Nghiên Cứu Phân Tích Thành Phần Hóa Học Hà Thủ Ô Đỏ (Fallopia Multifora) Tại Việt Nam

Luận án tiến sĩ y tế nghiên cứu hus nghiên cứu phân tích và đánh giá một số thành phần hóa học chính trong dược liệu và sản phẩm, phân tích chuyên sâu, xây dựng mô hình lý thuyết,

• Tác giả: N T H
• Người hướng dẫn: PGS. Tạ Thị Thảo
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Hóa phân tích
• Đề tài: Nghiên Cứu Phân Tích Và Đánh Giá Một Số Thành Phần Hóa Học Chính Trong Dược Liệu Và Sản Phẩm Chứa Hà Thủ Ô Đỏ (Fallopia Multiflora (Thunb.) Haraldson) Tại Việt Nam
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan về Hà thủ ô đỏ
• 1.2. Cây Hà thủ ô đỏ
• 1.3. Dược liệu Hà thủ ô đỏ
• 1.4. Thành phần hóa học
• 1.5. Công dụng và tác dụng dược lý của Hà thủ ô đỏ
• 1.6. Phân tích định lượng một số thành phần hóa học trong Hà thủ ô đỏ
• 1.7. Một số phương pháp phân tích sắc ký thường được áp dụng trong phân tích thành phần hóa học Hà thủ ô đỏ
• 1.8. Các phương pháp phân tích trong Dược điển
• 1.9. Các nghiên cứu về xác định thành phần hóa học trong Hà thủ ô đỏ
• 1.10. Nghiên cứu về phân loại nguồn gốc mẫu ứng dụng phương pháp thống kê đa biến
• 1.11. Một số nghiên cứu về phân loại nguồn gốc mẫu
• 1.12. Kết luận phần tổng quan
• 2. CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Mẫu dược liệu Hà thủ ô đỏ
• 2.3. Mẫu sản phẩm từ Hà thủ ô đỏ
• 2.4. Hóa chất, thiết bị
• 2.5. Các hóa chất khác
• 2.6. Thiết bị, dụng cụ
• 2.7. Phương pháp nghiên cứu
• 2.8. Tối ưu hóa điều kiện hệ thống sắc ký
• 2.9. Khảo sát phương pháp chuẩn bị mẫu
• 2.10. Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích
• 2.11. Xử lý số liệu thực nghiệm
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Phát triển phương pháp HPLC/UV để định lượng một số thành phần hóa học chính có trong dược liệu Hà thủ ô đỏ Việt Nam
• 3.1.1. Lựa chọn điều kiện phân tích HPLC/UV
• 3.1.2. Xây dựng các phương trình đường chuẩn
• 3.1.3. Nghiên cứu phương pháp xử lý mẫu dược liệu Hà thủ ô đỏ
• 3.1.4. Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích
• 3.1.5. Qui trình phân tích định lượng THSG, EM và PS trong dược liệu Hà thủ ô đỏ bằng phương pháp HPLC/UV
• 3.1.6. Kết luận về phương pháp HPLC/UV xây dựng được
• 3.2. Xây dựng mới phương pháp định lượng một số thành phần trong dược liệu Hà thủ ô đỏ Việt Nam bằng HPLC/FL
• 3.2.1. Lựa chọn điều kiện phân tích HPLC/FL
• 3.2.2. Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích
• 3.2.3. Qui trình phân tích định lượng THSG, RES, PC, EM và PS trong dược liệu Hà thủ ô đỏ bằng phương pháp HPLC/FL
• 3.2.4. So sánh phương pháp HPLC/FL xây dựng được với phương pháp đối chiếu HPLC/UV
• 3.2.5. Kết luận về phương pháp HPLC/FL xây dựng được
• 3.3. Xây dựng mới phương pháp định lượng đồng thời một số thành phần chính trong dược liệu Hà thủ ô đỏ Việt Nam bằng TLC/SD
• 3.3.1. Lựa chọn điều kiện phân tích TLC/SD
• 3.3.2. Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích
• 3.3.3. Qui trình phân tích định lượng THSG, EM và PS trong dược liệu Hà thủ ô đỏ bằng phương pháp TLC/SD
• 3.3.4. So sánh phương pháp TLC/SD xây dựng được với phương pháp HPLC/UV đối chiếu
• 3.3.5. Kết luận về phương pháp TLC/SD xây dựng được
• 3.4. Ứng dụng phân tích đánh giá chất lượng và phân loại nguồn gốc mẫu dược liệu Hà thủ ô đỏ
• 3.4.1. Phân tích hàm lượng hoạt chất trong dược liệu và sản phẩm từ Hà thủ ô đỏ bằng phương pháp HPLC/FL
• 3.4.2. Bước đầu phân loại nguồn gốc mẫu dược liệu Hà thủ ô đỏ dựa trên hàm lượng các hoạt chất định lượng được
• 3.5. Kết luận
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về Phân Tích Hóa Học Hà Thủ Ô Đỏ Tại Việt Nam

Hà thủ ô đỏ, hay còn gọi là Fallopia multiflora, là một trong những dược liệu quý giá trong y học cổ truyền Việt Nam. Nghiên cứu về thành phần hóa học của Hà thủ ô đỏ không chỉ giúp hiểu rõ hơn về công dụng của nó mà còn hỗ trợ trong việc phát triển các phương pháp phân tích hiện đại. Việc phân tích hóa học Hà thủ ô đỏ tại Việt Nam đang trở thành một lĩnh vực nghiên cứu quan trọng, nhằm đảm bảo chất lượng và hiệu quả của dược liệu này.

1.1. Hà Thủ Ô Đỏ và Vai Trò Trong Y Học Cổ Truyền

Hà thủ ô đỏ được biết đến với nhiều công dụng như bổ huyết, điều hòa khí huyết và hỗ trợ gan thận. Nghiên cứu cho thấy, dược liệu này có khả năng làm giảm lượng đường trong máu và hỗ trợ điều trị một số bệnh lý liên quan đến thần kinh.

1.2. Thành Phần Hóa Học Chính Trong Hà Thủ Ô Đỏ

Hà thủ ô đỏ chứa nhiều thành phần hóa học quan trọng như stilben và anthraquinon. Các hợp chất này không chỉ có tác dụng dược lý mà còn ảnh hưởng đến chất lượng của dược liệu. Việc phân tích các thành phần này là cần thiết để đảm bảo chất lượng sản phẩm.

II. Vấn Đề và Thách Thức Trong Phân Tích Hóa Học Hà Thủ Ô Đỏ

Mặc dù Hà thủ ô đỏ có nhiều công dụng, nhưng việc phân tích và đánh giá chất lượng dược liệu này tại Việt Nam vẫn gặp nhiều thách thức. Các vấn đề như giả mạo dược liệu và thiếu tiêu chuẩn hóa trong kiểm tra chất lượng đang gây khó khăn cho người tiêu dùng.

2.1. Tình Trạng Giả Mạo Dược Liệu Hà Thủ Ô Đỏ

Trên thị trường hiện nay, nhiều sản phẩm giả mạo Hà thủ ô đỏ đang được bày bán, gây ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng. Việc nhận diện và phân biệt dược liệu thật và giả là một thách thức lớn.

2.2. Thiếu Tiêu Chuẩn Trong Kiểm Tra Chất Lượng

Việc thiếu các tiêu chuẩn rõ ràng trong kiểm tra chất lượng Hà thủ ô đỏ dẫn đến tình trạng sản phẩm không đạt yêu cầu. Cần thiết phải xây dựng các tiêu chí định lượng phù hợp để đảm bảo chất lượng dược liệu.

III. Phương Pháp Phân Tích Hóa Học Hà Thủ Ô Đỏ Hiện Nay

Để đánh giá chất lượng Hà thủ ô đỏ, nhiều phương pháp phân tích hiện đại đã được áp dụng. Các phương pháp này không chỉ giúp xác định thành phần hóa học mà còn đảm bảo độ chính xác và tin cậy trong kết quả.

3.1. Phương Pháp HPLC UV Trong Phân Tích

HPLC/UV là một trong những phương pháp phổ biến nhất trong phân tích hóa học Hà thủ ô đỏ. Phương pháp này cho phép xác định nhanh chóng và chính xác các thành phần hóa học chính trong dược liệu.

3.2. Phương Pháp TLC SD Đánh Giá Chất Lượng

TLC/SD là phương pháp sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ hấp thụ quang, giúp phân tích và đánh giá chất lượng Hà thủ ô đỏ một cách hiệu quả. Phương pháp này có thể so sánh với HPLC để xác định độ chính xác.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Phân Tích Hóa Học Hà Thủ Ô Đỏ

Kết quả từ các nghiên cứu phân tích hóa học Hà thủ ô đỏ không chỉ giúp nâng cao chất lượng sản phẩm mà còn hỗ trợ trong việc phát triển các sản phẩm dược phẩm mới. Việc ứng dụng các phương pháp phân tích hiện đại sẽ giúp người tiêu dùng yên tâm hơn khi sử dụng dược liệu này.

4.1. Đánh Giá Chất Lượng Dược Liệu Trên Thị Trường

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng nhiều mẫu Hà thủ ô đỏ trên thị trường không đạt tiêu chuẩn chất lượng. Việc đánh giá chất lượng dược liệu là cần thiết để bảo vệ quyền lợi người tiêu dùng.

4.2. Phát Triển Sản Phẩm Mới Từ Hà Thủ Ô Đỏ

Nghiên cứu về thành phần hóa học của Hà thủ ô đỏ mở ra cơ hội phát triển các sản phẩm dược phẩm mới, giúp nâng cao giá trị của dược liệu này trong y học hiện đại.

V. Kết Luận và Tương Lai Của Nghiên Cứu Hà Thủ Ô Đỏ

Nghiên cứu về phân tích hóa học Hà thủ ô đỏ tại Việt Nam đang ngày càng trở nên quan trọng. Việc xây dựng các tiêu chuẩn và phương pháp phân tích phù hợp sẽ giúp nâng cao chất lượng dược liệu và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng.

5.1. Tương Lai Của Nghiên Cứu Hóa Học Hà Thủ Ô Đỏ

Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu và phát triển các phương pháp phân tích mới để đảm bảo chất lượng Hà thủ ô đỏ. Việc hợp tác giữa các nhà nghiên cứu và cơ quan quản lý sẽ là chìa khóa để nâng cao chất lượng dược liệu.

5.2. Đề Xuất Các Tiêu Chuẩn Mới Cho Hà Thủ Ô Đỏ

Cần thiết phải đề xuất các tiêu chuẩn mới cho Hà thủ ô đỏ dựa trên kết quả nghiên cứu. Điều này sẽ giúp nâng cao chất lượng và độ tin cậy của dược liệu trên thị trường.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ hóa học của nghiên cứu sinh N T H với đề tài "Nghiên cứu phân tích và đánh giá một số thành phần hóa học chính trong dược liệu và sản phẩm chứa Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson) tại Việt Nam" được thực hiện tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, chuyên ngành Hóa phân tích (mã số: 9440112.03), dưới sự hướng dẫn của PGS. Tạ Thị Thảo và PGS. Phương Thiện Thương. Công trình nghiên cứu được hoàn thành và bảo vệ năm 2019.

Về tính cấp thiết, rễ củ Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson, thuộc họ Rau răm Polygonaceae) là vị thuốc cổ truyền được sử dụng phổ biến với công năng bổ khí huyết, bổ gan thận, nhuận tràng, mạnh gân xương; y học hiện đại đã chứng minh tác dụng hạ đường huyết, chống viêm, tăng co bóp ruột và bảo vệ gan. Tuy nhiên, trên thị trường dược liệu Việt Nam tồn tại thực trạng dược liệu bị làm giả bằng củ nâu, củ cọc, rễ cây Hà thủ ô trắng, hoặc bị chiết kiệt hoạt chất trước khi bán ("dược liệu rác"). Bên cạnh đó, công tác tiêu chuẩn hóa dược liệu Hà thủ ô đỏ trong nước còn nhiều điểm bất cập. Chuyên luận Hà thủ ô đỏ trong Dược điển Việt Nam V (DĐVN V) quy định hàm lượng chất chiết được và chỉ tiêu định lượng nhóm anthraquinon dạng dẫn xuất (tính theo emodin và physcion) đạt từ 0,1% trở lên sau khi thủy phân. Dữ liệu khảo sát thực tế tại Viện Dược liệu cho thấy phần lớn các mẫu Hà thủ ô đỏ thu thập tại Việt Nam đều không đạt chỉ tiêu này. Thực trạng này đặt ra vấn đề cần làm rõ nguyên nhân bắt nguồn từ chất lượng nội tại của dược liệu trong nước hay do phương pháp phân tích và tiêu chí quy định trong Dược điển chưa phù hợp.

Khoảng trống nghiên cứu được xác định là:

1. Thiếu các nghiên cứu toàn diện đánh giá hàm lượng của cả hai nhóm hoạt chất đặc trưng gồm stilben (đặc biệt là 2,3,5,4'-tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucosid - THSG) và anthraquinon (emodin, physcion) trên các mẫu dược liệu trồng và thu hái tại các vùng sinh thái khác nhau của Việt Nam.
2. Thiếu quy trình phân tích định lượng đồng thời có độ nhạy cao (như sắc ký lỏng ghép đầu dò huỳnh quang - HPLC/FL) hoặc quy trình phân tích sàng lọc nhanh, chi phí thấp phục vụ kiểm soát nguyên liệu đầu vào (như sắc ký lớp mỏng quét mật độ quang - TLC/SD).
3. Thiếu dữ liệu hóa học kết hợp công cụ thống kê đa biến để bước đầu nhận dạng, phân loại nguồn gốc địa lý của các mẫu dược liệu Hà thủ ô đỏ Việt Nam.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án bao gồm:

1. Phát triển phương pháp HPLC/UV phân tích định lượng đồng thời THSG, emodin (EM) và physcion (PS) trong dược liệu Hà thủ ô đỏ làm phương pháp đối chiếu, sử dụng dữ liệu phổ khối lượng phân giải cao (MS/MS) để khẳng định tính đặc hiệu.
2. Xây dựng mới phương pháp HPLC/FL có độ nhạy cao để định lượng đồng thời 5 hoạt chất gồm THSG, resveratrol (RES), piceid (PC), emodin (EM) và physcion (PS) trong dược liệu và các sản phẩm chứa Hà thủ ô đỏ.
3. Xây dựng mới phương pháp TLC/SD nhằm định lượng nhanh THSG, EM và PS trong dược liệu Hà thủ ô đỏ phục vụ kiểm nghiệm nguyên liệu sản xuất.
4. Đánh giá hàm lượng hoạt chất stilben và anthraquinon trong 48 mẫu dược liệu Hà thủ ô đỏ thu hái tại Việt Nam và một số sản phẩm thương mại lưu thông trên thị trường.
5. Bước đầu ứng dụng các kỹ thuật phân tích thống kê đa biến nhằm phân loại nguồn gốc mẫu dược liệu dựa trên hàm lượng các hoạt chất chính.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Mẫu rễ củ cây Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson), bao gồm mẫu dược liệu tươi/khô, mẫu Hà thủ ô đỏ chế và các sản phẩm/chế phẩm thương phẩm chứa Hà thủ ô đỏ; các hợp chất chuẩn đối chiếu gồm THSG, emodin, physcion, resveratrol và piceid.
• Phạm vi không gian: 48 mẫu dược liệu thu thập từ các vùng phân bố tự nhiên và vùng trồng tại Việt Nam (tập trung ở các tỉnh miền núi phía Bắc như Hà Giang, Lai Châu, Lào Cai, Sơn La, Hòa Bình, Cao Bằng, Lạng Sơn...) và các mẫu sản phẩm trên thị trường Việt Nam.
• Phạm vi thời gian: Thực hiện trong giai đoạn 2017-2018 (thông qua đề tài cấp Viện Dược liệu về ứng dụng hệ HPLC-UV/FLD) và hoàn thành năm 2019.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan tài liệu của luận án tập trung khảo sát các chuyên luận kiểm nghiệm dược liệu Hà thủ ô đỏ trong các Dược điển quốc tế và các nghiên cứu phân tích thành phần hóa học đã được công bố trên thế giới cũng như tại Việt Nam.

Về quy định trong Dược điển, luận án đã tổng hợp các tiêu chí định lượng hoạt chất chính từ Dược điển Trung Quốc (DĐTQ 2010, 2015), Dược điển Hồng Kông (DĐHK), Dược điển Mỹ (USP) và Dược điển Việt Nam V (DĐVN V), thể hiện sự khác biệt rõ rệt về chỉ tiêu hoạt chất và phương pháp chuẩn bị mẫu:

Chỉ tiêu / Thông số	DĐTQ (2015)	DĐHK	DĐ Mỹ (USP)	DĐVN V (2017)
Hoạt chất quy định	THSG ≥ 1,0%; Anthraquinon dẫn xuất (tính theo EM, PS) ≥ 0,1%	THSG ≥ 2,2%	THSG ≥ 1,5%; Tổng anthraquinon ≥ 0,1%; Anthraquinon glycosid ≥ 0,07%	Anthraquinon dẫn xuất (tính theo EM, PS) ≥ 0,1% (chưa có THSG)
Dung môi chiết	Ethanol loãng (cho THSG); Methanol (cho anthraquinon)	Ethanol 50%	Methanol 70% (cho THSG); Methanol (cho anthraquinon)	Methanol (chiết hồi lưu và thủy phân bằng HCl 8%)
Phương pháp chiết	Hồi lưu (THSG); Hồi lưu và thủy phân HCl, chiết cloroform	Chiết siêu âm và ly tâm	Hồi lưu 90 phút (THSG); Hồi lưu 60 phút (anthraquinon)	Hồi lưu 60 phút, thủy phân bằng HCl 8%, chiết hồi lưu với cloroform
Kỹ thuật phân tích	HPLC/UV	HPLC/UV	HPLC/UV	HPLC/UV

Về các nghiên cứu phân tích bằng HPLC/UV, luận án điểm lại các công trình tiêu biểu:

• Nghiên cứu của Quan và cộng sự [47] định lượng THSG, EM, PS trên cột C18 (250 × 4,6 mm, 5 µm) với hệ pha động acetonitril (ACN) chứa 0,1% acid formic và nước chứa 0,1% acid formic ở bước sóng 290 nm. Nhóm tác giả khẳng định chiết hồi lưu bằng methanol cho hiệu suất cao hơn so với chiết Soxhlet và chiết siêu âm.
• Nhóm Huang và cộng sự [82] phân tích đồng thời THSG, EM, PS trong 25 phút sử dụng cột Zorbax SB-C18 với pha động gồm methanol và nước chứa 0,1% acid phosphoric tại nhiệt độ cột 30°C.
• Nhóm Yang và cộng sự [53] xây dựng quy trình phân tích đồng thời 13 hoạt chất trên hệ thống HPLC/PDA và HPLC/VWD với pha động ACN và nước chứa acid formic 0,05%, chứng minh detector quang phổ biến đổi bước sóng (VWD) cho độ chọn lọc và độ tuyến tính tốt hơn detector mảng diod (PDA).
• Tác giả Sun và cộng sự [85] chiết siêu âm bằng ethanol 70% để định lượng 2 hợp chất stilben và 6 flavonoid trong các bộ phận rễ, thân, lá của Hà thủ ô đỏ.
• Hu và cộng sự [17] sử dụng ethanol 95% chiết tách và phân lập điều chế được 2 g THSG tinh khiết qua hệ cột pha đảo với hệ dung môi methanol - nước.
• Tại Việt Nam, Hoàng Quỳnh Hoa và cộng sự [12] định lượng đồng thời EM và THSG bằng HPLC/UV trên cột C18, ghi nhận hàm lượng THSG trong dược liệu Hà thủ ô đỏ miền Bắc dao động 2,24 - 3,03%, hàm lượng EM dao động 0,069 - 0,112%, trong khi các mẫu trôi nổi trên thị trường không phát hiện thấy EM. Trần Việt Hùng và cộng sự [10] áp dụng HPLC/UV định lượng 5 hợp chất anthraquinon và stilben trong dược liệu Đại hoàng.

Về các kỹ thuật sắc ký khác và phân tích đa biến:

• Sắc ký lỏng ghép đầu dò huỳnh quang (HPLC/FL): He D và cộng sự [36] định lượng đồng thời 5 anthraquinon (aloe-emodin, EM, rhein, PS, chrysophanol) trong Đại hoàng, Cốt khí củ và Hà thủ ô đỏ tại bước sóng kích thích 440 nm và phát xạ 540 nm trên cột Hypersil C18 với hệ pha động methanol và acid formic 0,1% (85:15, v/v). Một số tác giả [37, 45, 56, 64] ứng dụng tính huỳnh quang của trans-resveratrol để phân tích trong rượu vang và nho ở các dải bước sóng kích thích/phát xạ như 300/381 nm, 320/404 nm, 315/395 nm, 298/386 nm. Luận án ghi nhận chưa có công bố nào ứng dụng HPLC/FL để định lượng các stilben trong Hà thủ ô đỏ.
• Sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC/MS/MS): Teng-Hua Wang và cộng sự [73] dùng UHPLC/LTQ/Orbitrap-MSn định danh 23 hợp chất phenolic và UHPLC/MS/MS định lượng 4 hoạt chất (acid gallic, THSG, EM, emodin-8-O-β-D-glucopyranosid) trong Hà thủ ô đỏ. Zhitao Liang và cộng sự [84] phân tích HPLC/MS trên 5 cặp mẫu Hà thủ ô đỏ sống và chế cùng 15 mẫu thuốc sắc, ghi nhận hàm lượng THSG và các anthraquinon glycosid giảm sau khi chế biến. Yang Zhao và cộng sự [79] phân tích cuộng lá Hà thủ ô đỏ bằng HPLC/UV/MS và dùng thuật toán PCA để phân loại vùng trồng dựa trên hàm lượng THSG.
• Sắc ký lớp mỏng quét mật độ quang (TLC/SD): Singh và cộng sự [58] định lượng anthraquinon trong Đại hoàng tại bước sóng 445 nm; nhóm nghiên cứu [59] định lượng physcion và chrysophanol trong Thảo quyết minh tại 289 nm và 258 nm. Chưa có công bố nào về định lượng đồng thời stilben và anthraquinon trong Hà thủ ô đỏ bằng TLC/SD.
• Ứng dụng thống kê đa biến (PCA, HCA): Luận án tổng quan các công trình ứng dụng dấu vân tay hóa học và chemometrics phân loại dược liệu Ginkgo biloba [80], phân biệt Dendrobii và Dendrobii officinalis [24], kiểm soát chất lượng Hoàng liên Rhizoma Coptidis chinensis [83], và phân biệt gelatin nguồn gốc bò - lợn [61].

Vị trí của luận án: Kế thừa các nền tảng kỹ thuật sắc ký hiện có, luận án giải quyết khoảng trống về phương pháp phân tích độ nhạy cao (HPLC/FL) định lượng đồng thời cả hai nhóm stilben và anthraquinon; thiết lập phương pháp TLC/SD đơn giản, kinh tế phục vụ sàng lọc nguyên liệu; đồng thời cung cấp bộ số liệu thực nghiệm trên 48 mẫu Hà thủ ô đỏ Việt Nam làm luận cứ khoa học đề xuất điều chỉnh chỉ tiêu chất lượng trong Dược điển Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết của luận án dựa trên cấu trúc hóa học và tính chất quang phổ của hai nhóm hợp chất chính:

• Nhóm stilben: Cấu trúc mạch C6-C2-C6, tiêu biểu là THSG (C20H22O9, phân tử lượng 406,38), piceid (C20H22O8) và resveratrol (C14H12O3). Các chất này có hệ nối đôi liên hợp hấp thụ mạnh trong vùng tử ngoại (286 - 320 nm) và có khả năng phát huỳnh quang khi được kích thích ở bước sóng thích hợp.
• Nhóm anthraquinon: Cấu trúc khung anthracen-9,10-dion, tồn tại ở dạng tự do (aglycon) như emodin (C15H10O5, phân tử lượng 270,24) và physcion (C16H12O5, phân tử lượng 284,26) hoặc dạng liên kết glycosid. Do có các nhóm chức hydroxyl (-OH), methoxy (-OCH3) gắn vào nhân thơm liên hợp với các nhóm carbonyl (C=O), anthraquinon hấp thụ bức xạ tử ngoại - khả kiến tại dải sóng 220 - 350 nm và gần 400 nm, đồng thời phát huỳnh quang trong dải sóng 420 - 850 nm.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm:

• Tối ưu hóa điều kiện sắc ký: Khảo sát các thông số cột sắc ký pha đảo (RP-HPLC C18), thành phần hệ dung môi pha động (acetonitril, methanol, nước có acid formic hoặc acid phosphoric), chương trình rửa giải gradient, tốc độ dòng, nhiệt độ buồng cột, thể tích tiêm mẫu và bước sóng phát hiện (UV và cặp bước sóng kích thích/phát xạ huỳnh quang FLD). Đối với TLC/SD, tối ưu hóa hệ dung môi khai triển bản mỏng silica gel, thể tích chấm mẫu và bước sóng quét vệt hấp thụ.
• Khảo sát phương pháp chuẩn bị mẫu: Do THSG có tính phân cực cao (chứa 4 nhóm phân cực -OH và 1 gốc đường) trong khi EM và PS kém phân cực, luận án khảo sát độc lập các phương pháp chiết (chiết hồi lưu, chiết siêu âm), bản chất dung môi (ethanol, methanol, nước và các tỷ lệ phối hợp), tỷ lệ thể tích dung môi trên khối lượng dược liệu, nhiệt độ chiết, thời gian và số lần chiết lặp lại.
• Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp (phương pháp thẩm định theo hướng dẫn của AOAC và Dược điển):
  • Tính đặc hiệu / độ chọn lọc: Kiểm tra độ tinh khiết pic sắc ký và xác nhận bằng khối phổ phân giải cao MS/MS.
  • Tính thích hợp của hệ thống sắc ký: Đánh giá số đĩa lý thuyết (N), hệ số kéo đuôi (Tf), độ phân giải giữa các pic (Rs) và độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu, diện tích pic (%RSD, n = 6).
  • Khoảng nồng độ tuyến tính và phương trình đường chuẩn: Đánh giá qua hệ số tương quan (R2).
  • Giới hạn phát hiện (LOD, MDL) và giới hạn định lượng (LOQ, MQL).
  • Độ chụm: Đánh giá độ lệch chuẩn tương đối của độ lặp lại trong ngày (RSDr) và độ lặp lại khác ngày (RSDR).
  • Độ đúng: Đánh giá qua hiệu suất thu hồi (Recovery %) khi thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ khác nhau vào nền mẫu thực.
  • Độ không đảm bảo đo (ĐKĐBĐ): Tính toán theo các nguồn gây sai số trong toàn bộ quy trình phân tích.
• Phương pháp xử lý dữ liệu và thống kê đa biến: Dữ liệu diện tích pic sắc ký và nồng độ hoạt chất được xử lý trên phần mềm sắc ký chuyên dụng; thuật toán phân tích cụm theo thứ bậc (HCA - tạo cây phân nhóm dạng cluster tree) và phân tích cấu tử chính (PCA - giảm chiều dữ liệu đa biến, xác định các trục phương sai lớn nhất) được sử dụng để phân loại các mẫu dược liệu theo vùng thu hái.

Hóa chất, thiết bị và nguồn dữ liệu:

• Mẫu thực nghiệm: 48 mẫu rễ củ Hà thủ ô đỏ tươi và khô thu hái tại các tỉnh phía Bắc Việt Nam, các mẫu Hà thủ ô đỏ chế và các sản phẩm chứa Hà thủ ô đỏ lưu hành trên thị trường.
• Chất chuẩn: THSG, emodin, physcion, resveratrol, piceid có độ tinh khiết phân tích.
• Thiết bị chính: Hệ thống HPLC kết nối detector UV-VIS (DAD/VWD), detector huỳnh quang (FLD); hệ thống HPLC ghép khối phổ (LC/MS/MS); máy quét mật độ quang sắc ký lớp mỏng (TLC Scanner Densitometry); cân phân tích độ chính xác 0,01 mg; bể siêu âm có điều nhiệt; hệ thống chiết hồi lưu cách thủy.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 cung cấp tổng quan lý thuyết và thực tiễn về đối tượng nghiên cứu:

• Trình bày đặc điểm hình thái thực vật của cây Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora), phân bố sinh thái tại các vùng núi đá vôi có độ cao 500 - 2000 m ở miền Bắc Việt Nam (nhiệt độ trung bình dưới 20°C). Mô tả đặc điểm dược liệu rễ củ (Radix Fallopia multiflora), cấu tạo mô học vỏ, lớp bần và lõi gỗ.
• Tổng hợp thành phần hóa học: rễ củ chứa khoảng 1,7% anthraquinon (emodin, physcion, rhein, chrysophanol), các dẫn xuất stilben (THSG, piceid, resveratrol), tanin (chiếm 7,68% ở mẫu sống, giảm còn 3,82% sau khi chế biến), tinh bột (45,2%), lipid và các khoáng chất vô cơ.
• Trình bày tác dụng dược lý trong y học cổ truyền (bổ can thận, dưỡng huyết, nhuận tràng, ích tinh) và y học hiện đại (chống lão hóa, điều hòa lipid máu, bảo vệ tế bào gan, hạ đường huyết, kháng khuẩn). Phân tích sự chuyển hóa và biến đổi hàm lượng tanin, anthraquinon tự do và anthraquinon toàn phần qua các công đoạn chế biến truyền thống.
• Phân tích chi tiết các kỹ thuật phân tích hóa học: HPLC/UV, HPLC/FL, LC/MS/MS, TLC/SD và chemometrics (PCA, HCA). Nhấn mạnh các hạn chế trong chuyên luận Hà thủ ô đỏ của DĐVN V khi chưa có tiêu chuẩn định lượng THSG và phương pháp định lượng anthraquinon dẫn xuất yêu cầu thủy phân phức tạp nhưng kết quả thực tế thường không đạt.

Chương 2: Thực nghiệm

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm, nguyên vật liệu và phương pháp thẩm định:

• Nguồn mẫu: Thu thập và mã hóa 48 mẫu dược liệu Hà thủ ô đỏ tươi/khô tại các địa phương (Hà Giang, Lào Cai, Lai Châu, Sơn La...), các mẫu Hà thủ ô đỏ chế và các sản phẩm thực phẩm chức năng/thuốc thành phẩm chứa Hà thủ ô đỏ.
• Khảo sát các điều kiện sắc ký: Đánh giá các loại pha tĩnh C18, hệ dung môi pha động (kênh nước acid hóa bằng acid formic hoặc acid phosphoric; kênh hữu cơ gồm acetonitril hoặc methanol), tỷ lệ rửa giải gradient và đẳng dòng, tốc độ dòng 0,8 - 1,0 ml/phút, nhiệt độ lò cột và thể tích tiêm mẫu.
• Tối ưu hóa các thông số khối phổ (MS/MS) phục vụ đánh giá tính đặc hiệu pic sắc ký.
• Khảo sát các thông số ảnh hưởng đến quá trình chuẩn bị mẫu: dung môi chiết, tỷ lệ dung môi/dược liệu, nhiệt độ chiết, thời gian chiết siêu âm và số lần chiết hồi lưu cho từng nhóm chất THSG và EM, PS.
• Thiết lập quy trình xác nhận giá trị sử dụng của các phương pháp phân tích theo hướng dẫn tiêu chuẩn hóa (tính đặc hiệu, độ tuyến tính, LOD, LOQ, MDL, MQL, độ lặp lại trong ngày và khác ngày, hiệu suất thu hồi và độ không đảm bảo đo ĐKĐBĐ).
• Thiết lập quy trình xử lý dữ liệu thực nghiệm bằng các thuật toán thống kê đa biến HCA và PCA.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm và thảo luận khoa học qua 4 nội dung chính:

1. Phát triển phương pháp HPLC/UV làm phương pháp đối chiếu:

• Tối ưu hóa điều kiện sắc ký phân tích đồng thời THSG, EM và PS. Dữ liệu khối phổ MS/MS khẳng định các pic phân tích có độ tinh khiết cao, không bị chồng chập bởi tạp chất nền.
• Nghiên cứu xử lý mẫu: Do độ phân cực khác biệt, luận án đã tối ưu hóa hai quy trình chiết riêng biệt cho THSG và nhóm EM, PS để đạt hiệu suất chiết tối đa.
• Xác nhận giá trị sử dụng: Phương trình đường chuẩn của THSG, EM và PS đạt hệ số tương quan R2 cao; độ thích hợp hệ thống, độ lặp lại trong ngày và khác ngày (RSD < 5%), hiệu suất thu hồi đạt yêu cầu theo quy định phân tích vết và hàm lượng hoạt chất tự nhiên; thiết lập đầy đủ giới hạn MDL, MQL và độ không đảm bảo đo (ĐKĐBĐ).

2. Xây dựng mới phương pháp HPLC/FL:

• Lựa chọn điều kiện sắc ký huỳnh quang: Thiết lập chương trình bước sóng kích thích (Ex) và phát xạ (Em) thích hợp cho cả 5 hoạt chất THSG, RES, PC, EM và PS. Phương pháp đạt độ chọn lọc và độ nhạy phân tích vượt trội so với HPLC/UV, cho phép định lượng chính xác ở nồng độ thấp.
• Thẩm định phương pháp HPLC/FL: Đánh giá độ tuyến tính, xác định LOD, LOQ, MDL, MQL, độ lặp lại trong ngày/khác ngày, hiệu suất thu hồi của từng chất trong số 5 hoạt chất phân tích và xác định độ không đảm bảo đo.
• So sánh phương pháp HPLC/FL với phương pháp đối chiếu HPLC/UV: Xây dựng đường hồi quy tuyến tính so sánh kết quả định lượng THSG, EM và PS giữa hai phương pháp; hệ số góc tiệm cận 1 và hệ số tương quan R2 chứng minh sự tương đồng thống kê và độ tin cậy của phương pháp HPLC/FL.

3. Xây dựng mới phương pháp TLC/SD:

• Tối ưu hóa hệ dung môi pha động (HDM) khai triển trên bản mỏng silica gel, lựa chọn được hệ dung môi HDM5 cho phép tách rõ ràng các vết THSG, EM và PS (xác định các giá trị hệ số lưu giữ Rf và độ rộng vết). Tối ưu hóa thể tích chấm mẫu và điều kiện quét đo mật độ quang.
• Thẩm định phương pháp TLC/SD: Đánh giá tính thích hợp hệ thống, khoảng nồng độ tuyến tính, LOD, LOQ, MDL, MQL, độ lặp lại trong ngày và khác ngày, hiệu suất thu hồi và độ không đảm bảo đo.
• So sánh phương pháp TLC/SD với phương pháp HPLC/UV: Phân tích đường hồi quy tương quan cho thấy phương pháp TLC/SD có độ chính xác tin cậy, phù hợp để kiểm tra nhanh nguyên liệu đầu vào.

4. Ứng dụng phân tích đánh giá chất lượng và phân loại nguồn gốc mẫu:

• Định lượng hàm lượng các hoạt chất THSG, EM, PS, RES, PC trong 48 mẫu dược liệu Hà thủ ô đỏ bằng phương pháp HPLC/FL và HPLC/UV. Kết quả cho thấy hàm lượng THSG chiếm tỷ lệ vượt trội so với các anthraquinon, trong khi hàm lượng anthraquinon tự do (EM, PS) ở mức thấp.
• Định lượng hoạt chất trong các mẫu sản phẩm thương phẩm chứa Hà thủ ô đỏ, đánh giá độ ổn định và hàm lượng thực tế so với nhãn công bố.
• Xử lý số liệu hàm lượng bằng các thuật toán thống kê đa biến: Đồ thị phân tích cụm theo thứ bậc (HCA) và đồ thị phân tích cấu tử chính (PCA) cho thấy các mẫu dược liệu có xu hướng phân cụm theo vùng địa lý thu hái dựa trên tương quan hàm lượng các hoạt chất stilben và anthraquinon.

Kết quả và những đóng góp mới

Về mặt khoa học:

• Xây dựng mới phương pháp HPLC/FL với độ nhạy cao để phân tích định lượng đồng thời 5 chất gồm THSG, resveratrol (RES), piceid (PC), emodin (EM) và physcion (PS) trong dược liệu và các sản phẩm chứa Hà thủ ô đỏ. Đây là nghiên cứu đầu tiên áp dụng đầu dò huỳnh quang để định lượng đồng thời cả nhóm stilben và anthraquinon trên đối tượng Hà thủ ô đỏ.
• Xây dựng mới phương pháp sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang (TLC/SD) để định lượng nhanh THSG, EM và PS trong dược liệu Hà thủ ô đỏ, cung cấp giải pháp phân tích kinh tế cho các cơ sở sản xuất.
• Phát triển và thẩm định phương pháp HPLC/UV làm phương pháp đối chiếu, ứng dụng phổ khối lượng phân giải cao MS/MS để kiểm tra độ đặc hiệu của pic sắc ký theo khuyến cáo của AOAC.
• Bước đầu ứng dụng công cụ hóa trắc lượng (chemometrics: HCA, PCA) dựa trên dữ liệu hàm lượng hoạt chất để phân loại nguồn gốc mẫu dược liệu Hà thủ ô đỏ theo vùng địa lý tại Việt Nam.

Về mặt thực tiễn và kiến nghị:

• Xây dựng thành công hệ thống các quy trình phân tích định lượng (HPLC/UV, HPLC/FL, TLC/SD) có tính khả thi cao, trang thiết bị phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm kiểm nghiệm tại Việt Nam, thao tác thực nghiệm rõ ràng, có thể áp dụng rộng rãi trong kiểm soát chất lượng nguyên liệu và thành phẩm.
• Kết quả định lượng trên 48 mẫu Hà thủ ô đỏ thực tế tại Việt Nam chứng minh hàm lượng THSG trong dược liệu luôn ở mức cao (thường đạt trên 1,0 - 2,0%), trong khi hàm lượng anthraquinon dạng dẫn xuất thường rất thấp, lý giải nguyên nhân vì sao hầu hết các mẫu kiểm nghiệm trong nước không đạt tiêu chuẩn DĐVN V.
• Luận án đề xuất cơ quan quản lý và Hội đồng Dược điển Việt Nam xem xét bổ sung chỉ tiêu định lượng hoạt chất THSG vào chuyên luận dược liệu Hà thủ ô đỏ trong Dược điển Việt Nam, đồng thời nghiên cứu điều chỉnh lại chỉ tiêu hoặc phương pháp định lượng anthraquinon cho phù hợp với thực tiễn dược liệu trong nước.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu:

• Số lượng mẫu nghiên cứu gồm 48 mẫu dược liệu, tập trung chủ yếu ở một số tỉnh miền núi phía Bắc và một số vùng trồng đại diện, chưa bao phủ toàn bộ các vùng sinh thái có phân bố Hà thủ ô đỏ trên toàn quốc.
• Việc phân loại nguồn gốc mẫu dược liệu bằng phương pháp thống kê đa biến (PCA, HCA) mới dừng lại ở bước đầu dựa trên hàm lượng của 5 hoạt chất chính, chưa kết hợp với toàn bộ dữ liệu phổ vân tay sắc ký hoặc các chỉ thị sinh học phân tử (DNA barcoding).
• Số lượng các mẫu sản phẩm thương phẩm khảo sát còn hạn chế về chủng loại và dạng bào chế.

Hướng nghiên cứu tiếp:

• Mở rộng thu thập mẫu dược liệu Hà thủ ô đỏ với số lượng lớn hơn tại các vùng sinh thái miền Trung và miền Nam để hoàn thiện bộ cơ sở dữ liệu hóa học quốc gia.
• Nghiên cứu sâu hơn về động học phân hủy và chuyển hóa của THSG và các anthraquinon trong các quy trình chế biến cổ truyền (chế với nước đỗ đen, cửu chưng cửu sái) để chuẩn hóa quy trình chế biến.
• Ứng dụng mô hình phân loại đa biến kết hợp dữ liệu vân tay hóa học toàn phổ (chromatographic fingerprinting) và phân tích hóa học lượng tử để nâng cao độ chính xác trong truy xuất nguồn gốc địa lý và phát hiện gian lận thương mại.

Giá trị tham khảo

Luận án có giá trị tham khảo chuyên môn đối với các nhóm đối tượng:

• Cơ quan quản lý và cơ quan biên soạn tiêu chuẩn (Cục Quản lý Dược, Viện Dược liệu, Hội đồng Dược điển Việt Nam): Cung cấp số liệu thực nghiệm làm cơ sở khoa học để sửa đổi, bổ sung chuyên luận dược liệu Hà thủ ô đỏ trong Dược điển Việt Nam, đặc biệt là việc đưa THSG thành chỉ tiêu định lượng bắt buộc.
• Hệ thống các Viện, Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc và thực phẩm trên toàn quốc: Tham khảo quy trình phân tích HPLC/UV đối chiếu, phương pháp HPLC/FL độ nhạy cao để kiểm tra tạp chất hoặc hàm lượng vết trong các chế phẩm phức tạp.
• Doanh nghiệp sản xuất dược phẩm và thực phẩm bảo vệ sức khỏe: Ứng dụng quy trình TLC/SD để kiểm tra, đánh giá nhanh chất lượng nguyên liệu đầu vào Hà thủ ô đỏ, phân biệt dược liệu thật và dược liệu giả mạo hoặc dược liệu đã bị chiết kiệt hoạt chất.
• Giảng viên, nghiên cứu sinh và học viên cao học ngành Hóa phân tích, Hóa dược, Dược học cổ truyền: Tham khảo quy trình tối ưu hóa điều kiện sắc ký, phương pháp xử lý mẫu phân cực khác biệt, quy trình thẩm định phương pháp phân tích theo AOAC và kỹ thuật xử lý số liệu đa biến (PCA, HCA).

Câu hỏi thường gặp

1. Vì sao đa số các mẫu Hà thủ ô đỏ tại Việt Nam kiểm nghiệm theo Dược điển Việt Nam V lại không đạt yêu cầu?
Chuyên luận Hà thủ ô đỏ trong DĐVN V quy định chỉ tiêu định lượng anthraquinon dạng dẫn xuất (tính theo emodin và physcion) phải đạt từ 0,1% trở lên sau khi chiết hồi lưu và thủy phân bằng acid vô cơ (HCl 8%). Kết quả thực nghiệm của luận án và dữ liệu từ Viện Dược liệu cho thấy hàm lượng anthraquinon tự do và dẫn xuất trong dược liệu Hà thủ ô đỏ tự nhiên tại Việt Nam vốn tồn tại ở mức rất thấp, trong khi thành phần chiếm ưu thế vượt trội là stilben (THSG). Quy định chỉ tiêu và phương pháp chiết thủy phân của DĐVN V chưa phản ánh sát thực tế thành phần hóa học của cây trồng tại Việt Nam.

2. Luận án đã xây dựng và phát triển những phương pháp phân tích sắc ký cụ thể nào?
Luận án đã thiết lập 3 phương pháp sắc ký:

• Phát triển phương pháp HPLC/UV định lượng đồng thời 3 hoạt chất (THSG, emodin, physcion) làm phương pháp đối chiếu, sử dụng phổ khối lượng phân giải cao MS/MS khẳng định độ đặc hiệu.
• Xây dựng mới phương pháp HPLC/FL định lượng đồng thời 5 hoạt chất (THSG, piceid, resveratrol, emodin, physcion) với độ nhạy cao nhờ đầu dò huỳnh quang.
• Xây dựng mới phương pháp TLC/SD định lượng đồng thời 3 hoạt chất (THSG, emodin, physcion) bằng kỹ thuật đo mật độ quang bản mỏng, phục vụ kiểm nghiệm nhanh nguyên liệu.

3. Nhóm hợp chất stilben nào được định lượng trong nghiên cứu và có đặc tính phân tích ra sao?
Nghiên cứu tập trung vào 3 hợp chất stilben là THSG (2,3,5,4'-tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucosid), resveratrol và piceid. Các hợp chất này tan tốt trong dung môi phân cực (nước, cồn loãng), hấp thụ ánh sáng tử ngoại tại dải sóng 286 - 320 nm và có khả năng phát huỳnh quang. Trong đó, THSG là hoạt chất đặc trưng nhất của Hà thủ ô đỏ với hàm lượng thực tế trong rễ củ dao động từ 1,0% đến trên 3,0%.

4. Kỹ thuật thống kê đa biến nào được sử dụng và đem lại kết quả gì trong phân loại nguồn gốc mẫu?
Luận án sử dụng hai thuật toán thống kê đa biến là Phân tích cụm theo thứ bậc (HCA) và Phân tích cấu tử chính (PCA), với biến số đầu vào là dữ liệu hàm lượng các hoạt chất (THSG, EM, PS, RES, PC) thu được từ 48 mẫu thực nghiệm. Kết quả cho thấy các mẫu dược liệu có sự gom cụm rõ rệt tương ứng với từng vùng địa lý thu hái (các tỉnh miền núi phía Bắc), chứng minh tính khả thi của việc dùng dữ liệu hóa học để nhận diện xuất xứ dược liệu.

5. Luận án đưa ra đề xuất kiến nghị cốt lõi nào đối với tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu Hà thủ ô đỏ?
Luận án kiến nghị bổ sung chỉ tiêu định lượng hợp chất THSG vào chuyên luận Hà thủ ô đỏ của Dược điển Việt Nam với mức hàm lượng quy định cụ thể, đồng thời điều chỉnh lại chỉ tiêu định lượng nhóm anthraquinon cho phù hợp với đặc tính tự nhiên của nguồn dược liệu Việt Nam, giúp kiểm soát hiệu quả tình trạng giả mạo và dược liệu kém chất lượng trên thị trường.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của nghiên cứu sinh N T H đã giải quyết thành công các vấn đề thực tiễn và khoa học trong kiểm soát chất lượng dược liệu Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora) tại Việt Nam thông qua việc thiết lập ba hệ thống phương pháp phân tích HPLC/UV đối chiếu, HPLC/FL độ nhạy cao và TLC/SD sàng lọc nhanh. Toàn bộ các quy trình phân tích đều được thẩm định đầy đủ về tính thích hợp hệ thống, độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ lặp lại, hiệu suất thu hồi và độ không đảm bảo đo theo tiêu chuẩn quốc tế. Kết quả phân tích định lượng trên 48 mẫu dược liệu thực tế đã cung cấp cơ sở dữ liệu hóa học quan trọng, bước đầu phân loại được nguồn gốc mẫu bằng công cụ thống kê đa biến (PCA, HCA), đồng thời làm sáng tỏ căn cứ khoa học để đề xuất bổ sung chỉ tiêu định lượng THSG vào Dược điển Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết, mục tiêu và nội dung Luận án Từ ngàn xưa, ông cha ta đã biết sử dụng nguồn cây cỏ phong phú xung quanh để làm thuốc trị bệnh, bồi bổ cơ thể, tăng cường sức khỏe. Các dược liệu quý được ghi chép thành các bài thuốc cổ truyền với nhiều tác dụng quý báu. Một trong số các dược liệu quý đó là Hà thủ ô đỏ.

Theo Y học cổ truyền, Hà thủ ô đỏ có nhiều tác dụng quý như bổ huyết, điều hoà khí huyết, bổ gan thận, mạnh gân cốt, nhuận tràng. Y học hiện đại đã chứng minh Hà thủ ô đỏ có tác dụng làm giảm lượng đường trong máu, hỗ trợ suy nhược thần kinh, làm tăng hoạt động của tim, làm tăng sự co bóp của ruột, có tác dụng chống viêm. Nhờ những tác dụng đó mà Hà thủ ô đỏ được sử dụng rộng rãi để làm thuốc phục vụ đời sống con người từ xưa đến nay. Tuy nhiên, hiện nay trên thị trường, vị thuốc quý này đang bị giả mạo bằng một số loại rễ củ như: Hà thủ ô trắng, Củ nâu, Củ cọc.

hoặc tình trạng người sử dụng mua phải dược liệu “rác” đã bị chiết hết các hoạt chất, gây ảnh hưởng đến sức khoẻ người bệnh và quyền lợi người tiêu dùng. Vì vậy, việc nghiên cứu đánh giá chất lượng, tiêu chuẩn hoá dược liệu Hà thủ ô đỏ là vấn đề hết sức cần thiết. Ở Việt Nam, qui định chính thống việc kiểm tra chất lượng dược liệu Hà thủ ô đỏ còn nhiều hạn chế. Chuyên luận Hà thủ ô đỏ trong Dược Điển Việt Nam V (DĐVN V) có qui định hàm lượng chất chiết được và chỉ tiêu định lượng anthraquinon dạng dẫn xuất (tính theo emodin và physcion).

Qua khảo sát một số mẫu, kết quả thu được cho thấy hầu hết các mẫu dược liệu Hà thủ ô đỏ Việt Nam đều không đạt theo yêu cầu của DĐVN V về chỉ tiêu hàm lượng anthraquinon dạng dẫn xuất, nguyên nhân có thể do chất lượng thực tế của mẫu Hà thủ ô đỏ Việt Nam, hoặc do chỉ tiêu quy định hoặc phương pháp phân tích chưa phù hợp. Để giải quyết vấn đề này, cần thiết thực hiện nghiên cứu về đánh giá, phân tích thành phần hóa học trên đối tượng Hà thủ ô đỏ trồng tại Việt Nam, từ đó xây dựng được tiêu chí định lượng phù hợp đối với dược liệu Hà thủ ô đỏ trồng tại Việt Nam, giúp cho công tác kiểm soát chất lượng dược liệu Hà thủ ô đỏ ở Việt Nam chặt chẽ hơn. 12 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Từ những thực tiễn trên, luận án “Nghiên cứu phân tích và đánh giá một số thành phần hóa học chính trong dƣợc liệu và sản phẩm chứa Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson) tại Việt Nam” được thực hiện với mục tiêu nghiên cứu xây dựng các phương pháp phân tích và đánh giá hàm lượng một số thành phần hóa học chính (thuộc nhóm chất stilben và anthraquinon) có trong dược liệu Hà thủ ô đỏ Việt Nam, từ đó gợi ý chỉ tiêu bổ sung cho chuyên luận Hà thủ ô đỏ trong DĐVN. Với mục tiêu đề ra, nội dung nghiên cứu của Luận án bao gồm: - Phát triển phương pháp HPLC/UV phân tích định lượng 2,3,5,4′- tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucosid, emodin và physcion trong dược liệu Hà thủ ô đỏ thành phương pháp đối chiếu (sử dụng phổ MS/MS đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp).

- Xây dựng mới một số phương pháp phân tích định lượng thành phần hóa học chính có trong dược liệu Hà thủ ô đỏ Việt Nam: HPLC/FL, TLC/SD (có so sánh với phương pháp đối chiếu). - Phân tích đánh giá hàm lượng hoạt chất (thuộc nhóm stilben và anthraquinon) trong các mẫu dược liệu và một số sản phẩm chứa Hà thủ ô đỏ trên thị trường. - Sơ bộ phân loại nguồn gốc mẫu dược liệu Hà thủ ô đỏ dựa trên thành phần hoá học kết hợp các phương pháp thống kê. Những đóng góp mới về mặt khoa học và thực tiễn của Luận án  Về mặt khoa học - Xây dựng mới phương pháp HPLC/FL với độ nhạy cao để phân tích định lượng 5 chất THSG, RES, PC, EM, PS trong dược liệu và sản phẩm chứa Hà thủ ô đỏ.

- Xây dựng mới phương pháp TLC/SD để định lượng nhanh THSG, EM và PS trong dược liệu Hà thủ ô đỏ nhằm phục vụ kiểm nghiệm nguyên liệu đầu vào dùng trong sản xuất. - Nghiên cứu đã bước đầu phân loại được nguồn gốc dược liệu Hà thủ ô đỏ dựa trên thành phần hoá học. 13 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail]  Về mặt thực tiễn - Nghiên cứu đã xây dựng và phát triển được một số phương pháp phân tích định lượng thành phần hoá học chính trong dược liệu Hà thủ ô đỏ gồm: HPLC/UV, TLC/SD và HPLC/FL. Các phương pháp phân tích xây dựng được có ưu điểm và phạm vi áp dụng khác nhau, tuỳ theo cơ sở vật chất của Phòng thí nghiệm và mục tiêu kiểm nghiệm.

Tuy nhiên, các phương pháp đều có ưu điểm là trang thiết bị không quá đắt tiền, thao tác thực nghiệm đơn giản nên có thể áp dụng rộng rãi trong kiểm nghiệm dược liệu và sản phẩm từ dược liệu. - Kết quả định lượng các hoạt chất chính có trong 48 mẫu Hà thủ ô đỏ đã gợi mở về tiêu chí lựa chọn chất đánh dấu đối với Hà thủ ô đỏ và đề xuất tiêu chí phù hợp, cần thiết bổ sung vào chuyên luận dược liệu Hà thủ ô đỏ của Dược điển Việt Nam. 14 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Tổng quan về Hà thủ ô đỏ 1.

Cây Hà thủ ô đỏ Hà thủ ô đỏ có tên khoa học là Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson, thuộc họ Rau răm (Polygonaceae), bộ Cẩm chướng (Caryophyllales). Hà thủ ô đỏ là cây dây leo, sống nhiều năm, thân thảo, mềm và nhẵn, leo quấn vào cây khác. Lá mọc so le hình tim, đầu thuôn nhọn, dài 4-6 cm, rộng 3-4 cm, có 3 gân xuất phát từ gốc lá, hai mặt nhẵn, mặt trên sẫm bóng có gai thịt; cuống dài khoảng 2 cm. Cụm hoa mọc ở kẽ lá hoặc đầu cành thành chùy phân nhánh, dài hơn lá; lá bắc ngắn; hoa nhỏ nhiều, màu trắng; nhị 8, thường dính vào gốc của bao hoa.

Quả 3 cạnh, nhẵn bóng màu nâu đỏ, nằm trong bao hoa mà 3 mảnh ngoài phát triển thành những cánh rộng. Mùa hoa từ tháng 9-11; mùa quả từ tháng 12-2 năm sau. Bộ phận dùng chính là rễ củ của cây màu nâu, hình trụ tròn (gọi là Hà thủ ô đỏ). Cây trồng 2-3 năm thì thu hoạch, thời gian thu hái khoảng từ tháng 10 đến tháng 12 [8,15].

Cây (a, b) và rễ củ (c, d) Hà thủ ô đỏ Ở Việt Nam, Hà thủ ô đỏ phân bố tự nhiên tập trung ở vùng trung du miền núi có độ cao từ 500-2000 m tại một số tỉnh miền núi phía Bắc: Hà Giang, Lai Châu, Lào Cai, Sơn La,… Các tỉnh ít gặp hơn như Hòa Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Lạng Sơn, Cao Bằng, Yên Bái. Hà thủ ô đỏ là loại cây ưa khí hậu ẩm mát của vùng cận nhiệt đới và nhiệt đới núi cao, cây ưa sáng và có thể hơi chịu bóng. Nơi mọc tự nhiên thích hợp nhất là các quần thể rừng núi đá vôi, độ cao tới 1700 m, nhiệt độ trung bình quanh năm dưới 20oC. Hà thủ ô đỏ thường mọc ở đất ẩm, xốp, nhiều 15 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] mùn, nhất là loại ở chân núi đá.

Hà thủ ô đỏ ra quả hàng năm, mỗi cây có thể ra nhiều quả. Sau khi quả già, phần thân leo trên mặt đất làm hạt giống phát tán xung quanh và sẽ nảy mầm vào mùa xuân hè năm sau [7,15]. Dược liệu Hà thủ ô đỏ Dược liệu Hà thủ ô đỏ (Radix Fallopia multiflora) là phần rễ củ phơi hay sấy khô của cây Hà thủ ô đỏ, có dạng hình củ tròn, hoặc hình thoi, không đều, củ nhỏ để nguyên, củ to bổ đôi theo chiều dọc, hay chặt thành từng miếng to. Mặt ngoài có những chỗ lồi lõm do các nếp nhăn ăn sâu tạo thành.

Mặt cắt ngang có lớp bần mỏng màu nâu sẫm, mô mềm vỏ màu đỏ hồng, có nhiều bột, ở giữa có ít lõi gỗ. Dƣợc liệu Hà thủ ô đỏ 1. Thành phần hóa học Hà thủ ô đỏ chứa khoảng 1,7% anthraquinon, trong đó có emodin, chrysophanol, rhein, physcion; 1,1% protid, 45,2% tinh bột, 3,1% lipid, 4,5% chất vô cơ, 26,4% các chất tan trong nước, lecitin, rhaponticin (rhapontin, ponticin), 2,3,5,4’-tetrahydroxytiben-2-O-β-D-glucosid (THSG). Hàm lượng các hoạt chất thay đổi rõ rệt sau khi chế biến.

Lúc chưa chế, HTO chứa 7,68% tanin, 0,25% dẫn chất anthraquinon tự do, 0,80% dẫn chất anthraquinon toàn phần. Sau khi chế, còn 3,82% tanin, 0,11% dẫn chất anthraquinon tự do và 0,25% dẫn chất anthraquinon toàn phần [15]. Stilben và anthraquinon là hai nhóm chất đặc trưng cho Hà thủ ô đỏ, được các nghiên cứu trên thế giới cũng như trong nước quan tâm, đặc biệt là được Dược điển một số nước dùng làm chất đối chiếu trong kiểm tra, đánh giá chất lượng dược liệu Hà thủ ô đỏ. 16 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.

Thành phần stilben Stilben là nhóm chất thuộc nhóm chất lớn phenylpropanoid, có chung một cấu trúc mạch cacbon là C6-C2-C6. Một số stilben đã được tìm thấy trong thực vật và khẳng định về hoạt tính đặc trưng của chúng như piceatannolin có trong rễ của cây vân sam Na Uy hay pinosylvin là một độc tố nấm bảo vệ gỗ khỏi bị nhiễm trùng nấm, được tìm thấy trong cây họ thông, pterostilben có trong Hạnh nhân, cây Thông và quả Mọng, resveratrol là một stilben quan trọng có trong Nho, Cốt khí củ…. Các hợp chất stilben được chứng minh có các tác dụng sinh học như: tác dụng chống oxi hóa, điều hòa cân nặng, chống dị ứng [52], tác dụng trên tim mạch [42], tác dụng kháng viêm [22]. Ngoài ra còn có tác dụng chống khối u, đặc biệt là ngăn ngừa ung thư vú, ở liều thấp cũng chỉ ra khả năng làm giảm quá trình di căn [22].

Riêng với THSG đã được chứng minh có tác dụng chống lão hóa, chống viêm [78], ức chế tế bào ung thư đối với ung thư đại trực tràng ở người [76]. piceid trans-resveratrol cis-resveratrol THSG Hình 1. Một số hợp chất stilben có trong dƣợc liệu Hà thủ ô đỏ THSG có CTPT là C20H22O9. Ở nhiệt độ thường, THSG tồn tại ở dạng chất rắn màu nâu đỏ [66,77].

Độ tan của THSG trong nước là 5 mg/ml. Cấu trúc của THSG (Hình 1.3) có các nối đôi liên hợp, THSG có khả năng hấp thụ ánh sáng và đây là cơ sở hóa học cho các nghiên cứu về phân tích định tính, định lượng THSG. Tương tự như THSG, piceid cũng là một hợp chất stilben glycosid, còn có tên gọi khác là polydatin.