏ sam) và Pyomelanine (màu nâu đen). Trong đó, Pyocyanin là màu sac đặc trưng của vi khuẩn, có khả năng khuếch tán vao môi trường làm cho môi trường có màu xanh lục.
Tỉnh chất sinh hóa - Không có khả năng lên men các loại đường: Glucose (-), Lactose (-), Sucrose (-), Maltose (-), Mannitol (-). Chỉ có khả năng oxy hóa đường Glucose. Staphylococcus aureus Gidi: Bacteria Nganh: Firmicutes Lop: Bacilli Bộ: Bacillales Ho: Staphylococceae Chi: Staphylococcus Loài: Staphylococcus aureus Hinh 2. Hinh anh vi thé Staphylococcus aureus [30] Staphylococcus aureus được phan lập từ mủ ung nhọt do Robert Koch phát hiện năm 1878.
Đến năm 1884, Louis Pasteur và F. Rosenbach nghiên cứu ti mi va phân loại Š. aureus thuộc hàng Eubacferiales, họ Micrococcaceae, dong Staphylococcus. aureus CÓ thé tồn tại trong không khí, bụi từ 50-100 ngày.
Do đó, chúng là vi trùng bệnh viện rất thường gặp trong bông, gạc ban, khăn trải giường, ngay cả trên các mặt băng và thiết bị y tế nêu không được vệ sinh và khử trùng kỹ càng. Chúng lây lan và thường khu trú trong nang lông của người và động vật, chúng chịu được nhiệt độ rất cực đoan từ 0-70°C, pH 3- 8. Gặp điều kiện thuận loi, chúng gây 6 mủ gây viêm nang lông, áp-xe da,. Đặc điểm hình thái Staphylococcus aureus là vi khuân Gram dương có dạng hình cầu, đường kính 1,0-1,5 um, sắp xếp không có thứ tự nhất định, thường tụ lại thành từng đám giống chùm nho.
aureus không di động, không có bào tử, một số chủng có vỏ capsule. Đặc điểm nuôi cấy Staphylococcus aureus mọc dé dàng trên hầu hết các loại môi trường, trong điều kiện hiểu khí, vi hiểu khí và ky khí tùy nghi. Nhiệt độ thích hợp nhất là 37°C và pH = 7,2-7,4 Trên môi trường đặc, S.aqureus mọc thành khóm màu vàng. aureus mọc khóm trơn, lôi, đường kính 1-4 mm và gây tan máu.
Tỉnh chất sinh hóa - Lên men đường: Glucose (+), Sucrose (+), Lactose (+), Maltose (+), Mannitol (+). Bacillus subtilis Gidi: Bacteria Ngành: Firmicutes Lop: Bacilli Bộ: Bacillales Ho: Bacillaceae Chi: Bacillus Loai: Bacillus subtilis Năm 1835, Christian Gottfried Ehrenberg phát hiện ra vi khuẩn này và gọi là Vibrio subtilis, đến năm 1872, Ferdinand Cohn chính thức đặt tên vi khuẩn nay là Bacillus subtilis. Năm 1949-1950, Kenry Albot đã phân lập được chúng thuần. Trong những năm thập niên 1950, được ứng dụng trong dược phẩm nhờ khả năng kích thích miễn dịch và tiêu hóa [28].
Đặc điểm hình thái Bacillus subtilis thuộc họ Bacillaceae là trực khuẩn gram dương, hình dạng có 2 dau tròn; có khả năng sản sinh bảo tử trong điều kiện môi trường cực đoan. Đặc điểm nuôi cấy Bacillus subtilis là vi khuân hiéu khí tùy tiện (trước đây Bacillus subtilis được xếp vào loại vi khuẩn hiếu khí bat buộc) và có nhiều đặc tính ưu việt, đặc biệt là khả năng chịu nhiệt tốt, có thé tổn tại ở dạng bào tử ở nhiệt độ 52°C. Bacillus subtilis có thé tồn tại trong khoảng pH rộng từ pH = 2. Tinh chất sinh hóa - Lên men đường: Glucose (+), Sucrose (+), Maltose (+), Mannitol (+), Lactose (-).
TINH CHAT GAY BENH, XET NGHIEM CAN LAM SANG VA DIEU TRI NHIÊM KHUAN DO TRUC KHUAN MU XANH VA TU CÂU VÀNG 2. Nhiễm khuẩn mủ xanh do Pseudomonas aeruginosa 2.