Đặt vấn đề Oligochitosan (OC) là loại polysaccharide tự nhiên có khối lượng phân tử (KLPT) thấp được chế tạo bằng phương pháp cắt mạch chitosan bởi các tác nhân như enzyme, hóa học và bức xạ. OC đã được nghiên cứu và minh chứng là không độc, có khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh, có hiệu ứng kích kháng và phòng trừ đối với nhiều loại bệnh gây hại trên thực vật. OC có KLPT < 10 kDa thể hiện hiệu ứng kích kháng bệnh hiệu quả. Cũng như chitosan, OC có khả năng tạo phức với nhiều ion kim loại như Cu2+, Zn2+, Mn2+, Fe2+,… thông qua liên kết phối trí với nhóm amin (–NH2) và nhóm hydroxyl (–OH) trong phân tử OC, làm tăng cường khả năng kháng khuẩn, kháng nấm.
Trong đó, phức OC-Zn2+ được quan tâm nghiên cứu và sử dụng phòng trừ bệnh cho cây trồng. Kẽm là nguyên tố vi lượng thiết yếu cho sự sinh trưởng, phát triển và có vai trò trong việc tăng cường các phản ứng phòng vệ của cây trồng. Một số nghiên cứu đã minh chứng phức OC-Zn2+ có khả năng kháng vi khuẩn, nấm bệnh cao hơn từ 2 − 8 lần so với OC và 4 − 16 lần so với Zn2+. Ngoài ra, việc sử dụng kẽm trên thực vật còn làm tăng tích lũy vi chất dinh dưỡng thiết yếu trong nông sản mà thường thiếu hụt trong chế độ ăn uống của con người.
Vì vậy, phức OC-Zn2+ là loại vật liệu tiềm năng có thể ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp an toàn. Trong sản xuất nông nghiệp tại Việt Nam, đậu nành (Glycine max) là cây trồng quan trọng vì là cây thực phẩm lâu đời, là nguồn cung cấp protein cho người và vật nuôi. Diện tích trồng đậu nành tại Việt Nam theo thống kê đến năm 2020 là 166.000 ha với sản lượng đạt 265.000 tấn nhưng chỉ đủ cung cấp 8 − 10% cho nhu cầu sử dụng trong nước. Vì vậy, phát triển sản xuất đậu nành để đáp ứng nhu cầu là hướng đi đúng đắn.
Xu hướng toàn cầu trong sản xuất nông nghiệp an toàn nói chung và đậu nành nói riêng, việc kiểm soát các loại bệnh hại thường xuyên do nấm Colletotrichum truncatum, Fusarium solani,… bằng chế phẩm như phức OC-Zn2+ là cần thiết. Tuy nhiên, tác động của phức OC-Zn2+ đối với mỗi loại cây trồng và mỗi loại vi sinh vật gây bệnh là khác nhau, trong đó khả năng phòng trừ bệnh thán thư của phức trên cây đậu nành do nấm C. truncatum chưa được nghiên cứu. Vì các lý do trên, chúng tôi chọn và thực hiện đề tài “Nghiên cứu chế tạo và khảo sát hiệu quả phòng trừ nấm Colletotrichum truncatum gây bệnh thán thư trên cây đậu nành (Glycine max) của phức oligochitosan-Zn2+” Với mục tiêu: Nghiên cứu chế tạo sản phẩm phức oligochitosan-Zn2+ có hiệu 2 lực phòng trừ bệnh thán thư hiệu quả trên cây đậu nành để ứng dụng làm chất bảo vệ cây trồng nguồn gốc sinh học, phục vụ phát triển nông nghiệp an toàn, bền vững.
Nội dung chính của luận án Nghiên cứu chế tạo oligochitosan (OC) có khối lượng phân tử (KLPT) từ 2 − 8 kDa bằng phương pháp chiếu xạ gamma Co60 kết hợp với sử dụng tác nhân oxi hóa H2O2 nồng độ thấp và xác định các đặc trưng tính chất của OC. Nghiên cứu chế tạo phức OC-Zn2+ và xác định đặc trưng tính chất của phức. Nghiên cứu hiệu lực kháng nấm Colletotrichum truncatum của phức OC-Zn2+ trong điều kiện phòng thí nghiệm (in vitro). Nghiên cứu hiệu ứng kích tạo enzyme chitinase và các chỉ tiêu tăng trưởng của cây đậu nành được xử lý với phức OC-Zn2+ và gây nhiễm nấm C.
truncatum gây bệnh thán thư trong thí nghiệm nhà kính. Đánh giá hiệu quả phòng trừ bệnh và hiệu lực nông học của phức OC-Zn2+ đối với cây đậu nành trên thí nghiệm đồng ruộng. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3. Ý nghĩa khoa học Luận án đóng góp dữ liệu khoa học đối với phương pháp điều chỉnh giảm KLPT chitosan bằng chiếu xạ gamma Co60 kết hợp với H2O2.
Sự kết hợp giữa hai tác nhân đã làm giảm liều xạ, tạo ra OC có KLPT thấp nhưng không làm thay đổi đáng kể cấu trúc hóa học so với chitosan ban đầu. Đã xác định được hiệu suất cắt mạch (Gs) đối với các dung dịch: chitosan 4%, chitosan 4% + 0,5% H2O2, và chitosan 2% + 0,5% H2O2 tương ứng là 0,40; 0,67; và 0,74 µmol/J. Đã chế tạo thành công dung dịch phức OC-Zn2+ với tỷ lệ mol −NH2/Zn2+ là 1/0,25; 1/0,5; 1/1 và khảo sát các tính chất đặc trưng của phức. Đã thiết lập mô hình cấu trúc liên kết phối trí giữa OC với Zn2+ chủ yếu theo dạng cầu nối, dạng phức có độ ổn định tốt hơn so với cấu trúc dạng treo.
Kết quả nghiên cứu hiệu lực sinh học của phức OC-Zn2+ cho thấy phức thể hiện lực kháng nấm C. truncatum và hiệu ứng kích tạo enzyme chitinase trên cây đậu nành theo kiểu tác động đồng vận giữa OC và Zn2+. Phức OC-Zn2+ làm giảm tỷ lệ và chỉ số bệnh thán thư trên đậu nành, và tăng năng suất đậu nành đạt 19,2% so với đối chứng và cao hơn so với OC (11,9%). Ý nghĩa thực tiễn Kết quả của luận án là cơ sở để xây dựng quy trình sản xuất OC và phức OC- Zn2+ với OC có KLPT và tỷ lệ mol −NH2/Zn2+ khác nhau bằng phương pháp chiếu xạ gamma Co60 kết hợp H2O2 nồng độ thấp nhằm giảm liều xạ và giảm giá thành sản phẩm, đồng thời có thể triển khai sản xuất quy mô lớn trên máy chiếu xạ công nghiệp.
Sản phẩm OC và phức OC-Zn2+ tạo ra từ kết quả của luận án ngoài mục đích ứng dụng kiểm soát bệnh hại thực vật để thay thế thuốc bảo vệ thực vật độc hại, mà còn có tiềm năng ứng dụng trong thức ăn chăn nuôi, thực phẩm và dược phẩm,. Những đóng góp mới của luận án 1. Đã chế tạo thành công phức OC-Zn2+ với tỷ lệ phần mol (−NH2/Zn2+) và OC KLPT khác nhau và đã xác định một số đặc trưng tính chất của phức OC-Zn2+. Phức OC- Zn2+ từ OC 5,1 kDa, tỷ lệ phần mol 1/0,5 có cấu trúc phức chủ yếu là dạng cầu nối ổn định đạt hơn 92% lượng Zn2+ liên kết phối trí với OC.
Đã đánh giá phức OC-Zn2+ có hiệu quả phòng trừ nấm Colletotrichum truncatum gây bệnh thán thư, cải thiện chỉ tiêu sinh trưởng và gia tăng năng suất đối với cây đậu nành. Đã chứng minh được hiệu quả phòng trừ nấm bệnh của phức phụ thuộc vào KLPT OC và nồng độ OC-Zn2+ sử dụng. Kết quả đạt được trong nội dung luận án góp phần làm cơ sở khoa học và ý nghĩa thực tiễn để nghiên cứu ứng dụng chế phẩm nông dược an toàn phục vụ phát triển nông nghiệp bền vững, nâng giá trị nông phẩm, và gia tăng hiệu quả kinh tế. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.
Nguồn gốc, đặc trưng cấu trúc của chitosan và oligochitosan 1. Chitosan Trong thực tiễn, chitosan thường được tách chiết ở quy mô lớn từ nguồn chitin vỏ tôm, cua, mai mực, đây là những nguồn phế phụ phẩm từ các nhà máy chế biến thủy hải sản (Hình 1. Trong tự nhiên, chitin tồn tại ở cả thực vật và động vật, là một polysaccharide có trữ lượng lớn, xếp thứ 2 sau cellulose [1].1: Nguồn nguyên liệu chế tạo chitin và chitosan [2] Chitin không tan trong nước, axít loãng, kiềm loãng và đặc, ancol, và hầu hết các dung môi hữu cơ. Chitin tan trong axít vô cơ đặc như HCl, H2SO4, H3PO4 và thường kèm theo sự giảm khối lượng phân tử.
Chitin tan trong một số dung môi hữu cơ có chứa clorua liti như: N,N-dimetylacetamid - 5% LiCl và N-etyl pyrrolydon - LiCl [3, 4]. Tuy nhiên, với đặc thù cấu trúc và dung môi hòa tan chitin làm hạn chế khả năng ứng dụng, do vậy nhiều nghiên cứu biến tính chitin đã được thực hiện. Chuyển hóa chitin thành chitosan là một trong những sản phẩm biến tính phổ biến. Chitosan là một trong những polysaccharide tự nhiên có phạm vi ứng dụng rộng rãi do có những đặc tính như không độc, có khả năng phân hủy sinh học, kháng khuẩn, kháng nấm và có tính tương hợp sinh học [3].
Chitosan là một copolymer phân hủy sinh học bao gồm các đơn vị D– glucosamine (GluN) và N–acetyl-D-glucosamine (GluNAc), là sản phẩm thu được từ quá trình deacetyl hóa tách nhóm acetyl khỏi nhóm amino ở vị trí C2 (Hình 1.2: Công thức cấu tạo của chitosan [2, 3] Chitosan là chỉ những sản phẩm deacetyl của chitin đạt hơn 50% [5]. Đơn vị cấu tạo trong phân tử chitosan là D–glucosamine (Hình 1.2a), nhưng trên thực tế mạch phân tử chitosan vẫn tồn tại nhóm acetyl, đan xen do sự deacetyl hóa chưa hoàn toàn (Hình 1. Trong phân tử chitosan, các mắt xích được liên kết với nhau như sau [4]: - Liên kết β-glycoside mỗi mắt xích lệch nhau một góc 180° tạo nên mạch xoắn - Tương tác Vander Waals (d = 0,3 – 0,6 μm) - Khi khoảng cách giữa các mắt xích quá nhỏ (0,3 µm), giữa chúng xuất hiện liên kết hydro, do tương tác giữa nhóm –OH và –NH2 trong phân tử. Chitosan có cấu trúc tinh thể về thực chất không đổi so với cấu trúc của chitin.
Ở trạng thái tự nhiên, chitosan là chất rắn, xốp nhẹ, hình vảy có thể xay nhỏ với kích thước khác nhau. Chitosan có màu trắng hoặc vàng nhạt, không mùi, không vị và có một số đặc trưng như liệt kê trên Bảng 1. Trong chitin có nhiều liên kết hydro nên chúng dễ bị phân chia nhỏ ở nhiệt độ cao. Đặc tính hóa học này làm cho chitin khó hòa tan trong nước, axít loãng, ancol, hoặc trong những dung môi hữu cơ dưới điều kiện bình thường.
Trái lại, chitosan do có nhóm –NH2 tự do, không tan trong nước nhưng tan tốt trong các dung môi hữu cơ như axít formic, axít adipic, axít acetic, axít lactic,. trong trường hợp này nhóm amin tự do bắt đầu hình thành nhóm –NH3+ [6]. Nhờ đặc tính này mà chitosan có giá trị hơn chitin cho những ứng dụng trong công nghiệp, có giá trị thương mại cao và có thể chế tạo thành nhiều dạng khác nhau như màng mỏng, sợi, bột,.1: Một số thông số đặc trưng của chitin và chitosan [4, 6] Thông số Chitin Chitosan Tên hóa học Polyacetylaminglucoza Polyaminoglucoza Công thức phân tử (C8H13NO5)n (C6H11NO4)n Khối lượng phân tử (203,21)n (161,17)n Hàm lượng nitơ lý thuyết 6,9% 8,7% Hàm lượng nitơ thực tế 6% – 7% 7% – 8,4% Khối lượng phân tử trung bình 3×105 – 5×105 1×105 – 3×105 Độ deacetyl hóa 10% – 15% > 50% Độ ẩm < 10% < 10% Hàm lượng tro < 2% < 1% Hàm lượng protein < 0,5% < 0,3% Một thông số rất quan trọng của chitosan là độ deacetyl hóa (ĐĐA%) hoặc độ acetyl hóa (ĐA% = 100 – ĐĐA%). Thực chất là sự khác nhau về hàm lượng của nhóm –NHCOCH3 và nhóm –NH2 trong chitin và chitosan [3].