Nghiên Cứu Vi Sinh Vật Đối Kháng Nấm Fusarium Oxysporum Gây Bệnh Héo Vàng Cà Chua Tại Hà Nội

Nghiên cứu vi sinh vật đối kháng nấm Fusarium oxysporum gây héo vàng cà chua tại Hà Nội và vùng lân cận, góp phần bảo vệ cây trồng.

• Tác giả: Phạm Thị Lương
• Người hướng dẫn: TS. Hà Minh Thanh
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật
• Đề tài: Nghiên Cứu Một Số Vi Sinh Vật Đối Kháng Nấm Fusarium Oxysporum Gây Bệnh Héo Vàng Cà Chua Tại Hà Nội
• Loại tài liệu: luận văn
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
• 1. MỞ ĐẦU
• 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
• 1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
• 1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
• 1.4. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
• 1.4.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở NGOÀI NƯỚC
• 2.1.1. Tác hại của bệnh héo vàng cà chua
• 2.1.2. Những nghiên cứu về nấm F. oxysporum
• 2.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở TRONG NƯỚC
• 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Địa điểm nghiên cứu
• 3.2. Thời gian nghiên cứu
• 3.3. Vật liệu nghiên cứu
• 3.3.1. Mẫu vật nghiên cứu
• 3.3.2. Vật liệu nghiên cứu trong phòng thí nghiệm
• 3.3.3. Vật liệu nghiên cứu trong nhà lưới
• 3.4. Nội dung nghiên cứu
• 3.5. Phương pháp nghiên cứu
• 3.5.1. Điều tra, thu thập nguồn nấm Fusarium gây bệnh, nguồn vi sinh vật đối kháng
• 3.5.2. Phương pháp phân lập nấm Fusarium gây bệnh héo vàng cà chua
• 3.5.3. Phương pháp lây bệnh nhân tạo
• 3.5.4. Phương pháp phân lập nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn trong đất
• 3.5.5. Phương pháp đánh giá khả năng đối kháng của nấm có ích với nấm Fusarium
• 3.5.6. Phương pháp đánh giá khả năng đối kháng của vi khuẩn, xạ khuẩn với nấm F.
• 3.5.7. Nghiên cứu các phản ứng sinh lý, sinh hóa của VSV đối kháng
• 3.5.8. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố sinh học đến sinh trưởng và phát triển của VSV đối kháng trong điều kiện phòng thí nghiệm
• 3.5.9. Giám định vi sinh vật có ích bằng phương pháp sinh học phân tử
• 3.5.10. Phương pháp xử lý số liệu
• 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Phân lập nấm F. oxysporum từ mẫu cây cà chua bị bệnh héo vàng thu thập ngoài đồng ruộng
• 4.2. Phân lập nấm Fusarium oxysporum từ mẫu bệnh héo vàng
• 4.3. Xác định tác nhân gây bệnh qua lây bệnh nhân tạo
• 4.4. Thu thập nguồn vi sinh vật đối kháng nấm F. oxysporum gây bệnh héo vàng cà chua
• 4.5. Phân lập các dòng vi sinh vật đối kháng
• 4.6. Khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn, xạ khuẩn có triển vọng trong phòng thí nghiệm
• 4.7. Đặc điểm sinh học, sinh lý và sinh hóa của các dòng vi khuẩn, xạ khuẩn có triển vọng
• 4.7.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng, phát triển của các dòng vi khuẩn và xạ khuẩn có triển vọng
• 4.7.2. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sinh trưởng, phát triển của các dòng vi khuẩn và xạ khuẩn có triển vọng
• 4.7.3. Đặc tính sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn và xạ khuẩn có triển vọng
• 4.8. Giám định vi sinh vật đối kháng
• 4.9. Khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn, xạ khuẩn trong điều kiện nhà lưới
• 4.10. Biến động quần thể của các dòng vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm F. oxysporum trong điều kiện nhà lưới
• 4.11. Hiệu quả ức chế của các dòng vi khuẩn và xạ khuẩn có triển vọng đối với bệnh héo vàng cà chua trong nhà lưới
• 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Bệnh Héo Vàng Cà Chua Tại Hà Nội

Bệnh héo vàng cà chua, do nấm Fusarium oxysporum gây ra, là một trong những bệnh hại nghiêm trọng đối với cây cà chua, đặc biệt tại khu vực Hà Nội và các vùng lân cận. Bệnh gây thiệt hại đáng kể về năng suất và chất lượng, ảnh hưởng đến kinh tế của người trồng cà chua. Việc nghiên cứu các biện pháp phòng trừ hiệu quả, đặc biệt là sử dụng vi sinh vật đối kháng, là vô cùng cần thiết. Theo nghiên cứu của Phạm Thị Lương (2016), bệnh héo vàng có thể làm giảm năng suất cà chua từ 20-30%, thậm chí trên 50% ở những vùng bị bệnh nặng. Do đó, việc tìm kiếm các giải pháp kiểm soát sinh học là một ưu tiên hàng đầu trong nông nghiệp bền vững.

1.1. Tầm Quan Trọng Của Cây Cà Chua Trong Nông Nghiệp Việt Nam

Cà chua là một loại cây trồng rau màu quan trọng, mang lại giá trị kinh tế cao cho người nông dân Việt Nam. Tuy nhiên, năng suất và chất lượng cà chua thường xuyên bị đe dọa bởi nhiều loại bệnh hại, trong đó có bệnh héo vàng do nấm bệnh cây trồng gây ra. Việc bảo vệ cây cà chua khỏi bệnh tật là yếu tố then chốt để đảm bảo nguồn cung ổn định và thu nhập cho người trồng.

1.2. Thực Trạng Bệnh Héo Vàng Cà Chua Tại Vùng Hà Nội

Tại Hà Nội, bệnh héo vàng cà chua đang trở thành một vấn đề ngày càng nghiêm trọng do thâm canh tăng vụ và sử dụng phân bón không cân đối. Điều này tạo điều kiện thuận lợi cho nấm Fusarium oxysporum phát triển và gây bệnh. Việc tìm kiếm các giải pháp phòng trừ bệnh hiệu quả và thân thiện với môi trường là một yêu cầu cấp thiết.

II. Thách Thức Trong Phòng Trừ Nấm Fusarium Gây Bệnh Héo Vàng

Phòng trừ bệnh héo vàng cà chua do nấm Fusarium oxysporum gây ra gặp nhiều khó khăn do đặc tính sinh học của nấm. Nấm có khả năng tồn tại lâu dài trong đất dưới dạng bào tử, thích nghi với nhiều điều kiện môi trường khắc nghiệt. Việc sử dụng thuốc hóa học để phòng trừ bệnh cũng gây ra nhiều tác động tiêu cực đến môi trường và sức khỏe con người. Theo Yangui et al. (2008), các loại nấm như Fusarium, Phytophthora, Pythium, Rhizoctonia rất khó phòng trừ do đặc tính sinh học và sinh thái của chúng.

2.1. Khả Năng Tồn Tại Lâu Dài Của Nấm Fusarium Trong Đất

Nấm Fusarium oxysporum có khả năng tồn tại trong đất dưới nhiều dạng khác nhau, bao gồm sợi nấm, bào tử lớn, bào tử nhỏ và hậu bào tử. Điều này khiến cho việc tiêu diệt hoàn toàn nấm trong đất trở nên vô cùng khó khăn, đòi hỏi các biện pháp phòng trừ tổng hợp và bền vững.

2.2. Tác Hại Của Việc Lạm Dụng Thuốc Hóa Học Trong Nông Nghiệp

Việc lạm dụng thuốc hóa học để phòng trừ bệnh héo vàng cà chua không chỉ gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng đến sức khỏe con người mà còn làm tăng khả năng kháng thuốc của nấm Fusarium oxysporum. Điều này làm giảm hiệu quả của các loại thuốc hóa học và gây khó khăn hơn trong việc phòng trừ bệnh.

2.3. Sự Cần Thiết Của Các Biện Pháp Kiểm Soát Sinh Học

Trong bối cảnh đó, việc áp dụng các biện pháp kiểm soát sinh học, đặc biệt là sử dụng vi sinh vật đối kháng, trở nên vô cùng quan trọng. Các vi sinh vật có lợi có khả năng ức chế sự phát triển của nấm Fusarium oxysporum một cách tự nhiên, giúp giảm thiểu việc sử dụng thuốc hóa học và bảo vệ môi trường.

III. Cách Phân Lập Vi Sinh Vật Đối Kháng Nấm Fusarium Hiệu Quả

Phân lập vi sinh vật đối kháng là bước quan trọng để tìm kiếm các tác nhân kiểm soát sinh học tiềm năng. Quá trình này bao gồm việc thu thập mẫu đất, phân lập các chủng vi sinh vật và đánh giá khả năng đối kháng của chúng với nấm Fusarium oxysporum. Theo phương pháp của Wen-Chuan Chung et al., việc pha loãng dung dịch đất và cấy trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo là một kỹ thuật hiệu quả để phân lập vi sinh vật đối kháng.

3.1. Thu Thập Mẫu Đất Chứa Vi Sinh Vật Đối Kháng

Việc thu thập mẫu đất nên được thực hiện tại các vùng rễ cây cà chua khỏe mạnh, nơi có khả năng chứa nhiều vi sinh vật đối kháng tự nhiên. Mẫu đất nên được bảo quản và xử lý cẩn thận để đảm bảo sự sống sót của các vi sinh vật.

3.2. Kỹ Thuật Phân Lập Vi Sinh Vật Trong Phòng Thí Nghiệm

Các kỹ thuật phân lập vi sinh vật trong phòng thí nghiệm bao gồm pha loãng mẫu đất, cấy trên môi trường dinh dưỡng chọn lọc và theo dõi sự phát triển của các khuẩn lạc. Các khuẩn lạc có khả năng ức chế sự phát triển của nấm Fusarium oxysporum sẽ được chọn lọc để đánh giá khả năng đối kháng.

3.3. Đánh Giá Khả Năng Đối Kháng Của Vi Sinh Vật Phân Lập

Khả năng đối kháng của vi sinh vật phân lập có thể được đánh giá bằng nhiều phương pháp khác nhau, bao gồm phương pháp cấy đối kháng, phương pháp giếng và phương pháp ký sinh trực tiếp. Các vi sinh vật có khả năng đối kháng mạnh mẽ sẽ được lựa chọn để nghiên cứu sâu hơn.

IV. Đánh Giá Khả Năng Đối Kháng Của Vi Sinh Vật Trong Nhà Lưới

Sau khi phân lập và đánh giá khả năng đối kháng trong phòng thí nghiệm, việc đánh giá hiệu quả của vi sinh vật đối kháng trong điều kiện nhà lưới là vô cùng quan trọng. Điều này giúp xác định khả năng ứng dụng thực tế của các vi sinh vật trong việc phòng trừ bệnh héo vàng cà chua. Theo nghiên cứu của Phạm Thị Lương (2016), việc trộn đều dung dịch nấm Fusarium oxysporum và dung dịch vi sinh vật đối kháng trong chậu trồng là một phương pháp hiệu quả để đánh giá khả năng kiểm soát bệnh.

4.1. Chuẩn Bị Môi Trường Thí Nghiệm Trong Nhà Lưới

Môi trường thí nghiệm trong nhà lưới cần được chuẩn bị kỹ lưỡng, bao gồm đất trồng đã khử trùng, chậu trồng và cây cà chua khỏe mạnh. Việc kiểm soát các yếu tố môi trường như nhiệt độ, độ ẩm và ánh sáng cũng rất quan trọng để đảm bảo tính chính xác của kết quả thí nghiệm.

4.2. Theo Dõi Và Đánh Giá Tỷ Lệ Mắc Bệnh Của Cây Cà Chua

Trong quá trình thí nghiệm, cần theo dõi và đánh giá tỷ lệ mắc bệnh của cây cà chua một cách thường xuyên. Các chỉ số như tỷ lệ cây bị bệnh, mức độ bệnh và năng suất cây trồng sẽ được ghi lại để so sánh hiệu quả của các vi sinh vật đối kháng khác nhau.

4.3. Phân Tích Biến Động Quần Thể Vi Sinh Vật Trong Đất

Việc phân tích biến động quần thể vi sinh vật trong đất giúp hiểu rõ hơn về cơ chế hoạt động của vi sinh vật đối kháng và tác động của chúng đến quần thể nấm Fusarium oxysporum. Điều này cung cấp thông tin quan trọng để tối ưu hóa việc sử dụng vi sinh vật đối kháng trong phòng trừ bệnh.

V. Ứng Dụng Vi Sinh Vật Đối Kháng Trong Phòng Trừ Bệnh Cà Chua

Việc ứng dụng vi sinh vật đối kháng trong phòng trừ bệnh héo vàng cà chua mang lại nhiều lợi ích, bao gồm giảm thiểu việc sử dụng thuốc hóa học, bảo vệ môi trường và nâng cao chất lượng sản phẩm. Các chế phẩm sinh học chứa vi sinh vật đối kháng có thể được sử dụng để xử lý đất, phun lên cây hoặc trộn vào giá thể trồng. Theo kết quả nghiên cứu, các dòng vi khuẩn và xạ khuẩn có khả năng hạn chế sự phát triển của nấm F. oxysporum với hiệu quả cao.

5.1. Phát Triển Các Chế Phẩm Sinh Học Từ Vi Sinh Vật Đối Kháng

Việc phát triển các chế phẩm sinh học từ vi sinh vật đối kháng đòi hỏi quy trình sản xuất nghiêm ngặt để đảm bảo chất lượng và hiệu quả của sản phẩm. Các yếu tố như chủng vi sinh vật, môi trường nuôi cấy, quy trình lên men và bảo quản cần được kiểm soát chặt chẽ.

5.2. Hướng Dẫn Sử Dụng Chế Phẩm Sinh Học Trên Đồng Ruộng

Việc sử dụng chế phẩm sinh học trên đồng ruộng cần tuân thủ theo hướng dẫn của nhà sản xuất để đảm bảo hiệu quả phòng trừ bệnh tốt nhất. Các yếu tố như thời điểm sử dụng, liều lượng và phương pháp phun cần được điều chỉnh phù hợp với điều kiện cụ thể của từng vùng trồng.

5.3. Lợi Ích Của Việc Sử Dụng Vi Sinh Vật Đối Kháng Trong Nông Nghiệp

Việc sử dụng vi sinh vật đối kháng trong nông nghiệp mang lại nhiều lợi ích, bao gồm giảm thiểu ô nhiễm môi trường, bảo vệ sức khỏe con người, nâng cao chất lượng sản phẩm và góp phần vào sự phát triển của nông nghiệp bền vững.

VI. Kết Luận Và Hướng Nghiên Cứu Về Vi Sinh Vật Đối Kháng

Nghiên cứu về vi sinh vật đối kháng nấm Fusarium oxysporum gây bệnh héo vàng cà chua tại Hà Nội đã mang lại những kết quả đầy hứa hẹn. Việc phân lập và đánh giá các chủng vi sinh vật đối kháng tiềm năng là cơ sở quan trọng để phát triển các chế phẩm sinh học hiệu quả và thân thiện với môi trường. Hướng nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình sản xuất chế phẩm sinh học, đánh giá hiệu quả trên diện rộng và nghiên cứu cơ chế đối kháng của vi sinh vật.

6.1. Tổng Kết Các Kết Quả Nghiên Cứu Về Vi Sinh Vật Đối Kháng

Các kết quả nghiên cứu đã xác định được một số chủng vi sinh vật đối kháng có khả năng ức chế sự phát triển của nấm Fusarium oxysporum trong điều kiện phòng thí nghiệm và nhà lưới. Các chủng vi sinh vật này có tiềm năng lớn để phát triển thành các chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh héo vàng cà chua.

6.2. Đề Xuất Các Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo Về Vi Sinh Vật

Các hướng nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình sản xuất chế phẩm sinh học, đánh giá hiệu quả trên diện rộng, nghiên cứu cơ chế đối kháng của vi sinh vật và đánh giá tác động của vi sinh vật đến hệ sinh thái đất.

6.3. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu Vi Sinh Vật Trong Nông Nghiệp

Nghiên cứu về vi sinh vật đóng vai trò quan trọng trong việc phát triển nông nghiệp bền vững, giúp giảm thiểu việc sử dụng thuốc hóa học, bảo vệ môi trường và nâng cao chất lượng sản phẩm. Việc đầu tư vào nghiên cứu vi sinh vật là một chiến lược quan trọng để đảm bảo an ninh lương thực và phát triển nông nghiệp bền vững.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh héo vàng do nấm Fusarium oxysporum gây ra là một trong những đối tượng dịch hại nguy hiểm hàng đầu trên cây cà chua tại Việt Nam, làm suy giảm nghiêm trọng năng suất từ 20% đến 30%, thậm chí vượt mức 50% tại các vùng chuyên canh bị nhiễm bệnh nặng. Sự tồn tại dai dẳng của nấm dưới dạng hậu bào tử trong đất cùng tình trạng lạm dụng thuốc hóa học kéo dài đã gây ô nhiễm môi trường, phá vỡ cân bằng sinh thái đất và gia tăng tính kháng thuốc của mầm bệnh.

Trước thực trạng đó, đề tài nghiên cứu được thực hiện nhằm mục tiêu phân lập, tuyển chọn và định danh các chủng vi sinh vật bản địa có hoạt tính đối kháng mạnh với nấm Fusarium oxysporum, từ đó tạo tiền đề khoa học vững chắc cho việc sản xuất các chế phẩm sinh học an toàn. Phạm vi nghiên cứu được triển khai trong giai đoạn 2015–2016, tập trung thu thập mẫu bệnh và mẫu đất tại vùng rễ cà chua ở 4 vùng sinh thái trọng điểm gồm Hà Nội, Vĩnh Phúc, Bắc Ninh và Hải Phòng.

Nghiên cứu mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn sâu sắc khi cung cấp nguồn dữ liệu sinh học phân tử chính xác về hai chủng vi sinh vật đối kháng tiềm năng là vi khuẩn Bacillus subtilis (dòng VF-7) và xạ khuẩn Streptomyces katrae (dòng F-123). Các dòng sinh vật này chứng minh hiệu lực ức chế nấm bệnh vượt trội đạt 78,41% đến 86,59% trong phòng thí nghiệm và 57,4% đến 67,7% trong điều kiện nhà lưới. Đây là giải pháp sinh học then chốt giúp xây dựng nền nông nghiệp tuần hoàn, bảo vệ sức khỏe cộng đồng và nâng cao giá trị thương phẩm cây cà chua.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên nền tảng lý thuyết kiểm soát sinh học trong bảo vệ thực vật bền vững và lý thuyết tương tác đối kháng giữa các quần thể vi sinh vật vùng rễ. Cơ chế phòng trừ sinh học tập trung vào ba nguyên lý chủ đạo: cạnh tranh không gian sống cùng nguồn dinh dưỡng carbon/nitơ; sinh tổng hợp các hợp chất kháng sinh tự nhiên; và hiện tượng ký sinh nấm thông qua việc tiết các enzyme ngoại bào ly giải vách tế bào sợi nấm.

Hệ thống lý thuyết tích hợp các khái niệm then chốt bao gồm: nhóm vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng thực vật, hiện tượng kích kháng hệ thống cảm ứng, và cơ chế tồn dư của hậu bào tử nấm Fusarium. Quá trình ức chế nấm bệnh diễn ra mạnh mẽ nhờ sự phối hợp của ba hệ enzyme thủy phân đặc hiệu:

• Enzyme Chitinase: Phân hủy trực tiếp liên kết polyme chitin tại thành tế bào nấm.
• Enzyme $\beta$-1,3-glucanase: Cắt đứt các liên kết glucan cấu trúc, làm suy yếu khung sợi nấm.
• Enzyme Cellulase: Hỗ trợ phá vỡ các thành phần hữu cơ phức tạp bao quanh mô bệnh.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu tiến hành khảo sát và thu thập tổng số 80 mẫu thân cây cà chua bị bệnh héo vàng cùng 60 mẫu đất vùng rễ tại các vườn chuyên canh thuộc Hà Nội, Vĩnh Phúc, Bắc Ninh và Hải Phòng. Phương pháp chọn mẫu tuân thủ nghiêm ngặt Quy chuẩn điều tra bảo vệ thực vật: mỗi địa phương lựa chọn 3 vườn đại diện, mỗi vườn bố trí 10 điểm theo hai đường chéo góc và mỗi điểm đánh giá 10 cây. Cỡ mẫu 80 mẫu bệnh và 60 mẫu đất bảo đảm tính đại diện thống kê và phản ánh chính xác phân bố của nấm bệnh trong tự nhiên.

Nghiên cứu lựa chọn các phương pháp phân tích chuyên sâu nhằm đáp ứng tính chính xác cao:

• Quy tắc lây bệnh nhân tạo Koch: Sử dụng dịch huyền phù nấm mật độ $1 \times 10^4$ bào tử/ml lây nhiễm trên cây cà chua giai đoạn 3–4 lá thật để xác định chính xác nguyên nhân gây bệnh trước khi phân lập trở lại.
• Phương pháp cấy đối xứng và đục lỗ thạch theo quy chuẩn quốc tế: Pha loãng nồng độ đất từ $10^{-5}$ đến $10^{-7}$ trên các môi trường chuyên biệt như SPA, King's B, NA và Gauze nhằm sàng lọc khách quan khả năng ức chế thông qua đường kính vòng vô khuẩn.
• Phương pháp sinh học phân tử: Tách chiết DNA tổng số, thực hiện phản ứng khuếch đại gen PCR đoạn 16S rRNA kích thước xấp xỉ 800 bp với cặp mồi chuyên biệt Phy1F/Phy1R, giải trình tự trực tiếp bằng kit BigDye Terminator v3.1 và tra cứu tương đồng trên hệ thống GenBank (NCBI) để định danh chính xác tuyệt đối tên loài vi sinh vật.

Toàn bộ quy trình thực nghiệm được triển khai đồng bộ từ năm 2015 đến năm 2016 tại Phòng thí nghiệm và Nhà lưới của Bộ môn Bệnh cây thuộc Viện Bảo vệ thực vật.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Phân lập mẫu bệnh thực tế: Từ 80 mẫu thân cây cà chua thu thập ngoài đồng ruộng, nghiên cứu đã phân lập được 57 mẫu xuất hiện nấm Fusarium oxysporum, chiếm tỷ lệ trung bình 71,25%. Tỷ lệ xuất hiện nấm bệnh cao nhất ghi nhận tại Hà Nội đạt 80,00% (16/20 mẫu) và Hải Phòng đạt 75,00% (15/20 mẫu), tiếp theo là Bắc Ninh đạt 70,00% (14/20 mẫu) và Vĩnh Phúc đạt 60,00% (12/20 mẫu).

Hiệu lực tuyển chọn chủng đối kháng: Từ 60 mẫu đất vùng rễ khỏe mạnh, đề tài phân lập thành công 77 dòng vi sinh vật. Qua thử nghiệm đối kháng in vitro, nghiên cứu đã chọn lọc được 10 dòng tiềm năng (chiếm 12,98%) tạo vòng ức chế lớn hơn 10 mm. Nổi bật nhất là dòng vi khuẩn VF-7 và dòng xạ khuẩn F-123. Kết quả giải trình tự gen 16S rRNA đã định danh dòng vi khuẩn VF-7 là Bacillus subtilis và dòng xạ khuẩn F-123 là Streptomyces katrae.

Hiệu quả ức chế nấm bệnh và kiểm soát ngoài nhà lưới:

• Trong phòng thí nghiệm: Các dòng vi khuẩn và xạ khuẩn tuyển chọn đạt hiệu lực kìm hãm sự phát triển của sợi nấm Fusarium oxysporum từ 78,41% đến 86,59%.
• Trong điều kiện nhà lưới: Xử lý hỗn hợp vi sinh vật đối kháng ở mật độ $1 \times 10^9$ cfu/g đất đã giúp giảm mạnh tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh, mang lại hiệu quả phòng ngừa đạt từ 57,40% đến 67,70% so với công thức đối chứng không xử lý sau 40 ngày theo dõi.

Đặc tính sinh học và an toàn sinh thái: Cả hai chủng B. subtilis VF-7 và S. katrae F-123 sinh trưởng tối ưu ở nhiệt độ 25–30°C và dải pH từ 7,0 đến 8,0. Chúng có khả năng sống kỵ khí tùy tiện, khử nitrat mạnh mẽ, đồng hóa tốt các nguồn đường glucose, saccarose và hoạt hóa cao độ 3 hệ enzyme cellulase, chitinase cùng $\beta$-glucanase. Thử nghiệm độc tính bán trường diễn trên 15 cá thể chuột bạch với liều lượng ổn định trong 30 ngày cho thấy chuột tăng trọng bình thường, các cơ quan nội tạng hoàn toàn khỏe mạnh, không ghi nhận bất kỳ dấu hiệu ngộ độc cấp hay mãn tính.

Thảo luận kết quả

Khả năng đối kháng mạnh của Bacillus subtilis VF-7 và Streptomyces katrae F-123 bắt nguồn từ cơ chế tổng hợp đa dạng các kháng sinh tự nhiên cùng hệ enzyme phân giải ngoại bào. Khi tiếp xúc với sợi nấm Fusarium, enzyme chitinase và $\beta$-glucanase phá hủy lớp vỏ ngoài của nấm, khiến cấu trúc sợi nấm bị co xoắn, đứt đoạn và tiêu biến hoàn toàn. Kết quả này tương đồng với các công bố quốc tế về vai trò của nhóm vi khuẩn Bacillus và chi Streptomyces trong kiểm soát sinh học nấm đất.

Trong báo cáo thực nghiệm, sự biến động mật độ quần thể vi sinh vật có thể được mô tả trực quan qua biểu đồ đường (line chart) theo các mốc thời gian 10, 20 và 30 ngày sau khi trồng. Biểu đồ chỉ ra rằng mật độ vi khuẩn và xạ khuẩn duy trì ổn định quanh ngưỡng $1 \times 10^7$ đến $1 \times 10^9$ cfu/g đất, trong khi mật độ bào tử nấm Fusarium gây bệnh giảm sâu tới hơn 60% so với đối chứng. Bảng ma trận so sánh các chỉ tiêu sinh hóa cũng minh chứng rõ rệt sự vượt trội của hai chủng VF-7 và F-123 về hoạt độ enzyme phân giải so với các dòng vi sinh vật thông thường khác.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm chuyển giao hiệu quả các kết quả nghiên cứu vào thực tiễn sản xuất nông nghiệp, các giải pháp và khuyến nghị hành động được xây dựng cụ thể như sau:

• Hoàn thiện quy trình nhân sinh khối quy mô công nghiệp: Viện Bảo vệ thực vật cùng các viện công nghệ sinh học nông nghiệp chủ trì nghiên cứu tối ưu hóa môi trường lên men xốp giá rẻ từ phụ phẩm nông nghiệp như cám gạo, bột ngô, bã đậu nành. Mục tiêu trong vòng 12 tháng đạt mật độ vi sinh vật thành phẩm không dưới $1 \times 10^9$ cfu/g với chi phí sản xuất giảm 25% so với môi trường tổng hợp.

• Nghiên cứu phối chế chế phẩm sinh học đa chức năng: Các doanh nghiệp sản xuất phân bón và thuốc bảo vệ thực vật sinh học phối hợp với nhóm tác giả tích hợp hai chủng Bacillus subtilis VF-7 và Streptomyces katrae F-123 cùng 5% chiết xuất thảo mộc như bã trầu hoặc bã sở. Thời gian hoàn thiện công thức trong 9 tháng, hướng tới nâng cao thời gian bảo quản chế phẩm đạt trên 12 tháng ở nhiệt độ phòng.

• Triển khai khảo nghiệm diện rộng ngoài đồng ruộng: Chi cục Trồng trọt và Bảo vệ thực vật các tỉnh Hà Nội, Vĩnh Phúc, Bắc Ninh tổ chức xây dựng các mô hình cánh đồng mẫu lớn canh tác cà chua an toàn trong 2 vụ liên tiếp. Chỉ tiêu đề ra là giảm thiểu 50% lượng thuốc trừ bệnh hóa học gốc đồng và carbendazim, đồng thời duy trì hiệu lực phòng trừ bệnh héo vàng đạt trên 65%.

• Ban hành quy trình quản lý dịch hại tổng hợp IPM: Trung tâm Khuyến nông Quốc gia biên soạn cẩm nang hướng dẫn kỹ thuật nhúng rễ cây con trong dung dịch vi sinh vật đối kháng nồng độ $1 \times 10^9$ cfu/ml trong thời gian 20 phút trước khi trồng. Đặt mục tiêu tổ chức 20 lớp tập huấn hàng năm cho hơn 1.000 lượt nông dân tại các hợp tác xã sản xuất rau an toàn đạt chuẩn VietGAP.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung và kết quả của luận văn mang lại giá trị thực tiễn và học thuật cho 4 nhóm đối tượng chính:

• Cán bộ nghiên cứu, giảng viên và sinh viên ngành Bảo vệ thực vật, Vi sinh vật học, Công nghệ sinh học: Tài liệu cung cấp cơ sở phương pháp luận bài bản về quy trình phân lập nấm đất, kỹ thuật đánh giá đối kháng in vitro/in vivo, phản ứng định tính enzyme ly giải và định danh sinh học phân tử bằng cặp mồi 16S rRNA chuyên biệt.

• Kỹ sư nông nghiệp và cán bộ bảo vệ thực vật tại các địa phương: Tham khảo hướng dẫn chẩn đoán lâm sàng triệu chứng bệnh héo vàng, quy tắc lây bệnh nhân tạo Koch và phương pháp quản lý sinh học nấm bệnh lưu tồn trong đất trên các loại cây trồng cạn.

• Doanh nghiệp sản xuất chế phẩm sinh học, phân bón hữu cơ vi sinh: Tiếp cận nguồn dữ liệu kỹ thuật tin cậy về đặc tính sinh lý, khả năng chịu nhiệt 25–30°C và độ an toàn trên động vật của hai chủng giống tiềm năng Bacillus subtilis và Streptomyces katrae để đưa vào dây chuyền sản xuất thương phẩm.

• Chủ trang trại, hợp tác xã sản xuất cà chua và nông sản sạch: Nắm bắt giải pháp xử lý cây con giai đoạn 3–4 lá thật bằng chế phẩm sinh học thay thế thuốc trừ nấm hóa học, giúp bảo vệ bộ rễ, tăng năng suất cây trồng và đáp ứng các tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm.

Câu hỏi thường gặp

Tác nhân chính gây bệnh héo vàng cà chua trong nghiên cứu là gì và mức độ gây hại ra sao?

Bệnh héo vàng do nấm Fusarium oxysporum gây ra qua đường xâm nhiễm từ rễ vào bó mạch libe, làm cản trở quá trình vận chuyển nước và dinh dưỡng. Trên đồng ruộng, bệnh làm giảm 20% đến 30% năng suất, nhiều vùng thiệt hại trên 50%. Kết quả phân lập 80 mẫu bệnh tại Hà Nội và phụ cận ghi nhận tỷ lệ nhiễm nấm trung bình lên tới 71,25%.

Hai chủng vi sinh vật đối kháng mạnh nhất được định danh trong luận văn là loài nào?

Nghiên cứu đã sàng lọc được 2 chủng đối kháng xuất sắc nhất từ 77 dòng phân lập là dòng vi khuẩn VF-7 và dòng xạ khuẩn F-123. Qua giải trình tự đoạn gen 16S rRNA kích thước khoảng 800 bp và đối chiếu cơ sở dữ liệu GenBank, chủng VF-7 được định danh chính xác là Bacillus subtilis và chủng F-123 là Streptomyces katrae.

Cơ chế nào giúp các vi sinh vật đối kháng tiêu diệt và ức chế nấm gây bệnh?

Hai chủng B. subtilis VF-7 và S. katrae F-123 ức chế nấm bệnh qua việc sản sinh các kháng sinh tự nhiên cùng hệ enzyme phân giải ngoại bào mạnh mẽ gồm chitinase, cellulase và $\beta$-1,3-glucanase. Các enzyme này phá vỡ trực tiếp thành tế bào nấm Fusarium, giúp đạt hiệu lực kìm hãm từ 78,41% đến 86,59% trong phòng thí nghiệm.

Sử dụng các chủng vi sinh vật đối kháng này có an toàn cho người và vật nuôi không?

Chế phẩm sinh học từ các chủng vi sinh vật này hoàn toàn an toàn. Nghiên cứu đã thực hiện thử nghiệm độc tính bán trường diễn trên 15 cá thể chuột bạch bằng cách cho uống dịch vi sinh vật kết hợp 5% dịch chiết thảo mộc trong 30 ngày liên tục. Kết quả theo dõi cho thấy chuột phát triển khỏe mạnh, tăng trọng đều và không có bất kỳ tổn thương nội tạng nào.

Phương pháp xử lý vi sinh vật đối kháng nào đạt hiệu quả kinh tế và kỹ thuật cao nhất?

Biện pháp đạt hiệu quả cao nhất là ngâm rễ cây giống cà chua giai đoạn 3–4 lá thật trong dung dịch vi sinh vật đối kháng mật độ $1 \times 10^9$ cfu/ml khoảng 20 phút trước khi trồng vào đất đã xử lý vi sinh. Phương pháp này giúp vi sinh vật nhanh chóng thiết lập quần thể tại vùng rễ, ức chế nấm bệnh và nâng cao hiệu lực phòng trừ lên đến 67,70% trong nhà lưới.

Kết luận

• Luận văn đã xác định nấm Fusarium oxysporum là tác nhân chính gây bệnh héo vàng cà chua tại Hà Nội và phụ cận với tỷ lệ xuất hiện trung bình 71,25% trên 80 mẫu bệnh khảo sát.
• Phân lập thành công 77 dòng vi sinh vật từ 60 mẫu đất vùng rễ, tuyển chọn được 10 dòng đối kháng mạnh tạo vòng ức chế nấm lớn hơn 10 mm.
• Định danh chính xác 2 chủng vi sinh vật đối kháng vượt trội bằng kỹ thuật sinh học phân tử PCR 16S rRNA là Bacillus subtilis VF-7 và Streptomyces katrae F-123.
• Khẳng định hiệu lực phòng trừ sinh học đạt 78,41% đến 86,59% trong phòng thí nghiệm và 57,40% đến 67,70% trong điều kiện nhà lưới, hoàn toàn an toàn sinh học qua thử nghiệm trên chuột bạch 30 ngày.
• Đóng góp nguồn vật liệu sinh học bản địa giá trị cao phục vụ nghiên cứu và sản xuất các dòng chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh cây trồng.

Trong giai đoạn 12–18 tháng tiếp theo, các đơn vị nghiên cứu cần đẩy mạnh hoàn thiện công nghệ lên men quy mô lớn và thử nghiệm diện rộng trên nhiều loại cây trồng khác nhau. Hãy liên hệ và hợp tác cùng các cơ sở nghiên cứu nông nghiệp để ứng dụng công nghệ vi sinh đối kháng ngay hôm nay, chung tay xây dựng nền nông nghiệp xanh, sạch và phát triển bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHẠM THỊ LƯƠNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI KHÁNG NẤM FUSARIUM OXYSPORUM GÂY BỆNH HÉO VÀNG CÀ CHUA TẠI HÀ NỘI VÀ PHỤ CẬN Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật Mã số: 60.12 Người hướng dẫn khoa học: TS. Hà Minh Thanh NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016 c LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Phạm Thị Lương i c LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc TS.

Hà Minh Thanh đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể các thầy cô giáo Ban Đào tạo Sau đại học, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt nam đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ và có những góp ý sâu sắc trong thời gian học tập và thực hiện luận văn. Xin chân thành cảm ơn các anh, chị và bạn bè đông nghiệp trong Bộ môn Bệnh cây, Viện Bảo vệ thực vật đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình trong quá trình thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn.

Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Phạm Thị Lương ii c MỤC LỤC Lời cam đoan. ii Mục lục. iii Danh mục chữ viết tắt. vi Danh mục bảng.

vii Danh mục hình. ix Trích yếu luận văn. Tính cấp thiết của đề tài. Mục tiêu nghiên cứu.

Phạm vi nghiên cứu. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài. Ý nghĩa khoa học. Ý nghĩa thực tiễn.

Tổng quan tài liệu. Tình hình nghiên cứu ở ngoài nước. Tác hại của bệnh héo vàng cà chua. Những nghiên cứu về nấm F.

Vi sinh vật đối kháng và cơ chế đối kháng của vi sinh vật. Tình hình nghiên cứu ở trong nước. Tác hại của bệnh héo vàng cà chua. Những nghiên cứu về nấm F.

Vi sinh vật đối kháng và cơ chế đối kháng của vi sinh vật. Nghiên cứu về chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh hại. Nghiên cứu về nhân sinh khối nấm có ích. Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu.

Địa điểm nghiên cứu. Thời gian nghiên cứu. Vật liệu nghiên cứu. Mẫu vật nghiên cứu.

Vật liệu nghiên cứu trong phòng thí nghiệm. Vật liệu nghiên cứu trong nhà lưới. Nội dung nghiên cứu. Phương pháp nghiên cứu.

Điều tra, thu thập nguồn nấm Fusarium gây bệnh, nguồn vi sinh vật đối kháng. Phương pháp phân lập nấm Fusarium gây bệnh héo vàng cà chua. Phương pháp lây bệnh nhân tạo. Phương pháp phân lập nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn trong đất.

Phương pháp đánh giá khả năng đối kháng của nấm có ích với nấm Fusarium. Phương pháp đánh giá khả năng đối kháng của vi khuẩn, xạ khuẩn với nấm F. Nghiên cứu các phản ứng sinh lý, sinh hóa của VSV đối kháng. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố sinh học đến sinh trưởng và phát triển của VSV đối kháng trong điều kiện phòng thí nghiệm.

Giám định vi sinh vật có ích bằng phương pháp sinh học phân tử. Phương pháp xử lý số liệu. Kết quả nghiên cứu và thảo luận. Phân lập nấm F.

oxysporum từ mẫu cây cà chua bị bệnh héo vàng thu thập ngoài đồng ruộng. Phân lập nấm Fusarium oxysporum từ mẫu bệnh héo vàng. Xác định tác nhân gây bệnh qua lây bệnh nhân tạo. Thu thập nguồn vi sinh vật đôi kháng nâm F.oxysporum gây bệnh héo vàng cà chua.

Phân lập các dòng vi sinh vật đối kháng. Khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn, xạ khuẩn có triển vọng trong phòng thí nghiệm. Đặc điểm sinh học, sinh lý và sinh hóa của các dòng vi khuẩn, xạ khuẩn có triển vọng. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng, phát triển của các dòng vi khuẩn và xạ khuẩn có triển vọng.

Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sinh trưởng, phát triển của các dòng vi khuẩn và xạ khuẩn có triển vọng. Đặc tính sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn và xạ khuẩn có triển vọng. Giám định vi sinh vật đối kháng. Khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn, xạ khuẩn trong điều kiện nhà lưới.

Biến động quần thể của các dòng vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm f. Oxysporum trong điều kiện nhà lưới. Hiệu quả ức chế của các dòng vi khuẩn và xạ khuẩn có triển vọng đối với bệnh héo vàng cà chua trong nhà lưới. Kết luận và kiến nghị.

59 Tài liệu tham khảo. 60 v c DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt BVTV Bảo vệ thực vật VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật XK Xạ khuẩn vi c DANH MỤC BẢNG Bảng 4. Phân lập nấm Fusarium oxysporum từ mẫu cây cà chua bị bệnh héo vàng. Kết quả lây bệnh nhân tạo và phân lập trở lại nấm F.

oxysporum trên cây cà chua. Phân lập và thử nghiệm khả năng đối kháng của các dòng VSV với nấm F. Phân lập nấm Trichoderma từ đất trồng cà chua. Khả năng đối kháng của các dòng VSV có triển vọng với nấm F.

oxysporum theo phương pháp cấy đối xứng. Khả năng đối kháng của các dòng VSV có triển vọng với nấm F. oxysporum theo phương pháp giếng. Khả năng đối kháng của các dòng Trichoderma với nấm F.

oxysporum gây héo vàng cà chua bằng ký sinh trực tiếp. Khả năng ức chế bằng kháng sinh bay hơi của các dòng Trichoderma với nấm F. oxysporum gây héo vàng cà chua. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của các dòng VK, XK có triển vọng.

Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sinh trưởng, phát triển của các dòng vi khuẩn và xạ khuẩn có triển vọng. Ảnh hưởng của pH môi trường đến sinh trưởng, phát triển của các dòng vi khuẩn, xạ khuẩn có triển vọng. Đặc tính yếm khí của các dòng VK, XK triển vọng. Khả năng khử Nitrat của các dòng vi khuẩn và xạ khuẩn có triển vọng.

Khả năng đồng hóa nguồn cac bon của các nguồn vi khuẩn, xạ khuẩn có triển vọng. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến sinh trưởng, phát triển của các dòng vi khuẩn, xạ khuẩn có triển vọng. Định tính hoạt độ enzym của các dòng vi khuẩn và xạ khuẩn triển vọng. Khả năng thủy phân tinh bột của các dòng vi khuẩn, xạ khuẩn có triển vọng.

Đánh giá khả năng gây độc bán trường diễn của các chủng vi sinh vật đối kháng và thảo mộc trên chuột (Sau 30 ngày). Trọng lượng chuột ở các ngày sau uống. Kết quả giám định vi khuẩn, xạ khuẩn đối kháng. Biến động quần thể của các dòng vi khuẩn, xạ khuẩn đối kháng trong điều kiện nhà lưới.

Biến động mật độ bào tử nấm gây bệnh trong đất khi sử dụng các vi sinh vật trong điều kiện nhà lưới. Hiệu quả của các dòng vi khuẩn và xạ khuẩn đối kháng có triển vọng với bệnh héo vàng cà chua trong nhà lưới. 58 viii c DANH MỤC HÌNH Hình 4. Bệnh héo vàng trên cây cà chua (Fusarium oxysporum).

Nấm Fusarium oxysporum sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường nhân tạo. Nấm Fusarium oxysporum phân lập từ thân cây sau 10 ngày lây bệnh. Đối kháng của một số dòng vi khuẩn, xạ khuẩn với nấm F. oxysporum theo phương pháp cấy đối xứng.

Ảnh hưởng của nhiệt độ đến một số dòng vi khuẩn, xạ khuẩn. Ảnh hưởng của các loại môi trường đến một số dòng vi khuẩn, xạ khuẩn. Ảnh hưởng của các độ pH đến một số dòng vi khuẩn và xạ khuẩn. Tính yếm khí của một số dòng vi khuẩn và xạ khuẩn.

Khả năng khử nitrat của một số dòng vi khuẩn, xạ khuẩn. Nguồn Cacbon từ Glucose. Nguồn Cacbon từ Saccarose. Nguồn Cacbon từ Manitol.

Nguồn Cacbon từ tinh bột tan. Khả năng chịu muối của dòng vi khuẩn F29. Khả năng hoạt hóa enzyme chitinase của một số dòng vi khuẩn, xạ khuẩn. Khả năng hoạt hóa enzyme β-glucanase của một số dòng vi khuẩn, xạ khuẩn.

Khả năng hoạt hóa enzyme cellulose của một số dòng VK, XK. Khả năng thủy phân tinh bột của một số dòng VK và XK. 53 ix c TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Phạm Thị Lương Tên luận văn: Nghiên cứu một số vi sinh vật đối kháng nấm Fusarium oxysporum gây bệnh héo vàng cà chua tại Hà nội và phụ cận. Ngành: Bảo vệ thực vật Mã số: 60.12 Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu: Xác định được một số chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng cao với nấm Fusarium oxysporum gây bệnh héo vàng cà chua tại Hà nội và phụ cận.

Phương pháp nghiên cứu: - Thu thập, phân lập nguốn nấm Fusarium gây bệnh, nguồn vi sinh vật đối kháng. Theo phương pháp nghiên cứu BVTV quyển I và quyển 3 của Viện Bảo vệ thực vật năm 1997 và 2000. + Chọn các vườn đại diện, thu mẫu cây bị bệnh héo vàng và thu mẫu đất tại vùng rễ cây bị bệnh (đối với phân lập nấm Fusarium) và không bị bệnh (đối với phân lập VSV đối kháng nấm gây bệnh). + Phân lập nấm Fusarium từ mô cây bị bệnh và từ đất: theo phương pháp của Burgess L.

+Phân lập VSV đối kháng nấm: Theo phương pháp của Wen-Chuan Chung et al. Pha loãng dung dịch đất từ 10-5 đến 10-7 lần, chan đều 0,5 ml dung dịch đã pha loãng trong hộp petri có chứa môi trường dinh dưỡng nhân tạo (SPA, YS, NA và CGA).