Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu khả năng ức chế vi khuẩn Xanthomonas sp gây bệnh loét trên cây chanh

Nghiên cứu khả năng ức chế vi khuẩn Xanthomonas sp trên cây chanh từ chiết xuất cây giao, mang lại giải pháp bảo vệ cây trồng hiệu quả.

• Tác giả: Nguyễn Thị Mỹ Lệ
• Người hướng dẫn: TS. Võ Thị Thu Oanh
• Trường học: Trường Đại Học Nông Lâm TP HCM
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nghiên cứu khả năng ức chế vi khuẩn Xanthomonas sp gây bệnh loét trên cây chanh của hoạt chất chiết xuất từ cây giao (Euphorbia tirucalli L.)
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. MỞ ĐẦU
• 1.1. Tính cấp thiết của luận án
• 1.2. Mục tiêu của luận án
• 1.3. Ý nghĩa khoa học của luận án
• 1.4. Ý nghĩa thực tiễn của luận án
• 1.5. Đối tượng nghiên cứu của luận án
• 1.6. Những đóng góp mới của luận án
• 2. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Tổng quan về cây chanh
• 2.1.1. Vị trí phân loại
• 2.1.2. Đặc điểm thực vật
• 2.1.3. Tình hình sản xuất chanh ở Long An
• 2.2. Tổng quan về bệnh loét do vi khuẩn trên cây chanh
• 2.2.1. Lịch sử và phân bố
• 2.2.2. Triệu chứng bệnh và thiệt hại về kinh tế
• 2.2.3. Nguồn bệnh và điều kiện phát sinh bệnh
• 2.2.4. Các dạng bệnh loét do vi khuẩn trên cây chanh
• 2.2.5. Biện pháp phòng trừ
• 2.3. Tổng quan về vi khuẩn Xanthomonas axonopodis gây bệnh loét trên cây chanh
• 2.3.1. Vị trí phân loại
• 2.3.2. Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa
• 2.3.3. Đặc điểm di truyền của vi khuẩn Xanthomonas axonopodis
• 2.3.4. Vai trò vùng rDNA-ITS
• 2.3.5. Giới thiệu về các gene gây bệnh
• 2.3.6. Một số kết quả nghiên cứu trên thế giới và trong nước về vi khuẩn Xanthomonas axonopodis pv. citri và bệnh loét do vi khuẩn Xanthomonas axonopodis pv. citri trên cây có múi
• 2.4. Tổng quan về cây giao (Euphorbia tirucalli L.)
• 2.4.1. Phân loại thực vật
• 2.4.2. Đặc điểm thực vật
• 2.4.3. Nguồn gốc và phân bố
• 2.4.4. Thành phần hóa học của cây giao (Euphorbia tirucalli L.)
• 2.4.5. Khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh trên cây trồng của dịch chiết cây giao (Euphorbia tirucalli L.)
• 2.5. Tổng quan về hợp chất thứ cấp phenolic
• 2.5.1. Tính chất kháng khuẩn của các hợp chất phenolic
• 3. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 3.2. Nội dung nghiên cứu
• 3.3. Vật liệu nghiên cứu
• 3.4. Phương pháp nghiên cứu
• 3.4.1. Phân lập và xác định loài vi khuẩn Xanthomonas sp. gây bệnh loét trên cây chanh theo hình thái, đặc điểm sinh hóa, trình tự vùng 16S rDNA, hrpW và pthA
• 3.4.2. Xác định loài vi khuẩn Xanthomonas sp. gây bệnh theo hình thái và đặc tính sinh hóa
• 3.4.3. Xác định loài vi khuẩn Xanthomonas sp. dựa vào trình tự vùng 16S rDNA, hrpW và pthA
• 3.4.4. Đánh giá hoạt tính ức chế vi khuẩn Xanthomonas sp. của cao chiết phân đoạn từ cây giao trong điều kiện in vitro
• 3.4.5. Xác định độ ẩm của mẫu bột cây giao
• 3.4.6. Xác định hợp chất trong cao phân đoạn có hoạt tính ức chế vi khuẩn Xanthomonas axonopodis pv.
• 3.4.7. Xác định hàm lượng các hợp chất có trong cao chiết phân đoạn có hoạt tính ức chế vi khuẩn X. axonopodis cao nhất
• 3.4.8. Đánh giá hiệu quả đối với bệnh loét do vi khuẩn X. axonopodis gây ra của cao chiết phân đoạn từ cây giao trong nhà lưới và ngoài đồng
• 3.4.9. Xác định liều lượng ức chế vi khuẩn Xanthomonas axonopodis trong điều kiện nhà lưới của cao chiết phân đoạn từ cây giao ở các nồng độ khác nhau
• 3.4.10. Đánh giá hiệu quả phòng trừ bệnh bệnh loét trên cây chanh của cao chiết phân đoạn từ cây giao ngoài đồng
• 3.4.11. Phương pháp xử lý số liệu
• 4. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Xác định loài vi khuẩn Xanthomonas axonopodis pv. citri gây bệnh loét trên cây chanh theo hình thái, đặc điểm sinh hóa, trình tự vùng 16S rDNA, hrpW và pthA
• 4.2. Xác định loài vi khuẩn Xanthomonas axonopodis pv. citri gây bệnh theo hình thái và đặc điểm sinh hóa
• 4.3. Kết quả khảo sát khả năng gây bệnh của các MPL X. citri theo quy tắc Koch’s
• 4.4. Xác định loài Xanthomonas axonopodis pv. citri dựa vào trình tự vùng gene 16S rDNA, hrpW và pthA
• 4.5. Xác định loài Xanthomonas sp. dựa vào trình tự vùng gene 16S rDNA
• 4.6. Xác định loài vi khuẩn X. citri dựa vào vùng gene hrpW
• 4.7. Xác định loài vi khuẩn X. citri dựa vào vùng gene pthA
• 4.8. Đánh giá hoạt tính ức chế vi khuẩn X. citri của cao chiết phân đoạn từ cây giao trong điều kiện phòng thí nghiệm
• 4.9. Kết quả tạo cao chiết toàn phần và các cao phân đoạn từ cây giao (Euphorbia tirucalli L.)
• 4.10. Đánh giá hoạt tính ức chế vi khuẩn X. citri của các cao chiết phân đoạn
• 4.11. Kết quả định tính các nhóm hoạt chất có trong các cao chiết phân đoạn từ cây giao
• 4.12. Hàm lượng phenolic tổng và flavonoid tổng của cao chiết phân đoạn từ cây giao (Euphorbia tirucalli L.)
• 4.13. Kết quả phân lập hợp chất
• 4.13.1. Hợp chất scopoletin (hợp chất 1)
• 4.13.2. Hợp chất gallic acid (hợp chất 2)
• 4.13.3. Hợp chất piperic acid (hợp chất 3)
• 4.13.4. Hợp chất 3,3’,4-tri-O-methylellagic acid (Hợp chất 4)
• 4.14. Hàm lượng các hợp chất có trong cao chiết phân đoạn có hoạt tính ức chế vi khuẩn X. citri cao nhất
• 4.15. Đánh giá hiệu quả đối với bệnh loét do vi khuẩn X. citri gây ra của cao chiết phân đoạn từ cây giao trong nhà lưới và ngoài đồng
• 4.16. Đánh giá hiệu quả đối với bệnh loét do vi khuẩn X. citri của cao chiết EA từ cây giao ở các nồng độ khác nhau trong điều kiện nhà lưới
• 4.17. Hiệu quả phòng trừ bệnh loét do vi khuẩn X. citri gây ra trên cây chanh của cao chiết ethyl acetate từ cây giao ở các nồng độ khác nhau ngoài đồng
• 4.18. Hiệu quả phòng trừ bệnh loét trên lá chanh của cao chiết ethyl acetate ở các nồng độ khác nhau
• 4.19. Hiệu lực phòng trừ bệnh loét trên quả chanh của cao chiết EA ở các nồng độ khác nhau
• 5. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN ĐÃ CÔNG BỐ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Xác định tác nhân gây bệnh loét trên cây chanh và đánh giá hoạt tính ức chế của dịch chiết cây giao

Luận án tập trung vào việc xác định loài vi khuẩn gây bệnh loét trên cây chanh không hạt (Citrus latifolia) và chanh giấy (Citrus aurantiifolia) tại Long An. Qua phân lập và kiểm tra 75 mẫu bệnh, kết quả cho thấy tất cả đều mang đặc điểm hình thái và sinh hóa của Xanthomonas axonopodis pv. Phân tích trình tự gen 16S rDNA, hrpW và pthA của các mẫu phân lập này cũng khẳng định là X. citri, tác nhân gây bệnh loét. "Trình tự vùng gene 16S rDNA của 9 mẫu phân lập Xanthomonas axonopodis trong nghiên cứu có độ tương đồng cao từ 94 ÷ 99%; vùng gene hrpW và pthA tương đồng 100% với loài vi khuẩn X. citri trên cơ sở dữ liệu Genebank." Nghiên cứu cũng đánh giá hoạt tính ức chế của dịch chiết cây giao (Euphorbia tirucalli) đối với vi khuẩn X. citri. Cao phân đoạn ethyl acetate (EA) thể hiện hoạt tính mạnh nhất. "Ở nồng độ 0,75%, khả năng ức chế vi khuẩn X. citri của cao chiết EA rất cao với đường kính vòng vô khuẩn lớn 17,67mm." Điều này cho thấy tiềm năng của cây giao trong việc kiểm soát bệnh loét chanh.

II. Phân tích thành phần hóa học của dịch chiết cây giao và hiệu quả ức chế trong điều kiện nhà lưới

Luận án đã phân tích thành phần hóa học của cao chiết EA từ cây giao. Kết quả cho thấy sự hiện diện của các nhóm hợp chất alkaloid, flavonoid, tannin, và terpenoid, với hàm lượng phenolic và flavonoid cao nhất. "Hàm lượng phenolic và flavonoid thu được trong cao chiết EA là cao nhất tương ứng 106,32 mgGAE/g và 450,83 μgQE/g cao chiết." Nghiên cứu cũng phân lập được các hợp chất scopoletin, gallic acid, và piperic acid từ cao EA, trong đó piperic acid được xác định là hợp chất mới từ cây giao ở Bình Thuận. Các hợp chất này đều có hoạt tính ức chế X. citri. Thí nghiệm trong nhà lưới cho thấy dịch chiết EA nồng độ 1% ức chế sự lây lan của vi khuẩn, giảm kích thước vết bệnh và đạt hiệu quả giảm bệnh lên đến 67,84% sau 3 lần xử lý. "Trong điều kiện nhà lưới, nghiệm thức xử lý dịch chiết cao EA nồng độ 1,0% ức chế tốt sự lan truyền của vi khuẩn X. axonopodis trong tế bào thực vật, với kích thước vết bệnh nhỏ nhất 0,91 mm..."

III. Đánh giá hiệu quả phòng trừ bệnh loét trên cây chanh của dịch chiết cây giao ngoài đồng

Nghiên cứu tiếp tục đánh giá hiệu quả của dịch chiết EA trong điều kiện thực tế ngoài đồng ruộng. Ở nồng độ 1,25%, dịch chiết EA cho thấy hiệu quả giảm bệnh đáng kể trên cả lá và quả chanh, với hiệu quả kéo dài đến 21 ngày sau xử lý. "Ngoài đồng, sử dụng dịch chiết EA ở nồng độ 1,25% để trừ bệnh loét trên cây chanh cho hiệu quả giảm bệnh trên lá là 63,75%, trên quả là 61,29% và hiệu quả kéo dài đến 21 ngày sau xử lý." Kết quả này khẳng định tiềm năng ứng dụng của dịch chiết cây giao như một giải pháp sinh học thay thế cho thuốc hóa học trong việc kiểm soát bệnh loét chanh, góp phần vào sản xuất chanh bền vững và an toàn.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Bệnh loét trên cây có múi, đặc biệt là trên cây chanh, do vi khuẩn Xanthomonas axonopodis pv. citri gây ra, là một trong những dịch hại truyền nhiễm nguy hiểm, gây tổn thất nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng thương phẩm của nông sản. Tại tỉnh Long An – vùng chuyên canh chanh trọng điểm thuộc khu vực Đồng bằng sông Cửu Long, tỷ lệ hại của bệnh loét trong mùa khô dao động từ 10 ÷ 15% và bùng phát mạnh trong mùa mưa khi ẩm độ tăng cao, gây khó khăn cho công tác kiểm soát đồng ruộng. Tập quán canh tác hiện nay phụ thuộc nhiều vào các loại thuốc bảo vệ thực vật hóa học phối trộn liều cao, phun nhiều lần trong một vụ, gây ra nhiều hệ lụy: làm tăng nguy cơ tồn dư hóa chất trên nông sản xuất khẩu, gia tăng chi phí đầu tư, phá vỡ cân bằng hệ sinh thái nông nghiệp và làm xuất hiện các chủng vi sinh vật kháng thuốc. Trong bối cảnh chuyển dịch sang nền nông nghiệp hữu cơ và an toàn sinh học, việc khai thác các hợp chất thứ cấp có hoạt tính kháng khuẩn từ thực vật để tạo chế phẩm sinh học là hướng tiếp cận cần thiết. Cây giao (Euphorbia tirucalli L.) là nguồn dược liệu tự nhiên chứa nhiều hợp chất chuyển hóa thứ cấp như alkaloid, phenolic, tannin, flavonoid và terpenoid, có khả năng ức chế nhiều chủng vi khuẩn Gram âm và Gram dương. Tuy nhiên, trước thời điểm luận án thực hiện, các nghiên cứu ứng dụng dịch chiết cây giao trong kiểm soát bệnh vi khuẩn trên cây trồng nông nghiệp tại Việt Nam còn rất hạn chế.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định cụ thể nhằm:

1. Xác định chính xác loài vi khuẩn Xanthomonas sp. gây bệnh loét trên cây chanh tại tỉnh Long An dựa trên các chỉ tiêu hình thái, sinh hóa và sinh học phân tử.
2. Khảo sát thành phần hóa học, định tính các nhóm hoạt chất và định lượng hàm lượng phenolic tổng, flavonoid tổng trong các cao chiết phân đoạn từ cây giao thu nhận tại các địa phương khác nhau.
3. Phân lập, xác định cấu trúc hóa học và định lượng các hợp chất đơn lẻ có hoạt tính ức chế vi khuẩn trong phân đoạn cao chiết có hoạt tính cao nhất.
4. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn in vitro, xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC), đồng thời thử nghiệm hiệu lực phòng trừ bệnh loét của cao chiết cây giao trong điều kiện nhà lưới và ngoài đồng ruộng thực tế.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Các mẫu vi khuẩn Xanthomonas axonopodis pv. citri gây bệnh loét thu thập từ lá, cành và quả của giống chanh không hạt (Citrus latifolia Tanaka) và chanh giấy (Citrus aurantiifolia Swingle); các dạng cao chiết phân đoạn và hợp chất tinh sạch chiết xuất từ cây giao (Euphorbia tirucalli L.).
• Phạm vi không gian: Thu thập mẫu bệnh phẩm loét tại 3 huyện chuyên canh chanh của tỉnh Long An (gồm Bến Lức, Thạnh Hóa và Đức Huệ); thu thập mẫu nguyên liệu cây giao tại 3 khu vực địa lý: TP. Phan Thiết (tỉnh Bình Thuận), huyện Cư Jút (tỉnh Đắk Nông) và huyện Bình Chánh (TP. Hồ Chí Minh).
• Phạm vi thời gian: Đề tài được thực hiện liên tục trong khoảng thời gian từ tháng 7/2017 đến tháng 6/2021.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan tài liệu của luận án đã hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế theo 4 trục nội dung chính:

Thứ nhất, về bệnh loét do vi khuẩn và tác nhân gây bệnh: Bệnh loét trên cây có múi được ghi nhận sớm nhất trên các mẫu thực vật cổ từ thế kỷ XIX (Fawcett và Jenkins, 1933). Bệnh xuất hiện tại Florida - Hoa Kỳ năm 1912 (Stall và Civerolo, 1991), sau đó lan rộng ra Nam Phi (Doidge, 1916), Nam Mỹ (Rossetti, 1977), Úc (Garnsey và ctv, 1979), Iran (Alizadeh và Rahimian, 1990) và Mali (Traore và ctv, 2008). Về phân loại bệnh học, Graham và ctv (2014) cùng Stall và Seymour (1983) đã phân định các dạng bệnh loét: dạng A do Xanthomonas citri (phổ biến toàn cầu và gây hại nặng nhất), dạng B và C do Xanthomonas aurantifolii (chủ yếu ở Nam Mỹ). Tại Việt Nam, Whittle (1992) ghi nhận bệnh loét trên cây có múi, tiếp đó Bui và ctv (2009) đã phân tích 577 dòng vi khuẩn thu thập từ 14 tỉnh thành phía Bắc và phía Nam, xác định các chủng gây bệnh trên chanh Mexico tại Việt Nam đều thuộc kiểu gen A (X. citri dạng A).

Thứ hai, về đặc điểm sinh học và chẩn đoán phân tử vi khuẩn Xanthomonas: Nghiên cứu sinh hóa của Verniere và ctv (1991, 1998) chỉ ra các đặc trưng phân biệt nhóm vi khuẩn loét dạng A qua khả năng sử dụng maltose, tinh bột, glycogen, thủy giải casein, gelatin và dung nạp NaCl 3%. Về di truyền học, các nghiên cứu của Brunings và Gabriel (2003), Yang và Gabriel (1995), Duan và ctv (1999) đã làm rõ vai trò của họ gen pthA (quy định độc lực gây tăng sinh tế bào và hoại tử mô trên cây có múi). Các công trình của Alegria và ctv (2004), Dunger và ctv (2005), Park và ctv (2006) làm sáng tỏ cấu trúc cụm gen hrp (hệ thống tiết loại III - T3SS) và ứng dụng gen hrpW trong thiết kế mồi PCR chuyên biệt. Cubero và Graham (2002), Manyam và Nargund (2020) đã phát triển các quy trình PCR sử dụng các cặp mồi khuếch đại 16S rDNA, pthA, hrpW và estA nhằm định danh nhanh và chính xác các chủng vi khuẩn gây bệnh loét.

Thứ ba, về biện pháp kiểm soát và tiềm năng của dịch chiết thảo mộc: Bên cạnh việc dùng kháng sinh, hóa chất bảo vệ thực vật (Beniwal và Chaubey, 1976; Maher và ctv, 2005; Sahi và ctv, 2007) hay vi sinh vật đối kháng như Pseudomonas, Bacillus, Trichoderma (Khodakaramian và Swings, 2003; Sarkar và ctv, 2007; Giri và ctv, 2008; Huang và ctv, 2012; de Oliveira và ctv, 2016), nhiều nghiên cứu đã chứng minh hiệu quả kháng X. citri từ dịch chiết thảo mộc: tinh dầu chanh (Mirzaei-Najafgholi và ctv, 2017), dịch chiết xoan Azadirachta indica (Ijato, 2016), ổi, cà độc dược, cỏ hôi (Bora và ctv, 2001), me Tamarindus indica (Leksomboon và ctv, 2001), tỏi Allium sativum (Iqram và ctv, 2003; Sarkar và ctv, 2018), chiêu liêu Chebulic myrobalan (Vudhivanich, 2003) và một số cây dược liệu khác (Prakash và ctv, 2012; Raju và ctv, 2013; Negi và Kuma, 2015).

Thứ tư, về cây giao (Euphorbia tirucalli L.): Các đặc tính thực vật học, sinh thái thích nghi khô hạn và thành phần hóa học đã được Van Damme (1990, 2001), Schmelzer và Gurib-Fakim (2008) ghi nhận. Hoạt tính kháng các loài vi khuẩn thực vật như Xanthomonas campestris, Erwinia carotovora pv. carotovora, Pseudomonas solanacearum của cây giao đã được Liror và ctv (1998) công bố.

Khoảng trống nghiên cứu được luận án lựa chọn giải quyết: Luận án tập trung đồng bộ từ khâu xác định căn nguyên vi sinh vật gây bệnh loét tại vùng chuyên canh chanh tỉnh Long An bằng công cụ phân tử đa gen (16S rDNA, hrpW, pthA); đến khâu sàng lọc hóa thực vật, định danh các hoạt chất tinh sạch có trong cây giao tại Việt Nam; và thử nghiệm hoạt tính ức chế Xanthomonas axonopodis pv. citri xuyên suốt từ điều kiện in vitro, mô hình bán tự nhiên trong nhà lưới đến khảo nghiệm thực địa ngoài vườn sản xuất.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án kết hợp giữa lý thuyết bệnh học thực vật thực nghiệm, di truyền học phân tử vi sinh vật và hóa học các hợp chất thiên nhiên.

Phương pháp phân lập và định danh vi khuẩn

• Thu thập và phân lập: Thu thập 75 mẫu bệnh phẩm loét điển hình trên lá, cành và quả từ các vườn chanh tại Bến Lức, Thạnh Hóa và Đức Huệ (Long An). Mẫu được khử trùng bề mặt, nghiền mô bệnh và cấy gạt trên môi trường thạch dinh dưỡng Nutrient Agar (NA) và Yeast extract Dextrose Calcium carbonate (YDC) agar, ủ ở nhiệt độ 28 ÷ 30°C.
• Xác định đặc tính sinh hóa: Nhuộm Gram; phản ứng catalase, oxidase, urease; thử nghiệm indol; khả năng thủy phân tinh bột, casein, gelatin, aesculin, tween 20 và 80; khả năng sinh H2S; khả năng dung nạp muối NaCl ở các nồng độ 1%, 2% và 3%; khả năng đồng hóa và sinh acid từ các nguồn đường (glucose, arabinose, sucrose, maltose, galactose, trehalose, mannose...).
• Kiểm chứng khả năng gây bệnh theo quy tắc Koch (Koch's postulates): Tiêm/chủng huyền phù vi khuẩn (mật độ 10⁶ ÷ 10⁸ CFU/mL) lên các cơ quan lá, cành và quả chanh khỏe mạnh đã tạo vết thương cơ giới; theo dõi triệu chứng lâm sàng ở các mốc thời gian sau chủng (NSC); quan sát cấu trúc vi thể mô bệnh bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM) và tái phân lập để đối chiếu chủng ban đầu.
• Giám định sinh học phân tử: Tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn. Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại 3 vùng gen đích:
  • Vùng 16S rDNA sử dụng cặp mồi phổ biến 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') và 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3').
  • Vùng gen hrpW sử dụng cặp mồi chuyên biệt XacF (5'-CGTCGTCGTTCTTGTCGTCG-3') và XacR (5'-TCGTCGTCCTCTTCGTCGTC-3').
  • Vùng gen độc lực pthA sử dụng cặp mồi J-pth1 (5'-CACTCACTCCACCCCCT-3') và J-pth2 (5'-CCTGTTCGGCAAGTCCTC-3'). Sản phẩm khuếch đại PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose, gửi giải trình tự nucleotide. Trình tự được xử lý, căn chỉnh (align) và so sánh với cơ sở dữ liệu NCBI GenBank; xây dựng cây phát sinh loài theo phương pháp Maximum Composite Likelihood với giá trị lặp lại bootstrap 1.000 lần.

Phương pháp hóa thực vật và phân lập hoạt chất

• Quy trình chiết xuất: Bột cành cây giao khô được ngâm chiết hồi lưu với ethanol (EtOH) để thu cao chiết toàn phần. Tiến hành chiết phân bố lỏng-lỏng phân đoạn với các dung môi có độ phân cực tăng dần gồm n-hexan (He), ethyl acetate (EA) và n-butanol (Bu), sau đó cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất giảm.
• Định tính và định lượng nhóm hoạt chất: Định tính sự có mặt của alkaloid, flavonoid, tannin, terpenoid và saponin bằng các phản ứng màu chỉ thị đặc trưng. Định lượng hàm lượng phenolic tổng số bằng phương pháp so màu Folin-Ciocalteu (tính theo đương lượng gallic acid: mg GAE/g cao chiết) và hàm lượng flavonoid tổng số bằng phương pháp tạo phức với nhôm clorid AlCl3 (tính theo đương lượng quercetin: μg QE/g cao chiết).
• Phân lập và xác định cấu trúc đơn chất: Sử dụng kỹ thuật sắc ký cột cổ điển (Column Chromatography - CC) với pha tĩnh silica gel, rửa giải bằng hệ dung môi gradient để phân tách các phân đoạn. Kiểm tra độ tinh sạch qua sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Cấu trúc phân tử của các hợp chất tinh sạch được xác định thông qua phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) một chiều và hai chiều (¹H-NMR, ¹³C-NMR).

Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

• Khảo nghiệm in vitro: Đánh giá khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch (đường kính lỗ thạch chuẩn), đo đường kính vòng vô khuẩn (mm) sau 24 ÷ 48 giờ ủ ở 30°C. Đối chứng dương sử dụng kháng sinh Streptomycin (nồng độ 0,01 mg/mL). Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC, đơn vị mg/mL) của các phân đoạn cao chiết.
• Khảo nghiệm trong điều kiện nhà lưới: Thử nghiệm trên cây chanh trồng chậu, lây nhiễm nhân tạo vi khuẩn gây bệnh; xử lý phun cao chiết EA ở các dãy nồng độ khác nhau (0,5%; 0,75%; 1,0%); theo dõi sự phát triển đường kính vết bệnh (mm) và tính toán hiệu quả giảm bệnh (%) sau các lần xử lý so với đối chứng không xử lý và đối chứng dùng thuốc hóa học.
• Khảo nghiệm ngoài đồng ruộng: Bố trí thí nghiệm theo khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh tại vườn chanh chuyên canh ở Long An; phun dịch chiết cao EA ở các nồng độ khác nhau (lên đến 1,25%); đánh giá tỷ lệ bệnh, chỉ số bệnh (%) trên lá và quả non, theo dõi hiệu lực kéo dài tại các thời điểm 7, 14 và 21 ngày sau xử lý.

Hạng mục nghiên cứu	Phương pháp / Kỹ thuật chính	Chỉ tiêu theo dõi / Đo lường
Định danh vi khuẩn	Hình thái, sinh hóa, giải trình tự gen (16S rDNA, hrpW, pthA)	Đặc điểm khuẩn lạc, phản ứng sinh hóa, độ tương đồng nucleotide (%)
Khảo sát hóa thực vật	Chiết phân đoạn lỏng-lỏng, Folin-Ciocalteu, AlCl3	Hiệu suất chiết, mg GAE/g cao, μg QE/g cao
Tinh sạch đơn chất	Sắc ký cột (CC), HPLC, Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)	Cấu trúc hóa học, hàm lượng đơn chất (mg/g cao)
Kháng khuẩn in vitro	Khuếch tán giếng thạch, vi pha loãng	Đường kính vòng vô khuẩn (mm), giá trị MIC (mg/mL)
Hiệu lực in vivo	Phun xử lý trên cây chanh trong nhà lưới và ngoài đồng	Kích thước vết bệnh (mm), tỷ lệ bệnh, hiệu quả giảm bệnh (%)

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương 1 tổng hợp có hệ thống cơ sở lý luận và thực tiễn liên quan đến đối tượng nghiên cứu:

• Trình bày đặc điểm thực vật học, phân loại học và giá trị kinh tế của cây chanh giấy (C. aurantiifolia) và chanh không hạt (C. latifolia), cùng thực trạng sản xuất chanh tại Long An giai đoạn 2014 ÷ 2020 (diện tích đạt 9.438 ha năm 2018).
• Tổng thuật bệnh loét trên cây có múi: lịch sử phân bố toàn cầu, triệu chứng tổn thương trên lá, cành, quả; các điều kiện sinh thái thuận lợi cho vi khuẩn xâm nhiễm (nhiệt độ 25 ÷ 35°C, ẩm độ cao, lây lan theo gió, mưa và qua vết thương sâu vẽ bùa).
• Hệ thống hóa các đặc điểm phân loại, hình thái (trực khuẩn Gram âm, đơn mao), sinh lý, các vùng gen chỉ thị phân tử (16S rDNA, cụm gen độc lực pthA, cụm gen gây bệnh hrpW) của Xanthomonas axonopodis pv. citri.
• Tổng hợp các phương pháp phòng trừ bệnh loét: canh tác, hóa học, giống kháng, vi sinh vật đối kháng và các nghiên cứu sử dụng dịch chiết thảo mộc tự nhiên.
• Tổng quan về cây giao (Euphorbia tirucalli L.): vị trí phân loại họ Euphorbiaceae, phân bố sinh thái, thành phần hóa thực vật chứa hoạt tính kháng khuẩn và các hợp chất chuyển hóa thứ cấp nhóm phenolic.

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm được triển khai từ tháng 7/2017 đến tháng 6/2021:

• Cung cấp danh mục mẫu bệnh phẩm thu thập từ 3 huyện (Bến Lức, Thạnh Hóa, Đức Huệ - tỉnh Long An) trên các bộ phận lá, cành, quả của 2 giống chanh (ký hiệu: BLKC, BLKL, BLKQ, THHC, THHL, THHQ, THKC, THKL, THKQ, DHKC, DHKL, DHKQ).
• Quy trình lấy mẫu cành cây giao tại Phan Thiết (Bình Thuận), Cư Jút (Đắk Nông) và Bình Chánh (TP. Hồ Chí Minh), kỹ thuật sơ chế và đo độ ẩm nguyên liệu bột.
• Trình bày chi tiết các bước định danh vi khuẩn: thử nghiệm sinh hóa, quy trình kiểm chứng Koch's, thông số phản ứng PCR cho 3 cặp mồi (27F/1492R, XacF/XacR, J-pth1/J-pth2), chương trình nhiệt chu kỳ luân nhiệt và phân tích dữ liệu trên GenBank.
• Quy trình chiết phân đoạn cao giao với hexan, ethyl acetate, butanol; phương pháp định tính các nhóm hoạt chất; công thức định lượng phenolic và flavonoid tổng số.
• Thiết lập chương trình sắc ký cột, gradient pha động HPLC, phương pháp đo phổ NMR để giải mã cấu trúc 4 hợp chất đơn lẻ.
• Phương pháp bố trí nghiệm thức đánh giá hoạt tính kháng khuẩn in vitro, thử nghiệm nhà lưới và thử nghiệm ngoài đồng ruộng, cùng các công thức tính toán chỉ số bệnh, hiệu quả giảm bệnh và phương pháp xử lý số liệu thống kê.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày các số liệu thực nghiệm thu được:

1. Kết quả định danh vi khuẩn gây bệnh loét:

• Toàn bộ 75 mẫu phân lập (MPL) thu từ Long An đều thể hiện đặc điểm hình thái và sinh hóa điển hình của Xanthomonas axonopodis pv. citri: trực khuẩn Gram âm, khuẩn lạc vàng sáp, nhầy bóng trên môi trường NA và YDC; oxidase âm tính, catalase dương tính, urease âm tính; thủy phân tinh bột, gelatin, casein, aesculin dương tính; dung nạp NaCl ở mức 1%, 2% và 3%.
• Thử nghiệm Koch khẳng định 100% các mẫu phân lập có khả năng tái gây bệnh loét với triệu chứng sùi nứt trên mô ký chủ; quan sát SEM ghi nhận sự xâm nhiễm và phá hủy tế bào mô lá, quả của vi khuẩn.
• Phân tích sinh học phân tử: Trình tự đoạn gen 16S rDNA của 9 mẫu phân lập đại diện có độ tương đồng từ 94 ÷ 99% với các chủng X. citri trên GenBank. Trình tự vùng gen hrpW và pthA của các chủng phân lập tương đồng 100% với trình tự loài Xanthomonas citri được công bố trên thế giới (hệ số bootstrap 1.000 lần). Dữ liệu trình tự 3 vùng gen đã được đăng ký thành công trên cơ sở dữ liệu NCBI GenBank.

2. Kết quả khảo sát hóa thực vật cao chiết cây giao:

• Hiệu suất chiết và độ ẩm của cao toàn phần và các cao phân đoạn từ mẫu cây giao ở 3 vùng sinh thái được xác lập chi tiết.
• Phân đoạn cao ethyl acetate (EA) thể hiện sự tích tụ phong phú nhất của các nhóm hoạt chất: alkaloid, flavonoid, tannin và terpenoid; không phát hiện saponin.
• Hàm lượng phenolic tổng số và flavonoid tổng số trong cao chiết EA đạt giá trị cao nhất trong các phân đoạn, lần lượt là 106,32 mg GAE/g cao chiết và 450,83 μg QE/g cao chiết.

3. Kết quả phân lập và xác định cấu trúc đơn chất từ cao EA:

• Từ phân đoạn cao EA, luận án đã cô lập và xác định cấu trúc hóa học của 4 hợp chất thông qua phân tích phổ NMR:
  1. Hợp chất 1: Scopoletin (hàm lượng 21,81 mg/g cao chiết).
  2. Hợp chất 2: Gallic acid (hàm lượng 14,86 mg/g cao chiết).
  3. Hợp chất 3: Piperic acid (hàm lượng 13,52 mg/g cao chiết).
  4. Hợp chất 4: 3,3',4-tri-O-methylellagic acid.
• Trong đó, piperic acid là hợp chất lần đầu tiên được phát hiện và thu nhận từ dịch chiết cây giao thu thập tại tỉnh Bình Thuận. Cả 3 hợp chất scopoletin, gallic acid và piperic acid đều thể hiện hoạt tính ức chế đối với vi khuẩn X. citri.

4. Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn:

• In vitro: Ở nồng độ 0,75% (tương đương 7,5 mg/mL), cao chiết EA thể hiện hoạt tính ức chế vi khuẩn X. citri mạnh nhất với đường kính vòng vô khuẩn đạt 17,67 mm, vượt trội so với các phân đoạn hexan và butanol.
• Trong nhà lưới: Xử lý phun cao chiết EA nồng độ 1,0% ức chế sự lan rộng của vết loét trên mô tế bào chanh; kích thước vết bệnh trung bình chỉ đạt 0,91 mm (so với đối chứng không xử lý là 1,90 mm), mang lại hiệu quả giảm bệnh đạt 67,84% sau 3 lần phun xử lý.
• Ngoài đồng ruộng: Ứng dụng dịch chiết cao EA ở nồng độ 1,25% mang lại hiệu quả giảm bệnh loét trên lá chanh đạt 63,75% và trên quả chanh đạt 61,29%, hiệu lực bảo vệ kéo dài ổn định đến 21 ngày sau xử lý.

Chỉ tiêu nghiên cứu	Giá trị / Kết quả định lượng	Ghi chú điều kiện / Mẫu
Số lượng mẫu phân lập định danh	75 mẫu (100% là X. axonopodis pv. citri)	Thu tại Bến Lức, Thạnh Hóa, Đức Huệ (Long An)
Độ tương đồng gen 16S rDNA	94 ÷ 99%	9 mẫu phân lập đại diện so với GenBank
Độ tương đồng gen hrpW và pthA	100%	So với loài X. citri trên GenBank (bootstrap 1.000)
Hàm lượng phenolic tổng (cao EA)	106,32 mg GAE/g cao	Cao nhất trong các cao phân đoạn
Hàm lượng flavonoid tổng (cao EA)	450,83 μg QE/g cao	Cao nhất trong các cao phân đoạn
Vòng vô khuẩn in vitro (cao EA 0,75%)	17,67 mm	Phương pháp khuếch tán giếng thạch
Hàm lượng Scopoletin	21,81 mg/g cao chiết EA	Đã xác định cấu trúc bằng phổ NMR
Hàm lượng Gallic acid	14,86 mg/g cao chiết EA	Đã xác định cấu trúc bằng phổ NMR
Hàm lượng Piperic acid	13,52 mg/g cao chiết EA	Hợp chất mới từ cây giao Bình Thuận
Kích thước vết bệnh trong nhà lưới (EA 1,0%)	0,91 mm (đối chứng: 1,90 mm)	Hiệu quả giảm bệnh đạt 67,84% sau 3 lần xử lý
Hiệu quả giảm bệnh ngoài đồng (EA 1,25%)	Lá: 63,75% - Quả: 61,29%	Hiệu lực duy trì đến 21 ngày sau xử lý

Chương 4: Kết luận và đề nghị

Chương 4 đúc kết các kết luận khoa học bám sát mục tiêu đề ra và đưa ra các kiến nghị định hướng ứng dụng thực tiễn:

• Khẳng định tính chính xác của việc xác định tác nhân gây bệnh loét trên chanh tại Long An là vi khuẩn Xanthomonas axonopodis pv. citri thuộc kiểu gen A.
• Khẳng định phân đoạn ethyl acetate từ cây giao có tiềm năng kháng khuẩn cao nhờ chứa các nhóm hợp chất phenolic, flavonoid và các đơn chất có hoạt tính sinh học rõ rệt (scopoletin, gallic acid, piperic acid).
• Xác lập nồng độ ứng dụng hiệu quả của cao EA trong điều kiện nhà lưới (1,0%) và ngoài đồng ruộng (1,25%).
• Đề nghị tiếp tục nghiên cứu công nghệ chiết xuất quy mô lớn và hoàn thiện quy trình bào chế chế phẩm thảo mộc dạng nhũ dầu hoặc bột hòa tan từ cao giao để phục vụ sản xuất thương mại.

Kết quả và những đóng góp mới

Luận án đã đạt được các đóng góp mới cụ thể như sau:

1. Về mặt khoa học và lý luận:

• Định danh chính xác loài vi khuẩn Xanthomonas axonopodis pv. citri gây bệnh loét trên giống chanh không hạt và chanh giấy tại tỉnh Long An dựa trên việc kết hợp đặc điểm hình thái, đặc tính sinh hóa và giải trình tự đồng thời 3 vùng gen đích (16S rDNA, hrpW, pthA).
• Cung cấp dữ liệu di truyền học phân tử của 9 mẫu phân lập Xanthomonas axonopodis pv. citri phân lập tại Việt Nam được đăng ký chính thức trên cơ sở dữ liệu quốc tế NCBI GenBank.
• Cung cấp dữ liệu khoa học về thành phần hóa thực vật của cây giao (Euphorbia tirucalli L.) phân bố tại Việt Nam; định lượng hàm lượng phenolic tổng số và flavonoid tổng số trong các phân đoạn chiết xuất.
• Lần đầu tiên phân lập, giải mã cấu trúc phân tử và định lượng hợp chất piperic acid (bên cạnh scopoletin, gallic acid và 3,3',4-tri-O-methylellagic acid) từ cao chiết phân đoạn ethyl acetate cây giao tại tỉnh Bình Thuận, đồng thời chứng minh hoạt tính kháng vi khuẩn X. citri của các hợp chất này.

2. Về mặt thực tiễn và ứng dụng:

• Chứng minh tính hiệu quả của cao chiết phân đoạn ethyl acetate từ cây giao trong việc ức chế sự phát triển của vi khuẩn Xanthomonas axonopodis pv. citri ở cả quy mô phòng thí nghiệm (in vitro), mô hình nhà lưới (giảm 67,84% bệnh ở nồng độ 1,0%) và điều kiện ngoài đồng ruộng thực tế (giảm 63,75% bệnh trên lá và 61,29% bệnh trên quả ở nồng độ 1,25%).
• Cung cấp cơ sở khoa học và thông số kỹ thuật thực nghiệm phục vụ việc nghiên cứu phát triển chế phẩm sinh học có nguồn gốc thảo mộc nhằm thay thế dần thuốc hóa học trong quản lý dịch hại cây có múi, hỗ trợ định hướng phát triển nông nghiệp sạch và nông nghiệp hữu cơ bền vững.

3. Kiến nghị và giải pháp đề xuất:

• Đề xuất ứng dụng dịch chiết cao ethyl acetate cây giao ở nồng độ 1,25% vào quy trình quản lý tổng hợp bệnh loét trên các vườn chanh chuyên canh.
• Tiếp tục khảo sát các biện pháp nâng cao hiệu suất chiết xuất hoạt chất piperic acid và scopoletin từ nguồn nguyên liệu cây giao ở các vùng sinh thái khác nhau.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Dựa trên phạm vi nghiên cứu được trình bày trong luận án, một số giới hạn và định hướng phát triển bao gồm:

• Phạm vi mẫu nghiên cứu: Các mẫu vi khuẩn phân lập phục vụ định danh và đánh giá độc lực tập trung chủ yếu tại 3 huyện (Bến Lức, Thạnh Hóa, Đức Huệ) thuộc tỉnh Long An; nguồn nguyên liệu cây giao thu thập giới hạn tại 3 tỉnh thành (Bình Thuận, Đắk Nông, TP. Hồ Chí Minh).
• Dạng chế phẩm: Các thử nghiệm ngoài đồng ruộng sử dụng cao chiết phân đoạn ethyl acetate ở quy mô phòng thí nghiệm, chưa hoàn thiện thành dạng chế phẩm thương mại hoàn chỉnh (như dạng huyền phù, nhũ tương hoặc bột thấm nước có chất phụ gia bảo quản và chất bám dính sinh học).
• Hướng nghiên cứu tiếp: Mở rộng đánh giá phổ kháng khuẩn của dịch chiết cây giao trên các chủng vi khuẩn thực vật gây hại khác thuộc chi Xanthomonas, Ralstonia hoặc Erwinia; nghiên cứu công nghệ nano hóa hoặc phối chế tạo màng sinh học nhằm kéo dài hơn nữa thời gian tồn lưu của hoạt chất ngoài đồng ruộng; tối ưu hóa quy trình tinh chế hoạt chất piperic acid và khảo sát độc tính sinh thái chi tiết trên các vi sinh vật có ích trong đất.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên ngành hữu ích cho các nhóm đối tượng:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên chuyên ngành Công nghệ sinh học, Bảo vệ thực vật, Hóa hợp chất thiên nhiên và Nông học: Có thể tham khảo phương pháp luận kết hợp giữa giám định vi sinh vật bằng kỹ thuật phân tử đa gen (16S rDNA, hrpW, pthA) và quy trình phân lập, xác định cấu trúc đơn chất bằng sắc ký cột và phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR.
• Các nhà nghiên cứu phát triển sản phẩm sinh học nông nghiệp (R&D): Cung cấp các thông số kỹ thuật chính xác về dung môi chiết phân đoạn, nồng độ hoạt chất (scopoletin, gallic acid, piperic acid), ngưỡng ức chế in vitro và liều lượng xử lý ngoài đồng ruộng làm cơ sở xây dựng công thức chế phẩm thảo mộc trừ bệnh cây trồng.
• Cán bộ kỹ thuật nông nghiệp, khuyến nông và các nhà vườn chuyên canh cây có múi: Tham khảo quy trình quản lý bệnh loét sinh học, thời điểm phát sinh dịch hại trên lá và quả non, từ đó áp dụng các giải pháp giảm thiểu thuốc hóa học để đáp ứng các tiêu chuẩn an toàn thực phẩm VietGAP, GlobalGAP trong xuất khẩu chanh.

Câu hỏi thường gặp

1. Tác nhân gây bệnh loét trên cây chanh tại Long An được luận án định danh chính xác là loài vi khuẩn nào và dựa trên những chỉ thị phân tử nào? Tác nhân gây bệnh được xác định là loài Xanthomonas axonopodis pv. citri (thuộc kiểu gen loét dạng A). Kết quả này dựa trên việc giải trình tự và so sánh 3 vùng gen đích: vùng 16S rDNA (cặp mồi 27F/1492R, tương đồng 94 ÷ 99%), vùng gen hrpW (cặp mồi XacF/XacR, tương đồng 100%) và vùng gen độc lực pthA (cặp mồi J-pth1/J-pth2, tương đồng 100% với các chủng X. citri trên NCBI GenBank).

2. Phân đoạn cao chiết nào từ cây giao có hoạt tính kháng vi khuẩn mạnh nhất và hàm lượng hợp chất phenolic, flavonoid đạt bao nhiêu? Phân đoạn cao chiết ethyl acetate (EA) thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất. Hàm lượng phenolic tổng số trong cao EA đạt 106,32 mg GAE/g cao chiết và hàm lượng flavonoid tổng số đạt 450,83 μg QE/g cao chiết, cao nhất trong tất cả các phân đoạn cao khảo sát (cao toàn phần EtOH, cao hexan, cao butanol).

3. Những hợp chất đơn lẻ nào đã được phân lập từ cao ethyl acetate của cây giao và hợp chất nào là phát hiện mới? Luận án đã phân lập và xác định cấu trúc của 4 hợp chất: scopoletin (21,81 mg/g cao), gallic acid (14,86 mg/g cao), piperic acid (13,52 mg/g cao) và 3,3',4-tri-O-methylellagic acid. Trong đó, piperic acid là hợp chất mới lần đầu tiên được phát hiện và thu nhận từ dịch chiết cây giao thu thập tại tỉnh Bình Thuận.

4. Hiệu quả phòng trừ bệnh loét của cao chiết ethyl acetate cây giao trong điều kiện nhà lưới và ngoài đồng ruộng đạt mức độ nào? Trong điều kiện nhà lưới, xử lý cao EA nồng độ 1,0% giúp hạn chế kích thước vết loét còn 0,91 mm (so với đối chứng là 1,90 mm), đạt hiệu quả giảm bệnh 67,84% sau 3 lần phun. Ngoài đồng ruộng, sử dụng cao EA nồng độ 1,25% giúp giảm 63,75% bệnh trên lá và 61,29% bệnh trên quả, hiệu lực phòng trừ kéo dài đến 21 ngày sau xử lý.

5. Vi khuẩn Xanthomonas axonopodis pv. citri phân lập tại Long An có những đặc điểm sinh hóa đặc trưng nào? Các mẫu phân lập mang đặc điểm sinh hóa: phản ứng catalase dương tính, oxidase âm tính, urease âm tính; có khả năng thủy phân tinh bột, gelatin, casein và aesculin; phát triển được trong môi trường chứa muối NaCl ở các nồng độ 1%, 2% và 3%; có khả năng sinh acid từ các loại đường arabinose, glucose, sucrose, galactose, mannose và trehalose.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Nguyễn Thị Mỹ Lệ đã xác định căn nguyên gây bệnh loét trên cây chanh tại tỉnh Long An là loài vi khuẩn Xanthomonas axonopodis pv. citri thông qua hệ thống đặc tính sinh hóa và trình tự các vùng gen chỉ thị phân tử (16S rDNA, hrpW, pthA). Công trình đã phân lập và làm sáng tỏ cấu trúc của các hoạt chất kháng khuẩn từ phân đoạn cao ethyl acetate của cây giao (Euphorbia tirucalli L.), trong đó ghi nhận piperic acid là hợp chất mới được tìm thấy từ nguồn nguyên liệu tại Bình Thuận bên cạnh scopoletin và gallic acid. Kết quả khảo nghiệm thực tế đã chứng minh dịch chiết cao ethyl acetate đạt hiệu quả giảm bệnh loét trên 60% ở cả điều kiện nhà lưới và đồng ruộng, cung cấp cơ sở dữ liệu khoa học và thực tiễn tin cậy cho việc phát triển các chế phẩm sinh học thảo mộc phục vụ quản lý bệnh hại cây có múi bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về cây chanh 1. Nguồn gốc Chanh giấy (Citrus aurantifolia Swingle), chanh có nguồn gốc xuất phát từ vùng Indonesia và Malaysia. Những người Ả Rập đã mang cây chanh đến Bắc Phi và Tây Nam Á rồi đến Địa Trung Hải.

Đến giữa thế kỉ XIII, chanh giấy được trồng tại Ý và Pháp. Chanh không hạt (Citrus latifolia Tanaka) là giống chanh được lai từ chanh giấy (C. aurantifolia Swingle) với giống chanh yên (C. Theo một số báo cáo, chanh không hạt có bộ gen tam bội dù chỉ có 18 bộ nhiễm sắc thể.

Chanh không hạt đã được trồng ở khu vực Địa Trung Hải với tên gọi khác là “Sakhesli”. Sau đó được các thương nhân Bồ Đào Nha mang đến Brazil và từ đây mang đến Úc năm 1824. Cây chanh không hạt đến California từ Tahiti giữa các năm 1850 ÷ 1880 và được đưa đến Florida vào năm 1883 (Morton, 1987). Ở miền nam Việt Nam, chanh không hạt được trồng nhiều và phổ biến ở các tỉnh ĐBSCL đem lại hiệu quả kinh tế cao, không chỉ được tiêu thụ trong nước mà còn xuất khẩu (Hồ Cao Việt, 2016).

Vị trí phân loại Cây chanh thuộc họ Cửu lý hương (Rutaceae), bộ Sapindales, chi Citrus. Cây chanh được trồng hiện nay có hai loại: chanh giấy (chanh ta) và chanh không hạt (chanh lai). Chanh giấy có tên khoa học là C. aurantifolia Swingle, tên tiếng Anh gọi là Lime.

Chanh không hạt có tên khoa học là C. Vị trí phân loại của chanh giấy được xếp như sau: Giới (Kingdom): Plantae Bộ (Order): Sapindales Họ (Family): Rutaceae Chi (Genus): Citrus Loài (Species): Citrus aurantifolia. 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Vị trí phân loại của chanh không hạt được xếp như sau: Giới (Kingdom): Plantae Bộ (Order): Sapindales Họ (Family): Rutaceae Chi (Genus): Citrus Loài (Species): Citrus latifolia 1. Đặc điểm thực vật Chanh giấy được trồng ở nước ta từ rất lâu, là loài cây bụi, cao khoảng 5 m.

Thân cây hiếm khi mọc thẳng mà tỏa nhiều nhánh từ nơi gần gốc, thân có nhiều gai nhọn. Lá hình trứng, dài khoảng 2,5 ÷ 9,0 cm, nhìn giống lá cam. Hoa chanh có đường kính khoảng 2,5 cm, màu trắng ngả sang màu vàng, có gân màu tím nhạt. Cây đơm hoa kết trái quanh năm nhưng ra quả nhiều nhất từ tháng 5 đến tháng 9.

Quả chín sau từ 5 đến 6 tháng khi hoa nở. Quả có vỏ mỏng, nhiều nước, mùi thơm, vị chua và nhiều hạt (Hình 1. Cây chanh giấy (C. aurantifolia Swingle) và chanh không hạt (C.

latifolia Tanaka) (A: cây chanh giấy; B: cây chanh không hạt) (Nguồn: Trung tâm nghiên cứu và phát triển cây giống học viện nông nghiệp Việt Nam) 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Chanh không hạt là một giống chanh lai giữa chanh giấy và chanh yên, được trồng rất phổ biến trên thế giới. Ở Việt Nam, chanh không hạt được nhập từ bang California (Mỹ). Cây mọc cao đến 6 m, thân không có gai, tán lá tròn, trái chùm, trái to 6 ÷ 7 quả/kg, không hạt, vỏ mỏng, màu xanh sáng, nhiều nước, vị ít chua có mùi thơm và không có vị đắng như chanh giấy nên được nhiều người ưu chuộng và giá trị xuất khẩu cao. Cây cho trái quanh năm, có thể cho năng suất quả 150 ÷ 200 kg/năm/cây (Hình 1.

Tình hình sản xuất chanh ở Long An Ở phía Nam, cây chanh được trồng chủ yếu ở vùng ĐBSCL (chiếm gần 60% tổng diện tích chanh cả nước). Chanh có 2 vụ/năm, chanh trái vụ (mùa khô) giá chanh tăng từ 35 ÷ 45% so với chính vụ (mùa mưa). Sau khi trồng từ 18 ÷ 20 tháng, chanh bắt đầu thu hoạch, với năng suất vụ đầu đạt khoảng 15 ÷ 20 tấn/ha. Đến năm thứ hai, thứ ba năng suất tăng lên 25 ÷ 35 tấn/ha (có vườn đạt 40 tấn/ha), lãi trung bình từ 150 ÷ 300 triệu đồng/ha.

Trung bình mỗi cây chanh mang 1.000 trái/năm, khoảng 70 ÷ 100 kg/cây/năm. Chanh không hạt trái to, 6 ÷ 7 quả/kg. Chu kỳ sinh trưởng của chanh không hạt có thể trên 10 năm. Trong những năm gần đây, cây chanh là một trong những cây trồng chủ lực trong chương trình chuyển đổi cơ cấu cây trồng của tỉnh Long An.

Tỉnh có diện tích chanh lớn nhất trong khu vực ĐBSCL (30% diện tích chanh toàn vùng). Diện tích chanh của tỉnh liên tục gia tăng trong những năm gần đây (Hình 1. Năm 2018, với diện tích chanh toàn tỉnh là 9.438 ha đạt 94,4% kế hoạch (10.000 ha), bằng 105,8% so cùng kỳ năm 2017.374 ha chanh cho trái, tập trung ở các huyện: Bến Lức, Thủ Thừa, Thạnh Hóa, Đức Huệ và Đức Hòa. Theo sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Long An, tỉnh đề ra mục tiêu phát triển diện tích cây chanh lên 11.

Phát triển vùng sản xuất nông nghiệp chuyên canh theo hướng phát triển kinh tế tập thể, sản xuất theo hướng VietGAP và GlobalGAP nhằm giúp nông dân có đầu ra ổn định, đưa sản phẩm chanh đến với thị trường trong và ngoài nước. Trong đó, Bến Lức là một trong năm huyện trồng chanh lớn của tỉnh, chủ yếu là chanh không hạt, hiện có 5.470 ha đất trồng chanh, tăng 752 ha so với cuối năm 2017, tổng sản lượng đạt 77. Từ cuối năm 2011, huyện Bến Lức đã xây dựng thương hiệu độc quyền chanh Bến Lức. 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.

Biểu đồ diện tích chanh tỉnh Long An từ năm 2014 ÷ 2020. (Nguồn: Tổng hợp từ các nguồn UBND Tỉnh Long An, 2014, 2016, 2020) Để đạt kế hoạch đề ra, ngành nông nghiệp và phát triển nông thôn, Long An tăng cường hoạt động xúc tiến thương mại, xây dựng thương hiệu, quản lý chất lượng sản phẩm và nâng cao hiệu quả kinh tế tập thể; hình thành quy trình sản xuất nông nghiệp tốt, mô hình chuỗi giá trị, cung ứng sản phẩm chanh an toàn, góp phần xây dựng nền nông nghiệp phát triển toàn diện, bền vững. Sản phẩm chanh tươi Việt Nam đã có mặt trên thị trường của nhiều quốc gia vùng Châu Á, Trung Đông và đặc biệt là cộng đồng Châu Âu (EU) nâng kim ngạch xuất khẩu chanh cả nước trên 3 tỷ USD. Trong đó, Long An đóng góp khoảng 0,5 triệu USD (Hồ Cao Việt, 2016).

Tuy nhiên, trước những cơ hội lớn, ngành hàng chanh tỉnh Long An cũng như cả nước còn đang và sẽ đối mặt với rất nhiều thử thách về truy suất nguồn gốc, quản lý chất lượng sản phẩm theo các tiêu chuẩn của thị trường nhập khẩu, hàng rào kiểm dịch đối với một số loại dịch bệnh trên chanh,…. Do đó, việc đảm bảo chất lượng an toàn vệ sinh thực phẩm, kiểm soát tốt các loại dịch bệnh và đáp ứng nguyên tắc xuất khẩu là điều kiện để nông sản Việt Nam vươn ra thế giới. 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Tổng quan về bệnh loét do vi khuẩn trên cây chanh 1.

Lịch sử và phân bố Theo Fawcett và Jenkins (1933), những vết bệnh được phát hiện trên cây thuộc họ cam quýt lâu đời nhất (C. medica được thu thập từ Ấn Độ vào năm 1827 ÷ 1831 và C. aurantifolia từ Indonesia vào năm 1842 ÷ 1844) được giữ tại Herbaria của vườn thực vật hoàng gia (Royal Botanic Gardens) ở Kew, Anh. Do đó, bệnh loét có thể xuất hiện lần đầu tiên và có nguồn gốc ở các khu vực nhiệt đới châu Á, như Nam Trung Quốc, Indonesia và Ấn Độ, nguồn gốc của cây có múi.

Năm 1912, tại Florida, Hoa kỳ, bệnh loét được chú ý lần đầu tiên, bệnh gây hại nghiêm trọng và lan rộng khắp Florida trên cây giống nhập khẩu từ Nhật Bản. Năm 1933, bệnh được loại bỏ thông qua việc kiểm tra nghiêm ngặt, loại bỏ các cây bị bệnh một cách triệt để. Năm 1986, bệnh lại xuất hiện và bùng phát thành dịch ở Manatee, Florida, phía nam vịnh (Stall và Civerolo, 1991). Sau đó, mầm bệnh xuất hiện phổ biến khắp châu Á và sau đó đến Nam Phi (Doidge, 1916), Châu Đại Dương, Nam Mỹ (Rossetti, 1977) và Úc, (Garnsey và ctv, 1979).

Ở Iran bệnh loét do vi khuẩn được báo cáo đầu tiên trên chanh Mexico, vùng Kahnouj, tỉnh Kerman (Alizadeh và Rahimian, 1990). Ở Kouli-koro, Mali (Tây Phi), tỷ lệ bệnh loét trên chanh chiếm 50% (Traore và ctv, 2008). Bệnh loét do vi khuẩn đã có mặt ở hầu hết các quốc gia trồng cây có múi trên thế giới (Sharma và Sharma, 2009) (Hình 1. Bảng đồ phân bố của bệnh loét trên cây có múi do vi khuẩn X.

citri (Nguồn: Cabi. org) 8 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Ở Việt nam, bệnh loét trên cây có múi được báo cáo đầu tiên bởi Whittle (1992). Vi khuẩn gây bệnh là X. Theo báo cáo của Bui và ctv (2009), vi khuẩn gây bệnh loét trên cây chanh Mexico thu nhận từ 14 tỉnh ở cả hai miền Bắc và Nam là X.

citri dạng loét A. Hiện nay, bệnh loét là một trong những bệnh hại phổ biến và gây hại nghiêm trọng ở hầu hết các vùng trồng cây có múi trong nước, làm ảnh hưởng lớn tới nguồn hàng xuất khẩu. Bệnh phát sinh và phát triển mạnh ở điều kiện ẩm độ cao và nhiệt độ 26 ÷ 35°C, lây lan rất nhanh gây hại trên tất cả các giống chanh (Nguyễn Văn Nga và Cao Văn Chí, 2013). Triệu chứng bệnh và thiệt hại về kinh tế Theo Sharma và Sharma (2009), bệnh loét trên cây có múi gây ra bởi nhiều chủng Xanthomonas khác nhau về đặc điểm sinh học và cây ký chủ nhưng các triệu chứng và dấu hiệu bệnh là như nhau.

Ở lá non, ban đầu vết bệnh là những chấm tròn có đường kính trên dưới 1mm, màu trong vàng, sũng ướt, thường thấy ở mặt dưới của lá, sau đó vết bệnh mở rộng và phá vỡ biểu bì mặt dưới lá, màu trắng nhạt hoặc nâu nhạt. Xung quanh vết bệnh có quầng tròn dạng giọt dầu màu vàng hoặc xanh tối. Khi vết bệnh già rắn lại nổi gờ giống như ghẻ, loét, sần sùi, mặt dưới xù xì, mặt trên nứt nẻ màu xám tro, mọc nhô lên mặt lá (Hình 1. Vết bệnh có thể nhìn thấy khoảng 7 đến 10 ngày sau khi nhiễm bệnh ở mặt dưới của lá và sau đó nhìn thấy rõ ở mặt trên.

Lá bị nhiễm bệnh nặng, rụng sớm dẫn đến cành trơ trụi. Vết bệnh ở quả cũng tương tự như ở lá: vết bệnh xù xì màu nâu hơn, mép ngoài có gờ nổi lên, ở giữa vết bệnh mô chết rạn nứt trên vỏ quả. Bệnh nặng có thể làm cho quả biến dạng, ít nước, khô sớm, dễ rụng. Bệnh loét làm ảnh hưởng đến giá trị thẩm mỹ của quả, không đạt tiêu chuẩn chất lượng để xuất khẩu (Hình 1.

Vết bệnh trên cành và thân cây con cũng giống như ở trên lá nhưng sùi lên tương đối rõ ràng.