Luận văn vai trò của stress sao chép trong duy trì ổn định hệ gen - Barry Dion

Dưới đây là meta tags cho bài viết "Dion thesis" theo yêu cầu: { "ai_description": "Dion thesis là một khái niệm trong lĩnh vực kinh tế học, liên quan đến

• Tác giả: Barry Dion
• Trường học: Đại học Toronto
• Chuyên ngành: Hóa sinh
• Đề tài: The Role of Replication Stress in the Maintenance of Genomic Stability
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2009
• Địa điểm: Toronto

Tóm tắt

I. Tổng quan về thuyết Dion về căng thẳng sao chép

Thuyết Dion về căng thẳng sao chép (Dion thesis) nghiên cứu vai trò của căng thẳng sao chép trong việc duy trì ổn định hệ gen. Căng thẳng sao chép xảy ra khi tiến trình sao chép DNA bị trì hoãn hoặc sụp đổ, dẫn đến đứt gãy hệ gen. Barry Dion (2009) chứng minh rằng căng thẳng này là yếu tố khởi đầu của bất ổn định hệ gen, góp phần hình thành khối u. Nghiên cứu sử dụng mô hình tiến hóa thực nghiệm để xác định vị trí dễ tổn thương, phạm vi biến đổi hệ gen và động lực sao chép dưới căng thẳng nội sinh. Kết quả cho thấy căng thẳng sao chép thúc đẩy tái tổ hợp không mong muốn, đặc biệt tại các điểm dễ vỡ. Kết luận quan trọng là căng thẳng sao chép không chỉ gây hại mà còn kích hoạt cơ chế sửa chữa tế bào.

1.1. Cơ chế sinh học của căng thẳng sao chép

Căng thẳng sao chép xảy ra khi tiến trình sao chép DNA bị chặn bởi các tổn thương sợi đơn (SSB) hoặc cấu trúc bất thường. Các yếu tố gây căng thẳng bao gồm thiếu hụt nucleotide, tổn thương oxy hóa DNA, hoặc protein liên kết DNA bất thường. Khi tiến trình sao chép bị trì hoãn, tiến trình sao chép có thể sụp đổ, dẫn đến đứt gãy hệ gen. Cơ chế sửa chữa chính là tái tổ hợp tương đồng (HR), sử dụng đoạn DNA tương đồng để phục hồi đứt gãy. HR hoạt động qua các bước: tạo sợi đơn DNA, lắp ráp nucleoprotein Rad51, tìm kiếm đoạn DNA tương đồng, và hình thành cấu trúc D-loop.

1.2. Tác động của căng thẳng sao chép đến ung thư

Căng thẳng sao chép thúc đẩy bất ổn định hệ gen bằng cách gây ra các biến đổi như khuếch đại gen, chuyển đoạn nhiễm sắc thể, hoặc mất đoạn. Những biến đổi này có thể kích hoạt oncogene hoặc vô hiệu hóa gen ức chế khối u, dẫn đến ung thư. Nghiên cứu của Dion chỉ ra rằng căng thẳng sao chép là dấu hiệu sớm của ung thư, đặc biệt trong ung thư vú, ung thư phổi, và ung thư đại trực tràng. Việc hiểu rõ cơ chế này giúp phát triển các liệu pháp nhắm trúng đích nhằm ngăn chặn tiến triển ung thư.

II. Phân tích vấn đề căng thẳng sao chép trong bất ổn định hệ gen

Căng thẳng sao chép là nguyên nhân chính gây ra bất ổn định hệ gen, đặc biệt trong tế bào ung thư. Khi tiến trình sao chép bị trì hoãn, tế bào phải đối mặt với hai nguy cơ: đứt gãy hệ gen không được sửa chữa hoặc sửa chữa sai lệch. Dion (2009) chứng minh rằng căng thẳng sao chép thúc đẩy tái tổ hợp không kiểm soát, dẫn đến các biến đổi hệ gen vĩnh viễn. Nghiên cứu sử dụng mô hình tiến hóa thực nghiệm để quan sát động lực sao chép dưới căng thẳng. Kết quả cho thấy các vị trí dễ tổn thương thường nằm gần các điểm dễ vỡ (fragile sites), nơi tiến trình sao chép dễ bị trì hoãn. Việc thiếu hụt nucleotide hoặc tổn thương DNA là nguyên nhân chính gây căng thẳng sao chép.

2.1. Điểm dễ tổn thương trong hệ gen

Các điểm dễ tổn thương là những vùng hệ gen dễ bị tổn thương do căng thẳng sao chép. Chúng thường nằm tại các vùng lặp lại, vùng nhiễm sắc thể dễ vỡ, hoặc vùng giàu A-T. Những điểm này có tiến trình sao chép chậm hơn do cấu trúc DNA bất thường hoặc sự hiện diện của các protein liên kết. Dion chỉ ra rằng các biến đổi hệ gen thường xảy ra tại những điểm này, dẫn đến mất cân bằng gen hoặc kích hoạt oncogene. Việc xác định các điểm dễ tổn thương giúp phát triển các liệu pháp nhắm trúng đích.

2.2. Ảnh hưởng của hydroxyurea HU đến căng thẳng sao chép

Hydroxyurea (HU) là chất ức chế ribonucleotide reductase, gây thiếu hụt nucleotide và tăng căng thẳng sao chép. Dion sử dụng HU trong nghiên cứu để mô phỏng căng thẳng sao chép nội sinh. Kết quả cho thấy các đột biến nhạy cảm với HU có thể dẫn đến bất ổn định hệ gen nghiêm trọng. Những đột biến này thường liên quan đến các gen tham gia vào sửa chữa DNA hoặc ổn định tiến trình sao chép. Việc xác định các đột biến này giúp hiểu rõ hơn về cơ chế bảo vệ hệ gen khỏi căng thẳng sao chép.

III. Giải pháp và phương pháp nghiên cứu căng thẳng sao chép

Nghiên cứu của Dion sử dụng hai phương pháp độc lập để phân tích căng thẳng sao chép. Phương pháp đầu tiên là tiến hóa thực nghiệm, quan sát động lực sao chép dưới căng thẳng nội sinh. Phương pháp thứ hai là sàng lọc các đột biến nhạy cảm với HU để xác định các gen liên quan đến ổn định tiến trình sao chép. Kết quả cho thấy các đột biến nhạy cảm với HU có thể dẫn đến bất ổn định hệ gen nghiêm trọng. Dion đề xuất cải tiến mô hình tiến hóa thực nghiệm để tăng cường áp lực chọn lọc, từ đó phát hiện các biến đổi hệ gen hiếm gặp. Phương pháp này có thể áp dụng trong nghiên cứu ung thư và phát triển liệu pháp điều trị.

3.1. Phương pháp tiến hóa thực nghiệm

Phương pháp tiến hóa thực nghiệm được sử dụng để quan sát động lực sao chép dưới căng thẳng nội sinh. Dion nuôi cấy tế bào trong điều kiện thiếu hụt nucleotide hoặc tổn thương DNA, sau đó quan sát các biến đổi hệ gen xảy ra. Kết quả cho thấy các vị trí dễ tổn thương thường nằm gần các điểm dễ vỡ. Phương pháp này giúp xác định các vị trí dễ tổn thương và động lực sao chép dưới căng thẳng. Dion đề xuất cải tiến mô hình bằng cách tăng áp lực chọn lọc để phát hiện các biến đổi hệ gen hiếm gặp.

3.2. Sàng lọc đột biến nhạy cảm với HU

Dion sử dụng phương pháp sàng lọc để xác định các đột biến nhạy cảm với HU, một chất gây căng thẳng sao chép. Kết quả cho thấy các đột biến này thường liên quan đến các gen tham gia vào sửa chữa DNA hoặc ổn định tiến trình sao chép. Những đột biến này có thể được nghiên cứu sâu hơn để hiểu rõ vai trò của chúng trong bảo vệ hệ gen. Phương pháp này giúp phát hiện các gen mới liên quan đến ổn định hệ gen, từ đó phát triển các liệu pháp điều trị ung thư.

IV. Kết luận và ứng dụng của thuyết Dion

Thuyết Dion về căng thẳng sao chép cung cấp cái nhìn sâu sắc về cơ chế gây ra bất ổn định hệ gen, đặc biệt trong ung thư. Dion chứng minh rằng căng thẳng sao chép là yếu tố khởi đầu của các biến đổi hệ gen, dẫn đến ung thư. Nghiên cứu đề xuất hai phương pháp quan trọng: tiến hóa thực nghiệm và sàng lọc đột biến nhạy cảm với HU. Những phương pháp này giúp xác định các vị trí dễ tổn thương và các gen liên quan đến ổn định hệ gen. Kết quả nghiên cứu có thể ứng dụng trong phát triển liệu pháp điều trị ung thư, đặc biệt trong nhắm trúng đích các gen liên quan đến căng thẳng sao chép.

4.1. Tầm quan trọng trong nghiên cứu ung thư

Thuyết Dion cung cấp cơ sở khoa học để hiểu rõ hơn về cơ chế gây ung thư do căng thẳng sao chép. Những phát hiện này giúp phát triển các liệu pháp nhắm trúng đích nhằm ngăn chặn tiến triển ung thư. Dion đề xuất rằng việc ngăn chặn căng thẳng sao chép có thể là chiến lược điều trị ung thư hiệu quả. Những nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc phát triển các chất ức chế căng thẳng sao chép, từ đó ngăn chặn sự hình thành khối u.

4.2. Hướng nghiên cứu tương lai

Nghiên cứu của Dion mở ra nhiều hướng nghiên cứu mới về căng thẳng sao chép và bất ổn định hệ gen. Những đột biến nhạy cảm với HU có thể được nghiên cứu sâu hơn để hiểu rõ vai trò của chúng trong bảo vệ hệ gen. Phương pháp tiến hóa thực nghiệm cũng có thể được cải tiến để phát hiện các biến đổi hệ gen hiếm gặp. Những nghiên cứu này có thể dẫn đến phát triển các liệu pháp điều trị ung thư mới, nhắm trúng đích các gen liên quan đến căng thẳng sao chép.

Trích đoạn nội dung tài liệu

THE ROLE OF REPLICATION STRESS IN THE MAINTENANCE OF GENOMIC STABILITY by Barry Dion A thesis submitted in conformity with the requirements for the degree of Master of Science Graduate Department of Biochemistry University of Toronto © Copyright by Barry Dion (2009) ii Title. The Role of Replication Stress in the Maintenance of Genomic Stability Master of Science, 2008. Department of Biochemistry, University of Toronto. Abstract Faithful transmission of the genome from one generation to the next is essential for the viability of cells.

In humans, loss of genomic stability can result in genomic aberrations such as amplifications, translocations, and deletions that may activate oncogenes or deactivate tumour suppressors, ultimately leading to tumourigenesis. Therefore our understanding of the mechanisms that protect the genome is essential to our understanding of cancer. Early manifestation of genomic instability is often associated with DNA replication stress, often caused by replication fork stalling and collapse. This thesis describes two independent modes of study to further elucidate genomic instability under replication stress.

First, I have investigated genomic instability during experimental evolutions to identify the properties of damage susceptible sites, define the range of genome alterations and examine the dynamics of replication through these sites as a result of endogenous replication stress. While I identified a number of novel rearrangements that occur near fragile sites it was clear that the frequency of rearrangements was not high enough and the selection pressure was not strong. Lessons from this study have provided a number of ideas for modifications to my experimental set-up. In a second, independent study I performed a screen to detect sensitivity to HU, an agent which induces replication stress, to identify mutants that are sensitive to transient HU exposure.

Sensitivity was independently confirmed and mutants that were not reported in past chronic HU screens were identified. These mutants can be followed up in the future to identify their role in replication fork stabilization and ultimately in genome maintenance. iii Acknowledgement Mom: For your continued support, our numerous conversations and your willingness to listen to me vent I thank you. I would not have been able to do any of this without you.

Thank you for believing in me even when I didn’t believe in myself. Family: Thank you to my entire family for your love, support and constant reassurance of my true abilities. For those in my family who passed during the pursuit of my degree, Dad, Nanny, Papa, Uncle John and Uncle Gary I want to especially thank you for your love and the perspective you have given me about my own life. Friends: Thank you to all my friends who have always been right there to make sure I didn’t forget to have fun during my seemingly endless pursuit of a higher education.

I will always remember the good times. For some of you, and you know who you are, thank you for listening to my neurotic rantings and talking me off an endless number of ledges. Your patience astounds me. Brown Lab: It was a blast; I couldn’t have picked a better group of colleagues to work with.

Your passion for science is only surpassed by your wealth of knowledge. I have learned so much from all of you. Your willingness to lend your advice and a hand, or two, means the world. Marty, thank for the many hours spent correcting, what some may call, catastrophic typing skills.

Jiongwen, seriously, stop reading my mind, it seemed that you were always two steps ahead of me. Thanks for all your help, no matter how much we gave you, you always had it under control. Johnny, the new recruit, thanks for listening to whatever random thought I had in my head at the time and rolling with the punches. If you apply this method to being a father, you will certainly be the greatest.

Jessica, you give a whole new meaning to Tim Horton’s fanaticism. Thank you for the amusement and your willingness to help me out. Jay, thanks for providing the humour in the lab. For the rest, past and present, THANK YOU! Committee Members: Angus and Corey, thank you for your amazing guidance throughout my degree.

I couldn’t have got to this point without your positive support. Maitreya Dunham: Thank you for all your hard work with the cheomstat experiments and all your advice, which has undoubtedly been essential for the completion or my degree. Grant: The supervisor, the mentor, the music lover, the beer provider. Thank you for all your support Grant.

What more could I have asked for in supervisor? You were always there for drop in meetings; you provided guidance and positive reinforcement. To top it all off there was always an abundance of Death Cab for Cutie, beer and free lunches. Thank you for believing in me. With all my gratitude, B.

iv Table of Contents ABSTRACT. II TABLE OF CONTENTS. IV LIST OF FIGURES. VII LIST OF TABLES.

VIII LIST OF ABBREVIATIONS .2 The Cell Cycle .3 DNA Damage and Replication Checkpoints .3 Checkpoint Signal Cascade .5 Rad9 and Mrc1 .5 Replication Fork Stalling, Collapse and Restart .10 Replication Fork Restart.12 Post-Replication Repair.14 Single-Strand Annealing .17 Mechanisms for Replication Fork Restart without chromosome breakage .17 Non-Homologous End-Joining .18 Break-Induced Replication .23 DNA Repeats and Secondary Structures.24 Replication Fork Barriers.25 Replication Slow Zones.26 Transfer RNA Genes .8 Copy Number Variations .9 Comparative Genome Hybridization .11 Rationale and Hypothesis for Thesis.38 MATERIALS AND METHODS .1 High resolution mapping of genome rearrangements during experimental evolutions in the presence of DNA replication stress.38 v Yeast Strains and Media .40 Comparitive Genome Hybridization.40 Genomic DNA Isolation.41 Whole Genome Amplification .41 Genomic DNA Fragmentation and Labeling.2 Identification of mutants sensitive to transient exposure to hydroxyurea .44 Yeast Stains and Media.44 Transient HU Screen.44 Growth and HU Treatment .45 DNA Extraction, Barcode Amplification, Array Hybridization and Data Analysis .46 Chronic HU Sensitivity.53 HIGH RESOLUTION MAPPING OF GENOME REARRANGMENTS DURING EXPERIMENTAL EVOLUTION IN THE PRESENCE OF DNA REPLICATION STRESS.54 csm3∆ evolution demonstrated CNVs consistent with a sulphur limited wild-type evolution.54 mec1∆ evolution revealed a novel one-copy deletion on chromosome XV .57 mad2∆ evolution revealed a novel CNVs on chromosome II .3 While Genome Amplification.2 Chromosome XIV Deletion .3 Novel Copy Number Variations .71 Copy number variations in mad2∆ .71 mec1∆ evolutions revealed a novel-one copy deletion on chromosome XV.75 Novel CNVs detected in both population and clone samples of a mec1∆tel1∆ batch evolutions .5 Whole Genome Amplification.6 Contributing Factors to Genomic Instability and Rearrangements.78 Genomic rearrangements detected in the haploid mec1∆tel1∆ mutant.82 Increasing the frequency of rearrangements .82 Is there an increase in the rate at which the SUL1 amplification arises in mutants with genomic instability phenotype? .82 Confirmation of the proposed structure of chromosome II in the mad2∆ evolution .83 Is the chromosome XV breakpoint susceptible to DNA breaks? .86 IDENTIFICATION OF MUTANTS SENSITIVE TO TRANSIENT EXPOSURE TO HYDROXYUREA………………………………………………………………………….……………………86 Mutants sensitive to transient HU are enriched for genes involved in DNA repair .89 Individual growth curves confirm sensitivity to transient HU exposure .91 Mutants sensitive to transient HU were variably sensitive to long-term exposure .95 Mutants sensitive to transient HU are enriched for genes involved in DNA repair .95 Individual growth curves confirm sensitivity to transient HU exposure .97 Mutants sensitive to transient HU were variably sensitive to long-term exposure .101 Do the gene deletions mutants have an S-phase progression defect? .101 Are these genes involved in stabilization of replication machinery? .102 APPENDIX A: SUPPLEMENTARY INFORMATION.116 vii List of Figures Figure 1.1 Schematic of the DNA damage and replication checkpoint.2 HR models for double-strand break repair .3 Schematic of non-homologous end-joining.4 Alternative mechanisms of break-induced replication .5 Comparative genome hybridization.6 Methods of experimental evolution.1 CNVs detected during the evolution of csm3∆.2 Novel deletion detected on the right arm chromosome XV .3 Novel CNVs detected in the mad2∆ evolution.4 Whole genome profile of a batch growth mec1∆sml1∆ mutant.5 Batch evolutions of haploid mec1∆tel1∆ mutants revealed novel CNVs in both population and clone samples .6 WGA can be used with CGH to overcome limitations in DNA quantity.7 Breakpoint analysis of multiple evolutions can provide insight into the mode or reason for a particular genomic rearrangement .8 Proposed mechanism accounting for the rearrangements seen in the mad2∆ chemostat evolution by B/F/B .9 Breakpoint of a novel deletion on chromosome XV in a mecl1∆sml1∆ chemostat evolution has sequence similarity to the ARS consensus sequence .10 Contributing factors to genomic instability and rearrangements .1 Description of the transient HU screen .2 Transient HU screen identified a number of mutants sensitive to transient HU .3 Confirmed sensitivity to transient HU using individual growth curves .4 Mutants sensitive to transient HU were variably sensitive to chronic HU.1 Plate I growth curves for the confirmation of mutants sensitive to transient HU .2 Plate II growth curves for the confirmation of mutants sensitive to transient HU.111 ix List of Tables Table 2.2: Oligonucleotides used for polymerase chain reactions .1: Table of mutants evolved by chemostatic growth and CNVs detected .1 List of mutants confirmed for transient HU sensitivity with individual growth curve scores, chronic HU scores, novelty and indication of detected sensitivity in previous chronic HU screens .2: Table of mutants evolved by batch growth and CNVs detected .1 Functional summaries of the mutants used in the evolution experiments .2 Raw data for all the sensitive mutants identified in each of the four transient HU screens.3 List of all mutants tested for transient HU sensitivity by growth curve analysis with individual scores and corresponding location on each plate. 5-fluoroorotic acid ACS.ARS consensus sequence ARS. autonomously replicating sequence ATR .ataxia-telangiectasia mutated and Rad53 related B/F/B.bridge/fusion/bridge BER.base excision repair BIR.break-induced replication CDK .cyclin-dependent kinase CGH .comparative genome hybridization ChIP .chromatin immunopreciptation CNV. copy number variation (d)HJ .(double) Holliday junction DNA.

deoxyribonucleic acid DNase.deoxyribonucleoside diphosphate dNTP. deoxyribonucleoside triphosphate DSB. double-strand DNA break DSBR. double-strand-break repair dsDNA .double-strand DNA DTR.

direct tandem repeats Hph.homologous recombination HU. integrated genome browser IR. inverted repeats Kan. long terminal repeat MCM.

mini-chromosome maintenance MMR.mismatch repair MR .mirror repeat Nat. nucleoside diphosphate NHEJ. non-homologous end-joining OD. optical density ORC.

origin recognition complex PCNA. proliferating cell nuclear antigen PFGE. pulsed-field gel electrophoresis PIKK .phosphatidylinositol 3-kinase-like kinase pre-RC. pre-replication complex PRR.

post-replication repair rDNA.ribosomal DNA RFB. replication fork barrier RFC. replication factor C RNA .ribonucleic acid RNR. ribonucleotide reductase RPA.

replication protein A RSZ .replication slow zones xi SCE. sister-chromatid exchange SDSA. synthesis-dependent strand-annealing SSA .single strand annealing ssDNA. single-strand DNA TAS.

tiling analysis software TLS .translesion DNA synthesis TNR. trinucleotide repeats tRNA .transfer RNA UV.whole genome amplification CHAPTER 1 Introduction 1.1 Saccharomyces cerevisiae Saccharomcyces cerevisiae, a budding yeast, is a useful model for higher eukaryotic organisms and plays a vital role in modern day research. Given that approximately 30% of proteins associated with known human diseases have orthologues in budding yeast, S. cerevisiae is an excellent model for the study of human disease (Foury, 1997).

The conservation of many of the processes observed in higher eukaryotes, such as replication, DNA damage and replication checkpoints and cell cycle control also establishes the usefulness of yeast in the study of human disease (Johnson and O'Donnell, 2005; Lee and Nurse, 1987; Perego et al., 2000; Zhou and Elledge, 2000). Additionally, it has been shown that 42% of yeast genes that cause chromosome instability are conserved in humans, demonstrating the importance of yeast in the study of genomic instability and ultimately cancer (Yuen et al. The prevalence of budding yeast in research today can also be attributed to the low cost at which experimental procedures can be completed, paired with its relatively quick doubling time (Botstein and Fink, 1988). Genetic manipulations, such as whole gene deletions, can be made easily and precisely through insertion of DNA fragments into the yeast genome by homologous recombination (Menacho-Marquez and Murguia, 2007).

Moreover, the large number of genetic tools available, such as the yeast deletion collection (Giaever et al.