Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Yogurt là sản phẩm sữa lên men truyền thống có giá trị dinh dưỡng cao, chứa hệ vi khuẩn lactic có lợi cho đường ruột và được tiêu thụ phổ biến trên toàn thế giới. Trong chế biến công nghiệp, chất lượng cảm quan và cấu trúc gel của yogurt là những tiêu chí kỹ thuật hàng đầu. Một trong những khiếm khuyết phổ biến nhất trong quá trình sản xuất và bảo quản yogurt là hiện tượng tách nước (syneresis hay tách whey), làm suy giảm độ đồng nhất và giá trị thương phẩm của sản phẩm.

Về bối cảnh thực tiễn tại Việt Nam, theo Quyết định số 3399/QĐ-BCT ngày 28/6/2010 của Bộ Công thương về Quy hoạch phát triển ngành công nghiệp chế biến sữa Việt Nam đến năm 2020, tầm nhìn đến năm 2025, sản lượng sữa tươi nội địa chỉ mới đáp ứng khoảng 35% nhu cầu năm 2015, 38% năm 2020 và định hướng 40% đến năm 2030. Nguồn sữa tươi trong nước chủ yếu ưu tiên cho sản phẩm sữa uống trực tiếp, do đó việc sử dụng sữa bột hoàn nguyên để sản xuất các sản phẩm sữa cô đặc và lên men như yogurt là định hướng công nghệ phù hợp. Tuy nhiên, sữa bột hoàn nguyên thường có khả năng liên kết gel và giữ nước kém hơn sữa tươi nguyên liệu tự nhiên nếu không có giải pháp kỹ thuật bổ trợ.

Mục tiêu chung của đề tài là khảo sát và đánh giá ảnh hưởng của việc bổ sung đồng thời chế phẩm enzyme transglutaminase vi sinh vật (MTGase) và phụ gia gelatin nhằm cải thiện cấu trúc mạng gel và giảm độ tách whey của sản phẩm yogurt. Theo văn bản giao nhiệm vụ, khóa luận thực hiện hai nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:

  1. Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung gelatin và transglutaminase trong sản phẩm yogurt.
  2. Đánh giá sự tương tác của transglutaminase và gelatin đến tính chất hóa lý (độ axit, độ tách whey, thời gian lên men, hàm lượng protein hòa tan trong whey, hình ảnh chụp kính hiển vi điện tử, quang phổ hồng ngoại biến đổi chuỗi), tính chất cơ lý (tính chất lưu biến) và tính chất cảm quan của sản phẩm yogurt.

Đối tượng nghiên cứu của khóa luận là sản phẩm yogurt sản xuất từ sữa bột nguyên kem, được biến tính cấu trúc bởi transglutaminase và gelatin. Phạm vi nghiên cứu về không gian được thực hiện tại phòng thí nghiệm và xưởng thực hành của Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Khoa Công nghệ Hóa học và Thực phẩm, Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh. Thời gian nghiên cứu được tiến hành từ ngày 13/01/2020 đến ngày 04/09/2020.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Về cơ sở lý thuyết, quá trình đông tụ tạo gel của yogurt dựa trên sự mất ổn định của hệ micelle casein khi độ pH của sữa giảm từ trạng thái bình thường (pH 6,6 - 6,8) về điểm đẳng điện của casein (pH 4,6) dưới tác động của axit lactic do vi khuẩn sinh ra. Micelle casein gồm bốn phân đoạn chính là $\alpha_{s1}$-casein (38%), $\alpha_{s2}$-casein (10%), $\beta$-casein (35%) và $\kappa$-casein (13%). Khi độ pH giảm xuống dưới 5,0, canxi photphat dạng keo (colloidal calcium phosphate - CCP) hòa tan hoàn toàn, điện tích âm bề mặt micelle bị triệt tiêu, lực đẩy tĩnh điện suy giảm và các tương tác kỵ nước gia tăng, dẫn đến sự kết tụ của các hạt casein thành mạng lưới không gian ba chiều giữ nước.

Nhằm gia cố mạng gel này, tác giả ứng dụng hai tác nhân:

  • Gelatin: Một loại protein keo ưa nước thu được từ quá trình thủy phân collagen động vật, có khả năng trương nở, hòa tan khi gia nhiệt và tạo mạng lưới liên kết hydro khi làm nguội, giữ các phân tử nước tự do trong các lỗ hổng gel.
  • Microbial Transglutaminase (MTGase, EC 2.3.2.13): Loại enzyme có nguồn gốc vi sinh vật xúc tác phản ứng chuyển nhóm acyl giữa nhóm $\gamma$-carboxamide của dư lượng glutamine và nhóm $\varepsilon$-amine bậc 1 của dư lượng lysine, tạo ra liên kết cộng hóa trị liên phân tử và nội phân tử $\varepsilon$-($\gamma$-glutamyl)lysine. $\kappa$-casein và $\beta$-casein là những cơ chất rất phù hợp cho MTGase do cấu trúc phân tử linh động, giúp liên kết ngang các chuỗi protein sữa và gelatin thành phức hợp bền vững.

Phương pháp bố trí thí nghiệm sử dụng phương pháp đáp ứng bề mặt (Response Surface Method - RSM) với mô hình cấu trúc lặp tâm trực giao cấp hai (Central Composite Circumscribed - CCC). Nghiên cứu khảo sát 2 yếu tố ảnh hưởng ($k=2$):

  • Biến $Z_1$: Hàm lượng MTGase (dao động từ 0,004 đến 0,120 g/g protein sữa).
  • Biến $Z_2$: Hàm lượng gelatin (dao động từ 0,128 đến 0,622 g/100 ml sữa).

Số lượng thí nghiệm thực hiện là $N = 2^k + 2k + n_0 = 4 + 4 + 5 = 13$ thí nghiệm (trong đó có 5 thí nghiệm lặp tại tâm, cánh tay đòn $\alpha = 1,414$). Hai hàm mục tiêu tối ưu hóa được xác định là độ tách whey ($y_1$, đơn vị %) và hàm lượng protein hòa tan trong whey ($y_2$, đơn vị mg/ml whey), cả hai đều hướng đến giá trị cực tiểu.

Quy trình sản xuất thực nghiệm gồm các công đoạn:

  1. Hoàn nguyên: Sữa bột nguyên kem được hòa tan với nước ở 45 - 50°C trong 20 phút để đạt hàm lượng chất khô 15%.
  2. Phối trộn: Bổ sung gelatin vào dung dịch sữa hoàn nguyên ở nhiệt độ 30°C, khuấy đều trong 15 phút.
  3. Xử lý enzyme: Đưa hỗn hợp sữa về 40°C, bổ sung enzyme MTGase theo tỷ lệ thí nghiệm và ủ ở 40°C trong 2 giờ.
  4. Thanh trùng: Gia nhiệt hỗn hợp ở 85°C trong 15 phút để vô hoạt enzyme và ức chế tạp khuẩn.
  5. Lên men: Cấy 5% giống vi khuẩn lactic hỗn hợp (Streptococcus thermophilus và Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus), ủ ở 40°C đến khi đạt pH 4,6 (thời gian khoảng 4 - 5 giờ).
  6. Làm lạnh và bảo quản: Hạ nhiệt độ sản phẩm xuống 22±2°C để ổn định cấu trúc gel, sau đó bảo quản lạnh ở 4±2°C.

Các phương pháp phân tích thực nghiệm bao gồm:

  • Xác định độ tách whey: Cân mẫu, ly tâm ở tốc độ 3500 vòng/phút trong 15 phút trên máy ly tâm Rotana 460, tách và cân lượng dịch whey thu được để tính tỷ lệ phần trăm tách whey.
  • Xác định protein hòa tan trong whey: Sử dụng phản ứng Folin theo phương pháp Lowry, đo độ hấp thụ quang học tại bước sóng 750 nm trên máy quang phổ UH5300 UV-Vis Spectrophotometer so sánh với đường chuẩn Albumin Egg.
  • Xác định độ axit: Phương pháp chuẩn độ theo thang độ Törner (°T) bằng dung dịch NaOH 0,1 M với chỉ thị phenolphtalein 1%.
  • Đo đặc tính lưu biến: Sử dụng thiết bị Rheostress RS để phân tích ứng suất cắt, độ nhớt biểu kiến theo tốc độ cắt và xác định hành vi chất lỏng.
  • Phân tích phổ hồng ngoại biến đổi chuỗi Fourier (FTIR): Ghi nhận phổ dao động phân tử trong dải số sóng từ 1800 - 1200 cm⁻¹ và 3600 - 3000 cm⁻¹.
  • Quan sát vi cấu trúc: Sử dụng kính hiển vi điện tử quét phát xạ trường (FESEM).
  • Đánh giá cảm quan và xử lý dữ liệu: Sử dụng phần mềm Design-Expert để tính toán hồi quy, kiểm định tiêu chuẩn Student và chuẩn kiểm định Fisher ($F$).

Nguồn dữ liệu thực nghiệm được xây dựng từ các nguyên liệu đạt chứng nhận chất lượng: sữa bột nguyên kem Fonterra (New Zealand), chế phẩm enzyme Saprona Transglutaminase 1E của C&P Enzymes (Đức), men giống lactic từ Green lines (Nga) và gelatin thương phẩm Long Hải.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng hợp các cơ sở lý luận về sản phẩm yogurt, nguyên liệu, vi sinh vật và cơ chế hình thành cấu trúc gel. Tác giả trình bày lịch sử phát triển của yogurt, các tiêu chuẩn thành phần theo FDA và USDA (chất béo tối thiểu 3,25%, chất khô không béo tối thiểu 8,25%, độ axit lactic không dưới 0,9%). Tác giả phân tích các hệ phân loại yogurt theo thành phần hóa học (thông thường, ít béo, không béo), trạng thái vật lý (set yogurt, stirred yogurt, yogurt uống) và hương vị. Chương 1 làm rõ vai trò cộng sinh giữa hai chủng Streptococcus thermophilus và Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus trong quá trình lên men lactic qua cơ chế protocooperation. Tác giả tập trung phân tích cấu trúc micelle casein, các phân đoạn $\alpha_{s1}$-, $\alpha_{s2}$-, $\beta$-, $\kappa$-casein và ba giai đoạn biến đổi hóa lý khi giảm pH sữa từ 6,7 về 4,6. Đồng thời, chương này tổng quan về đặc tính tạo gel, độ Bloom của gelatin, tính chất xúc tác độc lập với ion $Ca^{2+}$ của MTGase trong dải pH 5 - 8, nhiệt độ tối ưu 50°C và cơ chế tạo liên kết isopeptide $\varepsilon$-($\gamma$-glutamyl)lysine. Cuối chương là tổng thuật các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến việc ứng dụng MTGase và gelatin trên các hệ thực phẩm sữa.

Chương 2: Vật liệu và phương pháp

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn gốc nguyên vật liệu, hóa chất, máy móc phân tích và quy trình chế biến thực nghiệm yogurt từ sữa bột nguyên kem hoàn nguyên. Tác giả trình bày bảng phân tích thành phần hóa học của sữa bột Fonterra với các chỉ tiêu: protein 23,78%, lipid 28,28%, độ ẩm 2,79%, lactose 39%, khoáng 5,8%, vitamin A 736 µg/100 g và vitamin D3 11 µg/100 g. Trọng tâm của chương là thiết kế ma trận quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp 2 có tâm theo mô hình CCC gồm 13 thí nghiệm với 2 biến độc lập $Z_1$ (MTGase) và $Z_2$ (gelatin). Tác giả cung cấp đầy đủ các công thức tính toán cánh tay đòn $\alpha = 1,414$, tính phương sai tái hiện, kiểm định ý nghĩa hệ số hồi quy theo tiêu chuẩn Student, kiểm định độ tương thích của mô hình thực nghiệm theo tiêu chuẩn Fisher và mô tả quy trình giải bài toán tối ưu đơn mục tiêu trên phần mềm Design-Expert. Phần cuối chương chuẩn hóa các quy trình phân tích độ tách whey (ly tâm 3500 vòng/phút), định lượng protein hòa tan theo phương pháp Lowry ở bước sóng 750 nm, đo độ axit Törner, đo lưu biến trên máy Rheostress RS, đo phổ FTIR và chụp ảnh FESEM.

Chương 3: Kết quả và bàn luận

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm và thảo luận khoa học theo từng nội dung nghiên cứu. Trước hết, tác giả thiết lập phương trình hồi quy và phân tích bề mặt đáp ứng RSM cho hai hàm mục tiêu độ tách whey và hàm lượng protein hòa tan trong whey, xác định mức độ tương thích của mô hình qua phân tích phương sai ANOVA và hệ số Lack of fit. Từ kết quả mô hình hóa, tác giả lựa chọn 6 mẫu thực nghiệm đại diện (ký hiệu M1 đến M6) trải dài trên các vùng khảo sát để tiến hành đánh giá so sánh chuyên sâu với 3 mẫu đối chứng:

  • ĐC1: Mẫu chỉ bổ sung MTGase.
  • ĐC2: Mẫu chỉ bổ sung gelatin.
  • ĐC3: Mẫu đối chứng trắng (không bổ sung cả MTGase và gelatin).

Các kết quả thực nghiệm nổi bật được phân tích chi tiết trong chương gồm:

  • Khả năng giữ nước: Các mẫu phối hợp M1 - M6 đều ghi nhận tỷ lệ tách whey thấp hơn hẳn so với mẫu ĐC3.
  • Thời gian lên men: Sự hiện diện của MTGase và gelatin làm chậm nhẹ tốc độ giảm pH, kéo dài thời gian lên men đạt mốc pH 4,6 so với mẫu trắng, mẫu có nồng độ phối hợp cao nhất cần 4,58 giờ.
  • Đặc tính lưu biến: Dữ liệu đo ứng suất cắt theo tốc độ cắt xác nhận tất cả các mẫu yogurt đều thể hiện tính chất của chất lỏng giả dẻo (pseudoplastic) với chỉ số hành vi dòng chảy $n < 1$. Độ nhớt biểu kiến của các mẫu bổ sung kết hợp MTGase và gelatin cao hơn rõ rệt so với mẫu đối chứng ĐC3.
  • Phổ hồng ngoại FTIR: So sánh phổ của các mẫu ở hai dải số sóng 1800 - 1200 cm⁻¹ (vùng liên kết peptit amide I và amide II) và 3600 - 3000 cm⁻¹ (vùng dao động kéo dãn của nhóm N-H và O-H) cho thấy sự dịch chuyển nhẹ của các dải hấp thụ đặc trưng, xác nhận sự hình thành các liên kết cộng hóa trị mới và tương tác giữa các chuỗi polypeptide.
  • Vi cấu trúc FESEM: Hình ảnh chụp hiển vi điện tử phát xạ trường minh chứng mẫu bổ sung đồng thời MTGase và gelatin tạo ra mạng lưới gel protein dày đặc, cấu tử micelle liên kết đồng đều với kích thước lỗ xốp nhỏ hơn so với mạng gel thưa, lỗ rỗng lớn của mẫu ĐC3.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã thu thập và chứng minh bằng số liệu thực nghiệm định lượng về sự cải thiện tính chất hóa lý và cơ lý của yogurt khi kết hợp MTGase và gelatin:

Nhóm mẫu yogurt Hàm lượng MTGase & Gelatin bổ sung Độ tách whey (%) Độ nhớt biểu kiến (mPa·s) Thời gian lên men đến pH 4,6 (giờ) Đặc điểm vi cấu trúc gel (FESEM)
Mẫu kết hợp khảo sát (M1 - M6) Phối hợp theo ma trận RSM ($Z_1$: 0,004 - 0,120 g/g; $Z_2$: 0,128 - 0,622 g) 33,22 – 37,57 664,7 – 975,2 Lên đến 4,58 (mẫu nồng độ cao nhất) Mạng lưới protein đồng nhất, cấu tử nhỏ gọn, bề mặt gel mịn
Mẫu đối chứng không bổ sung (ĐC3) Không bổ sung MTGase ($Z_1 = 0$) và không bổ sung gelatin ($Z_2 = 0$) 45,39 527,3 Ngắn hơn các mẫu có enzyme Mạng lưới gel phân tán thưa hơn, nhiều khoảng rỗng lớn

Về mặt công nghệ, nghiên cứu đề xuất giải pháp kỹ thuật bổ sung kết hợp chế phẩm MTGase và gelatin trực tiếp vào quy trình sản xuất yogurt từ sữa bột hoàn nguyên 15% chất khô. Quy trình công nghệ đã cố định các thông số: hoàn nguyên ở 45 - 50°C trong 20 phút, phối trộn gelatin ở 30°C trong 15 phút, tiền xử lý enzyme ở 40°C trong 2 giờ trước khi thanh trùng 85°C/15 phút và lên men ở 40°C.

Về mặt đóng góp khoa học, đề tài đã làm rõ sự tương tác đồng thời giữa enzyme liên kết chéo MTGase và protein tạo gel gelatin trong môi trường sữa lên men. Trong khi các nghiên cứu trước đây tại Việt Nam chủ yếu khảo sát riêng rẽ từng phụ gia hoặc ứng dụng MTGase trên phô mai tươi, khóa luận này cung cấp bộ dữ liệu thực nghiệm toàn diện kết hợp giữa mô hình hóa thống kê RSM với các phương pháp phân tích cấu trúc tiên tiến (lưu biến học Rheostress RS, phổ FTIR và hiển vi điện tử FESEM).

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận được thực hiện trong phạm vi điều kiện kỹ thuật cụ thể và tác giả chỉ ra các giới hạn dựa trên nội dung thực nghiệm:

  • Nghiên cứu chỉ tiến hành khảo sát trên nền nguyên liệu sữa bột nguyên kem hoàn nguyên ở nồng độ cố định 15% chất khô, chưa mở rộng đối chứng trên các nền nguyên liệu khác như sữa tươi nguyên chất, sữa tách béo (ít béo, không béo) hoặc sữa dê.
  • Quá trình khảo sát thông số công nghệ chỉ tập trung vào 2 biến số là hàm lượng MTGase và hàm lượng gelatin trong giới hạn thiết kế của mô hình CCC, trong khi các thông số khác (nhiệt độ ủ enzyme 40°C, thời gian ủ 2 giờ, tỷ lệ giống men 5%) được giữ cố định.
  • Hướng mở rộng nghiên cứu tiếp theo bao gồm việc theo dõi độ ổn định cấu trúc và động học tách whey của yogurt trong suốt thời gian bảo quản dài ngày ở 4°C, đồng thời mở rộng quy mô thử nghiệm từ mức độ mẻ nhỏ phòng thí nghiệm lên hệ thống pilot công nghiệp.

Giá trị tham khảo

Báo cáo khóa luận là tài liệu tham khảo hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và giảng viên chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm, Kỹ thuật Hóa học, đặc biệt là nhóm nghiên cứu công nghệ chế biến sữa và đồ uống lên men.

Nội dung của đề tài mang giá trị ứng dụng thực tế cao ở các phần:

  • Phương pháp luận quy hoạch thực nghiệm: Cách xây dựng ma trận trực giao cấp hai lặp tâm CCC với 2 yếu tố, cách kiểm định Student, Fisher và xử lý số liệu tối ưu hóa bằng Design-Expert có thể làm mẫu cho các nghiên cứu tối ưu hóa công thức thực phẩm.
  • Phương pháp phân tích cơ lý và vi cấu trúc: Quy trình đo lưu biến học xác định hệ số chảy của chất lỏng giả dẻo, phương pháp phân tích phổ hồng ngoại FTIR để định danh biến đổi nhóm chức amino/carboxyl, và kỹ thuật chuẩn bị mẫu chụp ảnh FESEM đánh giá mạng protein sữa.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao nghiên cứu lại sử dụng sữa bột nguyên kem hoàn nguyên thay vì sữa tươi làm nguyên liệu chính?
Nghiên cứu xuất phát từ thực trạng ngành sữa Việt Nam theo Quyết định số 3399/QĐ-BCT, nguồn sữa tươi trong nước giai đoạn 2015 - 2020 chỉ đáp ứng được 35% đến 38% nhu cầu nội địa và ưu tiên cho sữa uống. Do đó, việc nghiên cứu giải pháp cải thiện cấu trúc yogurt sản xuất từ nguồn sữa bột hoàn nguyên có ý nghĩa thực tiễn quan trọng cho ngành chế biến sữa công nghiệp.

2. Tỷ lệ tách whey của các mẫu yogurt biến đổi như thế nào khi bổ sung kết hợp MTGase và gelatin?
Các mẫu yogurt bổ sung kết hợp MTGase và gelatin (M1 - M6) đạt tỷ lệ tách whey dao động trong khoảng từ 33,22% đến 37,57%, giảm đáng kể so với mức tách whey 45,39% ở mẫu đối chứng ĐC3 không bổ sung hai thành phần này.

3. Đặc tính lưu biến của các mẫu yogurt khảo sát thể hiện bản chất chất lỏng loại nào?
Kết quả phân tích trên thiết bị đo lưu biến chỉ ra rằng tất cả các mẫu yogurt đều có chỉ số hành vi dòng chảy $n < 1$, thể hiện bản chất là chất lỏng giả dẻo (pseudoplastic) có độ nhớt biểu kiến giảm khi tăng tốc độ cắt. Độ nhớt của các mẫu bổ sung MTGase và gelatin đạt từ 664,7 đến 975,2 mPa·s, vượt trội so với mẫu đối chứng ĐC3 chỉ đạt 527,3 mPa·s.

4. Bổ sung MTGase và gelatin ảnh hưởng như thế nào đến thời gian lên men của sản phẩm?
Hàm lượng MTGase và gelatin bổ sung làm kéo dài thời gian lên men của yogurt để đạt đến giá trị pH chuẩn 4,6 so với mẫu không bổ sung. Thời gian lên men dài nhất ghi nhận được là 4,58 giờ ở mẫu có hàm lượng kết hợp MTGase và gelatin cao nhất.

5. Kết quả phân tích FTIR và kính hiển vi FESEM khẳng định điều gì về cấu trúc sản phẩm?
Phổ FTIR ghi nhận sự dịch chuyển nhẹ của các dải hấp thụ ở vùng số sóng 1800 - 1200 cm⁻¹ và 3600 - 3000 cm⁻¹, phản ánh sự tương tác giữa các nhóm chức carboxyl ($C=O$) và amin ($N-H$). Hình ảnh FESEM chứng minh sự hình thành mạng lưới gel ba chiều đồng nhất, hạt micelle phân bố chặt chẽ và kích thước lỗ xốp nhỏ mịn hơn so với mẫu không bổ sung.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Hoàng Đức Khánh Nhân và Nguyễn Thị Phương Anh đã nghiên cứu thực nghiệm thành công ảnh hưởng tương tác giữa enzyme transglutaminase vi sinh vật (MTGase) và phụ gia gelatin đến chất lượng yogurt từ sữa bột nguyên kem. Kết quả chứng minh việc bổ sung đồng thời hai tác nhân giúp giảm tỷ lệ tách whey từ 45,39% xuống 33,22 - 37,57%, đồng thời gia tăng độ nhớt biểu kiến lên 664,7 - 975,2 mPa·s và tạo mạng lưới vi cấu trúc protein đồng nhất, mịn chắc. Công trình cung cấp quy trình công nghệ hoàn chỉnh và hệ thống dữ liệu hóa lý, cơ lý tin cậy cho ứng dụng cải thiện cấu trúc sản phẩm sữa lên men.