Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu
Xâm nhập mặn là một trong những hiện tượng thiên tai và biến đổi khí hậu nghiêm trọng tại khu vực Đồng bằng sông Cửu Long, đặc biệt tại các tỉnh hạ nguồn sông Mê Kông như Long An, Tiền Giang, Bến Tre, Kiên Giang và Cà Mau. Vào mùa khô (tháng 3 đến tháng 4), lượng nước ngọt từ thượng nguồn suy giảm kết hợp với triều cường và gió chướng đẩy nước biển lấn sâu vào nội đồng. Theo số liệu của Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn tỉnh Long An, năm 2020 tỉnh có 292.369,07 ha đất trồng cây hằng năm bị ảnh hưởng nặng nề bởi hạn mặn; trong đó lưu lượng nước ngọt thượng nguồn đổ về thấp hơn 5 – 20% so với năm 2016. Tháng 4/2020, độ mặn trên sông Vàm Cỏ Đông đạt 8,1 g/L và sông Vàm Cỏ Tây đạt 4,0 g/L, xâm nhập sâu vào các huyện Thủ Thừa, Bến Lức, Tân Trụ, Thạnh Hóa, Đức Hòa, Đức Huệ. Riêng huyện Thủ Thừa ghi nhận thiệt hại 1.700 ha lúa, 1.200 ha hoa màu và 9.100 ha thanh long, trong đó có khoảng 800 ha lúa gần như mất trắng.
Đất nhiễm mặn chứa nhiều muối hòa tan ($NaCl, Na_2SO_4, NaHCO_3, MgCl_2, MgSO_4$) làm tăng áp suất thẩm thấu của dung dịch đất cao hơn dịch bào rễ lúa, gây hiện tượng hạn sinh lý, cản trở hút nước và khoáng chất, làm giảm hàm lượng diệp lục, ức chế phân hóa chồi rễ và làm giảm năng suất. Việc lạm dụng phân bón hóa học nhằm bù đắp dinh dưỡng càng làm gia tăng độ chua và thoái hóa đất. Do đó, hướng tiếp cận sinh học sử dụng vi sinh vật vùng rễ kích thích sinh trưởng thực vật (Plant Growth Promoting Rhizobacteria - PGPR) có khả năng chịu mặn, cố định đạm tự do và sinh tổng hợp phytohormone Indole-3-acetic acid (IAA) là giải pháp bền vững nhằm hỗ trợ cây lúa sinh trưởng trong điều kiện bất lợi.
Mục tiêu của đề tài:
Tuyển chọn được chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng cố định đạm và chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng sinh tổng hợp chất kích thích sinh trưởng IAA tốt cho vùng trồng lúa bị xâm nhập mặn.
Nhiệm vụ nghiên cứu:
- Phân lập và tuyển chọn vi sinh vật có khả năng cố định đạm.
- Phân lập và tuyển chọn vi sinh vật có khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng IAA.
- Đánh giá và chọn lọc các vi sinh vật có khả năng chịu mặn.
- Kiểm tra hình thái, các đặc tính sinh hóa của các vi sinh vật đã tuyển chọn và định danh các chủng bằng phương pháp sinh học phân tử.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
- Đối tượng nghiên cứu: Các chủng vi sinh vật có khả năng cố định đạm và sinh tổng hợp IAA được phân lập từ đất vùng rễ lúa.
- Không gian: Các mẫu đất ruộng lúa thu nhận tại 5 vị trí thuộc huyện Thủ Thừa, tỉnh Long An; các thí nghiệm phân lập, khảo sát sinh hóa và sinh học phân tử được thực hiện tại Phòng Công nghệ Biến đổi Sinh học – Viện Sinh học Nhiệt đới (TP. Thủ Đức, TP. Hồ Chí Minh).
- Thời gian thực hiện: Từ tháng 12 năm 2022 đến tháng 07 năm 2023.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp
Khung lý thuyết và khái niệm khoa học
- Nhóm vi sinh vật PGPR: Vi sinh vật vùng rễ tác động trực tiếp lên cây trồng qua quá trình cố định nitơ tự do trong khí quyển nhờ phức hệ enzyme nitrogenase chuyển đổi $N_2$ thành $NH_4^+$, và tổng hợp các phytohormone (auxin, cytokinin, gibberellin).
- Sinh tổng hợp Indole-3-acetic acid (IAA): Auxin nội sinh do vi sinh vật tổng hợp qua quá trình chuyển hóa tiền chất L-tryptophan (theo các lộ trình indole-3-pyruvic acid, tryptamine hoặc indole-3-acetamide), giúp kích thích sự kéo dài tế bào rễ, phát triển rễ bên và tăng diện tích hấp thu dinh dưỡng của cây lúa.
- Cơ chế chịu mặn: Khả năng sinh trưởng và duy trì mật độ tế bào của vi sinh vật trong môi trường áp suất thẩm thấu cao do nồng độ muối $NaCl$ tăng dần.
Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm
- Thu và xử lý mẫu đất: Mẫu đất ruộng lúa được lấy ở 5 vị trí đại diện gần gốc lúa, phân tầng 0 – 20 cm và 20 – 30 cm, bảo quản lạnh 4°C. Đất được làm khô trong không khí 24 giờ, nghiền nhỏ, lắc với nước cất vô trùng theo tỷ lệ 1:2 (Jackson, 1973) để đo $pH$ và độ dẫn điện $EC$. Giá trị $EC$ được quy đổi sang độ mặn theo công thức $1\text{ dS/m} = 0,64‰$ (Jan và Amacher, 2020).
- Phân lập vi sinh vật: Phương pháp trải đĩa dịch pha loãng ($10^{-3}$ đến $10^{-5}$) trên môi trường chọn lọc:
- Môi trường Jensen (Succrose 20 g, $K_2HPO_4$ 1 g, $MgSO_4\cdot7H_2O$ 0,5 g, $NaCl$ 0,5 g, $FeSO_4$ 0,1 g, $CaCO_3$ 2 g, Agar 20 g/L) để phân lập vi sinh vật cố định đạm.
- Môi trường Burk's không đạm (Glucose 10 g, $KH_2PO_4$ 0,41 g, $K_2HPO_4$ 0,52 g, $Na_2SO_4$ 0,05 g, $MgSO_4\cdot7H_2O$ 0,1 g, $FeSO_4$ 0,0025 g, $Na_2MoO_4$ 0,0025 g, Agar 15 g/L) để phân lập vi sinh vật sinh IAA.
- Sàng lọc và định tính:
- Định tính cố định đạm bước 1 bằng chỉ thị Bromothymol Blue 0,05% trên môi trường Jensen (chuyển màu vàng do sinh ion ammonium mang tính acid).
- Định tính cố định đạm bước 2 bằng thuốc thử Nessler ($K_2[HgI_4]$) tạo phức hợp màu vàng đến nâu đậm.
- Định tính sinh IAA bằng thuốc thử Salkowski (phản ứng tạo phức màu hồng đến đỏ đậm với dịch nuôi cấy bổ sung 0,5 g/L L-tryptophan theo TCVN 10784:2015).
- Định lượng quang phổ:
- Định lượng amoni sinh ra bằng thuốc thử Nessler, đo quang phổ tại bước sóng 450 nm, đối chiếu đường chuẩn $(NH_4)_2SO_4$ ($y = 1,2634x + 0,1621; R^2 = 0,9915$).
- Định lượng IAA bằng thuốc thử Salkowski (Glikmann và Dessaux, 1995), ủ tối 30 phút, đo quang phổ tại bước sóng 530 nm, đối chiếu đường chuẩn IAA chuẩn ($y = 0,0042x - 0,0169; R^2 = 0,9927$).
- Khảo sát đặc tính hình thái và thử nghiệm sinh hóa: Nhuộm Gram, soi kính hiển vi 100X; kiểm tra khả năng tạo bào tử; thử nghiệm Catalase ($H_2O_2$ 3%), Citrate (Simmons Citrate), lên men đường và sinh $H_2S$ trên môi trường Triple Sugar Iron (TSI), thử nghiệm di động trên thạch bán lỏng 0,5% Agar.
- Đánh giá khả năng chịu mặn: Nuôi cấy các chủng tuyển chọn trong môi trường lỏng Nutrient Broth (NB) và Luria Bertani (LB) có nồng độ $NaCl$ cơ bản (0,5% hoặc 0,8%), 2%, 4% và 6% trong 48 – 72 giờ; xác định mật độ vi sinh vật ($Log_{10}\text{ CFU/mL}$) bằng phương pháp đếm khuẩn lạc đĩa thạch.
- Định danh sinh học phân tử: Tách chiết DNA tổng số bằng phương pháp CTAB; điện di kiểm tra trên gel Agarose 1%; khuếch đại gen 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi phổ biến 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') và 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'); giải trình tự và so sánh chuỗi với cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI) bằng BLAST; xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng thuật toán Neighbor-Joining (mô hình Tamura-Nei) trên phần mềm MEGA 11.
- Xử lý số liệu: Phân tích phương sai một nhân tố (One-way ANOVA) và kiểm định Tukey ($P < 0,01$ hoặc $P < 0,05$) trên phần mềm Minitab 16; vẽ đồ thị đường chuẩn bằng Microsoft Excel.
Nội dung chính theo từng chương
Chương 1. Đặt vấn đề
Chương này phân tích thực trạng hạn hán và xâm nhập mặn nghiêm trọng tại vùng Đồng bằng sông Cửu Long nói chung và tỉnh Long An nói riêng trong đợt hạn mặn lịch sử năm 2020. Tác giả chỉ ra tác động tiêu cực của mặn đối với nông nghiệp, đặc biệt là sự suy giảm năng suất lúa tại huyện Thủ Thừa. Từ đó, đề tài xác định mục tiêu và 4 nội dung thực hiện tập trung vào việc tuyển chọn các chủng vi sinh vật bản địa vùng rễ có khả năng cố định đạm, sinh IAA và chịu mặn cao.
Chương 2. Tổng quan tài liệu
Tác giả hệ thống hóa các tài liệu khoa học về:
- Tình hình xâm nhập mặn tại Việt Nam và các yếu tố ảnh hưởng (thủy văn, địa hình, khí tượng, biến đổi khí hậu và khai thác nước ngầm).
- Hậu quả của đất nhiễm mặn đến sinh lý, trao đổi chất, hình thái và năng suất cây lúa qua các giai đoạn sinh trưởng.
- Vai trò của nhóm PGPR: cơ chế cố định đạm tự do của các chi Bacillus, Pseudomonas, Azotobacter, Bradyrhizobium; cơ chế tổng hợp phytohormone IAA qua các lộ trình chuyển hóa L-tryptophan.
- Tổng quan các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về phân lập vi khuẩn chịu mặn và ảnh hưởng của nồng độ muối $NaCl$ đến khả năng tồn tại, sinh trưởng của vi sinh vật đất.
Chương 3. Vật liệu và phương pháp
Trình bày chi tiết đối tượng nghiên cứu, địa điểm thực hiện (Viện Sinh học Nhiệt đới), hệ thống trang thiết bị, hóa chất và môi trường chuyên dụng (Jensen, Burk’s, NB, LB, TSI, Simmons Citrate). Toàn bộ quy trình thu thập mẫu đất, đo $pH$/$EC$, các bước phân lập, định tính, định lượng amoni và IAA, thử nghiệm phản ứng sinh hóa, khảo sát mức độ chịu mặn $NaCl$ (0,5% – 6%), quy trình tách chiết DNA bằng CTAB, phản ứng PCR nhân đoạn gen 16S rRNA và phương pháp xử lý thống kê được mô tả chuẩn hóa, có thể lặp lại.
Chương 4. Kết quả và thảo luận
Chương này trình bày toàn bộ số liệu thực nghiệm thu được:
- Kết quả đo $pH$ (3,7 – 4,2) và $EC$ (0,18 – 3,38 dS/m, tương đương độ mặn 0,12‰ – 2,16‰) của 5 mẫu đất ruộng lúa tại huyện Thủ Thừa.
- Kết quả phân lập được 28 chủng vi sinh vật trên môi trường Jensen và 19 chủng trên môi trường Burk's không đạm.
- Quá trình định tính và định lượng khả năng cố định đạm của 19 chủng (hàm lượng amoni từ 0,7714 đến 3,0516 µmol/mL), chọn ra 3 chủng cao nhất: 1L2-30, 2L3-20, 2L3-30.
- Quá trình định tính và định lượng khả năng sinh IAA của 12 chủng (hàm lượng IAA từ 5,045 đến 65,822 µg/mL), chọn ra 3 chủng cao nhất: 1L4-20B, 2L4-20B, 2L5-20B.
- Kết quả đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào que ngắn bắt màu Gram dương, khả năng sinh bào tử và các phản ứng sinh hóa của 6 chủng tuyển chọn.
- Đánh giá khả năng chịu mặn ở các nồng độ $NaCl$ 0,5%/0,8%, 2%, 4%, 6%: Cả 6 chủng đều duy trì sinh trưởng đến 6% $NaCl$, trong đó chủng 1L2-30 và 1L4-20B đạt mật độ cao nhất.
- Kết quả sinh học phân tử xác định chủng 1L2-30 là Bacillus subtilis và chủng 1L4-20B là Bacillus amyloliquefaciens.
Chương 5. Kết luận và đề nghị
Đưa ra kết luận tổng kết toàn bộ các chỉ tiêu nghiên cứu đạt được về việc phân lập, tuyển chọn, định danh 2 chủng vi khuẩn triển vọng Bacillus subtilis 1L2-30 và Bacillus amyloliquefaciens 1L4-20B; đồng thời nêu rõ các đề nghị tiếp nối cho các nghiên cứu ứng dụng thực địa.
Kết quả và đóng góp
Kết quả định lượng và khảo sát thực nghiệm
1. Đặc tính nông hóa đất lấy mẫu
Các mẫu đất tại 5 vị trí thu nhận ở huyện Thủ Thừa có độ dẫn điện $EC$ dao động từ 0,18 đến 3,38 dS/m (tương ứng độ mặn 0,12‰ đến 2,16‰), thuộc ngưỡng mặn trung bình đến thấp đối với cây lúa. Giá trị $pH$ của đất dao động từ 3,7 đến 4,2, thể hiện tính acid cao (đất rất chua), làm bất hoạt sự hòa tan của các khoáng chất như $P, K, B$ và làm gia tăng nồng độ ion nhôm, sắt tự do gây độc bộ rễ.
2. Tuyển chọn chủng vi sinh vật cố định đạm
Từ 28 chủng phân lập ban đầu, qua 2 bước định tính bằng Bromothymol Blue và thuốc thử Nessler, tác giả đã sàng lọc được 19 chủng có khả năng sinh amoni và tiến hành định lượng quang phổ.
| Ký hiệu chủng |
Định tính Nessler |
Hàm lượng amoni sinh ra ($\mu\text{mol/mL}$) |
| 1L2-30 |
+++ (Nâu) |
$3,0516 \pm 0,0142^\text{a}$ |
| 2L3-20 |
+++ (Nâu) |
$2,6424 \pm 0,0683^\text{b}$ |
| 2L3-30 |
+++ (Nâu) |
$2,5880 \pm 0,0406^\text{b}$ |
| 2L4-20 |
+++ (Nâu) |
$2,1973 \pm 0,0829^\text{c}$ |
| 1L5-30 |
++ (Vàng đậm) |
$2,1811 \pm 0,0759^\text{c}$ |
| 1L1-30 |
++ (Vàng đậm) |
$2,1267 \pm 0,0773^\text{c}$ |
| 1L3-30 |
++ (Vàng đậm) |
$1,4581 \pm 0,0155^\text{d}$ |
| 1L5-20 |
++ (Vàng đậm) |
$1,4081 \pm 0,1410^\text{de}$ |
| 1L3-20 |
++ (Vàng đậm) |
$1,3758 \pm 0,0261^\text{e}$ |
| 3L5-30 |
++ (Vàng đậm) |
$1,0450 \pm 0,0592^\text{f}$ |
| 1L1-20 |
++ (Vàng đậm) |
$0,7714 \pm 0,0054^\text{g}$ |
(Ghi chú: Giá trị trung bình $\pm$ SD của 3 lần lặp lại. Các chữ cái theo sau khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê theo phép thử Tukey, $P < 0,01$).
3. Tuyển chọn chủng vi sinh vật sinh tổng hợp chất kích thích sinh trưởng IAA
Từ 19 chủng phân lập trên môi trường Burk's không đạm, qua định tính với thuốc thử Salkowski, 12 chủng có phản ứng đổi màu đã được định lượng quang phổ tại bước sóng 530 nm.
| Ký hiệu chủng |
Định tính Salkowski |
Hàm lượng IAA sinh ra ($\mu\text{g/mL}$) |
| 1L4-20B |
+++ (Đỏ) |
$65,822 \pm 0,816^\text{a}$ |
| 2L4-20B |
+++ (Đỏ) |
$45,196 \pm 0,996^\text{b}$ |
| 2L5-20B |
+++ (Đỏ) |
$43,340 \pm 1,325^\text{b}$ |
| 2L5-30B |
++ (Hồng đậm) |
$29,966 \pm 0,975^\text{c}$ |
| 2L2-20B |
++ (Hồng đậm) |
$21,799 \pm 0,281^\text{d}$ |
| 1L1-30B |
++ (Hồng đậm) |
$18,847 \pm 0,450^\text{e}$ |
| 2L4-30B |
++ (Hồng đậm) |
$13,176 \pm 0,622^\text{f}$ |
| 3L2-20B |
+ (Hồng) |
$10,300 \pm 1,087^\text{g}$ |
| 1L3-30B |
+ (Hồng) |
$8,895 \pm 1,860^\text{gh}$ |
| 1L4-30B |
+ (Hồng) |
$7,670 \pm 1,540^\text{hi}$ |
| 3L4-20B |
+ (Hồng) |
$5,886 \pm 0,697^\text{ij}$ |
| 1L5-30B |
+ (Hồng) |
$5,045 \pm 0,109^\text{j}$ |
(Ghi chú: Giá trị trung bình $\pm$ SD của 3 lần lặp lại. Các chữ cái theo sau khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê theo phép thử Tukey, $P < 0,01$).
4. Đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn ưu tú
Tất cả 6 chủng ưu tú đều là trực khuẩn ngắn Gram dương, có khả năng di động, Catalase dương tính, lên men Glucose và âm tính với phản ứng sinh $H_2S$. Chủng 1L2-30 và 1L4-20B đều dương tính với Citrate và lên men Lactose.
| Chỉ tiêu sinh hóa |
Chủng cố định đạm 1L2-30 |
Chủng cố định đạm 2L3-20 |
Chủng cố định đạm 2L3-30 |
Chủng sinh IAA 1L4-20B |
Chủng sinh IAA 2L4-20B |
Chủng sinh IAA 2L5-20B |
| Nhuộm Gram |
Dương (+) |
Dương (+) |
Dương (+) |
Dương (+) |
Dương (+) |
Dương (+) |
| Sinh bào tử |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
+ |
| Di động |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
| Citrate |
+ |
- |
- |
+ |
- |
+ |
| Glucose |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
| Lactose |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
+ |
| $H_2S$ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
| Catalase |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
5. Khả năng chịu mặn ($NaCl$) của các chủng tuyển chọn
Mật độ tế bào của các chủng vi khuẩn đều giảm dần khi tăng nồng độ muối từ 0,5%/0,8% lên 2%, 4% và 6% $NaCl$, tuy nhiên tất cả các chủng đều duy trì khả năng sinh trưởng ở nồng độ muối cao nhất (6% $NaCl$).
| Nhóm chủng |
Ký hiệu |
Mật độ ở $NaCl$ 0,5% / 0,8% ($Log_{10}\text{ CFU/mL}$) |
Mật độ ở $NaCl$ 2% ($Log_{10}\text{ CFU/mL}$) |
Mật độ ở $NaCl$ 4% ($Log_{10}\text{ CFU/mL}$) |
Mật độ ở $NaCl$ 6% ($Log_{10}\text{ CFU/mL}$) |
| Cố định đạm (môi trường NB) |
1L2-30 |
$11,21 \pm 0,11^\text{a}$ |
$11,19 \pm 0,02^\text{a}$ |
$8,93 \pm 0,06^\text{a}$ |
$7,77 \pm 0,10^\text{a}$ ($> 5\times10^7$) |
|
2L3-20 |
$10,70 \pm 0,19^\text{b}$ |
$10,89 \pm 0,12^\text{b}$ |
$8,60 \pm 0,02^\text{b}$ |
$7,43 \pm 0,02^\text{b}$ ($< 3\times10^7$) |
|
2L3-30 |
$11,31 \pm 0,11^\text{a}$ |
$11,16 \pm 0,02^\text{a}$ |
$8,42 \pm 0,02^\text{c}$ |
$7,31 \pm 0,13^\text{b}$ ($< 3\times10^7$) |
| Sinh IAA (môi trường LB) |
1L4-20B |
$11,19 \pm 0,04^\text{a}$ |
$11,07 \pm 0,01^\text{a}$ |
$9,09 \pm 0,02^\text{a}$ |
$7,93 \pm 0,03^\text{a}$ ($> 8\times10^7$) |
|
2L4-20B |
$11,00 \pm 0,004^\text{b}$ |
$10,75 \pm 0,19^\text{b}$ |
$8,88 \pm 0,01^\text{b}$ |
$7,88 \pm 0,01^\text{a}$ ($> 8\times10^7$) |
|
2L5-20B |
$11,19 \pm 0,02^\text{a}$ |
$11,01 \pm 0,02^\text{a}$ |
$8,90 \pm 0,02^\text{b}$ |
$6,79 \pm 0,17^\text{b}$ ($< 7\times10^6$) |
6. Kết quả định danh sinh học phân tử
- Chủng cố định đạm cao nhất 1L2-30 được xác định là loài Bacillus subtilis.
- Chủng sinh tổng hợp IAA cao nhất 1L4-20B được xác định là loài Bacillus amyloliquefaciens.
Đóng góp khoa học và so sánh với nghiên cứu trước
- Chủng Bacillus amyloliquefaciens 1L4-20B có khả năng sinh tổng hợp IAA đạt mức $65,822\ \mu\text{g/mL}$, tương đương mức tối ưu trong nghiên cứu của Sara và cộng sự (2020) ($66\ \mu\text{g/mL}$) và cao hơn đáng kể so với các công bố trước đây trên đất lúa của Nguyễn Anh Huy và Nguyễn Hữu Hiệp (2017) ($13,00 - 53,79\ \mu\text{g/mL}$) hay Mai Thị Hồng Hạnh (2020) ($3,2 - 38,71\ \mu\text{g/mL}$).
- Khả năng chịu mặn của cả hai chủng ưu tú Bacillus subtilis 1L2-30 và Bacillus amyloliquefaciens 1L4-20B duy trì mật độ sinh khối cao ở mức 6% $NaCl$ ($> 5\times10^7\text{ CFU/mL}$ và $> 8\times10^7\text{ CFU/mL}$), phù hợp với các nhận định của Upadhyay và cộng sự (2009) về khả năng chịu mặn đặc trưng của chi Bacillus.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
- Hạn chế:
- Nghiên cứu mới dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm (in vitro), đánh giá các hoạt tính sinh học trên môi trường nuôi cấy thuần khiết, chưa tiến hành thử nghiệm hiệu quả trực tiếp trên cây lúa trồng trong nhà lưới hoặc ruộng thí nghiệm bị nhiễm mặn.
- Mẫu đất thu thập trong đợt đầu mùa vụ gieo cấy lúa nên chỉ số $pH$ đất bị ảnh hưởng bởi dư lượng phân bón hóa học NPK bề mặt.
- Chưa tối ưu hóa đa yếu tố các thông số môi trường (nhiệt độ, pH, nguồn carbon, tỷ lệ L-tryptophan) để nâng cao tối đa hiệu suất sinh amoni và IAA của hai chủng.
- Hướng nghiên cứu tiếp:
- Khảo sát các điều kiện lên men tối ưu nhằm thu nhận sinh khối và hoạt tính sinh học cực đại của Bacillus subtilis 1L2-30 và Bacillus amyloliquefaciens 1L4-20B.
- Thử nghiệm phối trộn 2 chủng vi khuẩn trên để tạo chế phẩm vi sinh phức hợp (vừa cố định đạm vừa sinh IAA chịu mặn).
- Đánh giá khả năng kích thích nảy mầm, phát triển hệ rễ, tăng tích lũy chất khô và năng suất lúa trong điều kiện tưới nước nhiễm mặn ở quy mô chậu cây và đồng ruộng.
Giá trị tham khảo
- Đối tượng tham khảo: Sinh viên, học viên cao học, giảng viên và các nghiên cứu viên thuộc chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Khoa học Sinh học, Nông nghiệp, Vi sinh vật học ứng dụng và Khoa học Đất.
- Nội dung có giá trị sử dụng cao:
- Quy trình chi tiết sàng lọc từng bước (định tính bằng Bromothymol Blue/Salkowski đến định lượng quang phổ Nessler/Salkowski) để đánh giá khả năng cố định đạm và sinh IAA.
- Phương pháp bố trí thí nghiệm khảo sát sức chịu mặn của vi sinh vật đất ở các dải nồng độ $NaCl$ từ 0,5% đến 6%.
- Bộ số liệu thực nghiệm về các đặc tính sinh hóa và trình tự gen 16S rRNA của hai chủng Bacillus subtilis và Bacillus amyloliquefaciens phân lập từ đất nhiễm mặn Long An.
Câu hỏi thường gặp
1. Hai chủng vi khuẩn đạt kết quả tốt nhất trong nghiên cứu là gì và được định danh bằng phương pháp nào?
Hai chủng tốt nhất là chủng cố định đạm 1L2-30 (định danh là loài Bacillus subtilis) và chủng sinh IAA 1L4-20B (định danh là loài Bacillus amyloliquefaciens). Cả hai chủng được định danh bằng phương pháp sinh học phân tử: khuếch đại đoạn gen 16S rRNA bằng cặp mồi 27F/1492R, giải trình tự, đối chiếu BLAST trên NCBI và xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng phần mềm MEGA 11 theo mô hình Tamura-Nei.
2. Hàm lượng amoni và IAA cao nhất do các chủng vi sinh vật tạo ra trong nghiên cứu đạt bao nhiêu?
Hàm lượng amoni cao nhất được sinh ra từ chủng Bacillus subtilis 1L2-30 đạt $3,0516 \pm 0,0142\ \mu\text{mol/mL}$ (đo bằng phương pháp Nessler ở bước sóng 450 nm). Hàm lượng IAA cao nhất được sinh ra từ chủng Bacillus amyloliquefaciens 1L4-20B đạt $65,822 \pm 0,816\ \mu\text{g/mL}$ (đo bằng phương pháp Salkowski ở bước sóng 530 nm).
3. Khả năng chịu mặn của các chủng vi khuẩn tuyển chọn được đánh giá ở những nồng độ muối nào và kết quả ra sao?
Khả năng chịu mặn được khảo sát trên môi trường NB và LB ở các nồng độ muối $NaCl$ gồm mức cơ bản (0,5% hoặc 0,8%), 2%, 4% và 6%. Kết quả cho thấy ở mức 6% $NaCl$, chủng 1L2-30 đạt mật độ $7,77\ Log_{10}\text{ CFU/mL}$ ($> 5\times10^7\text{ CFU/mL}$) và chủng 1L4-20B đạt mật độ $7,93\ Log_{10}\text{ CFU/mL}$ ($> 8\times10^7\text{ CFU/mL}$).
4. Vì sao tác giả sử dụng môi trường Jensen và Burk's không đạm trong giai đoạn phân lập?
Môi trường Jensen là môi trường chuyên biệt không chứa nguồn đạm vô cơ, sử dụng succrose làm nguồn carbon để phân lập chọn lọc các vi sinh vật có khả năng cố định nitơ tự do từ không khí. Môi trường Burk's không đạm được sử dụng để phân lập các vi khuẩn vùng rễ có khả năng phát triển tự dưỡng nitơ kết hợp tiền chất sinh tổng hợp phytohormone IAA.
Kết luận
Khóa luận đã phân lập và tuyển chọn thành công các chủng vi khuẩn có lợi từ đất ruộng lúa bị xâm nhập mặn tại huyện Thủ Thừa, tỉnh Long An. Nghiên cứu đã xác định được chủng Bacillus subtilis 1L2-30 có khả năng cố định đạm cao nhất ($3,0516\ \mu\text{mol/mL}$) và chủng Bacillus amyloliquefaciens 1L4-20B có khả năng sinh tổng hợp phytohormone IAA vượt trội ($65,822\ \mu\text{g/mL}$). Cả hai chủng vi khuẩn này đều thể hiện sức sống bền bỉ và duy trì mật độ sinh khối cao trong điều kiện nồng độ muối lên đến 6% $NaCl$. Đây là nguồn vật liệu sinh học bản địa có giá trị thực tiễn cao, tạo tiền đề vững chắc cho việc nghiên cứu và sản xuất các chế phẩm vi sinh phục vụ canh tác lúa bền vững tại các vùng đất bị hạn mặn ở Đồng bằng sông Cửu Long.
