Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn nội sinh tăng cường khả năng kháng bệnh chết héo trên cây keo

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu phân lập và tuyển chọn vi khuẩn nội sinh giúp tăng khả năng kháng bệnh chết héo do nấm Ceratocystis sp trên cây keo.

• Tác giả: Lộc Thị Mai Hương
• Người hướng dẫn: TS. Đặng Kim Tuyến
• Trường học: Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Quản lý tài nguyên rừng
• Đề tài: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn nội sinh để tăng cường khả năng kháng bệnh chết héo do nấm Ceratocystis sp. gây hại trên cây keo tai tượng tại tỉnh Thái Nguyên
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp đại học
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục tiêu và yêu cầu của đề bài
• 1.2. Ý nghĩa của đề tài
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
• 2.1. Cơ sở khoa học
• 2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới
• 2.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
• 2.2.2. Nghiên cứu về bệnh hại keo
• 2.2.3. Nghiên cứu về vi khuẩn nội sinh
• 3. PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu
• 3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 3.2.1. Thời gian nghiên cứu
• 3.3. Nội dung nghiên cứu
• 3.4. Phương pháp nghiên cứu
• 3.4.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn nội sinh
• 3.4.2. Phương pháp đánh giá hiệu lực kháng nấm bệnh của các chủng vi sinh vật nội sinh
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Phân lập vi khuẩn nội sinh
• 4.2. Các chủng vi khuẩn nội sinh ở lá Keo tai tượng
• 4.3. Các chủng vi khuẩn nội sinh ở cành Keo tai tượng
• 4.4. Các chủng vi khuẩn nội sinh ở rễ Keo tai tượng
• 4.5. Hiệu lực kháng bệnh của các chủng loại vi khuẩn nội sinh trong phòng thí nghiệm
• 4.6. Mô tả đặc điểm của một số chủng vi khuẩn mạnh
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• 5.1. Tồn tại kiến nghị
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Phân lập vi khuẩn nội sinh

Việc phân lập vi khuẩn nội sinh từ cây keo tai tượng là bước đầu tiên trong nghiên cứu này. Các mẫu được thu thập từ các bộ phận khác nhau của cây như lá, cành và rễ. Mỗi bộ phận có sự hiện diện của các chủng vi khuẩn khác nhau, điều này cho thấy sự đa dạng của vi khuẩn nội sinh trong cây. Kết quả cho thấy rằng mật độ vi khuẩn nội sinh ở các bộ phận khác nhau có sự khác biệt rõ rệt. Các chủng vi khuẩn được phân lập sẽ được đánh giá khả năng kháng bệnh của chúng. Việc phân lập thành công các chủng vi khuẩn này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về hệ sinh thái vi sinh vật trong cây mà còn mở ra hướng đi mới trong việc sử dụng vi khuẩn nội sinh để phòng trừ bệnh hại. Theo nghiên cứu, các chủng vi khuẩn nội sinh có khả năng ức chế sự phát triển của nấm Ceratocystis sp., nguyên nhân chính gây bệnh chết héo trên cây keo. Điều này cho thấy tiềm năng ứng dụng của vi khuẩn nội sinh trong việc bảo vệ cây trồng khỏi các bệnh hại.

1.1. Các chủng vi khuẩn nội sinh ở lá

Nghiên cứu cho thấy rằng các chủng vi khuẩn nội sinh ở lá keo tai tượng có khả năng kháng bệnh đáng kể. Các mẫu lá được thu thập từ nhiều độ tuổi khác nhau cho thấy sự khác biệt trong mật độ và chủng loại vi khuẩn. Các chủng vi khuẩn như Pseudomonas và Bacillus đã được xác định có khả năng ức chế nấm Ceratocystis sp. Sự hiện diện của các chủng này không chỉ giúp cây chống lại bệnh mà còn thúc đẩy sự sinh trưởng của cây. Việc phân lập và xác định các chủng vi khuẩn này là rất quan trọng trong việc phát triển các chế phẩm sinh học nhằm phòng trừ bệnh hại. Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng việc sử dụng vi khuẩn nội sinh có thể là một giải pháp hiệu quả và thân thiện với môi trường trong việc quản lý dịch bệnh trên cây trồng.

1.2. Các chủng vi khuẩn nội sinh ở cành

Các mẫu cành keo tai tượng cũng được phân tích để xác định sự hiện diện của vi khuẩn nội sinh. Kết quả cho thấy rằng mật độ vi khuẩn ở cành có sự khác biệt so với lá và rễ. Một số chủng vi khuẩn như Bacillus subtilis đã được phát hiện có khả năng ức chế mạnh mẽ sự phát triển của nấm Ceratocystis sp. Việc nghiên cứu các chủng vi khuẩn ở cành không chỉ giúp hiểu rõ hơn về sự phân bố của vi khuẩn nội sinh mà còn mở ra cơ hội ứng dụng trong việc phát triển các biện pháp phòng trừ bệnh hại. Các chủng vi khuẩn này có thể được sử dụng để tạo ra các chế phẩm sinh học, giúp tăng cường khả năng kháng bệnh cho cây trồng. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc bảo vệ cây trồng khỏi các tác nhân gây hại, đồng thời giảm thiểu việc sử dụng hóa chất trong nông nghiệp.

1.3. Các chủng vi khuẩn nội sinh ở rễ

Rễ là bộ phận quan trọng trong việc hấp thụ dinh dưỡng và nước cho cây. Nghiên cứu cho thấy rằng vi khuẩn nội sinh ở rễ có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cây khỏi bệnh hại. Các chủng vi khuẩn như Pseudomonas fluorescens đã được phân lập từ rễ keo tai tượng và cho thấy khả năng ức chế nấm Ceratocystis sp. Việc phân lập các chủng vi khuẩn này từ rễ không chỉ giúp tăng cường khả năng kháng bệnh cho cây mà còn cải thiện khả năng sinh trưởng của cây. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng vi khuẩn nội sinh có thể tạo ra các chất kháng sinh tự nhiên, giúp cây chống lại sự xâm nhập của các mầm bệnh. Điều này mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các chế phẩm sinh học từ vi khuẩn nội sinh nhằm bảo vệ cây trồng một cách hiệu quả và bền vững.

II. Tuyển chọn vi khuẩn kháng bệnh

Sau khi phân lập vi khuẩn, bước tiếp theo là tuyển chọn vi khuẩn có khả năng kháng bệnh. Các chủng vi khuẩn được đánh giá dựa trên khả năng ức chế sự phát triển của nấm Ceratocystis sp. Các thí nghiệm trong phòng thí nghiệm cho thấy một số chủng vi khuẩn có hiệu quả cao trong việc ngăn chặn sự phát triển của nấm. Việc tuyển chọn vi khuẩn không chỉ dựa vào khả năng kháng bệnh mà còn phải xem xét đến khả năng sinh trưởng và phát triển của chúng trong điều kiện môi trường khác nhau. Các chủng vi khuẩn được chọn sẽ được sử dụng để phát triển các chế phẩm sinh học, giúp tăng cường khả năng kháng bệnh cho cây trồng. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc bảo vệ cây trồng khỏi các bệnh hại, đồng thời giảm thiểu việc sử dụng hóa chất trong nông nghiệp. Việc ứng dụng các chủng vi khuẩn kháng bệnh vào thực tiễn sẽ góp phần nâng cao năng suất và chất lượng cây trồng.

2.1. Đánh giá hiệu lực kháng bệnh

Đánh giá hiệu lực kháng bệnh của các chủng vi khuẩn là một bước quan trọng trong nghiên cứu này. Các thí nghiệm được thực hiện trong điều kiện kiểm soát để xác định khả năng ức chế nấm Ceratocystis sp. của từng chủng vi khuẩn. Kết quả cho thấy rằng một số chủng vi khuẩn có khả năng ức chế mạnh mẽ sự phát triển của nấm, điều này cho thấy tiềm năng ứng dụng của chúng trong việc phòng trừ bệnh hại. Việc đánh giá hiệu lực kháng bệnh không chỉ giúp xác định các chủng vi khuẩn tiềm năng mà còn cung cấp thông tin quan trọng cho việc phát triển các chế phẩm sinh học. Các chủng vi khuẩn có hiệu lực kháng bệnh cao sẽ được lựa chọn để phát triển thành các sản phẩm thương mại, giúp nông dân trong việc quản lý dịch bệnh một cách hiệu quả.

2.2. Mô tả đặc điểm của các chủng vi khuẩn mạnh

Mô tả đặc điểm của các chủng vi khuẩn mạnh là một phần quan trọng trong nghiên cứu này. Các chủng vi khuẩn được tuyển chọn không chỉ có khả năng kháng bệnh mà còn có các đặc điểm sinh học nổi bật. Việc hiểu rõ về đặc điểm của các chủng vi khuẩn này sẽ giúp tối ưu hóa quy trình sản xuất chế phẩm sinh học. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng các chủng vi khuẩn mạnh thường có khả năng sinh ra các chất kháng sinh tự nhiên, giúp cây chống lại sự xâm nhập của các mầm bệnh. Điều này không chỉ giúp bảo vệ cây trồng mà còn góp phần nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm nông nghiệp. Việc mô tả đặc điểm của các chủng vi khuẩn mạnh sẽ cung cấp cơ sở khoa học cho việc phát triển các sản phẩm sinh học trong tương lai.

Nội dung chính

Giới thiệu dự án

Rừng trồng sản xuất tại Việt Nam đóng vai trò then chốt trong chuỗi cung ứng nguyên liệu chế biến gỗ và bột giấy phục vụ tiêu dùng nội địa lẫn xuất khẩu. Theo thống kê của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, kim ngạch xuất khẩu gỗ và lâm sản đạt hàng tỷ USD mỗi năm, khẳng định vị thế chủ lực của ngành kinh tế lâm nghiệp. Trong cơ cấu cây trồng rừng, loài Keo tai tượng (Acacia mangium Willd) thuộc phân họ Trinh nữ (Mimosoideae) chiếm vị trí chiến lược nhờ tốc độ tăng trưởng nhanh (năng suất trung bình đạt 25–30 $\text{m}^3/\text{ha/năm}$, chu kỳ khai thác 6–7 năm đạt trên 200 $\text{m}^3/\text{ha}$), biên độ sinh thái rộng và khả năng cố định đạm cải tạo đất thông qua cộng sinh vi sinh vật.

       +-------------------------------------------------------------+
       |               Rừng Keo tai tượng (Acacia mangium)            |
       +-------------------------------------------------------------+
                                      |
                     Nhiễm nấm Ceratocystis sp. (VH11)
                                      |
       +-------------------------------------------------------------+
       | Triệu chứng: Héo tán lá -> Loét thân -> Chết ngược -> Thối đen |
       +-------------------------------------------------------------+
                                      |
            +-------------------------+-------------------------+
            |                                                   |
   [Biện pháp hóa học]                                 [Biện pháp sinh học]
   - Ô nhiễm đất & nguồn nước                          - Vi khuẩn nội sinh (Endophytic)
   - Tồn dư hóa chất độc hại                           - Đối kháng tự nhiên, bền vững
   - Kháng thuốc bảo vệ thực vật                       - Kích thích sinh trưởng cây chủ

Sự phát triển ồ ạt và độc canh rừng keo đã kéo theo áp lực dịch hại nghiêm trọng, điển hình là bệnh chết héo (vascular wilt/canker) do nấm Ceratocystis sp. gây ra. Nấm xâm nhập làm thâm đen mạch dẫn, gây loét thân, héo rũ tán lá và làm cây chết đứng chỉ sau thời gian ngắn phát bệnh. Tại tỉnh Thái Nguyên, tỷ lệ nhiễm bệnh ghi nhận ở mức trung bình 18,4%, cục bộ tại các khu vực như Quang Sơn và Cây Thị (Đồng Hỷ) tỷ lệ cây chết lên tới 50–57%, gây thiệt hại kinh tế nặng nề cho các chủ rừng.

Mục tiêu nghiên cứu cụ thể

1. Phân lập toàn diện hệ vi khuẩn nội sinh: Thu thập mẫu mô thực vật (lá, cành, rễ) từ các lâm phần Keo tai tượng 2, 4 và 6 tuổi tại Thái Nguyên để phân lập các chủng vi khuẩn nội sinh (Endophytic bacteria) thuần khiết.
2. Đánh giá hoạt tính đối kháng in vitro: Khảo nghiệm hiệu lực ức chế sự phát triển của hệ sợi nấm Ceratocystis sp. (chủng độc lực cao VH11) bằng phương pháp nuôi cấy kép (dual-culture assay).
3. Mô tả đặc điểm sinh học và hình thái: Định danh sơ bộ, quan sát hình thái khuẩn lạc và cấu trúc tế bào/bào tử qua kính hiển vi quang học độ phóng đại $1000\times$ của các chủng có hoạt lực mạnh.
4. Tuyển chọn chủng vi khuẩn triển vọng: Tuyển chọn các chủng vi khuẩn nội sinh ưu việt nhất nhằm cung cấp nguồn vật liệu sinh học cho việc sản xuất chế phẩm sinh học bảo vệ rừng.

Giải pháp kỹ thuật và phạm vi triển khai

Đề tài sử dụng giải pháp kiểm soát sinh học (Biological Control Agent - BCA) dựa trên vi khuẩn nội sinh sống trong mô thực vật nhưng không gây hại cho cây chủ. Khác với biện pháp hóa học gây ô nhiễm môi trường đất và nguồn nước, vi khuẩn nội sinh cạnh tranh không gian sống, dinh dưỡng và tiết ra các chất kháng sinh ức chế chọn lọc mầm bệnh. Đề tài tập trung nghiên cứu trên 12 cây mẫu Keo tai tượng đại diện cho 3 cấp tuổi tại Thái Nguyên, phối hợp phân tích chuyên sâu tại Trung tâm Nghiên cứu Bảo vệ rừng – Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam.

---

Phân tích và thiết kế giải pháp

Phân tích hiện trạng

Quản lý bệnh chết héo do nấm mạch dẫn Ceratocystis sp. hiện đang là bài toán phức tạp trên quy mô toàn cầu lẫn tại Việt Nam.

Tiêu chí so sánh	Biện pháp Hóa học (Thuốc trừ nấm)	Biện pháp Cơ học / Canh tác	Biện pháp Vi sinh vật nội sinh (Đề tài)
Cơ chế tác động	Tiêu diệt nấm qua hoạt chất hóa học	Chặt bỏ cây bệnh, vệ sinh rừng	Đối kháng tự nhiên, tiết enzyme/kháng sinh
Hiệu quả tức thời	Nhanh nhưng khó ngấm vào mạch gỗ	Thấp, chỉ ngăn lây lan thứ cấp	Bền vững, ức chế từ bên trong mô cây
Tác động môi trường	Gây ô nhiễm đất, nguồn nước, mất cân bằng sinh thái	Không gây hại nhưng xáo trộn cơ giới	An toàn sinh học 100%, bảo vệ hệ vi sinh bản địa
Khả năng kháng thuốc	Rất cao sau chu kỳ sử dụng lặp lại	Không áp dụng	Rất thấp do cơ chế ức chế đa phương thức
Chi phí vận hành	Cao, tốn công phun trên diện tích lớn	Trung bình, đòi hỏi nhiều nhân công	Thấp khi ứng dụng dạng phân bón/chế phẩm sinh học

Phân loại yêu cầu kỹ thuật theo mô hình MoSCoW:

• Must have (Bắt buộc): Khử trùng bề mặt mô thực vật triệt để nhằm loại bỏ vi sinh vật biểu sinh (epiphytes); phân lập được chủng thuần khiết; đo đạc chính xác bán kính vòng vô khuẩn ($V$).
• Should have (Nên có): Định lượng mật độ vi khuẩn ($\text{CFU/g}$ hoặc $\text{CFU/ml}$) trên các bộ phận và cấp tuổi; phân loại cấp độ ức chế thành 5 mức chuẩn hóa.
• Could have (Có thể có): Nhuộm màu tế bào bằng Congo đỏ và Xanh methylen để nhận diện hình thái bào tử dưới kính hiển vi soi dầu.
• Won't have (Chưa thực hiện đợt này): Giải trình tự gen 16S rRNA định danh loài và khảo nghiệm hiệu lực bảo vệ trực tiếp trên cây sống ngoài hiện trường (in vivo).

Thiết kế quy trình phân tích và tuyển chọn

Hệ thống phân tích và sàng lọc vi sinh vật nội sinh được thiết kế theo quy trình khép kín với các thông số nghiêm ngặt:

[Mẫu mô: Rễ, Cành, Lá] 
[Khử trùng bề mặt: Cồn 75% trong 60s -> Hơ đèn cồn -> Cắt 0.5-1.0mm]
[Đồng hóa mẫu: 1.0g mô + 9.0ml đệm PBS (pH 7.0) -> Ngâm 24h]
[Pha loãng bậc phân: 10^-1 -> 10^-2 -> 10^-3 -> 10^-4 -> 10^-5]
[Cấy trải 0.1ml dịch lên đĩa King's B -> Nuôi ủ 28°C]
[Phân lập dòng thuần khiết trên môi trường PDA -> Phân loại hình thái]
[Thử nghiệm đối kháng kép: Cấy nấm Ceratocystis sp. + Cấy vi khuẩn]
[Đo đạc vòng kháng sau 7 ngày: Công thức V = D - d]

Thông số kỹ thuật hóa chất và môi trường nuôi cấy

• Dung dịch đệm PBS (Phosphate-Buffered Saline, pH 7.0):
  • $\text{NaCl}$: 8,5 g/L
  • $\text{KH}_2\text{PO}_4$: 6,8 g/L
  • $\text{NaOH}$: 1,16 g/L
  • Nước cất vô trùng vừa đủ 1000 ml.
• Môi trường King’s B (Chuyên biệt phân lập vi khuẩn):
  • Proteose Peptone: 20,0 g/L
  • $\text{K}_2\text{HPO}_4$: 1,5 g/L
  • Agar vi sinh: 18,0 g/L
  • Nước cất vừa đủ 1000 ml.
• Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar - Nuôi cấy nấm và thử nghiệm kép):
  • Dịch chiết khoai tây tươi: 200,0 g/L
  • Dextrose ($\text{D-glucose}$): 20,0 g/L
  • Agar: 15,0–18,0 g/L
  • Nước cất vừa đủ 1000 ml.
• Thiết bị đo kiểm: Nồi hấp tiệt trùng áp suất cao ($121^\circ\text{C}$, 1 atm trong 30 phút), tủ sấy đối lưu ($80^\circ\text{C}$ trong 12 giờ), tủ định ôn ổn nhiệt ($25^\circ\text{C}$ và $28^\circ\text{C}$), kính hiển vi quang học vật kính soi dầu $100\times$.

Phương pháp luận (Methodology)

Nghiên cứu áp dụng quy trình kiểm định đối kháng vi sinh vật chuẩn hóa theo Singh & Tripathi (1999). Thiết kế thí nghiệm ngẫu nhiên hoàn chỉnh (CRD) với 3 lần lặp lại độc lập cho mỗi chủng vi khuẩn để loại trừ sai số ngẫu nhiên. Kiểm soát chất lượng (QA/QC) thông qua việc kiểm tra độ vô trùng của đĩa đối chứng âm (mẫu nước rửa cuối cùng không mọc vi khuẩn) và đối chứng dương (đĩa cấy nấm đơn dòng không có vi khuẩn đối kháng).

---

Implementation và kết quả

Quy trình phân lập và đánh giá thực nghiệm

Quy trình tính toán hiệu lực đối kháng được mô hình hóa bằng thuật toán đo đạc sinh học:

def evaluate_antagonistic_activity(D_fungus_diameter: float, d_colony_diameter: float) -> dict:
    """
    Tính khoảng cách vòng ức chế (V) và xếp loại hiệu lực kháng nấm Ceratocystis sp.
    Công thức: V = D - d
    """
    V = D_fungus_diameter - d_colony_diameter
    
    if V > 20.0:
        activity_level = "Rất mạnh (Rm)"
    elif 10.0 < V <= 20.0:
        activity_level = "Mạnh (M)"
    elif 5.0 < V <= 10.0:
        activity_level = "Trung bình (Tb)"
    elif 1.0 < V <= 5.0:
        activity_level = "Yếu (Y)"
    else:
        activity_level = "Không có hiệu lực (O)"
        
    return {
        "zone_width_mm": round(V, 2),
        "classification": activity_level,
        "is_promising_candidate": V > 10.0
    }

# Thử nghiệm thực tế chủng vi khuẩn triển vọng K7C3.3:
# D = 28.5 mm (mép nấm bệnh lùi lại), d = 10.0 mm (đường kính khuẩn lạc)
result_K7C3 = evaluate_antagonistic_activity(D_fungus_diameter=28.5, d_colony_diameter=10.0)
# Output: {'zone_width_mm': 18.5, 'classification': 'Mạnh (M)', 'is_promising_candidate': True}

Kết quả phân lập vi khuẩn theo cơ quan và cấp tuổi

Từ 12 cây mẫu đại diện, nghiên cứu đã phân lập được 49 phân lập vi khuẩn nội sinh, quy tụ về 16 chủng đặc trưng (ký hiệu từ K1 đến K16).

          [TỔNG SỐ 49 PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH THU NHẬN]
       [Lá]                     [Cành]                   [Rễ]
  5 phân lập (10.2%)      20 phân lập (40.8%)      24 phân lập (49.0%)
  5 chủng đặc trưng        10 chủng đặc trưng       8 chủng đặc trưng
  (K4, K10, K11, K13, K14) (K1, K4, K5, K6, K7,    (K1, K2, K3, K4,
                           K9, K10, K11, K12, K15)  K6, K8, K12, K16)

1. Phân bố vi khuẩn trong lá: Mật độ biến thiên từ $4 \times 10^5$ đến $8 \times 10^5\text{ CFU/ml}$. Chủng K4 và K10 chiếm mật độ cao nhất ($8 \times 10^5\text{ CFU/ml}$). Khuẩn lạc đa phần có màu vàng nhạt hoặc trắng vàng, mép răng cưa hoặc tròn bóng.
2. Phân bố vi khuẩn trong cành: Thu được 20 mẫu thuộc 10 chủng. Chủng K4 đạt mật độ cực đại tại mẫu C10 ($3,3 \times 10^6\text{ CFU/ml}$). Các chủng K4, K5, K7 xuất hiện phổ biến nhất (tần suất 3 lần/12 cây).
3. Phân bố vi khuẩn trong rễ: Rễ là cơ quan lưu trữ số lượng và mật độ vi khuẩn nội sinh cao nhất. Thu được 24 mẫu thuộc 8 chủng, mật độ trung bình đạt $6,6 \times 10^5$ đến $4,6 \times 10^6\text{ CFU/ml}$. Chủng K3 có tần suất xuất hiện cao nhất (6/12 cây), chủng K1 đạt mật độ cao nhất tại mẫu R8.

MẬT ĐỘ VI KHUẨN TRUNG BÌNH THEO CẤP TUỔI CÂY (CFU/ml)
Tuổi 2: [▓▓▓] 1.3 x 10^6
Tuổi 4: [▓▓▓▓▓▓▓▓▓▓▓▓▓▓▓▓▓▓▓▓▓▓] 11.0 x 10^6  <-- Đỉnh sinh khối
Tuổi 6: [▓▓▓▓▓▓▓▓▓▓▓▓▓▓] 7.3 x 10^6

Mối tương quan cấp tuổi: Mật độ vi khuẩn nội sinh đạt đỉnh ở cây 4 tuổi ($11,0 \times 10^6\text{ CFU/ml}$), cao hơn gấp 8,46 lần so với cây 2 tuổi ($1,3 \times 10^6\text{ CFU/ml}$) và cao hơn 1,5 lần so với cây 6 tuổi ($7,3 \times 10^6\text{ CFU/ml}$). Điều này phản ánh sự tương tác sinh lý mạnh mẽ giữa vi khuẩn nội sinh và cây chủ trong giai đoạn sinh trưởng phát triển tích cực nhất (khép tán và hình thành lõi gỗ).

Kết quả đánh giá hiệu lực ức chế nấm Ceratocystis sp.

Thử nghiệm đối kháng kép trên 31 chủng vi khuẩn đại diện cho thấy:

• Chủng kháng mạnh ($10 < V \le 20\text{ mm}$): 8 chủng (chiếm 25,8%), tiêu biểu là K7C3.3 ($V = 18,5\text{ mm}$), K1R9, K6C11.5, K1R1.1.
• Chủng kháng trung bình ($5 < V \le 10\text{ mm}$): 4 chủng (chiếm 12,9%), điển hình là K2R4 ($V = 7,0\text{ mm}$), K1R6.
• Chủng không có hiệu lực ($V \le 1\text{ mm}$): 19 chủng (chiếm 61,3%), bao gồm K3R3, K3R5, K4R11, K5C1.1.

Ký hiệu mẫu	Chủng vi khuẩn	Cơ quan phân lập	Vòng kháng $V$ (mm)	Cấp độ ức chế	Đặc điểm hình thái khuẩn lạc & tế bào
KC3.3	K7	Cành	18,5	Mạnh (M)	Vàng nhạt, mép không đều; tế bào hình trứng, bầu dục
KR9.1	K1	Rễ	16,0	Mạnh (M)	Trắng đục, mọc loang nhanh; bào tử kết đám ánh đồng
KC11.5	K6	Cành	15,2	Mạnh (M)	Trắng vàng, bề mặt sần sùi 2 vòng, hơi nhầy
KR1.1	K1	Rễ	10,0	Mạnh (M)	Trắng đục, mép hình tia, nhầy
KR4.1	K2	Rễ	7,0	Trung bình (Tb)	Trắng đục mờ, viền trơn nhẵn
KR3.1	K3	Rễ	0,0	Không (O)	Trắng vàng, mỏng, không ức chế sợi nấm

    [HÌNH ẢNH MÔ PHỎNG VÒNG ỨC CHẾ ĐỐI KHÁNG KÉP IN VITRO]
    
    +-----------------------------------------------+
    |         . . . . . . . . . . . . . . .         |
    |     . . : : : : : : : : : : : : : : . .       |
    |   . : : [ Hệ sợi nấm Ceratocystis ] : : .     |
    |  . : : (bị thoái hóa & chặn đứng mép) : .     |
    |  . : :                                 : : .  |
    |  . : :    <--- V = 18.5 mm --->        : : .  |
    |  . : :                                 : : .  |
    |  . : :        [ Khuẩn lạc K7C3.3 ]     : : .  |
    |  . : :        (tiết hoạt chất kháng)   : : .  |
    |   . : : : : : : : : : : : : : : : : : : .     |
    |     . . . . . . . . . . . . . . . . . .       |
    +-----------------------------------------------+

Đặc tính cơ chế của chủng K7C3.3 và K1R9: Trong 48 giờ đầu sau khi cấy kép, hệ sợi nấm bệnh vẫn phát triển. Từ giờ thứ 72 trở đi, vi khuẩn bắt đầu tăng sinh mạnh, lan rộng trên bề mặt thạch và tiết hoạt chất ngoại bào làm co cụm, đứt gãy sợi nấm Ceratocystis sp. (VH11), tạo thành quầng vô khuẩn rõ nét và ngăn chặn hoàn toàn sự phát triển của khuẩn ty nấm.

---

Đổi mới và đóng góp

Điểm mới khoa học và kỹ thuật

• Lập bản đồ phân bố mật độ vi sinh vật nội sinh theo tuổi sinh lý: Lần đầu tiên cung cấp dữ liệu định lượng về sự biến động mật độ vi khuẩn nội sinh trên Keo tai tượng tại Thái Nguyên qua 3 cấp tuổi (2, 4, 6 năm), xác lập mốc 4 tuổi là thời điểm hệ vi sinh nội sinh đạt trạng thái cực đại ($11,0 \times 10^6\text{ CFU/ml}$).
• Tuyển chọn chủng vi khuẩn ức chế chuyên biệt: Sàng lọc thành công chủng vi khuẩn K7C3.3 có vòng ức chế đạt $18,5\text{ mm}$ đối với chủng nấm Ceratocystis sp. độc lực cao (VH11).
• Cơ sở dữ liệu hình thái và phân bố mô học: Chứng minh rễ ($49,0%$) và cành ($40,8%$) là hai cơ quan dự trữ vi khuẩn đối kháng phong phú nhất, mở ra phương pháp tiếp cận khai thác mô cây rừng để tìm kiếm chủng giống sinh học.

Đóng góp thực tiễn cho ngành lâm nghiệp

Công trình đóng góp luận cứ khoa học quan trọng cho chương trình Quản lý dịch hại tổng hợp (IPM) trên cây rừng. Thay vì phụ thuộc vào các hoạt chất hóa học độc hại bị giới hạn bởi chứng chỉ rừng bền vững FSC (Forest Stewardship Council), việc ứng dụng vi khuẩn nội sinh bản địa mở đường cho sản xuất chế phẩm sinh học bảo vệ rừng keo bền vững.

---

Ứng dụng thực tế và triển khai

Kịch bản ứng dụng trong thực tế

+--------------------------------------------------------------------------+
|                  QUY TRÌNH ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM SINH HỌC                     |
+--------------------------------------------------------------------------+
  1. Giai đoạn Vườn ươm:
     -> Xử lý hạt giống bằng dịch huyền phù vi khuẩn K7C3.3 (10^8 CFU/ml)
     -> Tưới gốc cây con định kỳ 15 ngày/lần trước khi xuất vườn
  2. Giai đoạn Rừng trồng (1 - 4 tuổi):
     -> Bón bổ sung qua phân hữu cơ vi sinh chứa bào tử K7C3.3 / K1R9
     -> Phun sương bề mặt thân cây sau khi tỉa cành nhằm bịt kín vết thương hở

Phân tích hiệu quả kinh tế - kỹ thuật (Cost-Benefit Analysis)

• Thiệt hại khi không can thiệp: Tỷ lệ chết héo 18,4% gây tổn thất khoảng $35–50\text{ m}^3\text{ gỗ/ha}$ tại thời điểm thu hoạch, tương đương thiệt hại 35–55 triệu VNĐ/ha.
• Chi phí xử lý chế phẩm sinh học: Ước tính 3,5–5,0 triệu VNĐ/ha cho toàn bộ chu kỳ 5 năm (bao gồm xử lý cây con và bón bổ sung giai đoạn 1–3 tuổi).
• Tỷ suất hoàn vốn đầu tư (ROI): Giảm tỷ lệ cây chết xuống dưới 5%, bảo toàn năng suất rừng trồng, đem lại ROI ước tính đạt $1 : 7$ đến $1 : 10$ so với việc để dịch bệnh bùng phát tự nhiên.

---

Hạn chế và hướng phát triển

Hạn chế kỹ thuật

1. Chưa định danh phân tử: Nghiên cứu mới dừng lại ở việc mô tả hình thái khuẩn lạc và hình thái bào tử qua kính hiển vi quang học, chưa thực hiện giải trình tự vùng gen 16S rRNA để xác định chính xác tên loài (Species-level identification).
2. Quy mô thử nghiệm in vitro: Hiệu lực đối kháng mới được thẩm định trên môi trường nhân tạo PDA trong phòng thí nghiệm; chưa đánh giá sự tương tác phức tạp giữa vi khuẩn, nấm bệnh và phản ứng miễn dịch của cây sống dưới điều kiện thực địa.

Kế hoạch phát triển tiếp theo

• Giai đoạn 1 (Ngắn hạn): Tách chiết DNA bộ gen và giải trình tự gen 16S rRNA cho 2 chủng ưu việt K7C3.3 và K1R9; phân tích sinh hóa nhận diện nhóm hoạt chất kháng sinh tự nhiên (lipopeptide, iturin, surfactin).
• Giai đoạn 2 (Trung hạn): Thử nghiệm lây nhiễm nhân tạo nấm Ceratocystis sp. trên cây keo con trong nhà lưới có xử lý vi khuẩn nội sinh để đánh giá tỷ lệ sống và chỉ số bệnh (Disease Severity Index).
• Giai đoạn 3 (Dài hạn): Phối trộn đa chủng vi sinh vật (vi khuẩn nội sinh kháng nấm + nấm rễ nội sinh Mycorrhizae + vi khuẩn cố định đạm) sản xuất chế phẩm sinh học quy mô pilot phục vụ các công ty lâm nghiệp tại vùng Đông Bắc.

---

Đối tượng hưởng lợi

• Sinh viên & Học viên Lâm sinh - Công nghệ sinh học: Nắm bắt quy trình phân lập vi khuẩn nội sinh mô thực vật chuẩn hóa, phương pháp thử nghiệm đối kháng kép và xử lý số liệu mật độ vi sinh vật.
• Kỹ sư bảo vệ thực vật & Doanh nghiệp trồng rừng: Sở hữu giải pháp công nghệ sinh học bản địa thay thế hóa chất diệt nấm, đáp ứng tiêu chuẩn khắt khe của chứng chỉ FSC và chứng chỉ phát thải carbon.
• Nhà nghiên cứu bệnh học cây rừng: Kế thừa bộ số liệu về hệ vi sinh vật nội sinh trên Keo tai tượng tại Thái Nguyên để mở rộng nghiên cứu sang các loài cây lâm nghiệp khác như Keo lá tràm, Keo lai và Bạch đàn.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Yêu cầu kỹ thuật cốt lõi để phân lập thành công vi khuẩn nội sinh là gì?

Khâu then chốt là quy trình khử trùng bề mặt mô thực vật (sử dụng cồn $75^\circ$ trong 60 giây kết hợp hơ nhanh qua ngọn lửa đèn cồn) nhằm tiêu diệt toàn bộ vi sinh vật biểu sinh bám ngoài vỏ mà không làm chết các tế bào vi khuẩn sống bên trong mô mạch dẫn. Đĩa đối chứng nước rửa cuối cùng phải hoàn toàn vô trùng.

2. Tại sao mật độ vi khuẩn nội sinh ở cây 4 tuổi lại cao hơn đáng kể so với cây 2 và 6 tuổi?

Cây 4 tuổi là giai đoạn sinh trưởng sinh khối mãnh liệt nhất của Keo tai tượng (bắt đầu khép tán, phân cành mạnh và phát triển hệ mạch gỗ hoàn chỉnh), tạo ra nguồn dinh dưỡng thứ cấp và không gian nội mô phong phú nhất cho vi sinh vật nội sinh cư trú, trước khi cây bước vào giai đoạn thuần thục ở 6 tuổi.

3. Công thức tính hiệu lực ức chế nấm $V = D - d$ có ý nghĩa sinh học như thế nào?

$V$ biểu thị độ rộng thực tế của quầng vô khuẩn được tạo ra bởi hoạt chất kháng sinh do vi khuẩn tiết ra. Trị số $V$ càng lớn chứng tỏ khả năng khuếch tán và độc lực của hoạt chất đối kháng đối với sợi nấm Ceratocystis sp. càng mạnh, giảm thiểu khả năng nấm bệnh thích nghi và xâm lấn.

4. Vi khuẩn nội sinh có nguy cơ biến đổi thành tác nhân gây bệnh cho cây keo không?

Vi khuẩn nội sinh thực sự (True endophytes) đã cùng tiến hóa thích nghi và thiết lập mối quan hệ cộng sinh tương hỗ với cây chủ. Chúng chỉ sử dụng chất dinh dưỡng dư thừa và kích thích cơ chế tự vệ của cây. Tuy nhiên, các chủng tuyển chọn đều phải trải qua bước kiểm tra an toàn sinh học trên cây con trước khi thương mại hóa.

5. Khả năng kết hợp vi khuẩn nội sinh với các loại phân bón vi sinh hiện có?

Hoàn toàn khả thi. Vi khuẩn nội sinh như chủng K7C3.3 có thể phối trộn với chất mang hữu cơ (than bùn, mùn dừa) cùng các chủng vi sinh vật phân giải lân và cố định đạm để tạo thành "chế phẩm vi sinh đa chức năng", vừa thúc đẩy sinh trưởng vừa tăng cường miễn dịch tự nhiên cho rừng trồng.

---

Kết luận

Đề tài đã hoàn thành xuất sắc các mục tiêu nghiên cứu đặt ra thông qua việc phân lập thành công 49 mẫu vi khuẩn nội sinh thuộc 16 chủng trên cây Keo tai tượng tại Thái Nguyên. Nghiên cứu đã xác lập cơ sở dữ liệu khoa học về sự phân bố vi khuẩn nội sinh theo cơ quan (rễ và cành chiếm ưu thế) và theo cấp tuổi (đạt đỉnh ở 4 tuổi với $11,0 \times 10^6\text{ CFU/ml}$). Đề tài đã tuyển chọn được chủng vi khuẩn ưu việt K7C3.3 với hiệu lực ức chế nấm Ceratocystis sp. (VH11) rất mạnh (vòng kháng $18,5\text{ mm}$), mở ra hướng đi đột phá và bền vững trong công tác bảo vệ rừng trồng keo tại Việt Nam bằng công nghệ sinh học thân thiện môi trường.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Rừng luôn là tài sản quý giá mà thiên nhiên ban tặng, rừng luôn giữ vai trò hết sức quan trọng từ xưa tới nay. Song song với sự phát triển của toàn cầu rừng luôn giữ vai trò quan trọng trong cuộc sống con người, các giá trị kinh tế, xã hội và môi trường rừng đem lại vô cùng to lớn. Đúng như vậy, rừng che phủ một phần ba diện tích lục địa, thực hiện nhiều chức năng, cung cấp các dịch vụ thiết yếu và duy trì sự sống trên trái đất. Ước tính hiện nay có khoảng 1.6 tỷ người trên trái đất sống phụ thuộc vào rừng.

Rừng đóng vai trò quan trọng trong cuộc chiến chống biến đổi khí hậu toàn cầu, cung cấp O2 cho khí quyển và tổng hợp CO2 thải ra. Rừng cung cấp nguyên liệu cho nghành công nghiệp chế biến gỗ và giấy, cung cấp các sản phẩm cho tiêu dùng nội địa và xuất khẩu đạt giá trị cao. Rừng cung cấp nơi ở, việc làm, là nền tảng văn hoá của các cộng đồng dân cư trong khu vực rừng. Theo thống kê từ Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn năm 2010, giá trị xuất khẩu gỗ và sản phẩm gỗ đạt 3,4 tỷ USD, tăng 31,2 %; sản phẩm mây tre, cói lá, thảm đạt 169 triệu USD, tăng 16,48 % so với cùng kỳ năm trước.

Trong cơ cấu giá trị nông sản xuất khẩu của Việt Nam năm 2010, gỗ và sản phẩm gỗ đứng vị trí thứ 3, hàng mây tre, cói lá, thảm đứng vị trí thứ 10. Kết quả này cho thấy lâm sản là mặt hàng xuất khẩu quan trọng của nông sản Việt Nam [2]. Để đáp ứng nhu cầu người tiêu dùng việc sử dụng gỗ và nguyên liệu giấy ngày càng gia tăng trong khi nguồn nguyên liệu gỗ từ rừng ngày càng giảm sút. Đã có rất nhiều các chương trình, dự án trồng rừng đã được triển khai nhằm nâng cao diện tích rừng trồng.

Các loài keo là loài cây sinh trưởng nhanh, đồng thời lại có khả năng cải tạo đất cao, cây trồng chỉ sau 6-7 năm có n 2 thể thu được lớn hơn 200m³/ha, năng suất bình quân đạt 25-30m³/ha/năm (Mac Dicken và Brewbaker,1984). Với những ưu điểm trên, cây Keo đã nhanh chóng trở thành cây trồng rừng chủ lực cho ngành Lâm nghiệp, trong đó Keo tai tượng được coi là một trong các loài có triển vọng nhất cho trồng rừng đa mục đích: phòng hộ, cải tạo đất, cung cấp nguyên liệu, sinh trưởng nhanh được trồng với số lượng lớn ở nước ta nói chung và tỉnh Thái Nguyên nói riêng. Diện tích rừng trồng keo đang tăng mạnh ở Việt Nam, trong đó Keo tai tượng (Acacia mangium), Keo lá tràm (Acacia auriculiformis) và Keo lai là những loài cây được trồng chính trên phạm vi cả nước. Keo tai tượng là loài cây có phạm vi sinh thái rộng, sinh trưởng nhanh, thích ứng với các điều kiện lập địa khác nhau.

Keo tai tượng được trồng với mục đích cải tạo môi trường sinh thái, chống xói mòn, bảo vệ đất, giữ và điều tiết nguồn nước, tạo cảnh quan trong các khu du lịch, danh lam thắng cảnh… Có giá trị sử dụng nhiều mặt, cung cấp nguyên vật liệu cho ngành chế biến bột giấy, gỗ ván dăm, ngành xây dựng, tận dụng lá và hạt keo tai tượng trong công nghiệp chế biến thức ăn gia súc, chế biến phân vi sinh… Cũng chính vì diện tích rừng tăng nhanh dẫn đến sự xuất hiện nhiều của sâu bệnh hại lá và thân cành làm giảm chất lượng gỗ, gây chết cây và gây khó khăn không nhỏ cho công tác phòng trừ sâu bệnh hại. Một trong các bệnh hại keo có bệnh loét thân với triệu chứng héo tán lá, sau đó gỗ bị biến màu đen và cây bị nhiễm bệnh chết xuất hiện ở nhiều vùng sinh thái. Bệnh này được xác định là do nấm Ceratocystis sp. là loài nấm nguy hiểm cho nhiều loài cấy chứ không riêng loài keo, là nguyên nhân gây nên bệnh héo lá, loét thân cành.

Hiện nay trên thế giới cũng như ở Việt Nam là công tác tuyển chọn giống, lai tạo, tuyển chọn loài, xuất xứ và các dòng vô tính chống chịu sâu bệnh hại và các điều kiện bất lợi tốt đang là hướng đi mới, phát triển bền n 3 vững trong công tác quản lí dịch bệnh hại cây rừng. Ngoài ra nhiều nhà khoa học đã đi sâu vào nghiên cứu vi sinh vật nội sinh là những vi sinh vật sống trong mô tế bào của cây chủ, không gây bệnh cho cây chủ. Các vi sinh vật nội sinh này thúc đẩy quá trình sinh trưởng của cây chủ vì tạo ra một hàng rào kiểm soát sinh học bằng việc tiêu diệt trực tiếp hoặc ức chế các mầm bệnh đã xâm nhiễm vào cây chủ, làm giảm nguy cơ mắc bệnh đối với cây trồng đã và đang được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm [10]. Phương pháp này được coi là biện pháp hữu hiệu và thân thiện với môi trường.

Đã và đang được sử dụng nhiều nước trên thế giới, với nền khoa học nước ta những nghiên cứu mới này mới chỉ là bước đầu, do vậy việc đi sâu nghiên cứu về khuẩn nội sinh có khả năng kháng bệnh là rất quan trọng và cấp thiết. Từ nghiên cứu đó làm sáng tỏ vai trò của vi khuẩn nội sinh trong việc bảo vệ cây chủ khỏi sự xâm nhiễm của sinh vật gây bệnh và ứng dụng chúng trong phòng trừ bệnh chết héo keo do nấm Ceratocystis sp. gây hại đồng thời tuyển chọn ra các chủng khuẩn có khả năng kháng nấm bệnh. Trên cơ sở đó tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn nội sinh có hiệu lực đối kháng nấm Ceratocystis sp.

gây bệnh chết héo keo tai tượng (Acacia mangium Wild) tại tỉnh Thái Nguyên”. Mục tiêu và yêu cầu của đề bài Mục tiêu nghiên cứu: - Phân lập được chủng khuẩn nội sinh trên cây Keo tai tượng ở các độ tuổi khác nhau và ở các bộ phận khác nhau của cây (rễ, thân, lá). - Đánh giá được khả năng ức chế nấm gây bệnh của các chủng khuẩn nội sinh. - Mô tả được đặc điểm của khuẩn nội sinh.

- Tuyển chọn được các chủng khuẩn nội sinh có khả năng kháng lại bệnh chết héo do nấm Ceratocystis sp. Ý nghĩa của đề tài Ý nghĩa trong khoa học: Tuyển chọn được các chủng khuẩn nội sinh có khả năng kháng lại bệnh chết héo do nấm Ceratocystis sp. là tiền đề để tìm ra các chế phẩm phòng bệnh chết héo. Củng cố các kiến thức đã học trong môn bệnh cây rừng, đồng thời bổ xung kiến thức chuyên môn.

Biết cách tổng hợp, phân tích từ đó đưa ra phương hướng viết báo cáo nghiên cứu khoa học. Ý nghĩa trong thực tiễn: Quá trình nghiên cứu này rất hữu hiệu và thân thiện với môi trường. Thường thì khi cây bị bệnh người ta dùng các thuốc hóa học để trừ bệnh, khả năng tiêu diệt mầm bệnh là rất nhanh nhưng kéo theo nó là tình trạng ô nhiễm môi trường đất, nước, không khí. Vấn đề này sẽ được khắc phục nếu chúng ta sử dụng các chủng khuẩn nội sinh trong công tác phòng trừ dịch bệnh, mà hơn hết việc phòng bệnh rất ít các loại thuốc hóa học làm được.

n 5 PHẦN 2 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 2. Cơ sở khoa học Diện tích rừng sản xuất tăng lên dẫn đến khả năng xuất hiện các loài bệnh hại làm giảm năng suất và chất lượng rừng. Gần đây một số rừng trồng keo trọng điểm như: Tây Bắc, Đông Bắc… Xuất hiện những cây bị chết héo từ trên xuống hay gọi là chết ngược, bệnh rất khó phát hiện trong giai đoạn đầu. Các mẫu bệnh được Trung tâm Nghiên cứu Bảo vệ rừng Viện Khoa học Lâm Nghiệp giám định là do nấm Creratocystis sp.

Để giảm thiểu ảnh hưởng của bệnh không thể sử dụng biện pháp phòng trừ hóa học bởi sẽ gây ô nhiễm môi trường, không mang lại hiệu quả như mong muốn. Một trong những biện pháp đã và đang được các nhà nghiên cứu trên thế giới tiến hành và tuyển chọn giống có khả năng kháng bệnh phục hồi tốt sau khi cây bị bệnh. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc và trên thế giới 2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 2.

Nghiên cứu về bệnh hại keo Keo tai tượng (Acacia mangium), còn có tên khác là Keo lá to, Keo đại, Keo mỡ là một cây thuộc phân họ Trinh nữ (Mimosoideae). Keo tai tượng có nguồn gốc từ Australia, Papua New Guinea và Indonesia rồi đã trở thành một loài cây được trồng phổ biến ở vùng nhiệt đới. Từ những năm 1980, các lô hạt giống thu hái đã được gửi tới 90 nước trên thế giới. Trong đó có Philippin, Malaysia, Thái lan, Indonesia, Ấn Độ, Bangladesh, Trung Quốc và Việt Nam.

Keo tai tượng được đưa vào trồng ở Trung Quốc từ những năm 1960, tới năm 1997 có khoảng 200.000 ha keo được trồng ở phía Nam Trung Quốc gồm 4 tỉnh là Hải Nam, Quảng Đông, Quảng Tây và Vân Nam, tốc độ trồng n 6 rừng hàng năm khoảng 20. Keo được đưa vào khảo nghiệm và gây trồng ở Philipin từ những năm 1980. Trong đó Keo tai tượng được đánh giá là rất có triển vọng, năng suất của rừng trồng 10 tuổi đạt tới 32m3/ha/năm ở Talogon. Tính đến cuối năm 1990, diện tích rừng trồng Keo tai tượng ở Sabah - Malaysia khoảng 14.

Vào những năm ở thập kỉ 50 của thế kỉ XX, nhiều nhà khoa học nghiên cứ về bệnh cây đã tập trung vào việc xác định loài, mô tả nguyên nhân gây bệnh và điều kiện phát sinh, phát triển của bệnh. Đặc biệt ở các nước nhiệt đới [13], Roger L. Trong đó có một số bệnh hại lá của thông, keo, bạch đàn…[19]. (1954) [19] đã nghiên cứu một số bệnh hại trên cây keo.

Cây keo khô héo làm lá rụng và tàn lụi từ trên xuống dưới (chết ngược) do loài nấm hại lá Glomerella cingulata, đó là nguyên nhân chủ yếu của sự thiệt hại với loài Keo tai tượng trong vườn giống ở Papua New Guinea (FAO, 1981). Tại Malaysia, theo nghiên cứu của Lee (1993) [19] loài nấm này còn gây hại với các loài keo khác. Nhiều nhà nghiên cứu của Ấn Độ, Malaysia, Philipin, Trung Quốc cũng công bố nhiều loại nấm bệnh hại keo (Roger L. Tại hội nghị lần thứ III nhóm tư vấn nghiên cứu và phát triển của các loài Acacia, họp tại Đài Loan cuối tháng 6 năm 1964 nhiều đại biểu kể cả các tổ chức Quốc tế như CIFOR cũng như đã đề cập đến các vấn đề sâu bệnh hại các loài keo Acacia.