Tổng quan nghiên cứu

Bệnh dại là một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất với tỷ lệ tử vong gần như tuyệt đối khi xuất hiện triệu chứng lâm sàng. Theo ước tính, mỗi năm trên thế giới có khoảng 59.000 người tử vong do bệnh dại, trong đó 4% là trẻ em dưới 15 tuổi. Tại Việt Nam, bệnh dại lưu hành rộng khắp các tỉnh thành, với khoảng 70-110 người tử vong mỗi năm và gần 4.000 người phải điều trị dự phòng bằng vắc xin, chi phí ước tính hơn 3 tỷ đồng. Việc tiêm vắc xin kết hợp huyết thanh kháng dại (SAR) là biện pháp dự phòng duy nhất hiệu quả, giúp giảm tỷ lệ tử vong đáng kể, đặc biệt với các vết cắn gần trung khu thần kinh.

Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế (IVAC) đã nghiên cứu và sản xuất huyết thanh kháng dại từ huyết tương ngựa miễn dịch, sử dụng phương pháp Pope cải tiến từ năm 1996 với công suất khoảng 200.000 liều/năm. Tuy nhiên, quy trình này còn tồn tại hạn chế về độ tinh sạch sản phẩm, hàm lượng protein không mong muốn còn cao, ảnh hưởng đến chất lượng và an toàn khi sử dụng. Do đó, mục tiêu nghiên cứu của luận văn là hoàn thiện quy trình tinh chế huyết thanh kháng dại bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion nhằm nâng cao độ tinh sạch, hiệu suất thu hồi và đảm bảo các tiêu chuẩn chất lượng.

Nghiên cứu được thực hiện tại Viện IVAC trong năm 2021, tập trung vào giai đoạn tinh chế huyết thanh kháng dại sau khi đã qua xử lý sơ bộ bằng phương pháp Pope cải tiến. Kết quả nghiên cứu không chỉ góp phần nâng cao chất lượng sản phẩm huyết thanh kháng dại mà còn mở ra hướng phát triển quy mô sản xuất lớn hơn, giảm chi phí và tăng tính cạnh tranh trên thị trường trong nước và quốc tế.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình sắc ký tinh sạch protein, đặc biệt là kỹ thuật sắc ký trao đổi ion. Các khái niệm chính bao gồm:

  • Sắc ký trao đổi ion (Ion Exchange Chromatography - IEC): Phương pháp phân tách các phân tử dựa trên sự tương tác điện tích giữa protein và pha tĩnh (hạt nhựa mang điện tích). Protein mang điện tích trái dấu với hạt nhựa sẽ bị giữ lại, các tạp chất khác bị loại bỏ. Thay đổi pH và nồng độ muối trong dung dịch rửa giải giúp thu hồi protein mục tiêu.

  • Điểm đẳng điện (Isoelectric point - pI): Giá trị pH tại đó protein không mang điện tích tổng thể. Điều chỉnh pH dung dịch để protein mang điện tích phù hợp với hạt nhựa nhằm tối ưu hóa quá trình hấp phụ hoặc loại bỏ.

  • Phương pháp Flow-through: Protein mục tiêu không bám vào cột mà đi qua, trong khi các tạp chất bám lại trên hạt nhựa. Phương pháp này giúp loại bỏ tạp chất hiệu quả, giữ nguyên cấu trúc và hoạt tính của protein.

  • Kháng thể F(ab')2: Mảnh kháng thể được tạo ra từ IgG sau thủy phân bằng pepsin, giữ chức năng liên kết kháng nguyên nhưng giảm phản ứng phụ. Đây là thành phần chính trong huyết thanh kháng dại.

Ngoài ra, các kỹ thuật đánh giá chất lượng như SDS-PAGE, SE-HPLC, Western blot được sử dụng để xác định độ tinh sạch, đặc hiệu và hiệu giá của sản phẩm.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được thiết kế gồm hai nội dung chính:

  1. Thiết lập quy trình tinh chế bằng sắc ký trao đổi ion:

    • Nguồn nguyên liệu: Huyết thanh kháng dại đã qua xử lý sơ bộ bằng phương pháp Pope cải tiến.

    • Dung dịch đệm khảo sát: Hai loại dung dịch đệm được thử nghiệm là 20mM Acetate + 50mM NaCl và 20mM Phosphate + 50mM NaCl, pH 5.7, độ dẫn điện 5-6 mS/cm.

    • Khả năng bám mẫu: Thử nghiệm với các nồng độ protein 40, 60 và 80 mg/mL để xác định khả năng hấp phụ tối ưu trên gel Fractogel® EMD DEAE.

    • Thiết bị: Cột sắc ký XK 16/20, máy sắc ký lỏng cao áp Thermo, các thiết bị phân tích SDS-PAGE, SE-HPLC, Western blot.

    • Phân tích: Đánh giá hiệu suất thu hồi, độ tinh sạch (SE-HPLC, SDS-PAGE), hàm lượng protein, an toàn chung, chất gây sốt, endotoxin và vô khuẩn.

  2. Tinh chế thử nghiệm và đánh giá chất lượng huyết thanh kháng dại:

    • Quy trình: Tinh chế 5 lô huyết thanh (mỗi lô 1 lít) bằng phương pháp sắc ký trao đổi anion Flow-through với gel Fractogel® EMD DEAE, tốc độ dòng 2 cm/h, pH 5.7.

    • Đánh giá: So sánh độ sạch kháng thể (SE-HPLC, SDS-PAGE), đặc hiệu (Western blot), hiệu suất thu hồi, giới hạn tạp nhiễm (endotoxin giảm >7% so với mẫu ban đầu), an toàn chung và chất gây sốt theo tiêu chuẩn dược điển.

Thời gian nghiên cứu kéo dài trong năm 2021, với các bước khảo sát, tối ưu quy trình và đánh giá chất lượng sản phẩm hoàn chỉnh.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Lựa chọn dung dịch đệm tối ưu:

    • Dung dịch 20mM Acetate + 50mM NaCl cho hiệu suất thu hồi trung bình đạt khoảng 85%, độ tinh sạch cao hơn so với dung dịch Phosphate tương ứng (khoảng 78%).

    • Độ dẫn điện và pH ổn định trong khoảng 5-6 mS/cm và 5.7, phù hợp với điều kiện sắc ký trao đổi anion.

  2. Khả năng bám mẫu tối ưu:

    • Ở nồng độ protein 40 mg/mL, hiệu suất thu hồi đạt 88%, độ tinh sạch cao nhất (độ tinh sạch protein đạt trên 90% theo SE-HPLC).

    • Khi tăng nồng độ lên 60 và 80 mg/mL, hiệu suất thu hồi giảm nhẹ còn khoảng 80-82%, độ tinh sạch giảm do quá tải gel.

  3. Đánh giá chất lượng huyết thanh sau tinh chế:

    • SDS-PAGE và Western blot cho thấy băng protein chính ở vị trí 110 kDa tương ứng với kháng thể F(ab')2, độ tinh sạch tăng từ 72% (quy trình cũ) lên trên 90% (quy trình mới).

    • Endotoxin giảm hơn 7% so với mẫu ban đầu, chất gây sốt và an toàn chung đạt tiêu chuẩn dược điển Việt Nam.

    • Hiệu suất thu hồi protein trung bình đạt 85%, đảm bảo tính kinh tế cho quy trình sản xuất.

  4. So sánh với các nghiên cứu khác:

    • Kết quả tương tự hoặc vượt trội so với các nghiên cứu quốc tế sử dụng gel protein G hoặc kỹ thuật sắc ký ái lực, nhưng chi phí thấp hơn đáng kể nhờ sử dụng gel anion Fractogel® EDM DEAE.

    • Quy trình Flow-through giúp giảm số bước tinh chế, rút ngắn thời gian và giảm tổn thất protein.

Thảo luận kết quả

Việc lựa chọn dung dịch đệm acetate với pH 5.7 và độ dẫn điện 5-6 mS/cm tạo điều kiện tối ưu cho sự tương tác điện tích giữa kháng thể F(ab')2 và gel trao đổi anion, giúp loại bỏ hiệu quả các tạp chất như protein tế bào chủ, nội độc tố và các phân tử không mong muốn khác. Khả năng bám mẫu tối ưu ở 40 mg/mL protein giúp cân bằng giữa hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch, tránh quá tải gel làm giảm chất lượng sản phẩm.

Phương pháp Flow-through được chứng minh là phù hợp với đặc tính điện tích của kháng thể F(ab')2 (pI từ 5.85 đến 7.75), khi pH dung dịch thấp hơn pI, kháng thể mang điện tích dương và không bám vào gel anion, trong khi các tạp chất mang điện tích âm bị giữ lại. Điều này giúp thu nhận sản phẩm tinh khiết trong dịch thu.

So với các phương pháp sắc ký ái lực protein G hoặc lọc gel Sephadex, quy trình sắc ký trao đổi ion sử dụng gel Fractogel® EDM DEAE có ưu điểm về chi phí thấp, khả năng chịu áp lực cao, tốc độ dòng lớn (2 cm/h tương đương 6.7 ml/phút), phù hợp cho sản xuất quy mô lớn. Các kết quả phân tích SDS-PAGE, SE-HPLC và Western blot minh chứng cho độ tinh sạch và đặc hiệu cao của sản phẩm, đáp ứng các tiêu chuẩn chất lượng nghiêm ngặt.

Biểu đồ so sánh độ tinh sạch và hiệu suất thu hồi giữa các điều kiện dung dịch đệm và nồng độ mẫu có thể minh họa rõ ràng sự ưu việt của dung dịch acetate và nồng độ 40 mg/mL. Bảng tổng hợp kết quả kiểm tra endotoxin, chất gây sốt và an toàn chung cũng cho thấy sự cải thiện rõ rệt so với quy trình cũ.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Áp dụng quy trình sắc ký trao đổi ion với gel Fractogel® EDM DEAE và dung dịch đệm acetate pH 5.7 trong sản xuất huyết thanh kháng dại:

    • Mục tiêu: Nâng cao độ tinh sạch sản phẩm trên 90%, hiệu suất thu hồi trên 85%.

    • Thời gian: Triển khai trong vòng 6 tháng để chuyển đổi quy trình sản xuất.

    • Chủ thể thực hiện: Bộ phận sản xuất và nghiên cứu phát triển tại Viện IVAC.

  2. Tối ưu hóa nồng độ mẫu bơm vào cột ở mức 40 mg/mL để đảm bảo hiệu quả tinh chế và kéo dài tuổi thọ gel:

    • Mục tiêu: Giảm thiểu quá tải gel, duy trì chất lượng sản phẩm ổn định.

    • Thời gian: Thực hiện song song với việc đào tạo nhân viên vận hành.

    • Chủ thể thực hiện: Phòng kỹ thuật và vận hành.

  3. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cơ sở cho huyết thanh kháng dại tinh chế bằng sắc ký trao đổi ion:

    • Mục tiêu: Đảm bảo các chỉ tiêu an toàn, hiệu quả, độ tinh sạch, endotoxin, chất gây sốt theo dược điển Việt Nam.

    • Thời gian: Hoàn thành trong 3 tháng.

    • Chủ thể thực hiện: Phòng kiểm nghiệm và đảm bảo chất lượng.

  4. Đào tạo và nâng cao năng lực cho cán bộ kỹ thuật về quy trình sắc ký trao đổi ion và các kỹ thuật đánh giá chất lượng:

    • Mục tiêu: Đảm bảo vận hành quy trình chính xác, giảm sai sót và nâng cao hiệu quả sản xuất.

    • Thời gian: Tổ chức các khóa đào tạo trong 2 tháng.

    • Chủ thể thực hiện: Ban lãnh đạo Viện phối hợp với phòng đào tạo.

  5. Nghiên cứu mở rộng quy mô sản xuất và ứng dụng quy trình sắc ký trao đổi ion trong tinh chế các loại huyết thanh kháng khác:

    • Mục tiêu: Đa dạng hóa sản phẩm, tăng khả năng cạnh tranh trên thị trường.

    • Thời gian: Lập kế hoạch nghiên cứu trong 12 tháng tiếp theo.

    • Chủ thể thực hiện: Phòng nghiên cứu và phát triển sản phẩm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Các nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Sinh học thực nghiệm, Công nghệ sinh học:

    • Lợi ích: Hiểu rõ về ứng dụng sắc ký trao đổi ion trong tinh chế protein, kỹ thuật phân tích chất lượng sản phẩm sinh học.

    • Use case: Áp dụng trong nghiên cứu phát triển các sản phẩm sinh học khác như kháng thể, vaccine.

  2. Chuyên gia và kỹ thuật viên tại các viện nghiên cứu, nhà máy sản xuất dược phẩm sinh học:

    • Lợi ích: Nắm bắt quy trình tinh chế huyết thanh kháng dại hiện đại, tối ưu hóa quy trình sản xuất.

    • Use case: Cải tiến quy trình sản xuất, nâng cao chất lượng sản phẩm, giảm chi phí.

  3. Cơ quan quản lý chất lượng và an toàn thực phẩm, dược phẩm:

    • Lợi ích: Tham khảo tiêu chuẩn chất lượng, phương pháp đánh giá an toàn và hiệu quả sản phẩm huyết thanh kháng dại.

    • Use case: Xây dựng hoặc cập nhật quy định, tiêu chuẩn kiểm định sản phẩm.

  4. Các nhà hoạch định chính sách y tế và phòng chống dịch bệnh:

    • Lợi ích: Hiểu rõ vai trò của huyết thanh kháng dại trong dự phòng bệnh dại, tầm quan trọng của công nghệ sản xuất hiện đại.

    • Use case: Lập kế hoạch cung ứng, phân phối sản phẩm huyết thanh kháng dại hiệu quả, đảm bảo an toàn cho cộng đồng.

Câu hỏi thường gặp

  1. Sắc ký trao đổi ion là gì và tại sao được chọn để tinh chế huyết thanh kháng dại?

    Sắc ký trao đổi ion là kỹ thuật phân tách dựa trên tương tác điện tích giữa protein và hạt nhựa mang điện tích trái dấu. Phương pháp này giúp loại bỏ tạp chất hiệu quả, giữ nguyên cấu trúc và hoạt tính của kháng thể F(ab')2. So với các kỹ thuật khác, nó có chi phí thấp, dễ mở rộng quy mô và phù hợp với sản xuất công nghiệp.

  2. Điểm đẳng điện (pI) ảnh hưởng thế nào đến quá trình sắc ký trao đổi ion?

    Điểm đẳng điện là pH tại đó protein không mang điện tích. Khi pH dung dịch thấp hơn pI, protein mang điện tích dương và ngược lại. Việc điều chỉnh pH giúp protein mục tiêu hoặc tạp chất bám hoặc không bám vào gel sắc ký, từ đó tối ưu hóa quá trình tinh chế.

  3. Phương pháp Flow-through trong sắc ký trao đổi ion có ưu điểm gì?

    Phương pháp Flow-through cho phép protein mục tiêu không bám vào cột mà đi qua, trong khi các tạp chất bị giữ lại trên gel. Điều này giúp giảm số bước tinh chế, giữ nguyên hoạt tính protein và tăng hiệu suất thu hồi.

  4. Làm thế nào để đánh giá độ tinh sạch và đặc hiệu của huyết thanh kháng dại sau tinh chế?

    Độ tinh sạch được đánh giá bằng kỹ thuật SE-HPLC và SDS-PAGE, cho biết tỷ lệ protein mục tiêu so với tạp chất. Đặc hiệu được xác định bằng Western blot, phát hiện kháng thể F(ab')2 đặc hiệu với kháng nguyên dại. Các chỉ tiêu an toàn như endotoxin, chất gây sốt cũng được kiểm tra theo tiêu chuẩn dược điển.

  5. Quy trình sắc ký trao đổi ion có thể áp dụng cho các sản phẩm sinh học khác không?

    Có, quy trình này rất linh hoạt và được sử dụng rộng rãi trong tinh chế các loại protein, kháng thể, vaccine và các sản phẩm sinh học khác nhờ khả năng phân tách chọn lọc, giữ nguyên hoạt tính và dễ dàng mở rộng quy mô sản xuất.

Kết luận

  • Hoàn thiện quy trình tinh chế huyết thanh kháng dại bằng sắc ký trao đổi ion với gel Fractogel® EMD DEAE và dung dịch đệm acetate pH 5.7 đã nâng cao độ tinh sạch sản phẩm lên trên 90% và hiệu suất thu hồi đạt khoảng 85%.

  • Phương pháp Flow-through giúp loại bỏ hiệu quả các tạp chất như protein tế bào chủ, endotoxin, đồng thời giữ nguyên cấu trúc và hoạt tính của kháng thể F(ab')2.

  • Quy trình mới giảm chi phí sản xuất, rút ngắn thời gian tinh chế và phù hợp với sản xuất quy mô công nghiệp.

  • Kết quả đánh giá chất lượng sản phẩm đáp ứng các tiêu chuẩn an toàn, hiệu quả theo dược điển Việt Nam.

  • Đề xuất triển khai áp dụng quy trình trong sản xuất thực tế, đồng thời mở rộng nghiên cứu ứng dụng cho các sản phẩm huyết thanh kháng khác nhằm nâng cao năng lực sản xuất và đáp ứng nhu cầu thị trường.

Hành động tiếp theo là tổ chức đào tạo nhân viên vận hành, xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cơ sở và tiến hành chuyển giao quy trình sản xuất quy mô lớn nhằm góp phần nâng cao hiệu quả phòng chống bệnh dại tại Việt Nam.