Luận văn thạc sĩ: Ứng dụng hạt từ gắn kháng thể để phát hiện Salmonella spp trong thực phẩm

Luận văn thạc sĩ kỹ thuật nghiên cứu công nghệ sinh học đánh giá khả năng ứng dụng hạt từ gắn kháng thể kháng salmonella spp để phát, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân,

• Tác giả: Đỗ Thị Kim Yến
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Nguyệt Thu
• Trường học: Đại học Bách Khoa
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Ứng Dụng Hạt Từ Gắn Kháng Thể Phát Hiện Salmonella Trong Thực Phẩm
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. VI KHUẨN SALMONELLA
• 1.1.1. Đặc điểm sinh học
• 1.1.2. Đặc điểm kháng nguyên
• 1.1.3. Vị trí phân loại và danh pháp
• 1.1.4. Đặc điểm sinh hóa
• 1.1.5. Salmonella gây bệnh ở người và động vật bậc cao
• 1.1.5.1. Đặc điểm gây bệnh
• 1.1.5.2. Cơ chế gây bệnh
• 1.2. TÌNH HÌNH NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM DO SALMONELLA
• 1.2.1. Trên thế giới
• 1.2.2. Tại Việt Nam
• 1.3. CÁC QUY ĐỊNH VỀ SALMONELLA TRONG THỰC PHẨM
• 1.4. PHÁT HIỆN SALMONELLA BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY THEO ISO 6579:2002
• 1.4.1. Tiền tăng sinh
• 1.4.2. Tăng sinh chọn lọc
• 1.4.3. Phân lập trên môi trường thạch chọn lọc
• 1.4.4. Khẳng định bằng phản ứng sinh hóa và huyết thanh học
• 1.5. MÔI TRƯỜNG THẠCH MÀU DÙNG PHÂN LẬP SALMONELLA
• 1.5.1. Môi trường thạch màu dựa trên khả năng tạo enzyme galactosidase
• 1.5.2. Môi trường thạch màu dựa trên khả năng tạo enzyme esterase
• 1.5.3. Môi trường thạch màu kết hợp cả hai đặc tính tạo enzyme galactosidase và enzyme esterase
• 1.6. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÁCH MIỄN DỊCH TỪ (IMS)
• 1.6.1. Kháng thể
• 1.6.2. Nguyên tắc hoạt động
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM
• 2.1.1. Các loại môi trường và hóa chất
• 2.1.2. Vật liệu thí nghiệm
• 2.1.3. Hạt từ và kháng huyết thanh thỏ nhóm O đa giá Salmonella
• 2.1.4. Chủng vi khuẩn
• 2.1.5. Mẫu thí nghiệm
• 2.2. PHƯƠNG PHÁP
• 2.2.1. Sơ đồ nội dung thực hiện đề tài
• 2.2.2. Phương pháp ngưng kết kháng thể với vi khuẩn
• 2.2.3. Phương pháp tinh chế kháng thể đặc hiệu kháng Salmonella bằng sắc ký ái lực qua cột Hitrap-Protein A
• 2.2.4. Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide 12%-SDS
• 2.2.5. Phương pháp Bradford (xác định nồng độ kháng thể)
• 2.2.6. Phương pháp gắn kháng thể vào hạt từ nhờ carbodiimide
• 2.2.7. Phương pháp xác định hiệu suất cộng hợp kháng thể vào hạt từ
• 2.2.8. Phương pháp ngưng kết phức hợp hạt từ kháng thể với vi khuẩn
• 2.2.9. Phương pháp đếm khuẩn lạc (xác định mật độ vi khuẩn)
• 2.2.10. Phương pháp tách miễn dịch từ (IMS)
• 2.2.11. Phương pháp nuôi cấy chuẩn phát hiện Salmonella trong thực phẩm ISO 6579:2002
• 2.2.12. Phương pháp phát hiện Salmonella trong thực phẩm bằng IMS cấy trực tiếp trên thạch chọn lọc XLD hoặc HE
• 2.2.13. Phương pháp phát hiện Salmonella trong thực phẩm bằng IMS tăng sinh trong môi trường chọn lọc RV
• 2.2.14. Phương pháp phát hiện Salmonella trong thực phẩm bằng IMS cấy trực tiếp trên thạch màu SCA
• 2.2.15. So sánh và đánh giá các phương pháp IMS kết hợp nuôi cấy với phương pháp nuôi cấy chuẩn để phát hiện Salmonella trong thực phẩm
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
• 3.1. CỘNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ HẠT TỪ GẮN KHÁNG THỂ KHÁNG SALMONELLA SPP.
• 3.1.1. Tinh chế kháng thể
• 3.1.2. Kiểm tra kháng thể sau tinh chế
• 3.1.3. Cộng hợp kháng thể sau tinh chế lên hạt từ
• 3.1.4. Kiểm tra hoạt tính kháng thể sau cộng hợp lên hạt từ
• 3.1.5. Đánh giá phức hợp hạt từ gắn kháng thể sau cộng hợp
• 3.2. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA HẠT TỪ GẮN KHÁNG THỂ ĐỂ PHÁT HIỆN SALMONELLA TRONG THỰC PHẨM
• 3.2.1. So sánh và đánh giá phương pháp IMS cấy trực tiếp trên thạch chọn lọc XLD và phương pháp nuôi cấy chuẩn để phát hiện Salmonella trên thực phẩm
• 3.2.2. So sánh và đánh giá phương pháp IMS qua tăng sinh chọn lọc trong RV và phương pháp nuôi cấy chuẩn để phát hiện Salmonella trên thực phẩm
• 3.2.3. So sánh và đánh giá phương pháp IMS cấy trực tiếp trên thạch màu SCA và phương pháp nuôi cấy chuẩn để phát hiện Salmonella trên thực phẩm
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về Salmonella

Vi khuẩn Salmonella là một trong những tác nhân chính gây ngộ độc thực phẩm trên toàn cầu. Theo thống kê, mỗi năm có hàng triệu trường hợp nhiễm bệnh do Salmonella, dẫn đến hàng chục ngàn ca tử vong. Vi khuẩn này có khả năng tồn tại trong nhiều môi trường khác nhau và lây nhiễm qua đường tiêu hóa. Đặc điểm sinh học của Salmonella bao gồm hình dạng que, Gram âm, và khả năng di động nhờ lông roi. Vi khuẩn này có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ rộng, từ 5 đến 47 độ C, với nhiệt độ tối ưu là 37 độ C. Đặc biệt, Salmonella có khả năng kháng lại nhiều điều kiện môi trường, làm cho việc phát hiện và kiểm soát chúng trở nên khó khăn hơn.

1.1 Đặc điểm sinh học của Salmonella

Vi khuẩn Salmonella có kích thước nhỏ, khoảng 0,4-0,6µm x 2-3µm, và không có khả năng hình thành bào tử. Chúng có thể tồn tại trong môi trường bên ngoài vật chủ và phát triển ở nhiều nhiệt độ khác nhau. Đặc điểm này khiến cho việc phát hiện Salmonella trong thực phẩm trở nên cần thiết và cấp bách, đặc biệt trong bối cảnh an toàn thực phẩm ngày càng được chú trọng.

II. Phương pháp phát hiện Salmonella

Phương pháp nuôi cấy truyền thống được xem là tiêu chuẩn vàng để phát hiện Salmonella trong thực phẩm. Tuy nhiên, phương pháp này có nhược điểm là thời gian thực hiện lâu, từ 5-7 ngày, và có thể cho kết quả âm tính giả do sự hiện diện của các vi sinh vật nền khác. Để khắc phục nhược điểm này, phương pháp phân tách miễn dịch từ (IMS) đã được phát triển. Phương pháp này sử dụng các hạt từ gắn kháng thể đặc hiệu để tách và cô đặc Salmonella từ mẫu thực phẩm, giúp tăng độ nhạy và giảm thời gian phân tích.

2.1 Phương pháp nuôi cấy chuẩn

Phương pháp nuôi cấy chuẩn theo ISO 6579:2002 là phương pháp được công nhận rộng rãi để phát hiện Salmonella. Phương pháp này bao gồm các bước tiền tăng sinh, tăng sinh chọn lọc và phân lập trên môi trường thạch chọn lọc. Tuy nhiên, thời gian thực hiện lâu và có thể gặp khó khăn trong việc phát hiện Salmonella trong các mẫu thực phẩm có độ tạp nhiễm cao.

2.2 Phương pháp phân tách miễn dịch từ IMS

Phương pháp IMS sử dụng các hạt từ mang kháng thể đặc hiệu kháng Salmonella. Sau khi liên kết với kháng thể, vi khuẩn có thể được tách ra dễ dàng nhờ vào từ tính. Phương pháp này không chỉ giúp tăng độ nhạy mà còn giảm thời gian phân tích xuống còn 1-2 ngày. Điều này rất quan trọng trong việc đảm bảo an toàn thực phẩm và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

III. Đánh giá khả năng ứng dụng của hạt từ gắn kháng thể

Nghiên cứu này tập trung vào việc đánh giá khả năng ứng dụng của hạt từ gắn kháng thể kháng Salmonella trong việc phát hiện vi khuẩn này trong thực phẩm. Kết quả cho thấy phương pháp IMS kết hợp với nuôi cấy có thể cải thiện khả năng phát hiện Salmonella so với phương pháp nuôi cấy chuẩn. Đặc biệt, phương pháp IMS-RV và IMS-SCA cho độ đặc hiệu cao hơn, giúp phát hiện Salmonella trong các mẫu thực phẩm có độ tạp nhiễm vi sinh vật nền cao.

3.1 So sánh các phương pháp phát hiện

Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp IMS-XLD có độ đặc hiệu và khả năng phát hiện thấp hơn so với phương pháp nuôi cấy chuẩn. Ngược lại, phương pháp IMS-RV và IMS-SCA cho độ đặc hiệu cao hơn, đặc biệt trong các mẫu thực phẩm có độ tạp nhiễm cao. Điều này chứng tỏ rằng việc sử dụng hạt từ gắn kháng thể là một bước tiến quan trọng trong việc phát hiện Salmonella.

IV. Kết luận và đề xuất

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc ứng dụng hạt từ gắn kháng thể kháng Salmonella có thể cải thiện đáng kể khả năng phát hiện vi khuẩn này trong thực phẩm. Phương pháp IMS-SCA không chỉ giúp giảm thời gian thử nghiệm mà còn tăng độ nhạy và độ chính xác trong việc phát hiện Salmonella. Đề xuất cho các nghiên cứu tiếp theo là mở rộng ứng dụng của phương pháp này trong các loại thực phẩm khác nhau và đánh giá khả năng phát hiện trong các điều kiện thực tế.

4.1 Đề xuất nghiên cứu tiếp theo

Cần thực hiện thêm các nghiên cứu để đánh giá khả năng ứng dụng của hạt từ gắn kháng thể trong các loại thực phẩm khác nhau. Việc này sẽ giúp xác định tính khả thi và hiệu quả của phương pháp trong việc đảm bảo an toàn thực phẩm và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Nhiễm khuẩn thực phẩm do Salmonella spp. là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây ngộ độc và tử vong trên toàn cầu, với ước tính khoảng 10 triệu ca mắc và hơn 100.000 trường hợp tử vong mỗi năm. Tại Việt Nam, vi sinh vật gây ra 33% đến 49% tổng số vụ ngộ độc thực phẩm, trong đó Salmonella chiếm tới 70% các vụ việc nghiêm trọng. Theo các khảo sát dịch tễ tại Thành phố Hồ Chí Minh, tỷ lệ mẫu nhiễm Salmonella lên đến 30,74% trên thịt heo và 45,45% trên thịt gà. Đồng thời, hàng loạt lô hàng thủy hải sản xuất khẩu như cá nục (nhiễm 55%) và cá cơm (nhiễm 15%) từng bị cơ quan quản lý quốc tế cảnh báo, gây tổn thất kinh tế nghiêm trọng cho ngành thực phẩm.

Vấn đề cốt lõi đặt ra là phương pháp nuôi cấy truyền thống theo tiêu chuẩn ISO 6579:2002 tuy đạt giới hạn phát hiện 1 tế bào trong 25g mẫu nhưng đòi hỏi thời gian kéo dài từ 5 đến 7 ngày và dễ cho kết quả âm tính giả khi vi sinh vật nền lấn át. Mục tiêu trọng tâm của nghiên cứu này là chế tạo thành công phức hợp hạt từ gắn kháng thể kháng Salmonella spp. và đánh giá toàn diện khả năng ứng dụng kỹ thuật phân tách miễn dịch từ (Immunomagnetic Separation - IMS) kết hợp môi trường nuôi cấy để phát hiện nhanh vi khuẩn Salmonella trong thực phẩm.

Nghiên cứu được triển khai thực nghiệm tại Phòng Hóa Miễn dịch thuộc Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh trong giai đoạn từ ngày 19/01/2015 đến ngày 14/07/2015. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của công trình thể hiện ở việc rút ngắn chu kỳ kiểm nghiệm xuống 24 giờ, giảm thiểu chi phí lưu kho của doanh nghiệp và cung cấp giải pháp sàng lọc có độ chọn lọc cao trên các nền mẫu thực phẩm phức tạp.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng phân loại kháng nguyên Kauffmann-White, bao quát hơn 2.673 kiểu huyết thanh Salmonella dựa trên sự kết hợp của kháng nguyên thân O (bản chất Lipopolysaccharide ổn nhiệt), kháng nguyên lông H (protein flagellin) và kháng nguyên vỏ Vi. Về mặt sinh hóa, vi khuẩn Salmonella mang đặc tính chuyển hóa đặc trưng như khả năng sản xuất enzyme esterase (thủy phân các ester mạch carbon từ 7 đến 10) và không biểu hiện hoạt tính beta-D-galactosidase, tạo cơ sở cho việc thiết kế các môi trường thạch màu chọn lọc.

Cơ sở phân tách miễn dịch từ dựa trên nguyên lý tương tác đặc hiệu giữa phối tử kháng thể đa dòng cố định trên bề mặt hạt nano thuận từ với kháng nguyên mục tiêu. Phân tử Immunoglobulin G (IgG) liên kết với kháng nguyên vi khuẩn thông qua mạng lưới liên kết không đồng trị (kỵ nước, ion, hydro, Van der Waals) với hằng số cân bằng liên kết đạt từ 10^8 đến 10^12 M^-1.

Bên cạnh đó, nghiên cứu tích hợp cơ chế chỉ thị kép của thạch màu Salmonella Chromogenic Agar (SCA): enzyme esterase của Salmonella phân cắt cơ chất Magenta-caprylate tạo khuẩn lạc màu hồng tím, trong khi enzyme beta-D-galactosidase của các vi khuẩn đường ruột khác phân giải X-gal cho khuẩn lạc màu xanh, loại bỏ triệt để hiện tượng che lấp khuẩn lạc.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu và vật liệu thực nghiệm bao gồm các chủng vi khuẩn chuẩn đại diện cho các nhóm huyết thanh A, B, D, E4 (như Salmonella Paratyphi A, Salmonella Typhimurium, Salmonella Enteritidis, Salmonella Newport, Salmonella Anatum, Salmonella Senftenberg) và các mẫu thực phẩm do Viện Y tế Công cộng Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp.

Kháng huyết thanh thỏ đa giá nhóm O (Poly A và Poly B) được tinh chế qua cột sắc ký ái lực Hitrap Protein A thể tích 1 ml trên hệ thống tự động AKTA Explorer. Nồng độ kháng thể được chuẩn hóa bằng phương pháp đo quang phổ Bradford và kiểm tra độ tinh sạch qua điện di biến tính SDS-PAGE trên gel polyacrylamide 12%. Kháng thể sau tinh chế được cộng hợp đồng hóa học lên hạt siêu thuận từ Carboxylic acid MyOne kích thước đường kính 1 µm thông qua phản ứng hoạt hóa bằng 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) trong đệm 4-Morpholinoethanesulfonic acid (MES).

Quy trình phân tích đối chứng được thiết kế chặt chẽ giữa phương pháp nuôi cấy chuẩn ISO 6579:2002 và ba quy trình cải tiến: IMS cấy trực tiếp trên thạch Xylose Lysine Deoxycholate (IMS-XLD), IMS tăng sinh trong môi trường Rappaport Vassiliadis (IMS-RV), và IMS cấy trực tiếp trên thạch màu (IMS-SCA) trên cỡ mẫu thử nghiệm đồng nhất 25g. Toàn bộ lộ trình thực nghiệm diễn ra liên tục trong 6 tháng tại phòng thí nghiệm chuyên sâu.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình tinh chế và gắn kháng thể lên hạt từ đạt hiệu suất cao. Phức hợp hạt từ - kháng thể sau khi tạo thành giữ vững hoạt tính sinh học, cho khả năng tóm bắt nhạy bén các chủng Salmonella thuộc nhóm B, D1, E1, E4 ở mật độ 10^2 CFU/ml và nhóm A, C ở mật độ 10^3 CFU/ml trong môi trường mẫu.

Thử nghiệm phương pháp IMS-XLD cấy trực tiếp trên thạch chọn lọc truyền thống cho thấy độ đặc hiệu và khả năng phát hiện Salmonella thấp hơn phương pháp nuôi cấy chuẩn ISO 6579:2002. Mật độ vi sinh vật nền cao trên đĩa XLD làm nhiễu và lấn át sự hình thành tâm đen của khuẩn lạc mục tiêu.

Ngược lại, phương pháp IMS-RV (qua tăng sinh chọn lọc) và IMS-SCA (cấy trực tiếp lên thạch màu) thể hiện độ đặc hiệu vượt trội so với quy trình nuôi cấy chuẩn. Trên các nền mẫu thực phẩm có mức độ tạp nhiễm hệ vi sinh vật nền dày đặc, tỷ lệ phát hiện dương tính của IMS-RV và IMS-SCA cao hơn rõ rệt so với phương pháp chuẩn truyền thống.

Quy trình IMS-SCA rút ngắn tổng thời gian phân tích từ 5-7 ngày xuống còn 3-4 ngày, tức giảm được 24 đến 48 giờ thao tác và ủ mẫu so với quy trình chuẩn ISO 6579:2002. Tuy nhiên, khả năng thu hồi hạt từ bị suy giảm trên các mẫu thực phẩm chứa tỷ lệ chất béo cao do hiện tượng nhũ hóa cản trở tương tác từ tính.

Thảo luận kết quả

Khả năng phân lập vượt trội của phương pháp IMS-SCA bắt nguồn từ tác động hiệp đồng giữa việc cô đặc vật lý bằng hạt từ 1 µm và hệ thống nhận diện enzym màu sắc. Việc loại bỏ giai đoạn tăng sinh chọn lọc RV kéo dài 24 giờ nhưng vẫn duy trì độ chính xác cao là nhờ hạt từ đã loại bỏ phần lớn vi sinh vật cạnh tranh ngay từ dịch tiền tăng sinh, sau đó cơ chất Magenta-caprylate trên đĩa SCA giúp phân biệt ngay lập tức khuẩn lạc Salmonella màu hồng tím với độ nhạy quang học cao.

Các dữ liệu nghiên cứu có thể được tổng hợp trực quan qua biểu đồ cột so sánh tỷ lệ phát hiện Salmonella trên từng nhóm thực phẩm giữa phương pháp chuẩn và IMS-SCA, cùng bảng ma trận đối chiếu thời gian xử lý mẫu (rút ngắn từ 120 giờ xuống còn 72 giờ). Kết quả này hoàn toàn tương thích với các công bố quốc tế về kỹ thuật tách miễn dịch từ, đồng thời chứng minh giải pháp tự chế tạo hạt từ tại Việt Nam hoàn toàn đáp ứng các tiêu chuẩn phân tích vi sinh nghiêm ngặt.

Đề xuất và khuyến nghị

Thứ nhất, chuẩn hóa quy trình sản xuất hạt từ sinh học: Viện Pasteur và các cơ sở công nghệ sinh học cần hoàn thiện quy trình liên kết chéo kháng thể đơn dòng kháng Salmonella lên hạt từ Carboxylic, đặt mục tiêu nâng cao độ ổn định bắt giữ đạt trên 95% sau 12 tháng lưu trữ ở điều kiện 4 độ C.

Thứ hai, áp dụng quy trình kiểm nghiệm nhanh IMS-SCA: Các trung tâm kiểm nghiệm thực phẩm và phòng kiểm nghiệm đạt chuẩn ISO 17025 nên triển khai thử nghiệm phương pháp IMS-SCA để sàng lọc các mẫu thịt tươi và thủy sản, cắt giảm thời gian trả kết quả xuống dưới 72 giờ, áp dụng lộ trình thí điểm trong vòng 6 đến 12 tháng.

Thứ ba, cải tiến đệm xử lý nền mẫu giàu chất béo: Các nhóm nghiên cứu vi sinh thực phẩm cần bổ sung tác nhân hoạt động bề mặt như Tergitol 7 với tỷ lệ 0,22% hoặc hệ đệm enzyme lipase vào bước tiền tăng sinh để phân tán hoàn toàn chất béo, nâng hiệu suất thu hồi hạt từ lên trên 90% đối với mẫu bơ sữa và thực phẩm chế biến sẵn.

Thứ tư, tích hợp công nghệ IMS với Real-time PCR: Các cơ quan quản lý an toàn vệ sinh thực phẩm và doanh nghiệp chế biến xuất khẩu cần đầu tư kết hợp hạt từ IMS làm sạch mẫu với kỹ thuật Real-time PCR để định lượng nhanh Salmonella ở ngưỡng 1-10 CFU/25g trong thời gian dưới 8 giờ, hoàn thành triển khai trong giai đoạn tới.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nhóm chuyên viên kiểm nghiệm vi sinh tại các phòng lab phân tích: Tài liệu cung cấp thông số kỹ thuật chi tiết về quy trình phân tách miễn dịch từ, giúp tối ưu hóa thời gian phân tích từ 5 ngày xuống 3 ngày và giảm thiểu tỷ lệ âm tính giả do vi sinh vật nền.

Nhóm quản lý chất lượng (QA/QC) tại doanh nghiệp chế biến thủy sản và thực phẩm: Sử dụng quy trình IMS-SCA để kiểm soát nguyên liệu đầu vào và các lô hàng xuất khẩu như cá nục, nghêu đông lạnh, hạn chế tối đa nguy cơ bị đối tác cảnh báo hoặc trả hàng.

Nhóm giảng viên, nghiên cứu sinh và học viên ngành Công nghệ Sinh học: Luận văn là tài liệu tham khảo giá trị về kỹ thuật sắc ký ái lực Protein A, phương pháp cộng hợp EDC và cơ chế tác động của các môi trường thạch màu sinh hóa thế hệ mới.

Nhóm doanh nghiệp sản xuất kit chẩn đoán và vật tư sinh học: Khai thác quy trình chế tạo hạt từ carboxyl 1 µm gắn kháng thể nhằm phát triển các bộ kit chẩn đoán nhanh mầm bệnh đường ruột phục vụ thị trường nội địa trong 12 đến 24 tháng tới.

Câu hỏi thường gặp

Phương pháp IMS-SCA có thể thay thế hoàn toàn tiêu chuẩn ISO 6579:2002 không? Phương pháp IMS-SCA hoạt động như một công cụ sàng lọc nhanh vượt trội giúp rút ngắn 24 giờ kiểm nghiệm và nâng cao khả năng phát hiện trên mẫu có tạp khuẩn cao. Tuy nhiên, trong các tranh chấp pháp lý quốc tế, các thử nghiệm sinh hóa và huyết thanh học khẳng định theo ISO 6579:2002 vẫn là tiêu chuẩn trọng tài cuối cùng.

Vì sao phương pháp IMS-XLD cấy trực tiếp lại cho kết quả kém hơn phương pháp chuẩn? Môi trường XLD phụ thuộc vào phản ứng sinh H2S và chuyển hóa đường của vi khuẩn. Khi cấy trực tiếp phức hợp hạt từ mà không qua tăng sinh chọn lọc, các vi khuẩn đường ruột khác như Proteus hay Citrobacter cạnh tranh chất dinh dưỡng và làm biến đổi màu thạch, khiến việc nhận diện Salmonella bị sai lệch.

Ưu điểm nổi bật nhất của thạch màu SCA so với thạch truyền thống là gì? Thạch màu SCA sử dụng cơ chất kép Magenta-caprylate và X-gal. Nhờ enzyme esterase đặc hiệu, Salmonella tạo thành khuẩn lạc màu hồng tím nổi bật, hoàn toàn tách biệt với các coliform tạo khuẩn lạc màu xanh hoặc không màu, giúp chuyên viên đọc kết quả chính xác trong 24 giờ ủ.

Kỹ thuật IMS gặp trở ngại gì khi xử lý mẫu thực phẩm chứa nhiều dầu mỡ? Hàm lượng lipid và chất béo cao tạo ra các hạt nhũ tương bao bọc xung quanh vi khuẩn và hạt từ, làm suy giảm lực liên kết kháng nguyên - kháng thể và cản trở sự di chuyển của hạt từ về phía thanh nam châm, khiến hiệu suất thu hồi vi khuẩn giảm xuống dưới 50%.

Giới hạn phát hiện của hạt từ tự chế tạo trong nghiên cứu đạt mức nào? Hạt từ Carboxylic 1 µm gắn kháng thể thỏ đa giá đạt ngưỡng tóm bắt 10^2 CFU/ml đối với các nhóm Salmonella phổ biến gồm B, D1, E1, E4 và đạt mức 10^3 CFU/ml đối với nhóm A và C, đáp ứng hoàn hảo yêu cầu cô đặc tế bào sau giai đoạn tiền tăng sinh.

Kết luận

• Tinh chế thành công kháng thể kháng Salmonella nhóm OMA và OMB bằng sắc ký ái lực Hitrap Protein A và cộng hợp cộng hóa trị lên hạt từ Carboxylic acid MyOne 1 µm qua chất liên kết EDC.
• Đạt giới hạn tóm bắt nhạy bén ở mức 10^2 CFU/ml đối với các nhóm huyết thanh B, D1, E1, E4 và 10^3 CFU/ml đối với nhóm A, C.
• Xác định quy trình IMS-SCA là giải pháp tối ưu nhất, rút ngắn 24 đến 48 giờ thời gian phân tích so với quy trình nuôi cấy chuẩn ISO 6579:2002.
• Chứng minh phương pháp IMS-RV và IMS-SCA có độ đặc hiệu và tỷ lệ phát hiện cao hơn phương pháp truyền thống trên các nền mẫu thực phẩm nhiễm tạp khuẩn nặng.
• Xác định rõ hạn chế của kỹ thuật trên các nền mẫu có hàm lượng chất béo cao, mở ra định hướng xử lý mẫu bổ sung bằng chất phân tán lipid.

Đóng góp chính của luận văn là hoàn thiện công nghệ chế tạo hạt từ miễn dịch nội địa và xây dựng quy trình kết hợp IMS - thạch màu SCA có độ chính xác cao phục vụ kiểm nghiệm an toàn thực phẩm. Kế hoạch tiếp theo trong 12 tháng tới là nâng cấp kháng thể đơn dòng và tích hợp hệ thống phát hiện sinh học phân tử tự động. Hãy ứng dụng ngay quy trình IMS-SCA vào hệ thống kiểm soát chất lượng vi sinh để nâng cao độ an toàn cho chuỗi cung ứng thực phẩm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1-Tổng quan tài liệu 1. Vị trí phân loại và danh pháp Chi Salmonella thuộc họ vi khuẩn đƣờng ruột. Số lƣợng kiểu huyết thanh gia tăng liên tục qua các năm. Hiện nay có 2673 kiểu huyết thanh Salmonella và đƣợc phân thành 2 loài: Salmonella enterica và Salmonella bongori.

Loài Salmonella enterica gồm 6 loài phụ và đƣợc chỉ định bởi chữ số La Mã: Salmonella enterica I, II, IIIa, IIIb, IV, VI. Loài Salmonella bongori chỉ có 1 loài phụ và đƣợc chỉ định là V [34](Bảng 1.1: Số lƣợng các loài phụ của loài S. Bongori Loài Loài phụ Số lƣợng Năm 2007 [17] Năm 2010 [21] S. bongori V 23 23 Tổng 2610 2673 Salmonella đƣợc gọi tên theo công thức kháng nguyên, trong đó thông tin loài thƣờng bị bỏ qua, một số chủng thuộc loài phụ enterica đƣợc đặt tên riêng và tên này không đƣợc viết in nghiêng (ví dụ S.

Danh pháp Salmonella theo công thức kháng nguyên với thứ tự nhƣ sau: Loài phụ Kháng nguyên O: kháng nguyên H pha 1: kháng nguyên H pha 2 Ví dụ: Salmonella II 47:b:1,5 (Sự thiếu hụt một kháng nguyên H sẽ đƣợc diễn tả bằng dấu “-”) 5 Chương 1-Tổng quan tài liệu 1. Đặc điểm sinh hóa Một số đặc điểm sinh hóa chính của Salmonella bao gồm: lên men glucose và mannitol sinh acid, không lên men saccharose và lactose (trừ 1 số chủng), không có khả năng chuyển trytophan thành indole, không phân giải urea, và hầu hết các chủng đều sinh H2S.2: Các đặc tính sinh hóa của các loài phụ Salmonella [34] Loài S.bongori Loài phụ I II IIIa IIIb IV VI V Đặc tính dulcitol + + - - - d + ONPG (2 giờ) - - + + - d + malonate - + + + - - - gelatinase - + + + + + - sorbitol + + + + + - + Tăng trƣởng với KCN - - - - + - + d-tartrate + - - - - - - γ- glutamyltranferase +(*) + - + + + + galacturonate - + - + + + + ß-glucuronidase d d - + - d - mucate + + + -(70%) - + + salicin - - - - + - - lactose - - -(70%) +(70%) - d - Môi trƣờng sống chủ Động vật máu Động vật máu lạnh và môi trƣờng yếu nóng + : ≥ 90% có phản ứng dƣơng tính, - : ≥ 90% có phản ứng âm tính d: phản ứng khác nhau tuỳ thuộc kiểu huyết thanh (*): Typhimurium d, Dublin - 6 Chương 1-Tổng quan tài liệu 1. Salmonella gây bệnh ở ngƣời và động vật bậc cao 1. Đặc điểm gây bệnh Có đến 59% trong tổng số kiểu huyết thanh Salmonella thuộc về Salmonella enterica loài phụ enterica.

Các kiểu huyết thanh đƣợc phân lập từ thực phẩm với tần suất cao nhất mỗi năm gồm có: Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium, Salmonella Heidelberg, Salmonella Hadar đều thuộc về loài phụ enterica. Trong đó, Salmonella Typhimurium và Salmonella Enteritidis là hai kiểu huyết thanh chủ yếu gây ngộ độc thực phẩm cho ngƣời [7]. Các bệnh do Salmonella gây ra cho ngƣời có thể chia vào 4 nhóm: sốt thƣơng hàn bao gồm bệnh thƣơng hàn và phó thƣơng hàn, viêm dạ dày ruột và nhiễm trùng máu [36]. Tùy thuộc vào các kiểu huyết thanh và hiệu quả bảo vệ của thể chủ chống lại kiểu huyết thanh đó, Salmonella có thể lây nhiễm gan, lá lách, túi mật, xƣơng, màng não hay các cơ quan khác.3: Các biểu hiện bệnh thƣờng gặp gây ra bởi các kiểu huyết thanh Salmonella [36] 7 Chương 1-Tổng quan tài liệu Ở ngƣời khỏe mạnh, số lƣợng vi khuẩn Salmonella cần thiết để gây bệnh từ 105- 109 với thời gian ủ bệnh là 4-14 ngày.

Các vi khuẩn sống sót đến ruột xâm nhập qua niêm mạc ruột vào các hạch mạc treo ruột. Trong quá trình sống, Salmonella gây bệnh do sản sinh ra các nội độc tố và ngoại độc tố tác động lên tế bào vật chủ [24],[42],[46]. Cơ chế gây bệnh Nội độc tố do thành phần lipid A có LPS đƣợc phóng thích khi vi khuẩn Salmonella bị phân huỷ (Hình 1. Nội độc tố giữ vai trò chính trong việc gây bệnh với độc lực cao và khả năng chịu nhiệt độ cao (ở 100°C sau 2 giờ vẫn còn độc lực) [46].

Để thể hiện độc tính, nội độc tố phải liên kết với tế bào thông qua các thụ thể bề mặt. Nhiều cơ quan trong cơ thể chịu tác động của nội độc tố nhƣ gan, thận, cơ, tim gây nên hiện tƣợng rối loạn tiêu hóa, tắc mạch máu. Nội độc tố còn tác động trực tiếp lên hệ thống miễn dịch kích thích hình thành kháng thể [46].4: Nội độc tố Lipid A hiện diện trong cấu trúc LPS của vách tế bào Salmonella [59] Ngoại độc tố đóng vai trò là độc tố đƣờng ruột và độc tố tế bào. Độc tố đƣờng ruột gồm có độc tố thẩm xuất chậm (DPF-Delayed Permeability Factor) không bền với 8 Chương 1-Tổng quan tài liệu nhiệt, gây đáp ứng sau 18 giờ và độc tố thẩm xuất nhanh (RPF-Rapid Permeability Factor) bền với nhiệt, gây đáp ứng sau 2 giờ [24],[42].

Độc tố DPF sẽ hoạt hóa men adenylcylase trong tế bào giúp tăng tiết c-AMP, khiến cho protein kinase A (PKA) đƣợc hoạt hóa. Điều này làm cho sự phosphoryl hóa kênh Cl- vƣợt quá mức bình thƣờng. Kết quả là kích thích tế bào tăng tiết Cl-, HCO3- ra khỏi tế bào ruột đồng thời ức chế Na+ vào trong tế bào ruột gây tiêu chảy, mất nƣớc. Độc tố RPF sẽ hoạt hóa men guanylcylase trong tế bào giúp tăng tiết c-GMP, khiến cho protein kinase G (PKG) đƣợc hoạt hóa và gây tiêu chảy với cơ chế tƣơng tự [45] (Hình 1.

Khi ngƣời và động vật tiêu chảy thì kèm theo là hiện tƣợng hàng loạt tế bào biểu mô ruột bị tổn thƣơng hoặc bị phá hủy do các độc tố tế bào gây ra. Cơ chế chung của độc tố tế bào là ức chế tổng hợp protein và làm trƣơng tế bào [38].5: Cơ chế gây tiêu chảy bởi sự điều hòa Guanyl cylase [45] 9 Chương 1-Tổng quan tài liệu 1. TÌNH HÌNH NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM DO SALMONELLA 1. Trên thế giới Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), số trƣờng hợp ngộ độc thực phẩm đang có chiều hƣớng gia tăng ở nhiều nơi trên thế giới.

Các tác nhân vi sinh gây ngộ độc thực phẩm gồm có các vi rút thuộc nhóm norovirus và các vi khuẩn nhƣ Campylobacter, Salmonella, E.coli, Listeria, Staphylococcus aureus. Trong nhóm tác nhân vi khuẩn, Salmonella là tác nhân gây ngộ độc thực phẩm đứng hàng thứ nhất. Theo ƣớc tính mỗi năm trên thế giới có đến 10 triệu trƣờng hợp bị bệnh và 100.000 ca tử vong do ăn phải thực phẩm bị nhiễm vi khuẩn Salmonella [57]. Theo số liệu thống kê 2011 của trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh CDC (Centers for Desease Control and Prevention), tại Mỹ, số ca tử vong do ngộ độc thực phẩm bởi vi khuẩn chiếm trên 80%, trong đó do Salmonella gây ra chiếm tỉ lệ cao nhất với 28% [53].3: 5 tác nhân hàng đầu gây tử vong do ngộ độc thực phẩm ở Mỹ, 2011 [53] Tác nhân Ƣớc lƣợng số ca tử vong hằng năm Tỉ lệ (%) Salmonella, nontyphoidal 378 28 Toxoplasma gondii 327 24 Listeria monocytogenes 255 19 Norovirus 149 11 Campylobacter spp.

76 6 Tổng 88 10 Chương 1-Tổng quan tài liệu 1. Tại Việt Nam Mỗi năm ở Việt Nam có khoảng 250-500 vụ ngộ độc thực phẩm với 7.000 ngƣời bị mắc bệnh và 100-200 ca tử vong. Ngộ độc thực phẩm do bị nhiễm vi sinh vật chiếm 33-49%, chủ yếu do tác nhân Salmonella chiếm tới 70% số vụ ngộ độc [54]. Theo báo cáo kết quả giám sát từ tháng 5/2013 - 4/2014 tại Tp.HCM đƣợc thực hiện bởi Cục Quản lý chất lƣợng nông lâm sản và thủy sản phối hợp với JICA cho thấy số mẫu nhiễm Salmonella trên thịt heo là 71/231 mẫu kiểm tra (30,74%), thịt gà là 105/231 mẫu kiểm tra (45,45%) [49].

Nhiễm khuẩn thực phẩm cũng gây nên tổn thất kinh tế lớn cho các doanh nghiệp Việt Nam. Đối với hàng thủy sản Việt Nam xuất khẩu sang Mỹ, trong quý 1 năm 2012, mỗi tháng có 1 lô hàng bị FDA cảnh báo về việc nhiễm khuẩn Salmonella, và riêng trong tháng 4 năm 2012, 19/20 lô hàng bị FDA cảnh báo nhiễm khuẩn Salmonella. Các lô hàng thƣờng nhiễm khuẩn là cá nục (55%), cá cơm (15%) [56]. Tại thị trƣờng EU, theo số liệu thống kê năm 2013 cho thấy tình hình các lô hàng thủy sản Việt Nam bị cảnh báo nhiễm Salmonella tăng lên đáng kể so với năm 2012, tập trung vào mặt hàng nghêu luộc đông lạnh.

Điều này đã gây ảnh hƣởng nghiêm trọng đến uy tín chất lƣợng hàng thủy sản Việt Nam. CÁC QUY ĐỊNH VỀ SALMONELLA TRONG THỰC PHẨM Do Salmonella có khả năng gây hại nghiêm trọng đến sức khỏe con ngƣời nên Việt Nam và nhiều nƣớc trên thế giới đã quy định không cho phép sự hiện diện của Salmonella trong thực phẩm [1],[5],[20]. PHÁT HIỆN SALMONELLA BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY THEO ISO 6579:2002 Phƣơng pháp nuôi cấy đƣợc xem là phƣơng pháp chuẩn đang đƣợc áp dụng ở tất cả các phòng kiểm nghiệm vi sinh để phát hiện Salmonella spp. trong thực phẩm cũng nhƣ bệnh phẩm [4],[20].

Phƣơng pháp nuôi cấy chuẩn cho phép phát hiện Salmonella ở ngƣỡng 1 tế bào trong 25 g mẫu thực phẩm, thời gian cho kết quả là 5-7 ngày. Qui 11 Chương 1-Tổng quan tài liệu trình bao gồm các bƣớc: tiền tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định (Hình 1.6: Quy trình phân lập Samonella theo ISO 6579:2002 1. Tiền tăng sinh Ủ trực tiếp mẫu thực phẩm cần phân tích vào môi trƣờng tăng sinh chọn lọc thƣờng khó phục hồi các vi sinh vật mong muốn do:  Một số tế bào khỏe mạnh thƣờng bị chết trong môi trƣờng tăng sinh chọn lọc [8]. Khi chúng có số lƣợng thấp, chúng có thể bị giết chết toàn bộ.

Nuôi cấy tiền tăng sinh cho phép số lƣợng vi khuẩn tăng lên vì thế giúp làm giảm tác động này. 12 Chương 1-Tổng quan tài liệu  Tế bào tổn thƣơng nhạy cảm hơn tế bào khỏe mạnh khi tiếp xúc với các tác nhân chọn lọc. Phần lớn kỹ thuật làm giàu khi nghiên cứu thƣờng dùng các tế bào khỏe mạnh nên tế bào bị tổn thƣơng có thể khó hồi phục tại nồng độ của các tác nhân chọn lọc sử dụng trong môi trƣờng tăng sinh. Trong trƣờng hợp này, giai đoạn tiền tăng sinh cho phép các tế bào đích sửa chữa tổn thƣơng và giúp chúng lấy lại khả năng đề kháng với các tác nhân chọn lọc trƣớc khi tiếp xúc với chúng trong môi trƣờng tăng sinh [8].

Theo ISO 6579, đệm peptone là môi trƣờng đƣợc lựa chọn sử dụng cho các loại mẫu thực phẩm.