Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Enzyme lipase Porcine pancreas (LPP) 1.1 Định nghĩa: Theo Adriano A. M và cộng sự (2012), Lipase (triglyceride acyl hydrolase) thuộc nhóm enzyme thuỷ phân (Hydrolase), là enzyme có khả năng xúc tác sự thuỷ giải các nối ester của triacylglyceride thành glycerol và acid béo tự do. Mã số của enzyme lipase là EC 3.2 Cấu trúc của enzyme lipase Porcine pancreas (LPP): Enzyme lipase Porcine pancreas là một protein hình cầu bao gồm một chuỗi đơn của 449 amino acid. Cấu trúc không gian của chúng gồm hai vùng xác định.
Vùng N – terminal là một mắt lưới của xoắn α và các sợi song song β, là đoạn amino acid 1 – 336. Bộ ba xúc tác Ser, Asp và His lần lượt ở tại vị trí amino acid 153, 177 và 264. Vùng C – terminal hầu hết là các gấp β, chứa amino acid 337 – 349, vùng này tương tác với colipase. Colipase là một protein cofactor nhỏ, với khối lượng phân tử khoảng 10 kDa.
Cấu trúc tinh thể của enzyme LPP có một vài chỗ võng bao phủ bộ ba xúc tác. Vị trí của các võng cản trở sự tiếp xúc của cơ chất với bộ ba xúc tác. Vùng võng rộng nhất trong số các vùng võng được hình thành là do cầu nối disulfide giữa Cys238 và Cys262. Một võng khác được hình thành bởi phần 76 – 85 (gọi là “nắp”), thuộc vùng N – terminal, bao phủ trung tâm hoạt động ngăn không cho cơ chất đi vào tâm hoạt động.
Nắp được mở ổn định bởi các liên kết hydro giữa nắp và colipase. Khi nắp này mở, cho phép cơ chất đi vào tiếp xúc với tâm hoạt động [1],[10],[35].1 Cấu trúc lipase và mô hình trung tâm xúc tác của chúng[10] Hình 1.2 Mô hình đóng và mở của nắp trong lipase[10] 1.3 Tính chất của LPP: – Phân tử lượng của LPP: Enzyme lipase Porcine pancreas có khối lượng phân tử khoảng 50 – 52 kDa [6],[10]. – pH đẳng điện của enzyme LPP (pI): 5 pI của enzyme là pH mà tại đó phân tử enzyme trung hòa về điện, do enzyme không mang điện nên không thể liên kết được với các micelle (nước) làm cho enzyme bị kết tủa. Tại pI của enzyme thì kết tủa đạt cực đại.
Cũng như các enzyme khác, enzyme lipase Porcine pancreas cũng có một giá trị pH đẳng điện nhất định. pI của enzyme là một thông số có ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất cố định của enzyme lên chất mang LDHs [6],[10]. – Hoạt độ của enzyme LPP: Có rất nhiều định nghĩa về hoạt độ của enzyme, nhưng thông thường hoạt độ của enzyme được định nghĩa như sau: một đơn vị hoạt độ của enzyme là lượng enzyme chuyển hóa một micromol cơ chất hoặc một micromol sản phẩm tạo thành sau một khoảng thời gian phản ứng tại một nhiệt độ và pH xác định. – Ảnh hưởng của pH lên tính chất của LPP: pH của môi trường có ảnh hưởng lớn đến phản ứng enzyme, vì nó ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và ảnh hưởng đến độ bền protein của enzyme.
Enzyme LPP thể hiện hoạt độ cao nhất tại môi trường pH kiềm, trong giới hạn 7. Với cơ chất là dầu oliu, pH tối ưu cho hoạt động của LPP nằm trong giới hạn là 7.0; với ethyl acetate, pH tối ưu là 7. pH tối ưu của lipase tái tổ hợp LipA chủng Ralstonia sp. M1 là 10,75 và enzyme có độ bền ở dải pH kiềm từ 8,0 đến 10,5.
Lipase tự nhiên chủng Ralstonia sp. M1 cũng có pH tối ưu tương tự, là pH 10 và bền ở dải pH rộng hơn từ 7. Lipase từ Acinetobacter sp. RAG-1 bền ở dải pH từ 5,8 đến 9,0 với hoạt độ tối đa ở pH 9.
Lipase từ Acinetobacter sp. SY-01 có hoạt độ tối đa ở pH 10 và bền ở dải pH từ 9 đến 11.thermocatenulatus BTL2 cho thấy hoạt độ tối đa ở pH trong khoảng 7.0 và độ bền ở dải pH từ 7 đến 11. Độ bền pH và pH tối ưu là một trong những cơ sở khi chọn lipase để xúc tác phản ứng mong muốn. Ví dụ như lipase có độ bền ở dải pH kiềm chính là một trong những điều kiện khi chọn loại lipase này làm phụ gia trong bột giặt [6],[10].
6 – Ảnh hưởng của nhiệt độ lên tính chất của LPP: Vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng theo nhiệt độ trong một giới hạn xác định mà ở đó phân tử enzyme vẫn còn bền, chưa bị biến tính. Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của LPP là 35 – 400C. Với cơ chất là triacylglycerol, LPP thể hiện hoạt độ cao nhất khi nhiệt độ nằm trong khoảng 35 – 400C, pH dao động từ 6.5; với triacetin thì nhiệt độ tại 350C, pH 7.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt độ của lipase từ các nguồn khác nhau [18]. Ảnh hưởng của pH, nhiệt độ Nguồn gốc pH tối ưu Nhiệt độ tối ưu (0C) Vi khuẩn Bacillus sp.0 37 Bacillus coagulans BTS-3 8.5 50 Lactobacilli 30 Acinetobacter radioresistens 7.0 30 Aeromonas sobria LP004 6.0 60 Nấm mốc Penicillium candidum 9.5 30 Aspergillus oryzae RIB128 5.5 35 Nấm men Cryptococcus sp.2 Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt độ của lipase từ các nguồn khác nhau [18].
Ảnh hưởng của các ion kim loại Nguồn gốc Chất hoạt hóa Chất ức chế Vi khuẩn Bacillus thermoleovorans ID-1 Ca2+, Zn2+ Bacillus natto Na+, PO43−, Ca2+ Staphylococcus aureus 226 Ca2+, Mg2+ Mn2+ Staphylococcus aureus Ca2+, Mn2+ Coban, Kẽm Fe2+, Ni2+, Cu2+, Hg2+ Serratia marcescens 345 Mg2+ , Zn2+ Fe2+, Mn2+, Ca2+, Hg2+ , Bacillus sp. FH5 Mg2+, Ba2+ Cu2+, Co2+, Na+,Zn2+ Acinetobacter sp. CR9 Cu2+, Mo2+, Mg2+, Zn2+ Ca2+ Acinetobacter baumannii BD5 Mn2+, Ca2+, Mg2+ Cu2+, Zn2+ Nấm mốc Rhizopus oryzae Fe2+, Cu2+, Hg2+, Aspergillus terreus Ca2+, Mg2+ Fe2+, Ni2+, Cu2+, Co2+ 1. Cơ chế hoạt động của enzyme LPP: Khi một phân tử triacylglycerol đến trung tâm hoạt động (vùng kỵ nước), nó đi vào tiếp xúc với bộ ba xúc tác Ser152, His263 và Asp176.
Lúc này, bộ ba xúc tác sẽ thực hiện phản ứng thủy phân. Bộ ba được định hướng khi một trong số các nguyên tử oxy ở phần cuối của Asp176 liên kết với một nguyên tử nitơ trong vòng Histidin bằng liên kết hydro, giúp cho His263 được định vị để nguyên tử nitơ khác của nó tạo liên kết hydro với nhóm hydroxyl của Ser152. Liên kết hydro thứ hai này kéo hydro ra xa từ liên kết cộng hóa trị với oxy của nó một cách tương đối, với định vị này thì enzyme sẵn sàng để hoạt động. 8 Bước đầu tiên của phản ứng xảy ra dựa trên phản ứng thế ái nhân của serin và của cacbon glycerol thứ nhất của chuỗi ở bên cạnh Ser152.
Tác nhân ái nhân là nhóm OH- của serin mang điện tích âm tấn công vào trung tâm tích điện dương của cacbon glycerol thứ nhất, làm cho liên kết giữa Cacbon glycerol thứ nhất và Oxy của este yếu đi. Oxy trong liên kết este trở thành nhóm linh động (leaving group) và nó được thêm một proton H+ vào từ nhóm OH- của Ser152 để trung hòa điện tích âm của nó. Khi oxy nhận được H+, sản phẩm acid béo từ vị trí đầu tiên được hình thành và hoàn toàn tự do. Lúc này, phần đang chứa glycerol vẫn giữ liên kết với oxy của Ser152, tuy nhiên liên kết này phải bị phá vỡ để enzyme duy trì chức năng của nó.
Bước thứ hai của cơ chế thủy phân liên quan đến sự hình thành và di chuyển của diglyceride từ nửa đang chứa glycerol. Để giải phóng ra phân tử glycerol, cần một nhóm hydroxyl để liên kết với cacbon đầu tiên của glycerol và một ion H+ để thêm một proton trở lại vào oxy của Ser152. Một phân tử nước ở môi trường ngoài cung cấp các thành phần cần thiết này. Thông qua tương tác hydro, phân tử nước bị phân ly thành H+ và OH-.
Do sự hình thành cầu nối hydro giữa H+ với OH- của hai phân tử nước khác nhau, ion hydronium (H3O+) được hình thành. Ion hydronium có một momen lưỡng cực rất lớn và hoạt động như một tác nhân ái nhân lên cacbon glycerol đầu tiên. Thời điểm này, oxy của Ser152 rời khỏi nhóm. Chuỗi bên cạnh tích điện âm của Ser152 nhanh chóng thêm một proton vào bởi ion H+ từ nước.
Lúc này, sản phẩm diglyceride được hình thành. Liên kết hydro giữa nitơ thơm của His263 và nhóm hydroxyl trên Ser152 được phục hồi trở lại và trở về cấu trúc ban đầu của nó, sẵn sàng cho phản ứng khác (xem hình 1.3) Phản ứng thủy phân tiếp theo xảy ra để xúc tác diglyceride vừa mới hình thành thành một acid béo và một monoglyceride. Cơ chế trong trường hợp này giống hai bước như với thủy phân triglyceride, ngoại trừ các tấn công ái nhân lên cacbon thứ ba của glycerol. Cơ chế này cho ra một monoglyceride và acid béo mới từ trung tâm hoạt động, và enzyme chuẩn bị tiến đến triglyceride khác [5],[35].3 Sơ đồ về cơ chế thủy phân của lipase trên triglyceride [35] 10 1.
Ứng dụng của enzyme lipase: Lipase có nhiều ứng dụng trong công nghiệp như: chất tẩy rửa, trong thực phẩm, dược phẩm, da, dệt may, mỹ phẩm và các ngành công nghiệp giấy.1 Trong công nghiệp sản xuất các chất tẩy rửa: Hiện nay thị trường lớn nhất cho các loại lipase là việc sử dụng nó như những chất cấu thành trong các loại bột giặt ở công nghệ giặt khô. Ngày nay lipase được dùng trong bột giặt để thuỷ phân các vết dầu mỡ mà con người tiết ra quần áo, chăn đệm trong điều kiện nhiệt độ thấp và pH cao với những chất hoá học có hoạt tính bề mặt [Gormen & Malmos, 1991]. Một số lipase ở dạng thương phẩm đã được sử dụng trong ngành thuốc tẩy là: Lipase humicola của Novo Nordisk, lipolase hoặc lipase P.glumace của Unilever [Estell và cộng sự, 1985] được sử dụng trong ngành công nghiệp tẩy rửa. Nhưng những lipase dùng làm bột giặt cho những hộ gia đình giữ ổn định với các protease và hoạt động có hiệu quả trong điều kiện kiềm [5], [58].2 Trong công nghiệp thực phẩm: Lipase được sử dụng để thủy phân chất béo trong bơ, sữa, phomai nhằm làm tăng các chất tạo hương của các sản phẩm này.
Đối với thực phẩm được chế biến từ sữa, lipase được sử dụng rộng rãi để làm tăng mùi vị, làm tăng độ chín của phomat, hoặc chế biến những sản phẩm như phomat và phân giải lipid [Bech, 1992]. Những axit béo tự do mạch ngắn (chủ yếu là C4, C6) được thuỷ phân ra do tăng lipase vào sữa béo dẫn đến sự tăng hương vị đặc trưng cho sữa. Trong khi đó nếu các axit béo mạch trung bình (C12, C14) được tạo ra sẽ có xu hướng tạo ra mùi vị tựa như xà phòng cho sản phẩm. Thêm vào đó những axit béo tự do này có thể tham gia vào các phản ứng hoá học đơn giản với vi sinh vật dẫn đến việc tổng hợp những gia vị có mùi thơm khác nhau.