MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết, mục tiêu và nội dung Luận án Từ ngàn xưa, ông cha ta đã biết sử dụng nguồn cây cỏ phong phú xung quanh để làm thuốc trị bệnh, bồi bổ cơ thể, tăng cường sức khỏe. Các dược liệu quý được ghi chép thành các bài thuốc cổ truyền với nhiều tác dụng quý báu. Một trong số các dược liệu quý đó là Hà thủ ô đỏ.
Theo Y học cổ truyền, Hà thủ ô đỏ có nhiều tác dụng quý như bổ huyết, điều hoà khí huyết, bổ gan thận, mạnh gân cốt, nhuận tràng. Y học hiện đại đã chứng minh Hà thủ ô đỏ có tác dụng làm giảm lượng đường trong máu, hỗ trợ suy nhược thần kinh, làm tăng hoạt động của tim, làm tăng sự co bóp của ruột, có tác dụng chống viêm. Nhờ những tác dụng đó mà Hà thủ ô đỏ được sử dụng rộng rãi để làm thuốc phục vụ đời sống con người từ xưa đến nay. Tuy nhiên, hiện nay trên thị trường, vị thuốc quý này đang bị giả mạo bằng một số loại rễ củ như: Hà thủ ô trắng, Củ nâu, Củ cọc.
hoặc tình trạng người sử dụng mua phải dược liệu “rác” đã bị chiết hết các hoạt chất, gây ảnh hưởng đến sức khoẻ người bệnh và quyền lợi người tiêu dùng. Vì vậy, việc nghiên cứu đánh giá chất lượng, tiêu chuẩn hoá dược liệu Hà thủ ô đỏ là vấn đề hết sức cần thiết. Ở Việt Nam, qui định chính thống việc kiểm tra chất lượng dược liệu Hà thủ ô đỏ còn nhiều hạn chế. Chuyên luận Hà thủ ô đỏ trong Dược Điển Việt Nam V (DĐVN V) có qui định hàm lượng chất chiết được và chỉ tiêu định lượng anthraquinon dạng dẫn xuất (tính theo emodin và physcion).
Qua khảo sát một số mẫu, kết quả thu được cho thấy hầu hết các mẫu dược liệu Hà thủ ô đỏ Việt Nam đều không đạt theo yêu cầu của DĐVN V về chỉ tiêu hàm lượng anthraquinon dạng dẫn xuất, nguyên nhân có thể do chất lượng thực tế của mẫu Hà thủ ô đỏ Việt Nam, hoặc do chỉ tiêu quy định hoặc phương pháp phân tích chưa phù hợp. Để giải quyết vấn đề này, cần thiết thực hiện nghiên cứu về đánh giá, phân tích thành phần hóa học trên đối tượng Hà thủ ô đỏ trồng tại Việt Nam, từ đó xây dựng được tiêu chí định lượng phù hợp đối với dược liệu Hà thủ ô đỏ trồng tại Việt Nam, giúp cho công tác kiểm soát chất lượng dược liệu Hà thủ ô đỏ ở Việt Nam chặt chẽ hơn. 12 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Từ những thực tiễn trên, luận án “Nghiên cứu phân tích và đánh giá một số thành phần hóa học chính trong dƣợc liệu và sản phẩm chứa Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson) tại Việt Nam” được thực hiện với mục tiêu nghiên cứu xây dựng các phương pháp phân tích và đánh giá hàm lượng một số thành phần hóa học chính (thuộc nhóm chất stilben và anthraquinon) có trong dược liệu Hà thủ ô đỏ Việt Nam, từ đó gợi ý chỉ tiêu bổ sung cho chuyên luận Hà thủ ô đỏ trong DĐVN. Với mục tiêu đề ra, nội dung nghiên cứu của Luận án bao gồm: - Phát triển phương pháp HPLC/UV phân tích định lượng 2,3,5,4′- tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucosid, emodin và physcion trong dược liệu Hà thủ ô đỏ thành phương pháp đối chiếu (sử dụng phổ MS/MS đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp).
- Xây dựng mới một số phương pháp phân tích định lượng thành phần hóa học chính có trong dược liệu Hà thủ ô đỏ Việt Nam: HPLC/FL, TLC/SD (có so sánh với phương pháp đối chiếu). - Phân tích đánh giá hàm lượng hoạt chất (thuộc nhóm stilben và anthraquinon) trong các mẫu dược liệu và một số sản phẩm chứa Hà thủ ô đỏ trên thị trường. - Sơ bộ phân loại nguồn gốc mẫu dược liệu Hà thủ ô đỏ dựa trên thành phần hoá học kết hợp các phương pháp thống kê. Những đóng góp mới về mặt khoa học và thực tiễn của Luận án Về mặt khoa học - Xây dựng mới phương pháp HPLC/FL với độ nhạy cao để phân tích định lượng 5 chất THSG, RES, PC, EM, PS trong dược liệu và sản phẩm chứa Hà thủ ô đỏ.
- Xây dựng mới phương pháp TLC/SD để định lượng nhanh THSG, EM và PS trong dược liệu Hà thủ ô đỏ nhằm phục vụ kiểm nghiệm nguyên liệu đầu vào dùng trong sản xuất. - Nghiên cứu đã bước đầu phân loại được nguồn gốc dược liệu Hà thủ ô đỏ dựa trên thành phần hoá học. 13 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Về mặt thực tiễn - Nghiên cứu đã xây dựng và phát triển được một số phương pháp phân tích định lượng thành phần hoá học chính trong dược liệu Hà thủ ô đỏ gồm: HPLC/UV, TLC/SD và HPLC/FL. Các phương pháp phân tích xây dựng được có ưu điểm và phạm vi áp dụng khác nhau, tuỳ theo cơ sở vật chất của Phòng thí nghiệm và mục tiêu kiểm nghiệm.
Tuy nhiên, các phương pháp đều có ưu điểm là trang thiết bị không quá đắt tiền, thao tác thực nghiệm đơn giản nên có thể áp dụng rộng rãi trong kiểm nghiệm dược liệu và sản phẩm từ dược liệu. - Kết quả định lượng các hoạt chất chính có trong 48 mẫu Hà thủ ô đỏ đã gợi mở về tiêu chí lựa chọn chất đánh dấu đối với Hà thủ ô đỏ và đề xuất tiêu chí phù hợp, cần thiết bổ sung vào chuyên luận dược liệu Hà thủ ô đỏ của Dược điển Việt Nam. 14 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Tổng quan về Hà thủ ô đỏ 1.
Cây Hà thủ ô đỏ Hà thủ ô đỏ có tên khoa học là Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson, thuộc họ Rau răm (Polygonaceae), bộ Cẩm chướng (Caryophyllales). Hà thủ ô đỏ là cây dây leo, sống nhiều năm, thân thảo, mềm và nhẵn, leo quấn vào cây khác. Lá mọc so le hình tim, đầu thuôn nhọn, dài 4-6 cm, rộng 3-4 cm, có 3 gân xuất phát từ gốc lá, hai mặt nhẵn, mặt trên sẫm bóng có gai thịt; cuống dài khoảng 2 cm. Cụm hoa mọc ở kẽ lá hoặc đầu cành thành chùy phân nhánh, dài hơn lá; lá bắc ngắn; hoa nhỏ nhiều, màu trắng; nhị 8, thường dính vào gốc của bao hoa.
Quả 3 cạnh, nhẵn bóng màu nâu đỏ, nằm trong bao hoa mà 3 mảnh ngoài phát triển thành những cánh rộng. Mùa hoa từ tháng 9-11; mùa quả từ tháng 12-2 năm sau. Bộ phận dùng chính là rễ củ của cây màu nâu, hình trụ tròn (gọi là Hà thủ ô đỏ). Cây trồng 2-3 năm thì thu hoạch, thời gian thu hái khoảng từ tháng 10 đến tháng 12 [8,15].
Cây (a, b) và rễ củ (c, d) Hà thủ ô đỏ Ở Việt Nam, Hà thủ ô đỏ phân bố tự nhiên tập trung ở vùng trung du miền núi có độ cao từ 500-2000 m tại một số tỉnh miền núi phía Bắc: Hà Giang, Lai Châu, Lào Cai, Sơn La,… Các tỉnh ít gặp hơn như Hòa Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Lạng Sơn, Cao Bằng, Yên Bái. Hà thủ ô đỏ là loại cây ưa khí hậu ẩm mát của vùng cận nhiệt đới và nhiệt đới núi cao, cây ưa sáng và có thể hơi chịu bóng. Nơi mọc tự nhiên thích hợp nhất là các quần thể rừng núi đá vôi, độ cao tới 1700 m, nhiệt độ trung bình quanh năm dưới 20oC. Hà thủ ô đỏ thường mọc ở đất ẩm, xốp, nhiều 15 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com mùn, nhất là loại ở chân núi đá.
Hà thủ ô đỏ ra quả hàng năm, mỗi cây có thể ra nhiều quả. Sau khi quả già, phần thân leo trên mặt đất làm hạt giống phát tán xung quanh và sẽ nảy mầm vào mùa xuân hè năm sau [7,15]. Dược liệu Hà thủ ô đỏ Dược liệu Hà thủ ô đỏ (Radix Fallopia multiflora) là phần rễ củ phơi hay sấy khô của cây Hà thủ ô đỏ, có dạng hình củ tròn, hoặc hình thoi, không đều, củ nhỏ để nguyên, củ to bổ đôi theo chiều dọc, hay chặt thành từng miếng to. Mặt ngoài có những chỗ lồi lõm do các nếp nhăn ăn sâu tạo thành.
Mặt cắt ngang có lớp bần mỏng màu nâu sẫm, mô mềm vỏ màu đỏ hồng, có nhiều bột, ở giữa có ít lõi gỗ. Dƣợc liệu Hà thủ ô đỏ 1. Thành phần hóa học Hà thủ ô đỏ chứa khoảng 1,7% anthraquinon, trong đó có emodin, chrysophanol, rhein, physcion; 1,1% protid, 45,2% tinh bột, 3,1% lipid, 4,5% chất vô cơ, 26,4% các chất tan trong nước, lecitin, rhaponticin (rhapontin, ponticin), 2,3,5,4’-tetrahydroxytiben-2-O-β-D-glucosid (THSG). Hàm lượng các hoạt chất thay đổi rõ rệt sau khi chế biến.
Lúc chưa chế, HTO chứa 7,68% tanin, 0,25% dẫn chất anthraquinon tự do, 0,80% dẫn chất anthraquinon toàn phần. Sau khi chế, còn 3,82% tanin, 0,11% dẫn chất anthraquinon tự do và 0,25% dẫn chất anthraquinon toàn phần [15]. Stilben và anthraquinon là hai nhóm chất đặc trưng cho Hà thủ ô đỏ, được các nghiên cứu trên thế giới cũng như trong nước quan tâm, đặc biệt là được Dược điển một số nước dùng làm chất đối chiếu trong kiểm tra, đánh giá chất lượng dược liệu Hà thủ ô đỏ. 16 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.
Thành phần stilben Stilben là nhóm chất thuộc nhóm chất lớn phenylpropanoid, có chung một cấu trúc mạch cacbon là C6-C2-C6. Một số stilben đã được tìm thấy trong thực vật và khẳng định về hoạt tính đặc trưng của chúng như piceatannolin có trong rễ của cây vân sam Na Uy hay pinosylvin là một độc tố nấm bảo vệ gỗ khỏi bị nhiễm trùng nấm, được tìm thấy trong cây họ thông, pterostilben có trong Hạnh nhân, cây Thông và quả Mọng, resveratrol là một stilben quan trọng có trong Nho, Cốt khí củ…. Các hợp chất stilben được chứng minh có các tác dụng sinh học như: tác dụng chống oxi hóa, điều hòa cân nặng, chống dị ứng [52], tác dụng trên tim mạch [42], tác dụng kháng viêm [22]. Ngoài ra còn có tác dụng chống khối u, đặc biệt là ngăn ngừa ung thư vú, ở liều thấp cũng chỉ ra khả năng làm giảm quá trình di căn [22].
Riêng với THSG đã được chứng minh có tác dụng chống lão hóa, chống viêm [78], ức chế tế bào ung thư đối với ung thư đại trực tràng ở người [76]. piceid trans-resveratrol cis-resveratrol THSG Hình 1. Một số hợp chất stilben có trong dƣợc liệu Hà thủ ô đỏ THSG có CTPT là C20H22O9. Ở nhiệt độ thường, THSG tồn tại ở dạng chất rắn màu nâu đỏ [66,77].
Độ tan của THSG trong nước là 5 mg/ml. Cấu trúc của THSG (Hình 1.3) có các nối đôi liên hợp, THSG có khả năng hấp thụ ánh sáng và đây là cơ sở hóa học cho các nghiên cứu về phân tích định tính, định lượng THSG. Tương tự như THSG, piceid cũng là một hợp chất stilben glycosid, còn có tên gọi khác là polydatin.