Tối Ưu Hóa Môi Trường Nuôi Cấy Vi Khuẩn Phân Giải Lân

Khóa luận trình bày quy trình sàng lọc và tối ưu hóa môi trường nuôi cấy lỏng cho vi khuẩn phân giải lân, góp phần vào công nghệ sinh học.

• Tác giả: Nguyễn Thành Lễ
• Người hướng dẫn: ThS. Nguyễn Thị Thùy Dương
• Trường học: Trường Đại học Nông Lâm
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Tối Ưu Hóa Môi Trường Nuôi Cấy Vi Khuẩn Phân Giải Lân
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN
• TÓM TẮT
• ABSTRACT
• 1. CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1.1. Các nguyên tố đa lượng góp phần chính vào sự phát triển của thực vật, trong đó có photpho
• 1.2. Vai trò của photpho (P) trong cơ thể thực vật
• 1.3. Việc xác định chủng vi khuẩn có khả năng phân giải lân cao và kết hợp nghiên cứu thành phần môi trường nhân nuôi tạo sinh khối phục vụ cho việc sản xuất chế phẩm
• 1.4. Mục tiêu của đề tài
• 1.5. Nội dung đề tài
• 2. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Tổng quan về photpho trong đất
• 2.2. Ảnh hưởng của photpho đối với sinh trưởng và phát triển của cây trồng
• 2.3. Nguồn dinh dưỡng cho cây trồng từ phosphate
• 2.4. Sự tồn tại của phosphate trong đất
• 2.5. Phosphate hữu cơ trong đất
• 2.6. Phosphate vô cơ
• 2.7. Vai trò của vi sinh vật phân giải phosphate khó tan
• 2.8. Vi sinh vật phân giải phosphate khó tan
• 2.9. Cơ chế phân giải lân của vi sinh vật
• 2.10. Axit hữu cơ được tạo ra bởi vi sinh vật phân giải phosphate
• 2.11. Hiệu quả của phân vi sinh vật phân giải phosphate
• 3. CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 3.2. Môi trường - hóa chất được sử dụng
• 3.3. Thiết bị và dụng cụ
• 3.4. Phương pháp nghiên cứu
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 4.1. Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng phân giải lân cao
• 4.2. Định danh chủng vi khuẩn có khả năng phân giải lân
• 4.3. Định danh sinh học phân tử chủng vi khuẩn có khả năng phân giải lân
• 4.4. Tối ưu hóa thành phần môi trường nuôi cấy thu sinh khối vi khuẩn
• 4.5. Sàng lọc các yếu tố có ý nghĩa bằng ma trận Plackett — Burman
• 4.6. Tối ưu hóa thành phần môi trường nuôi cấy thu sinh khối vi khuẩn
• 4.7. Kiểm tra thực nghiệm
• 4.8. Thảo luận
• DANH SÁCH BẢNG
• DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
• DANH SÁCH HÌNH

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Tối Ưu Hóa Môi Trường Nuôi Cấy Vi Khuẩn Phân Giải Lân

Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy vi khuẩn phân giải lân là một trong những nghiên cứu quan trọng trong lĩnh vực công nghệ sinh học. Việc sử dụng vi khuẩn có khả năng phân giải lân giúp cải thiện chất lượng đất và tăng năng suất cây trồng. Nghiên cứu này không chỉ giúp tìm ra các chủng vi khuẩn hiệu quả mà còn xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy.

1.1. Khái Niệm Về Vi Khuẩn Phân Giải Lân

Vi khuẩn phân giải lân là những vi sinh vật có khả năng chuyển hóa lân khó tan thành dạng dễ tiêu cho cây trồng. Chúng đóng vai trò quan trọng trong việc cung cấp lân cho cây, giúp cải thiện sự sinh trưởng và phát triển.

1.2. Tầm Quan Trọng Của Tối Ưu Hóa Môi Trường

Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy giúp tăng cường khả năng sinh trưởng của vi khuẩn, từ đó nâng cao hiệu quả phân giải lân. Điều này không chỉ giúp tiết kiệm chi phí mà còn bảo vệ môi trường.

II. Vấn Đề Trong Việc Nuôi Cấy Vi Khuẩn Phân Giải Lân

Mặc dù có nhiều lợi ích, việc nuôi cấy vi khuẩn phân giải lân vẫn gặp phải nhiều thách thức. Các yếu tố như điều kiện môi trường, nguồn dinh dưỡng và sự cạnh tranh giữa các vi sinh vật có thể ảnh hưởng đến hiệu quả phân giải lân.

2.1. Các Yếu Tố Ảnh Hưởng Đến Quá Trình Nuôi Cấy

Nhiệt độ, pH, và nồng độ các chất dinh dưỡng là những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn. Việc kiểm soát các yếu tố này là cần thiết để đạt được kết quả tối ưu.

2.2. Sự Cạnh Tranh Giữa Các Vi Sinh Vật

Trong môi trường nuôi cấy, sự cạnh tranh giữa các vi sinh vật có thể làm giảm hiệu quả phân giải lân. Cần có các biện pháp để tối ưu hóa sự phát triển của vi khuẩn phân giải lân.

III. Phương Pháp Tối Ưu Hóa Môi Trường Nuôi Cấy Vi Khuẩn

Có nhiều phương pháp để tối ưu hóa môi trường nuôi cấy vi khuẩn phân giải lân. Các phương pháp này bao gồm việc điều chỉnh thành phần dinh dưỡng, sử dụng thiết kế thí nghiệm và áp dụng các công nghệ sinh học hiện đại.

3.1. Thiết Kế Thí Nghiệm Plackett Burman

Thiết kế Plackett-Burman giúp xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy một cách hiệu quả. Phương pháp này cho phép tối ưu hóa nhanh chóng và tiết kiệm chi phí.

3.2. Tối Ưu Hóa Thành Phần Môi Trường

Việc tối ưu hóa thành phần môi trường nuôi cấy như nguồn carbon, nitơ và khoáng chất là rất quan trọng. Các nghiên cứu cho thấy rằng sự kết hợp hợp lý giữa các thành phần này có thể nâng cao mật độ sinh khối vi khuẩn.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Vi Khuẩn Phân Giải Lân

Vi khuẩn phân giải lân không chỉ có ứng dụng trong nông nghiệp mà còn trong bảo vệ môi trường. Việc sử dụng vi khuẩn này giúp giảm thiểu việc sử dụng phân bón hóa học, từ đó bảo vệ sức khỏe đất và cây trồng.

4.1. Tăng Cường Năng Suất Cây Trồng

Sử dụng vi khuẩn phân giải lân giúp cây trồng hấp thu lân hiệu quả hơn, từ đó tăng năng suất và chất lượng nông sản. Nghiên cứu cho thấy rằng việc áp dụng vi khuẩn này có thể thay thế một phần đáng kể phân bón hóa học.

4.2. Bảo Vệ Môi Trường

Việc sử dụng vi khuẩn phân giải lân giúp giảm thiểu ô nhiễm từ phân bón hóa học. Điều này không chỉ bảo vệ sức khỏe đất mà còn bảo vệ hệ sinh thái xung quanh.

V. Kết Luận Về Tối Ưu Hóa Môi Trường Nuôi Cấy Vi Khuẩn

Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy vi khuẩn phân giải lân là một lĩnh vực nghiên cứu quan trọng với nhiều tiềm năng ứng dụng. Việc phát triển các phương pháp tối ưu hóa hiệu quả sẽ góp phần nâng cao năng suất cây trồng và bảo vệ môi trường.

5.1. Tương Lai Của Nghiên Cứu

Nghiên cứu về vi khuẩn phân giải lân sẽ tiếp tục phát triển, với nhiều ứng dụng mới trong nông nghiệp và công nghệ sinh học. Các nghiên cứu sâu hơn sẽ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế hoạt động của vi khuẩn này.

5.2. Khuyến Khích Ứng Dụng Trong Nông Nghiệp

Khuyến khích nông dân áp dụng vi khuẩn phân giải lân trong canh tác sẽ giúp cải thiện năng suất và chất lượng nông sản. Điều này cũng góp phần bảo vệ môi trường và phát triển bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC KHÓA LUẬN TOT NGHIỆP SÀNG LOC VA TOI UU HÓA MOI TRƯỜNG NUÔI CAY LONG CHUNG VI KHUAN CÓ KHẢ NANG PHAN GIẢI LAN Ngành hoc : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh vién thuc hién : NGUYÊN THÀNH LẺ Mã số sinh viên : 19126083 Niên khóa : 2019 - 2023 TP. Thủ Đức, 08/2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP SÀNG LOC VA TOI UU HÓA MOI TRƯỜNG NUÔI CAY LONG CHUNG VI KHUAN CO KHA NANG PHAN GIAI LAN Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện ThS. NGUYEN THỊ THUY DUONG NGUYEN THANH LE LỜI CẢM ƠN Sau khi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp, em xin chân thành cảm ơn đến sâu sắc đến ThS. Nguyễn Thị Thùy Dương tại Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ, hỗ trợ tận tình và truyền đạt kinh nghiệm giúp em có thể thực hiện đề tài một cách tốt nhất.

Cảm ơn các anh chị và các bạn thuộc phòng Vi sinh — Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ, hỗ trợ, an ủi và chia sẻ những khó khăn dé em thực hiện đề tài, đạt kết quả như mong muốn. Xin cảm ơn thay, cô đã giảng day và truyền đạt cho em những kiến thức vô cùng quý báu đề hoàn thành tốt quá trình học tập làm nền tảng trong nghiên cứu và chuẩn bị cho công việc sau này. Xin cảm ơn Ban Giám hiệu, Khoa Khoa học sinh học, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi nhất dé em hoàn thành tốt đề tải một cách chính xác và mang tính khoa học. Cảm ơn tập thé lớp DH19SM đã cùng nhau chia sẻ những khó khăn, cùng nhau trao đôi, học tập trong suốt 4 năm tại trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.

Con xin cảm ơn bố mẹ đã sinh thành, nuôi nắng, yêu thương, dạy dỗ, là chỗ dựa vững chắc, động viên va ủng hộ con rat nhiêu trong suôt 4 năm học vừa qua. XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN Tôi tên Nguyễn Thành Lễ, MSSV: 19126083, Lớp: DH19SM thuộc khoa Khoa học Sinh học Trường Đại học Nông Lâm. Tôi xin cam đoan đề tài “Sang lọc và tối ưu hóa môi trường nuôi cấy lỏng chủng vi khuẩn có khả năng phân giải lân” được tiễn hành công khai, minh bach, dựa trên sự cố gắng, nỗ lực của ban thân dưới sự hướng dẫn nhiệt tình, khoa học của ThS. Nguyễn Thị Thùy Dương cùng với sự giúp đỡ không nhỏ từ anh chị, các bạn thuộc phòng VI sinh — Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh.

Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong đề tài là trung thực va hoàn toàn không sao chép hoặc sử dụng kết quả của đề nghiên cứu nào tương tự. Nếu phát hiện có sự sao chép kết quả nghiên cứu của đề tài khác, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm. Thành phó Hồ Chi Minh, tháng 7 năm 2023 Nguyễn Thành Lễ ll TÓM TẮT Việc cung cấp nguồn lân đễ tan cho thực vật nhằm thay thế nguồn lân trong các loại phân bón hóa học nhưng vẫn đảm bảo được chất lượng nông sản và sức khỏe cây trồng là van dé quan trọng hiện nay. Sử dụng các loại vi sinh vật phân giải lân có sẵn trong đất là phương pháp đang được hướng tới, vì phương pháp này đáp ứng được xu hướng bảo vệ môi trường của thế giới hiện nay.

Nghiên cứu này được thực hiện nhằm tìm ra loài vi khuẩn có khả năng phân giải lân tốt và xác định thành phan môi trường nuôi cấy rẻ tiền cho mật độ cao. Kết quả khảo sát khả năng phân giải lân của các chủng vi khuẩn trên môi trường PVK cho thấy chủng H15 có vòng phân giải lân sau 4 ngày cao nhất đạt là 1,14+0,11 mm và sau 14 ngày là 1,27+0,06 mm. Kết quả định danh vùng 16S RNA cho thấy chủng H15 thuộc loài Sporosarcina luteola với độ tương đồng 97,89%. Sau đó tiễn hành tối ưu hóa môi trường nuôi cấy lỏng chủng H15 với các yếu tố bao gồm nguồn cacbon, nitơ, các nguồn khoáng được chọn và sang lọc bằng thiết kế Plackett — Burman và Full Factorial Design với ham mục tiêu là sinh khối chủng vi khuẩn H15.

Kết quả cho thấy, có 5 yêu tố ảnh hưởng chính đến mật độ sinh khối chủng H15 là glucose, (NH4)2SOx4, NaCl, MgSOx, KzHPO¿. Thành phan môi trường nuôi cấy lỏng tối ưu gồm glucose 30 g/L, (NH¿)2SO¿ 5 g/L, NaCl 15 g/L, MgSO¿ 5 g/L, KaHPO¿ 1,25 g/L với giá tiền là 8,460 đồng/L. Từ khóa: Sporosarcina luteola, vi khuẩn phân giải lân, tối ưu hóa, Plackett — Burman, Full Factorial Design ll ABSTRACT The provision of readily soluble phosphate sources for plants to replace phosphorus in chemical fertilizers while ensuring the quality of agricultural products and plant health is currently an important issue. Using of naturally occurring phosphate- solubilizing microorganisms in the soil is a method that is gradually being pursued, as it aligns with the global trend of environmental protection.

This study was conducted to identify the baterial species with good phosphate-solubilizing ability and determine the optimal culture medium for high-density and cost-effective cultivation. The ability of bacterial strains isolated from the PVK environment to solubilize phosphate was investigated. The results showed that strain H15 had the highest phosphate-solubilizing ability after 4 days reached 1,142°+0,11 mm and after 14 days reached 1,272+0,06 mm. Identification of the 16S RNA region revealed that strain H15 belongs to the species Sporosarcina luteola with 97,89% similarity.

Subsequently, the liquid culture medium for strain H15 was optimized for high biomass density with factors including carbon source, nitrogen source, and selected mineral sources were screened and optimized using Plackett-Burman and Full Factorial Design designs with the goal of maximizing the biomass yield. The results indicated that five main factors influenced the biomass density of strain H15: glucose, (NH4)2SO4, NaCl, MgSOu, and K2HPO,. The optimized composition of the liquid culture medium included glucose 30 g/L, (NH4)2SO4 5 g/L, NaCl 15 g/L, MgSOà 5 g/L, and K2HPOs, 1.25 g/L at a cost of 8,460 VND/L. Keywords: Sporosarcina luteola, phosphate-solubilizing bacteria, optimization, Plackett — Burman, Full Factorial Design IV MỤC LỤC Trang LOI CAM 0.

i XÁC NHAN VA CAM ĐOAN. ii THỈNH Tế mangongtnipbuitntttdiNg0SL09)/-NAGIGS0UX0GE825NG10100000000105100:9054001008/808501009080/0. 1V [VD] 0G eee ee eee ee eee V [AE KếCHi EEÍ TIẾT TTE maugnbnergtttbbrtitiinoestobposrilgtiotdsgtrbogtlfotrisciSiG301 ni vii DANH SÁCH BẢNG. re viii DANH SACED TÌNH,.cmpdhggrrmTogtipCơggg/7 45-272 004020 0071400 ix Se See ae 1 1.

Đặt vấn AG aes eeccceeeeccssseeccssseeeessnescessneecessneccsssneseessnesessnneccessneceesnesessnseseanneeeesneeesenees | I0 i00 G6 tai 8n. | OR EÍT suaeagtenoirtipegtpoteeogidoonsuostosstoVfcspsgtigssuiyltyrssiolzrassbgfosasiEtegpndesee | CHƯƠNG 2. TONG QUAN TÀI LIEU .--2- 22 5222222EE22EE2EE+2EE2EE2EE22EE2EEzzEzzrxee 3 2. Tổng quan về photpho trong đất.

Ảnh hưởng của photpho đối với sinh trưởng và phát triển của cây trồng. Nguồn dinh dưỡng cho cây trồng từ phosphate. Sự tồn tại của phosphate trong đất. Phosphate hữu cơ trong đất.3H54G3338835580143SESQISQSãSUXSS883430300:38860t4gg10g0g0.

Vai trò của vi sinh vat phân giải phosphate khó tan. Vi sinh vật phân giải phosphate khó tan. Cơ chế phân giải lân của vi sinh vật. Hiệu quả của phan vi sinh vật phân giải phosphate.

Ung dung vi sinh vật phân giải phosphate.----- 2 252 ©222222222E2Ez2zzzzz2zz>z2 7 "N0 on eễảẻ:. Ung dung vi sinh vật phân giải phosphate ở Việt Nam .---------- 7 CHƯƠNG $%, VAT LIEU VÀ PFHHWONO TH osccmsemuncnnsrcnuenunncsaevinsennocnnd 9 3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu.---- 2-2 ©22+22++2E++EE++EE+2EE+2EE++rErzrxezrrrr 9 Bis, WA HCU 116 WISTS Us sesccinasssavsissmtaca sem nhất ga. 9 322-14 Wat HIẾN sec gu tt th ö D0 9 PEERGEOIESPEIBEHIEEORNELEHSSHĐGEEDDAEGG SE SEEESIERSHGSBSq-Et2SNsiaesd 9 3.

Môi trường - hóa chất được sử dụng. Thiết bị và dụng cụ. Phương phap nghiÊn Cu ‹‹-s:csscsscsszczs16620366116616666006066665185613131856082GIÖSEESGHSGERGESSS8. Khảo sát khả năng phân giải lân của các chủng vi khuân.

Định danh chủng vi khuẩn có khả năng phân giải lân được chọn. Tôi a ha rõ thick ee thí nghĩ meeseseeoeseaoseaituidroiogsidbiovvglGU2101000160010000510 160660600 11 53,4. Phương thấp xử Tý số TIS. -c0ceonecnnconsancernennearneeascnnsannencenncanaanasoarananneoneennannennes 13 CHƯƠNG 4.

KET QUA NGHIÊN CỨU. Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng phân giải lân cao. Định danh chủng vi khuẩn có khả năng phân giải lân. Định danh sinh học phân tử chủng vi khuẩn có khả năng phân giải lân.

Tối ưu hóa thành phan môi trường thu sinh khối vi khuẩn. Sang lọc các yếu tố có ý nghĩa bang ma trận Plackett — Burman. Tối ưu hóa thành phan môi trường nuôi cấy thu sinh khối vi khuẩn. Kiểm tra thực nghiệm.

Thảo: luận: cHuñ1g. 12/1114 HHg kh HH TA E1 11 L408316/ BET LUẬN WA HỆ NƠI seeeeseoeveasiesoobirisingietdtvitgaLgiSSE9001000202x00 29 lì. 29 Cn | sua gi Bo ditoif0Gki66thoaGtifxGfSinGWSSNGEERERIESESAIESNf8kiBfPirnirgREsird 29 ey ee ETE C eeree30 32000099 —. | Mi DANH SÁCH CHỮ VIET TAT VSV : VỊ sinh vật P : Photphose TSA : Tryptic Soy Agar TSB : Tryptic Soy Broth rDNA : Ribosome TAE : Tris — brorate -EDTA PCR : Polymerase Chain Reaction S.luteola : Sporosarcina luteola PVK : Pikovskaya Vil DANH SÁCH BANG Bảng 2.

Axit hữu cơ được tạo ra bởi vi sinh vat phân giải phosphate. Các biến trong ma tran Plackett-Burman. Nồng độ các yếu tố sử dụng trong Full Factorial Desgin. Kết quả đường kính vòng phân giải lân 4 ngày và 14 ngày sau khi cấy.

Ma trận thiết kế Plackett — Burman. Mức ảnh hưởng của các yếu tô trong Plackett — Burman. Khoảng biến thiên của các yếu tố trong Full Factorial Design. Thiết kế ma trận Full Factorial Desgin.

Kết quả phân tích Full Factorial Desgin.-- 2: 22©22222222222xz2z2zzzzxz 23 Bang 4. Mật độ trung bình vi khuẩn sau 10 lần lặp lại. Thành phan của môi trường ở nghiệm thức trung tâm và tối ưu. Giá thành của môi trường nghiệm thức 24.

--- --- ---+-+++c+sc+sc+sces 27 Bang 4. Giá thành của môi trường TSB tổng hợp.---222552552522522222522 27 vill DANH SÁCH HÌNH Hình 4. Khuẩn lạc đơn H15 trên môi trường TSA. Tế bao vi khuẩn H15 dưới kính hién vi có độ phóng đại 100X.

Vi khuẩn H15 được cay trên thạch máu cừu. Kết quả điện di vi khuẩn HI5. So sánh chủng H15 trên Genbank bằng NCBI. Sơ đồ pha hệ chủng H]5.

22 2 22E+2EE22EE22EE22EE2E21222122212232222222222 18 1X CHUONG 1. Dat van dé Các nguyên tô đa lượng góp phan chính vào sự phát triển của thực vật, trong đó có photpho, chiếm khoảng 0,2% khối lượng khô của thực vật. Vai trò của photpho (P) trong cơ thể thực vật là thành phần của axit nucleic, ATP, photpholipid, coenzim; cần cho nở hoa, đậu quả, phát triển rễ, tăng cường khả năng chịu bệnh ở thực vat; do đó chất lượng nông sản bị ảnh hưởng đáng kế bởi sự hap thu P cua thuc vat. Mac du luong P trong dat rat cao nhưng nó thường có mặt ở dang khó tan.

P di chuyền chủ yếu bằng cách khuếch tán, do khả năng di động của P lại chậm nhưng tốc độ hấp thu của thực vật lại rất cao đã tao ra một vùng xung quanh rễ bị cạn kiệt P; từ đất, thực vật hap thu P dưới dạng H›POx va HPO, (Schachtman và ctv, 1998). Việc thiếu hụt P trong đất là một trong những nhân tổ hạn chế sự sinh trưởng của cây trồng.