ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh tim mạch (CVD) là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên toàn thế giới cũng như tại Việt Nam [13]. Nồng độ trong huyết tương của lipoprotein cholesterol tỷ trọng thấp (LDL-C) có liên quan đến việc tăng nguy cơ phát triển bệnh tim mạch [8, 13, 19, 21]. Phytosterol gồm các sterol và stanol có nguồn gốc thực vật [17] – các hợp chất này không được tổng hợp trong cơ thể người và chỉ được lấy từ thức ăn [32]. Nhiều nghiên cứu cho thấy phytosterol thực vật có khả năng làm giảm sự hấp thu cholesterol của cơ thể, từ đó làm giảm LDL-C trong huyết tương [18, 19, 24, 26, 30, 32].
Tiêu thụ 2 g phytosterol/ngày có thể làm giảm 10% LDL-C [12, 13, 23]. Mức tiêu thụ này cao gấp 5-13 lần trong khẩu phần ăn (150-450 mg/ngày) của người bình thường [12, 23]. Một trong những vấn đề đó là cơ thể người chỉ có khả năng hấp thu một lượng nhỏ phytosterol từ thực phẩm, ở mức dưới 5% với sterol thực vật và 0,5% với stanol thực vật, trong khi hấp thu tới 50% -60% cholesterol từ thức ăn [17]. Do đó, phytosterol hấp thu từ khẩu phần ăn hàng ngày thường không đủ lớn để có tác dụng giảm cholesterol trong máu [3].
Phytosterol dưới dạng tự do hoặc este được thêm vào nhiều loại thực phẩm, đã được Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) công nhận là an toàn (GRAS) [17, 26]. Điều này đã dẫn đến việc chúng được chấp nhận rộng rãi như các thành phần dinh dưỡng và việc sử dụng chúng ngày càng tăng trong các sản phẩm thực phẩm bổ sung [15] để cải thiện sức khỏe con người. Chính vì vậy, việc phát triển phương pháp định lượng để khảo sát lượng phytosterol có trong thực phẩm, thực phẩm bổ sung như các sản phẩm sữa là cần thiết. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về các phương pháp xác định phytosterol trong thực phẩm như sữa, sữa chua,…Ở Việt Nam, phương pháp phân tích phytosterol trong dầu thực vật bằng sắc ký khí khối phổ GC-MS đã được phát triển và áp dụng tại viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia.
Với mong muốn mở rộng nền mẫu trên các mẫu thực phẩm và thực phẩm chức năng khác, nghiên cứu “Xác định phytosterol trong thực phẩm, thực phẩm chức năng bằng sắc ký khí khối phổ GC-MS” được thực hiện với hai mục tiêu sau: 1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng phytosterol trong sữa bằng sắc ký khí khối phổ GC-MS. Ứng dụng phương pháp xác định hàm lượng phytosterol trong một số mẫu sữa. Giới thiệu về Phytosterol 1.
Giới thiệu chung Phytosterol, bao gồm sterol có cấu trúc vòng thơm không bão hòa và stanol có cấu trúc vòng bão hòa, là các hợp chất steroid có trong thực vật và tương tự như cholesterol có trong động vật [12, 29], và có hơn 200 loại phytosterol khác nhau được tìm thấy trong thực vật. Tương tự như cholesterol, chúng tham gia vào quá trình quan trọng như trao đổi chất với sự tham gia vào màng tế bào, truyền tín hiệu và vai trò điều tiết ở thực vật [23]. Các phytosterol phổ biến nhất được tìm thấy trong thực vật là β- sitosterol, campesterol [23], lần lượt chiếm khoảng 65%, 30% lượng phytosterol trong chế độ ăn uống của con người. Các stanol thực vật phổ biến nhất là sitostanol và campestanol chiếm khoảng 5% phytosterol trong chế độ ăn uống [29].
Sau nhiều năm, tầm quan trọng của phytosterol trong chế độ ăn uống và các nghiên cứu tập trung vào lợi ích của chúng tăng lên đáng kể. Ngoài tác dụng làm giảm LDL-C, phytosterol còn được nghiên cứu với các hoạt tính chống viêm, chống oxy hóa và đặc tính chống ung thư [12, 14, 17, 29]. Phytosterol thường có trong dầu thực vật (46,3%), ngũ cốc (38,9%), rau (9,2%), quả hạch (2,0%), trái cây (1,5%), đậu và các sản phẩm từ đậu (1,4%) và củ (0,8%). Hàm lượng phytosterol của các loại dầu thực vật nằm trong khoảng 142,64–1891,82 mg/100 g [33].
Các loại hạt như quả óc chó, hạnh nhân, đậu phộng, quả phỉ và hạt mắc ca có tổng hàm lượng phytosterol nằm trong khoảng 99,12–207,17 mg/100 g [20]. Hạt dẻ cười và hạt hướng dương cũng rất giàu phytosterol với hàm lượng 270–289 mg/100 g [27]. So với các loại rau có tổng hàm lượng phytosterol là 20–30 mg/100 g, báo cáo cho thấy bột, ngũ cốc và mầm có hàm lượng trung bình cao hơn là 52 (17–344) mg/100 g, bánh mì là 54 (29–89) mg/100 g và các loại bánh ngọt và bánh quy khác là 52 (27–112) mg/ 100 g [25]. Hiện nay, phytosterol dạng tự do và este acid béo đã được thêm vào các nền thực phẩm không phải là chất béo như sữa ít chất béo, bánh, nước cam, thanh ngũ cốc, đồ uống ít béo, không béo và sô cô la thanh [18].
Một số loại sản phẩm thực phẩm chức năng như chất béo dạng phết, sữa, sữa chua, sốt mayonnaise và nước sốt salad được bổ sung phytosterol tự do hoặc este acid béo phytosteryl ở mức cao, có sẵn trên thị trường, đặc biệt là ở một số nước châu Âu [18, 20, 22]. Cấu trúc của phytosterol Tùy thuộc vào số lượng nhóm methyl ở vị trí C-4, phytosterol được chia thành 3 nhóm: 2 4-Desmethylsterols (dòng cholestan) bao gồm β-sitosterol, stigmasterol, campesterol và brassicasterol. 4-Monomethylsterols (dòng 4α-methylcholestan) gồm gramisterol, citrostadienol và lophenol. 4,4’-Dimethylsterols (dòng lanostane hay triterpen alcohols) gồm gramisterol, citrostadienol và lophenol.
Các phytosterol phổ biến nhất đều thuộc nhóm 4-Desmethylsterols [14, 31]. Ngoài các dạng với cấu trúc chính, phytosterol còn được chia thành 5 loại tùy thuộc vào loại gốc liên kết với chúng gồm: sterol tự do (FS), este acid hydroxycinnamic (HSE), este steryl (SE), steryl glycoside (SG) và steryl glycol được acyl hóa (ASG) [23, 24]. Phytosterol là triterpen có cấu trúc vòng perhydrocyclopentanophenanthren, có nhóm hydroxyl ở vị trí C-3, chuỗi bên bao gồm 8–10 nguyên tử carbon ở vị trí C-17 và thường là liên kết đôi ở vị trí C-5 [14]. Cấu trúc chung của phytosterol được thể hiện ở Hình 1-1.
Hình 1-1: Cấu trúc chung của phytosterol Phytosterol có cấu trúc tương tự như cholesterol (Hình 1-2). Sự khác biệt chính là phytosterol thường có nhóm methyl hoặc ethyl ở vị trí C-24 và một số phytosterol thông thường có liên kết đôi không bão hòa ở vị trí C-22 [14]. 3 Hình 1-2: Cấu trúc của các phytosterol phổ biến và cholesterol Trong đề tài này, các phytosterol bao gồm β-sitosterol, campesterol và brassicasterol là những phytosterol quan trọng được sử dụng để nghiên cứu. Các phytosterol đều có cấu trúc chung là nhân steroid đa vòng và trong phân tử chỉ chứa nhóm chức alcol nên không có sự khác biệt về tính chất lý hóa.
Phytosterol là bột màu trắng hoặc dạng tinh thể. Nhiệt độ sôi khoảng 100- 215°C. Trong phytosterol, nhân steroid đa vòng và chuỗi bên ở vị trí C-17 dẫn đến khả năng hòa tan trong nước kém, trong khi nhóm hydroxyl ở vị trí C-3 hạn chế khả năng hòa tan trong dầu, dễ dàng hòa tan trong các dung môi không phân cực. Điểm nóng chảy cao cũng không có lợi cho ứng dụng thực tế của chúng trong ngành công nghiệp thực phẩm.
Để mở rộng ứng dụng của phytosterol trong thực phẩm, độ hòa tan, khả năng phân tán và khả dụng sinh học cần phải được tăng lên bằng các biến đổi hóa học hoặc vật lý [14]. 4 β-sitosterol có công thức là C29H50O, khối lượng phân tử là 414,71 g/mol, là phytosterol phổ biến nhất, chiếm khoảng 65% trong chế độ ăn của con người. Theo các nghiên cứu, β-sitosterol ngoài khả năng làm ức chế sự hấp thu cholesterol, nó còn có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư, sự hình thành mạch, xâm lấn và di căn. Ngoài ra, chất này còn chống oxy hóa, là tác nhân chống tiểu đường, bảo vệ thần kinh.
β-sitosterol có tiềm năng cao trong điều trị các bệnh khác nhau và các chất tương tự cũng rất đáng chú ý trong tương lai. Campesterol có công thức là C28H48O, khối lượng phân tử là 400,68 g/mol, là phytosterol chiếm lượng lớn thứ 2 trong chế độ ăn của con người (30%), vai trò của nó tương tự như β-sitosterol. Brassicasterol có công thức là C29H46O, trong công thức cấu tạo có thêm liên kết đôi ở vị trí C-22, khối lượng phân tử là 398,7 g/mol. Brassicasterol là phytosterol chiếm lượng nhỏ trong tổng các phytosterol, được tìm thấy trong tảo biển và dầu hạt cải.
Ngoài vai trò tương tự như β-sitosterol và campesterol thì nó còn có vai trò là chất ức chế EC 1.72 (Delta(24)-sterol reductase), một dấu ấn sinh học, chất chuyển hóa ở người, chất chuyển hóa thực vật, chất chuyển hóa động vật, chất chuyển hóa tảo, chất ức chế sinh tổng hợp sterol. Hấp thu phytosterol và cơ chế gây ức chế hấp thu cholesterol Phytosterol không được tổng hợp nội sinh ở người mà được hấp thu từ thức ăn. Mặc dù cùng có khung cấu trúc sterol, phytosterol được hấp thu ở ruột kém hơn nhiều so với cholesterol. Đối với người khỏe mạnh, tỷ lệ hấp thu phytosterol thường dưới 5%, còn với cholesterol là 35%–70% [14].
Quá trình hấp thụ phytosterol ở ruột diễn ra theo ba giai đoạn: Đầu tiên, phytosterol tạo thành mixen hỗn hợp với acid béo, acid mật, lecithin và các chất dinh dưỡng khác. Sau đó, các mixen hỗn hợp đến gần tế bào biểu mô ruột để đi vào màng viền bàn chải. Phytosterol được giải phóng từ các mixen và được vận chuyển vào các tế bào biểu mô ruột qua trung gian là các protein quan trọng trong quá trình hấp thụ sterol trên màng vi nhung mao. Cuối cùng, phytosterol tự do đi vào tế bào biểu mô ruột được este hóa bởi acyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase (ACAT), sau đó được tập hợp thành chylomicron với triacylglycerol và apolipoprotein B48 dưới tác dụng của protein chuyển triglyceride microsome.
Quá trình este hóa ruột của sterol bởi ACAT đã được báo cáo là kém hiệu quả hơn đối với phytosterol so với cholesterol [14]. Khi vào bên trong tế bào ruột, sự hấp thụ phytosterol bị ức chế bởi hoạt động của các chất vận chuyển dòng ra, bao gồm một cặp protein cassette liên kết ATP (ABC) được gọi là ABCG5 và ABCG8. ABCG5 và ABCG8 mỗi loại tạo thành một nửa chất vận chuyển tiết ra phytosterol và cholesterol không ester hóa từ tế bào ruột vào lòng 5 ruột. Phytosterol được các chất vận chuyển ABCG5/G8 tiết trở lại vào ruột với tốc độ lớn hơn nhiều so với cholesterol, dẫn đến sự hấp thu phytosterol trong chế độ ăn uống ở ruột thấp hơn nhiều so với cholesterol.
Trong tế bào ruột, phytosterol không dễ dàng được este hóa như cholesterol, vì vậy chúng được kết hợp thành chylomicron ở nồng độ thấp hơn nhiều. Những phytosterol được tích hợp vào chylomicron đi vào tuần hoàn máu và được gan hấp thụ.