ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN PHƯỚC MINH NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG SINH ERYTHROMYCIN TRONG TÔM, CÁ BẰNG KỸ THUẬT SÓNG VUÔNG QUÉT NHANH TRÊN CỰC GIỌT CHẬM VÀ KHẢ NĂNG ĐÀO THẢI LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT Tp. Hồ Chí Minh năm 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN PHƯỚC MINH NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG SINH ERYTHROMYCIN TRONG TÔM, CÁ BẰNG KỸ THUẬT SÓNG VUÔNG QUÉT NHANH TRÊN CỰC GIỌT CHẬM VÀ KHẢ NĂNG ĐÀO THẢI Chuyên ngành: Chế Biến Thực Phẩm và Đồ Uống Mã số chuyên ngành: 62.01 Phản biện độc lập 1: GS.TS Trần Thị Luyến Phản biện độc lập 2: TS Nguyễn Như Trí Phản biện 1: PGS.TS Ngô Mạnh Thắng Phản biện 2: TS Nguyễn Bá Hoài Anh Phản biện 3: TS Nguyễn Phước Thành NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1.
Trần Bích Lam 2. Nguyễn Trọng Giao Tp. Hồ Chí Minh năm 2012 LỜI CAM ĐOAN Tác giả xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tác giả. Các kết quả nghiên cứu và các kết luận trong luận án này là trung thực, và không sao chép từ bất kỳ một nguồn nào và dƣới bất kỳ hình thức nào.
Việc tham khảo các nguồn tài liệu (nếu có) đã đƣợc thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng theo yêu cầu. Tác giả luận án Nguyễn Phƣớc Minh i TÓM TẮT LUẬN ÁN Luận án đã xây dựng đƣợc phƣơng pháp sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm trong việc phân tích dƣ lƣợng kháng sinh erythromycin trong tôm, cá đạt đƣợc giới hạn phát hiện (LoD = 0,52 ppb), đáp ứng yêu cầu giới hạn dƣ lƣợng cho phép theo tiêu chuẩn quốc tế (Codex, FAO/WHO, EU, Mỹ, Canada, Úc), rút ngắn thời gian phân tích, đơn giản hóa kỹ thuật, tiết kiệm chi phí. Giải thích đƣợc cơ chế xuất hiện sóng của erythromycin, từ đó khái quát hoá và đƣa ra đƣợc giả thuyết dự đoán khả năng nhận danh và định lƣợng từng họ kháng sinh nhƣ phenicol, nitrofuran, fluoroquinolon (thƣờng gặp trong nuôi trồng thuỷ sản) bằng kỹ thuật sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm. Kết quả luận án đã cho thấy rằng các dẫn xuất erythromycin không chỉ đƣợc chuyển hoá từ Sacchropolyspora erythrea bằng con đƣờng lên men, mà còn erythromycin A khi vào cơ thể tôm cá, dƣới tác dụng của các enzyme oxy hóa khử và enzyme chuyển methyl hóa, chuyển thành erythromycin C, E, F, sau đó bị đào thải.
Luận án cũng đƣa ra đƣợc giả thuyết giải thích cơ chế chuyển hoá erythromycin trong tôm càng xanh, cá rô phi khi nuôi. Luận án đã đánh giá và rút ra đƣợc quy luật thời gian ngƣng kháng sinh erythromycin trƣớc thu hoạch trên đối tƣợng tôm càng xanh và cá rô phi. ii ABSTRACT A new sensitive analytical approach for determination of erythromycin A in giant freshwater prawn (Macrobrachium rosenbergii), tilapia (Oreochromis niloticus) by a fast scanning stripping square wave voltammetry using the dropping mercury electrode (PSA- F) was developed and validated to meet requirements of detection limit, low cost and simple technique. Clarify the mechanism of peak appearance of erythromycin on basic of square wave voltammetry.
From that point, a general hypothesis about the identified and quantified ability for antibiotic groups such as phenicols, nitrofurans, fluoroquinolones (in aquaculture) by square wave voltammetry at dropping mercury electrode was clearly introduced. Overcome the opinion that derivatives of erythromycins were only metabolized by Sacchropolyspora erythrea in fermentation. Specifically was an evidence of biotransformation of erythromycin A to erythromycin C, E, F during prawn and tilapia aquaculture. From this point, a hypothesis of bio-transformative mechanism in these species was also established.
Investigate the elimination and bio-transformation of erythromycin A in giant freshwater prawn and tilapia so that appropriated withdrawal time periods were outlined to each specie. iii LỜI CÁM ƠN Nhìn lại những gì đã qua, trƣớc tiên em xin bày tỏ tình thƣơng mến và lòng biết ơn sâu sắc đến Ba Mẹ đã nuôi dƣỡng và lo lắng cho em đến ngày hôm nay, không chỉ là giá trị vật chất mà còn là những giá trị tinh thần hết sức quý báu không gì so sánh đƣợc. Em xin trân trọng gửi lời cám ơn đến thầy Nguyễn Trọng Giao và cô Trần Bích Lam những ngƣời thầy cô hƣớng dẫn rất đáng kính, ngƣời đã tận tình chỉ dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện luận án. Sự biết ơn này cũng xin đƣợc chân thành gửi đến quý thầy cô: thầy Lê Văn Việt Mẫn, thầy Nguyễn Hoàng Dũng, cô Đống Thị Anh Đào, cô Phan Ngọc Hoà tại Bộ Môn Công Nghệ Thực Phẩm, Khoa Kỹ Thuật Hoá Học, ĐH Bách Khoa Tp.
HCM; thầy Nguyễn Phƣớc Thành - Trƣờng ĐH Tôn Đức Thắng; thầy Nguyễn Bá Hoài Anh - Trƣờng ĐH Khoa Học Tự Nhiên Tp. HCM; thầy Nguyễn Nhƣ Trí - ĐH Nông Lâm Tp. HCM cùng bạn bè gần xa đã có những định hƣớng và góp ý hết sức quý báo cho em trong suốt thời gian qua. Sau cùng, em rất tự hào và vinh dự khi đƣợc học tập dƣới mái trƣờng ĐH Bách Khoa Tp.
HCM, một trong những trƣờng ĐH hàng đầu ở Việt Nam với những điều kiện học tập thuận lợi nhất. iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN. iv MỤC LỤC. v DANH MỤC CÁC HÌNH.
viii DANH MỤC CÁC BẢNG. x DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT. xi TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI. 1 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU.
3 TÍNH MỚI CỦA ĐỀ TÀI. 4 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN. Tồn dƣ kháng sinh đối với an toàn thực phẩm .1 Thực trạng về tình hình sử dụng kháng sinh trong thú y và chăn nuôi .2 Ảnh hưởng của chất kháng sinh tồn dư đến chất lượng thực phẩm .3 Những qui định về sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi – thú y .4 Một số thông tin về tình trạng dư lượng kháng sinh và vệ sinh an toàn thủy hải sản 8 1.2 Erythromycin và biến đổi của erythromycin trên cơ thể thủy sản .2 Con đường sinh tổng hợp của erythromycin bởi Saccharopolyspora erythraea .3 Chuyển hóa và đào thải erythromycin trên cơ thể thủy sản .4 Các vi khuẩn gây bệnh trên tôm càng xanh, cá rô phi và tác dụng của erythromycin .3 Các kỹ thuật dùng để phân tích erythromycin .1 Phương pháp ELISA .2 Phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ.3 Phương pháp Von-ampe .4 Những vấn đề tồn tại cần giải quyết. 29 CHƢƠNG II.
NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .1 Nguyên vật liệu, thiết bị dụng cụ, hóa chất .1 Nguyên vật liệu .2 Thiết bị dụng cụ .2 Phƣơng pháp nghiên cứu .1 Sơ đồ tiến trình nghiên cứu .2 Phương pháp thực nghiệm .3 Phương pháp xử lý số liệu. 40 CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .1 Các điều kiện phù hợp cho quá trình định lƣợng erythromycin bằng phƣơng pháp sóng vuông quét nhanh và stripping sóng vuông quét nhanh .1 Nghiên cứu thăm dò định hướng và chọn vùng quét thế .2 Nghiên cứu tìm dung dịch nền và pH thích hợp .3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ dung dịch nền .4 Nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi hoà tan erythromycin .5 Nghiên cứu các điều kiện chạy máy thích hợp .6 Nghiên cứu ảnh hưởng của các ion gây nhiễu .7 Nghiên cứu xây dựng đường chuẩn .8 Nghiên cứu lựa chọn quy trình trích ly mẫu.2 Các thông số thẩm định phƣơng pháp .1 Khoảng tuyến tính.2 Giới hạn phát hiện .3 Độ đúng, độ chính xác, hiệu suất thu hồi .4 Đánh giá khả năng nhận danh erythromycin A với các kháng sinh khác .5 So sánh đối chứng kết quả SWV với LC-MS/MS .6 So sánh hiệu quả kinh tế giữa SWV với các phương pháp khác .3 Ứng dụng phân tích erythromycin trên các mẫu thực tế tôm, cá tại các địa phƣơng .1 Tôm càng xanh .4 Xác định quy luật chuyển hóa sinh học và đào thải kháng sinh erythromycin trên cơ thể thủy sản khi nuôi .1 Đào thải erythromycin A trong cơ thịt thuỷ sản .2 Chuyển hoá sinh học của kháng sinh gốc. 93 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ.
94 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 95 vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Công thức cấu tạo của erythromycin .2: Con đƣờng sinh tổng hợp các dẫn xuất erythromycin .3: Nguyên lý khái quát của kỹ thuật sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm.4: Nguyên lý khái quát của kỹ thuật Stripping sóng vuông trên cực giọt chậm .1: Sơ đồ nghiên cứu phân tích erythromycin .1: Các nhóm chức trong công thức cấu tạo của erythromycin .2: Phổ erythromycin ghi 5 lần trong nền đệm Amoni axetat 0,1 M; pH 8,0 .3: Phổ erythromycin trên nền Natri axetat 0,1M .4: Phổ erythromycin ghi 5 lần trên nền Amoni axetat 0,1M .5: Phổ erythromycin ghi 5 lần trên nền Citrat – Phosphat 0,1M .6: Phổ erythromycin ghi 5 lần trên nền Borax 0,1M .7: Phổ erythromycin ghi 5 lần trên nền Tris 0,1M .8: Phổ erythromycin ghi 5 lần trên nền Amoni axetat pH 8,0 .9: Ảnh hƣởng của nồng độ dung dịch nền Amoni axetat đến cƣờng độ dòng của erythromycin A .10: Phổ erythromycin ghi 5 lần khi dùng dung môi hòa tan .11: Phổ erythromycin theo chiều quét .12: Phổ erythromycin ghi 5 lần ở Vstart .13: Ảnh hƣởng của Vstart đến cƣờng độ dòng của erythromycin A .14: Phổ erythromycin ghi 5 lần ở Vstep .15: Ảnh hƣởng của Vstep đến cƣờng độ dòng của erythromycin A .16: Phổ erythromycin ghi 5 lần ở Vpulse.17: Ảnh hƣởng của Vpulse đến cƣờng độ dòng của erythromycin A .18: Phổ erythromycin ghi 5 lần ở Tdrop= 1.19: Ảnh hƣởng của Tdrop đến cƣờng độ dòng của erythromycin A .20: Phổ erythromycin ghi 5 lần với Telectrolise .21: Ảnh hƣởng của Telectrolise đến cƣờng độ dòng của erythromycin A .22: Phổ erythromycin ghi 5 lần ở Velectrolise .23: Ảnh hƣởng của Velectrolise đến cƣờng độ dòng của erythromycin A.24: Đƣờng chuẩn erythromycin A trên dung dịch nền Amoni axetat 0,1 M, pH 8,0 .25: Hiệu suất thu hồi erythromycin trên tôm càng xanh khi so sánh các quy trình .26: Hiệu suất thu hồi erythromycin trên cá rô phi khi so sánh các quy trình .27: Nồng độ erythromycin đƣợc xác định trên mẫu tôm càng xanh ở các thời điểm và mức nồng độ khác nhau .28: Nồng độ erythromycin đƣợc xác định trên mẫu cá rô phi ở các thời điểm và mức nồng độ khác nhau .29: Đƣờng chuẩn erythromycin trên nền mẫu tôm càng xanh .30: Đƣờng chuẩn erythromycin trên nền mẫu cá rô phi .31: Thực trạng nhiễm erythromycin ở tôm càng xanh tại các tỉnh ĐBSCL .32: Thực trạng nhiễm erythromycin ở cá rô phi tại các tỉnh ĐBSCL .33: Đào thải hàm lƣợng erythromycin A trong cơ thịt tôm càng xanh đã đƣợc cho ăn 50 và 100 mg.kg-1 thể trọng.ngày-1 trong 7 ngày .34: Đào thải hàm lƣợng erythromycin A trong cơ thịt cá rô phi đã cho ăn 50 và 100 mg.kg-1 thể trọng.ngày-1 trong 7 ngày .