MỞ ĐẦU An toàn thực phẩm đang là mối quan tâm hàng đầu của toàn xã hội. An toàn thực phẩm trong sản phẩm chăn nuôi không chỉ đơn thuần là sản phẩm (thịt, trứng, sữa) không nhiễm bẩn, ôi thiu, nhiễm khuẩn (yếu tố gây ngộ độc cấp tính), mà còn ở chỗ sản phẩm chứa các chất gây ra ngộ độc tích luỹ, mãn tính hay trƣờng diễn (hocmon, kháng sinh, độc chất). Trong vô số các nguyên nhân dẫn đế n viê ̣c mấ t an toàn vê ̣ sinh thƣ̣c phẩ m , thì vấn đề về dƣ lƣợng thuốc kháng sinh và tồn dƣ chất kích thí ch tăng tro ̣ng trong thịt gia súc gia cầm cũng là thực trạng nan giải và đáng báo động. Với mô ̣t lƣơ ̣ng thƣ̣c phẩ m khổ ng lồ tƣ̀ đô ̣ng vâ ̣t đang đƣơ ̣c tiêu thu ̣ trên thi ̣trƣờng , ít ai nghĩ đến viê ̣c mỗi ngày trong cơ thể chúng ta đa ng phải dần tić h lũy dƣ lƣơ ̣ng chấ t kić h thić h tăng tro ̣ng và thuố c kháng sinh.
Nguyên nhân do ngƣời dân sƣ̉ du ̣ng rấ t tùy tiê ̣n các loại thức ăn tăng trọng và thuốc kháng sinh nhằm ngăn ngừa , trị bệnh và giúp vật nuôi mau ăn chó ng lớn. Hâ ̣u quả là dƣ lƣơ ̣ng chấ t kích thích và thuố c kháng sinh trong thiṭ gia súc, gia cầ m vƣơ ̣t ngƣỡng cho phép gấ p nhiề u lầ n , tuy không gây ngô ̣ đô ̣c cấ p tiń h tƣ́c thời, nhƣng sẽ gây nguy ha ̣i về lâu dài cho sƣ́c khỏe của ngƣờ i tiêu dùng. Sulfonamid (SAs) là một nhóm thuốc kháng sinh tổng hợp đóng một vai trò quan trọng và hiệu quả trong việc hạn chế sự nhiễm trùng do vi khuẩn và vi sinh vật trong hệ thống tiêu hóa của vật nuôi. Vì vậy, chúng đƣợc sử dụng trong thức ăn chăn nuôi nhằm kích thích tăng trƣởng, ngăn chặn và điều trị một loạt các bệnh ở gia súc gia cầm nhƣ các bệnh về tiêu hóa hay hô hấp.
Song hệ quả không thể tránh khỏi khi sử dụng nhóm các chất kháng sinh này là tồn dƣ của chúng trên thịt gia súc gia cầm, gây nguy cơ kháng thuốc kháng sinh của vi sinh vật, làm giảm sức đề kháng của vật nuôi, và gây hại cho sức khỏe con ngƣời nhƣ: ung thƣ tuyến giáp, sốc phản vệ và kháng thuốc [1]. Ngộ độc thực phẩm thƣờng xảy ra do thiếu sót trong công tác kiểm tra, thanh tra từ nguyên liệu dùng để chế biến thực phẩm, do sơ xuất trong nấu nƣớng, vệ sinh. 10 Việc nghiên cứu xác định dƣ lƣợng SAs trong thịt gia súc gia cầm đã đƣợc nhiều tác giả trên thế giới quan tâm. Tuy nhiên, ở Việt Nam, vấn đề này vẫn chƣa đƣợc nghiên cứu sâu.
Việc nghiên cứu và đƣa ra phƣơng pháp xác định nhanh, chính xác SAs giúp cho công tác thanh tra kiểm tra đƣợc chặt chẽ, đảm bảo an toàn cho ngƣời tiêu dùng. Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ là phƣơng pháp hiện đại, có độ nhạy cao, cho phép xác định nhanh và chính xác. Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ(LC-MS/MS) xác đinh dư lượng một số kháng sinh nhóm Sulfonamid trong thịt gia súc gia cầm ”. Với nội dung nghiên cứu nhƣ sau: - Tối ƣu các điều kiện chạy máy LC-MS/MS để tách và xác định các SAs - Tối ƣu quá trình xử lý mẫu.
- Ứng dụng phân tích trên một số mẫu thực tế. 11 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Giới thiệu về kháng sinh nhóm sulfonamid (SAs) 1.1 Lịch sử phát hiện [6] Năm 1935 ngƣời ta thấy chất màu prontosil đƣợc chuyển hóa invitro thành hoạt chất sulfanilamide, một dẫn xuất ngăn ngừa đƣợc nhiễm liên cầu ở chuột. Sau đó các sulfonamid khác đƣợc tổng hợp, là những chất chuyển hóa của sulfanilamide với các vị trí thế N1 và N4.
Trong đó sulfanilamide và sulfadiazine đƣợc cấp phép vào năm 1939 và 1941. Theo các nhà Dƣợc học phân loại thì Sulfonamid là một nhóm thuốc có tác động tĩnh khuẩn miễn dịch giữ vai trò chủ yếu trong việc loại bỏ tận gốc sự nhiễm trùng. Do đó, các sulfonamid trở thành những tác nhân hóa trị liệu đầu tiên đƣợc dùng để ngăn ngừa và điều trị nhiễm khuẩn toàn thân ở ngƣời. Từ đó tới nay, một loạt sulfonamid khác đƣợc cấp phép, mặc dù hiện nay, hiếm khi chúng đƣợc dùng đơn độc mà thƣờng hay kết hợp với một vài chất khác.
Phân loại SAs Các SAs đƣợc phân loại theo khả năng hấp thu và thời gian bài thải chúng ra khỏi cơ thể, đa số bài thải qua đƣờng thận bằng cách khuếch tán thụ động. Tuy nhiên, có một số bị tái hấp thụ ở ống thận làm cho chúng duy trì lâu hơn trong cơ thể [8]. Dựa vào thời gian tác dụng có thể chia SAs thành 4 nhóm nhƣ sau: - SAs tác động toàn thân, bao gồm: + SAs tác động nhanh (3-6 giờ), bài thải nhanh: sulfamerazin, sulfadimidin, sulfathiazole. + SAs nửa chậm (6-10 giờ): sulfapyridin, sulfamethoxazol, sulfadiazine.
12 +SAs bài thải chậm (10-12 giờ): sulfamethoxypyridazin, sulfadimethoxin, sulfadoxin. - SAs kháng khuẩn đƣờng ruột: sulfaguanidin,phtalylsulfathiazon. - SAs tác động tại chỗ (thuốc nhỏ mắt): sulfacetamid,sulfadiazine bạc. - SAs trị cầu trùng (thƣờng kết hợp với nhóm diaminopyrimidin): sulfadimidin, solfaquinoxalin, sulfadimethoxin,sulfadoxin.3 Cấu tạo của SAs Thay thế các gốc R1, R2, R3 khác nhau, sẽ cho các SAs khác nhau Bảng 1.1: Cấu trúc hoá học của một số SAs đƣợc xác định trong đề tài Khối SAs Công thức lƣợng STT pKa Công thức cấu tạo phân tử phân tử (g/mol) Sulfisomidine (SIM) 1 C12H14N4O2S 278,331 7,35 4-amino-N-(2,6- dimethylpyrimidin-4-yl) benzenesulfonamid Sulfadiazine (SD) 2 C10H10N4O2S 250,278 6,5 4-amino-N-pyrimidin- 2-yl-benzenesulfonamid Sulfathiazole 3 C9H9N3O2S2 255,319 7,24 (STZ) 13 4-amino-N-(1,3-thiazol- 2-yl)benzenesulfonamid Sulfapyridine (SP) 4 C11H11N3O2S 249,29 8,54 (4-amino-N-pyridin-2- ylbenzenesulfonamid) Sulfamerazine (SM) 5 C11H12N4O2S 264,305 6,98 4-amino-N-(4- methylpyrimidin-2-yl) benzenesulfonamid Sulfamonomethoxine (SMM) 4-Amino-N-(6- 6 C11H12N4O3S 280,30 6,05 methoxy-4- pyrimidinyl)benzenesulf onamid Sulfachloropyridazine (SCP) 7 C10H9ClN4O2S 284,72 5,90 N’-(6-Chloro-3- pyridazinyl)sulfanilamid e Sulfamethoxazole (SMX) 8 C10H11N3O3S 253,279 5,81 4-amino-N-(5- methylisoxazol-3-yl)- benzenesulfonamid 14 Sulfisoxazole (SSA) 9 C11H13N3O3S 267,30 4,83 4-amino-N-(3,4- dimethyl-1,2-oxazol-5- yl)benzenesulfonamid Sulfadimethoxine (SDM) 4-amino-N-(2,6- 10 dimethoxypyrimidin-4- C12H14N4O4S 310,33 6,21 yl) benzenesulfonamid đồng vị của SDM: trong phân tử có Sulfadimethoxine-d4 C12H10D4N4O4 bốn nguyên tử hidro 1H bị thay thế 11 314 6,21 (IS) S bởi bốn nguyên tử deuteri 2H, đƣợc dùng làm nội chuẩn 1.4 Tác dụng của SAs Cơ chế tác động: SAs là một hợp chất hữu cơ có chứa các gốc SO2NH2 (amid của acid sulfonic).
Cấu trúc phân tử của nó tƣơng tự nhƣ p-aminobenzoic acid (PABA) là cần thiết trong các vi khuẩn sinh vật, nhƣ một chất nền của enzym dihydropteroat cho sự tổng hợp của acid tetrahydrofolic (THF). Cơ chế tác dụng kìm khuẩn của SAs là do nó cạnh tranh với acid PABA trong tế bào vi khuẩn, làm cho việc tổng hợp và vận chuyển acid folic (động vật có vú dùng acid folic có trong thực phẩm còn vi khuẩn phải tổng hợp folic) thành nucleoprotein cần cho mọi tế bào sống của vi khuẩn bị ngƣng trệ, gây rối loạn sự sinh sản và phát triển của vi khuẩn. PABA kết hợp với pteroic acid hoặc glutamic để tạo pteroylglutamic acid (PGA), chất này nhƣ một coenzyme trong sự tổng hợp purin và timin. PGA cũng là một phần của phân tử B12 có liên quan tới sự biến dƣỡng acid amin và purin.
Do đó khi thiếu 15 PABA sẽ gây thiếu purin, acid nucleic. Điều này cũng giải thích tại sao các vi khuẩn tự tổng hợp đƣợc PABA thì đề kháng với SAs và tại sao thymin, purin, methionin, và một số amin khác lại đối kháng hiệu quả với SAs. Do đó vi khuẩn bị tiêu diệt trƣớc sức đề kháng của cơ thể hoặc nhờ tác dụng của thuốc. Chúng đƣợc sử dụng trong phòng và điều trị nhiễm trùng do vi khuẩn, đái tháo đƣờng, phù, tăng huyết áp, và bệnh gút… Các sulfonamid có tác dụng kháng khuẩn cho hệ miễn dịch giữ vai trò chủ yếu trong loại trừ tận gốc sự nhiễm trùng.
Sulfonamid có hiệu quả cao trong giai đoạn đầu của nhiễm trùng cấp tính vì giai đoạn này vi khuẩn có mức biến dƣỡng cao, dễ kết hợp với Sulfonamid, thêm vào đó khả năng thực bào còn mạnh và sự khuếch tán của thuốc chƣa bị cản trở bởi quá trình xơ hóa trong viêm mãn tính. Chúng có khả năng kháng khuẩn trên vi khuẩn Gram dƣơng, Gram âm, Protozoa [9]. Tác dụng phụ của SAs: Các loại SAs đƣợc các nhà sản xuất đƣa vào trong thức ăn gia súc, gia cầm, các thuốc chống mốc, thuốc chống oxy hóa giúp sinh vật tăng sức đề kháng, phòng trị nhiễm khuẩn đồng thời giống nhƣ một chất kích thích tăng trƣởng đem lại lợi ích cho ngƣời chăn nuôi. Tuy nhiên những năm gần đây xảy ra hiện tƣợng kháng kháng sinh và tồn dƣ kháng sinh trong thịt, cá, tôm…do ngƣời nông dân sử dụng không đúng cách và quá nhiều thuốc kháng sinh và không đảm bảo thời gian ngƣng sử dụng trƣớc khi thu hoạch, làm cho kháng sinh tích tụ trong thịt.
Khi ngƣời tiêu dùng sử dụng thực phẩm có chứa dƣ lƣợng kháng sinh SAs trong thịt, tôm, cá, trứng, sữa.sau một thời gian dài sử dụng chúng sẽ tích lũy trong cơ thể, có thể gây hiện tƣợng kháng kháng sinh ở ngƣời, làm mất đi cả vi khuẩn có lợi, ngoài ra SAs dễ bị acetyl hóa ở gan thành N4- acetyl sulfonamid khó tan trong nƣớc, đồng thời từ quản cầu thận tới ống dẫn tiểu, SA đƣợc làm đậm đặc 50 lần, sự bài tiết H+ vào ống thận làm nƣớc tiểu càng acid hơn, giảm tính tan của sulfonamid từ đó trở thành tinh thể trong ống thận, gây hiện tƣợng kết tinh ở đƣờng tiết niệu gây viêm thận và sỏi thận, tiểu ra máu. Sulfonamid có khả năng gây ra một loạt các phản ứng bất lợi, bao gồm cả rối loạn đƣờng tiết niệu, rối loạn tạo máu , rối loạn chuyển hóa porphyrin, và 16 phản ứng quá mẫn cảm. Khi sử dụng với liều lƣợng lớn, chúng có thể gây ra phản ứng dị ứng mạnh mẽ. Hai hội chứng nghiêm trọng nhất là hội chứng Stevens- Johnson và hoại tử biểu bì độc hại (cũng đƣợc gọi là hội chứng Lyell).
SAs hấp thu tốt qua đƣờng tiêu hóa, ngoại trừ các SAs có tác động tại chỗ.5 Tình hình sử dụng kháng sinh Sulfonamid SAs là một trong những nhóm chất lâu đời nhất của các hợp chất kháng khuẩn. Chúng đƣợc sử dụng lâm sàng trong 50 năm và lần đầu tiên đƣợc đăng ký tại Úc năm 1940. Tại nhiều quốc gia, việc sử dụng SAs trong chăn nuôi đƣợc xem xét trên nhiều khía cạnh nhƣ dƣ lƣợng còn lại trong thịt sau giết mổ, mức độ ảnh hƣởng tới sức khỏe con ngƣời…trở thành vấn đề khá nhạy cảm trong thƣơng mại quốc tế.