Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu
Ung thư là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên phạm vi toàn cầu, trong đó khoảng 90% số ca tử vong bắt nguồn từ sự xâm lấn và lan rộng của khối u qua quá trình di căn. Trước thách thức này, điều trị trúng đích phân tử đã trở thành một định hướng trọng tâm của y học hiện đại. Trong số các mục tiêu sinh học được phát hiện, Heat shock protein 90 (HSP90) đóng vai trò then chốt như một protein chaperon hỗ trợ sự gấp cuộn, ổn định cấu trúc và ngăn ngừa sự thoái hóa của hàng trăm protein cơ chất (client protein) tham gia vào chu kỳ tế bào và các con đường truyền tín hiệu sinh tồn. Do các tế bào ung thư tăng sinh không kiểm soát và phụ thuộc lớn vào sự ổn định của các oncoprotein, HSP90 thường xuyên bị biểu hiện quá mức tại các khối u như ung thư vú, phổi, buồng trứng và tuyến tụy.
Ban đầu, các nghiên cứu tập trung vào các chất ức chế miền đầu N (NTD) của HSP90 theo cơ chế cạnh tranh với ATP (tiêu biểu như geldanamycin và radicicol). Tuy nhiên, các chất này khi tiến hành thử nghiệm lâm sàng đều thất bại trong việc xin phê duyệt từ Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) do độc tính trên gan và việc kích hoạt phản ứng sốc nhiệt (Heat Shock Response - HSR). Phản ứng HSR giải phóng yếu tố phiên mã HSF-1, dẫn đến việc điều hòa tăng biểu hiện bù trừ của chính HSP90 và các protein sốc nhiệt khác, buộc phải tăng liều và gây độc tính quá liều. Nhằm khắc phục hạn chế này, hướng nghiên cứu nhắm vào miền đầu C (CTD) của HSP90 xuất hiện như một giải pháp thay thế tiềm năng vì không gây ra phản ứng sốc nhiệt. Các hợp chất tự nhiên nhắm CTD đầu tiên được ghi nhận là novobiocin và deguelin, cùng chuỗi dẫn chất lai NCT kết hợp cấu trúc của hai chất này. Đồng thời, dị vòng benzimidazol đã được chứng minh có hoạt tính kháng ung thư thông qua nhiều cơ chế và có khả năng liên kết với HSP90. Do đó, khóa luận thực hiện thiết kế, tổng hợp và đánh giá hoạt tính của các dẫn chất mới kết hợp khung deguelin và benzimidazol.
Mục tiêu nghiên cứu được xác định cụ thể gồm 3 nhiệm vụ:
- Tổng hợp 3 hợp chất dựa trên phần cấu trúc acid chromen trên khung deguelin và cấu trúc khung benzimidazol.
- Thử hoạt tính gây độc tế bào của các chất tổng hợp được trên dòng tế bào ung thư vú MDA-MB-231 và ung thư phổi A549.
- Nghiên cứu cơ chế tác dụng của các hợp chất có hoạt tính chống ung thư dựa trên thử hoạt tính chống tế bào ung thư và mô phỏng docking phân tử.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
- Đối tượng nghiên cứu: Ba dẫn chất mới thuộc nhóm 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-carboxamid mang khung benzimidazol thế (ký hiệu CT-239, CT-404, CT-406); hai dòng tế bào ung thư người gồm ung thư vú MDA-MB-231 và ung thư phổi A549; cấu trúc không gian miền đầu C của HSP90.
- Phạm vi không gian và thời gian: Nghiên cứu thực nghiệm hóa dược và mô phỏng được thực hiện tại Bộ môn Hóa hữu cơ, Khoa Công nghệ Hóa dược; thử nghiệm sinh học in vitro tại Phòng thí nghiệm Dược lý phân tử, Bộ môn Dược lý, Trường Đại học Dược Hà Nội; hoàn thành vào tháng 6 năm 2024.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp
Khóa luận được xây dựng dựa trên cơ sở sinh học phân tử về cấu trúc homodimer của protein chaperon HSP90, bao gồm miền đầu N (NTD - vị trí gắn ATP điều hòa hoạt tính ATPase), miền giữa (MD - vị trí tương tác với protein cơ chất) và miền đầu C (CTD - chịu trách nhiệm dime hóa và tương tác với co-chaperon qua trình tự bảo tồn MEEVD). Bốn đồng dạng chính của HSP90 được hệ thống hóa gồm HSP90α (gồm HSP90α1, HSP90α2) và HSP90β trong tế bào chất, GRP94 trong lưới nội chất và TRAP1 trong ty thể. Về mặt phối tử ức chế CTD, nghiên cứu kế thừa dữ liệu về chuỗi dẫn xuất NCT (lai giữa khung coumarin/noviose của novobiocin và acid chromen của deguelin, tiêu biểu là NCT-50, NCT-58, NCT-80). Rationale thiết kế cấu trúc dựa trên việc duy trì khung 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen cùng liên kết amid cầu nối để tạo liên kết hydro với Ser677 và Lys615 tại túi liên kết pck1b của miền CTD, đồng thời đưa khung 5-carbamoylbenzimidazol vào nhằm tăng cường tương tác π và tạo liên kết hydro bổ sung.
Phương pháp nghiên cứu thực tế bao gồm các kỹ thuật tổng hợp hóa dược và phân tích cấu trúc:
- Phương pháp tổng hợp hóa học: Sử dụng quy trình tổng hợp hữu cơ nhiều giai đoạn gồm phản ứng amid hóa tạo dẫn xuất benzamid, phản ứng thế ái nhân $N$-alkyl hóa dẫn chất clo bằng amin thơm, phản ứng khử hóa nhóm nitro thành amin bằng tác nhân chuyển hydro xúc tác $\text{Pd/C}$ hoặc bột kẽm trong môi trường acid, phản ứng ngưng tụ đóng vòng tạo khung benzimidazol xúc tác bởi $\text{NaHSO}_3$, và phản ứng ghép nối tạo liên kết amid sử dụng hệ tác nhân carbodiimid ($\text{EDC}\cdot\text{HCl}/\text{HOBt}$).
- Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết và khẳng định cấu trúc: Sắc ký lớp mỏng (SKLM) trên bản mỏng silicagel $\text{GF}_{254}$, đo nhiệt độ nóng chảy trên máy điện tử EZ-Melt; phân tích phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR), phổ khối lượng ion hóa phun bụi điện tử (ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ($^1\text{H-NMR}$) và carbon ($^{13}\text{C-NMR}$).
- Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học in vitro: Thử nghiệm độc tế bào dựa trên phép thử khử muối tetrazolium (MTT) theo nguyên tắc Mosmann (1983) trên 2 dòng tế bào MDA-MB-231 và A549, đo quang phổ hấp thụ tại bước sóng 570 nm.
- Phương pháp mô phỏng in silico: Xây dựng mô hình cấu trúc tương đồng (homology model) cho miền CTD của HSP90 người qua máy chủ SWISS-MODEL từ khuôn mẫu PDB 3Q6M và 2CG9; tối ưu hóa cấu trúc và mô phỏng gắn kết phân tử bằng phần mềm Molecular Operating Environment (MOE 2015) với trường lực Amber99; khảo sát tương tác chi tiết qua Discovery Studio 2024.
Nguồn dữ liệu thực nghiệm được thu thập trực tiếp tại Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (dữ liệu NMR, MS), Khoa Hóa học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội (dữ liệu IR), và Bộ môn Dược lý – Trường Đại học Dược Hà Nội (số liệu quang phổ MTT).
Nội dung chính theo từng chương
Chương 1: Tổng quan
Chương Tổng quan phân tích hệ thống hóa về đích phân tử HSP90, nhấn mạnh vai trò của protein chaperon này trong việc duy trì chu kỳ tế bào và con đường truyền tín hiệu gây ung thư. Tác giả trình bày chi tiết về cấu trúc ba miền của HSP90, chu trình cộng tác giữa HSP90 với các co-chaperon (HSP40, HSP70, HOP, p23, Aha1) và các immunophilin (FKBP51, FKBP52) nhằm hoàn thiện cấu hình của protein cơ chất. Cơ chế gây độc của các chất ức chế đầu N (như dẫn xuất geldanamycin và radicicol) được làm rõ thông qua việc kích hoạt phản ứng sốc nhiệt HSR qua trung gian HSF-1, từ đó khẳng định tính ưu việt của hướng tiếp cận ức chế miền đầu C (CTD).
Chương này cũng tổng hợp các nghiên cứu về vị trí liên kết ATP giả định tại miền đầu C gồm 4 túi (pck1a, pck1b, pck2, pck3), trong đó túi pck1b được xác định là vị trí tương tác then chốt với các acid amin Lys631, Lys632, Lys576, Glu584, Ala629, Tyr627 và Lys615. Tác giả điểm luận các nhóm chất ức chế CTD tự nhiên và bán tổng hợp: novobiocin cùng các dẫn chất cải tiến chuỗi bên amid (KU174, biphenylamid); deguelin và các thế hệ dẫn chất (L80, SL-145, SH-1242); và chuỗi phối tử lai NCT (NCT-50, NCT-80, NCT-58). Đồng thời, tổng quan trình bày đặc tính sinh học của khung benzimidazol – cấu trúc tương đồng purin có mặt trong các thuốc chống ung thư lưu hành (bendamustin, selumetinib) – kèm theo các con đường tổng hợp từ ortho-phenylendiamin (OPDA) qua các xúc tác acid, hạt nano ZnO, vi sóng, quang hóa và natri bisulfit ($\text{NaHSO}_3$). Cuối chương, nguyên lý protein docking sử dụng thuật giải di truyền (Genetic Algorithm) và chiến lược thiết kế phân tử lai giữa acid 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-carboxylic và khung 5-carbamoylbenzimidazol được luận giải chi tiết.
Chương 2: Nguyên liệu, thiết bị, nội dung, phương pháp nghiên cứu
Chương 2 mô tả toàn bộ hóa chất, dung môi phân tích và hệ thống trang thiết bị chuyên dụng phục vụ nghiên cứu, bao gồm máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance 600 MHz, máy khối phổ Agilent 1100 Series LC-MSD-Trap-SL, máy quang phổ FT-IR Affinity-IS Shimadzu, tủ ấm tế bào và máy tính Dell chạy phần mềm Chemdraw 22.0, MOE 2015, Discovery Studio 2024.
Quy trình tổng hợp được xây dựng theo 2 giai đoạn:
- Giai đoạn 1 (Tổng hợp amin trung gian qua 5 bước):
- Bước 1: Điều chế 4-chloro-3-nitrobenzamid (hợp chất II) từ acid 4-chloro-3-nitrobenzoic với tác nhân $\text{SOCl}_2$, xúc tác DMF, sau đó phản ứng với amoniac đậm đặc.
- Bước 2: Tổng hợp các dẫn chất 3-nitro-4-(benzylamino)benzamid thế (III.1, III.2, III.3) qua phản ứng thế ái nhân với các benzylamin tương ứng (benzylamin, 3,4-dimethoxybenzylamin, 4-fluorobenzylamin) có mặt base $\text{K}_2\text{CO}_3$ trong DMF ở 90°C.
- Bước 3: Khử nhóm nitro trên nhân benzen bằng $\text{HCOONH}_4$ với xúc tác $\text{Pd/C}$ 10% trong methanol để thu được các dẫn chất o-phenylendiamin (IV.1, IV.2, IV.3).
- Bước 4: Đóng vòng benzimidazol bằng phản ứng ngưng tụ giữa IV và 4-nitrobenzaldehyd dưới tác dụng oxy hóa của $\text{NaHSO}_3$ trong dung môi dimethylacetamid (DMAC) ở 120°C, tạo thành các dẫn chất nitro V.1, V.2, V.3.
- Bước 5: Khử hóa chọn lọc nhóm 4-nitrophenyl thành 4-aminophenyl bằng bột kẽm và acid acetic trong dung môi cồn, thu được các amin trung gian VI.1, VI.2, VI.3.
- Giai đoạn 2 (Tổng hợp chất mục tiêu):
- Ghép nối acid 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-carboxylic với amin trung gian VI bằng tác nhân tạo liên kết amid $\text{EDC}\cdot\text{HCl}$, phụ gia HOBt và base triethylamin (TEA) trong DMF ở 50°C trong 24 giờ để tạo 3 hợp chất đích CT-239, CT-404, CT-406.
Quy trình thử hoạt tính in vitro mô tả chi tiết phép thử MTT trên tế bào MDA-MB-231 và A549 nuôi cấy trong môi trường DMEM bổ sung 10% FBS, thử nghiệm ở 5 nồng độ (1, 3, 10, 30, 100 µM) với chất chuẩn doxorubicin (0,1–10 µM) và NCT-58, xử lý số liệu xác định $\text{IC}_{50}$ bằng mô hình hồi quy phi tuyến trên GraphPad Prism 8. Quy trình docking được chuẩn hóa qua 4 bước: dựng mô hình tương đồng SWISS-MODEL từ PDB 3Q6M và 2CG9, chuẩn bị protein bằng Protonate 3D với trường lực Amber99, tối ưu hóa phối tử 3D, và thực hiện dock 100 cấu dạng để chọn 10 cấu dạng có mức năng lượng tự do thấp nhất.
Chương 3: Thực nghiệm, kết quả
Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được về tổng hợp hữu cơ, phân tích hóa lý, hoạt tính sinh học và tính toán mô phỏng:
-
Thực nghiệm tổng hợp: Tác giả ghi nhận hiệu suất của từng bước trung gian:
- Tổng hợp hợp chất II: Đạt khối lượng 4,78 g, hiệu suất 96%.
- Dẫn chất nhóm III: III.1 thu được 0,62 g (89%); III.2 thu được 0,66 g (80%); III.3 thu được 0,63 g (88%).
- Dẫn chất nhóm IV: IV.1 đạt 420 mg (76%); IV.2 đạt 420 mg (70%); IV.3 đạt 400 mg (71%).
- Đóng vòng benzimidazol nhóm V: V.1 đạt 352 mg (54%); V.2 đạt 344 mg (51%); V.3 đạt 300 mg (47%).
- Khử hóa nhóm VI: VI.1 đạt 218 mg (67%); VI.2 đạt 189 mg (59%); VI.3 đạt 155 mg (56%).
- Tổng hợp 3 chất mục tiêu: CT-239 đạt 36 mg (hiệu suất 22%); CT-404 đạt 33 mg (hiệu suất 21%); CT-406 đạt 28 mg (hiệu suất 18%). Tất cả đều thu được ở dạng chất rắn màu trắng.
-
Độ tinh khiết và đặc trưng hóa lý: Các chất tổng hợp đều cho một vết duy nhất trên sắc ký lớp mỏng và có khoảng nóng chảy hẹp:
- CT-239: $R_f = 0,42$ (hệ dung môi $\text{MeOH}:\text{DCM} = 10:90$); nhiệt độ nóng chảy $T_{nc} = 225\text{--}227^\circ\text{C}$.
- CT-404: $R_f = 0,45$ (hệ dung môi $\text{MeOH}:\text{DCM} = 10:90$); nhiệt độ nóng chảy $T_{nc} = 234\text{--}236^\circ\text{C}$.
- CT-406: $R_f = 0,44$ (hệ dung môi $\text{MeOH}:\text{DCM} = 10:90$); nhiệt độ nóng chảy $T_{nc} = 228\text{--}230^\circ\text{C}$.
-
Khẳng định cấu trúc phổ:
- Phổ FT-IR: Xác nhận sự hiện diện của các dao động hóa trị đặc trưng của liên kết $\text{N-H}$ amid ở hai dải $3300\text{--}3333\text{ cm}^{-1}$ và $3180\text{--}3184\text{ cm}^{-1}$; dao động $\text{C=O}$ amid ở $1664\text{--}1676\text{ cm}^{-1}$; $\text{C-H}$ thơm ($sp^2$) ở $3032\text{--}3065\text{ cm}^{-1}$; $\text{C-H}$ no ($sp^3$) ở $2835\text{--}2965\text{ cm}^{-1}$; và $\text{C-O}$ ether tại $1063\text{--}1064\text{ cm}^{-1}$ và $1246\text{--}1254\text{ cm}^{-1}$.
- Phổ khối ESI-MS: Xuất hiện các pic ion phân tử $[M+H]^+$ với cường độ mạnh, phù hợp tuyệt đối với khối lượng phân tử tính toán: CT-239 ($\text{C}{34}\text{H}{30}\text{N}4\text{O}4$, số khối tính toán 558,2, tìm thấy $m/z = 559,6$); CT-404 ($\text{C}{36}\text{H}{34}\text{N}4\text{O}6$, tính toán 618,3, tìm thấy $m/z = 619,4$); CT-406 ($\text{C}{34}\text{H}{29}\text{FN}_4\text{O}_4$, tính toán 576,2, tìm thấy $m/z = 577,4$).
- Phổ $^1\text{H-NMR}$ và $^{13}\text{C-NMR}$: Dữ liệu độ dịch chuyển hóa học ($\delta$, ppm) xác nhận đầy đủ số lượng và vị trí các proton và carbon trong phân tử (như tín hiệu proton amid $\text{H}_{28}$ ở $\delta 10,36\text{ ppm}$, tín hiệu proton nhân thơm, các nhóm methoxy và methyl của vòng chromen).
-
Hoạt tính kháng tế bào ung thư và mô phỏng gắn kết: Kết quả thử nghiệm MTT được đối chiếu với hai chất chuẩn doxorubicin và NCT-58 trên hai dòng tế bào MDA-MB-231 và A549. Kết quả mô phỏng docking tại túi pck1b khẳng định các phân tử thiết kế duy trì được cấu dạng liên kết ổn định với miền đầu C của HSP90.
Kết quả và đóng góp
Nghiên cứu đã hoàn thành toàn diện quy trình hóa dược từ thiết kế, tổng hợp đến đánh giá in vitro và in silico đối với 3 dẫn chất mang khung benzimidazol liên kết với acid chromen.
Dữ liệu hóa học và hóa lý của 3 hợp chất mục tiêu được tổng hợp tại bảng sau:
| Hợp chất |
Nhóm thế $R$ |
Khối lượng thu được (mg) |
Hiệu suất phản ứng (%) |
Cảm quan |
Giá trị $R_f$ ($\text{MeOH}:\text{DCM} = 10:90$) |
Nhiệt độ nóng chảy $T_{nc}$ ($^\circ\text{C}$) |
Công thức phân tử |
Khối lượng phân tử tính toán |
Pic ion phân tử $[M+H]^+$ ($m/z$) |
| CT-239 |
Benzyl |
36 |
22 |
Chất rắn màu trắng |
0,42 |
225–227 |
$\text{C}{34}\text{H}{30}\text{N}_4\text{O}_4$ |
558,2 |
559,6 |
| CT-404 |
3,4-Dimethoxybenzyl |
33 |
21 |
Chất rắn màu trắng |
0,45 |
234–236 |
$\text{C}{36}\text{H}{34}\text{N}_4\text{O}_6$ |
618,3 |
619,4 |
| CT-406 |
4-Fluorobenzyl |
28 |
18 |
Chất rắn màu trắng |
0,44 |
228–230 |
$\text{C}{34}\text{H}{29}\text{FN}_4\text{O}_4$ |
576,2 |
577,4 |
Dữ liệu thử nghiệm hoạt tính ức chế sinh học của các chất đối chứng được ghi nhận trong nghiên cứu:
| Chất thử nghiệm |
Dòng tế bào ung thư vú MDA-MB-231 |
Dòng tế bào ung thư phổi A549 |
|
$\text{IC}_{50}$ ($\mu\text{M}$) [95% CI] |
$\text{IC}_{50}$ ($\mu\text{M}$) [95% CI] |
| Doxorubicin |
1,64 [0,56 – 5,09] |
1,94 [1,75 – 2,15] |
| NCT-58 |
9,57 [5,74 – 16,00] |
6,12 [3,31 – 11,44] |
Đóng góp của khóa luận thể hiện ở các điểm cụ thể do tác giả đề xuất:
- Thiết kế thành công cấu trúc phân tử mới kết hợp giữa khung 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen (từ hoạt chất tự nhiên deguelin) và khung 5-carbamoylbenzimidazol nhằm nhắm tới miền đầu C của HSP90.
- Tối ưu hóa được quy trình tổng hợp gồm 6 bước phản ứng liên tiếp, sử dụng tác nhân $\text{NaHSO}_3$ thân thiện và hiệu quả để đóng vòng benzimidazol trong dung môi DMAC, cùng hệ ghép nối $\text{EDC}\cdot\text{HCl}/\text{HOBt}$ để tạo liên kết amid khó với hiệu suất kiểm soát được.
- Cung cấp đầy đủ bộ dữ liệu phổ cấu trúc chuẩn xác (IR, MS, $^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$) của 3 dẫn chất mới, làm giàu thêm cơ sở dữ liệu hóa dược về các phối tử ức chế HSP90 không kích hoạt phản ứng sốc nhiệt HSR.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
Hạn chế của nghiên cứu:
- Hiệu suất tổng hợp ở bước ghép nối tạo liên kết amid cuối cùng giữa acid carboxylic và dẫn xuất amin benzimidazol còn tương đối thấp (dao động từ 18% đến 22%), đòi hỏi phải tinh chế nhiều lần qua sắc ký cột.
- Số lượng dẫn chất tổng hợp được trong khuôn khổ khóa luận còn hạn chế (mới dừng lại ở 3 dẫn chất mang các nhóm benzyl thế khác nhau), chưa bao quát được toàn diện mối liên quan cấu trúc - tác dụng (SAR) của dãy chất.
- Chưa có cấu trúc tinh thể tia X trực tiếp với độ phân giải cao của phức hợp giữa miền đầu C HSP90 người và phối tử thử nghiệm, nghiên cứu docking vẫn phải phụ thuộc vào mô hình tương đồng (homology model) xây dựng từ protein HSP90 của vi khuẩn E. coli (PDB 2CG9) kết hợp khuôn mẫu người (PDB 3Q6M).
Hướng nghiên cứu tiếp theo:
- Tiếp tục khảo sát và tối ưu hóa điều kiện phản ứng ghép nối amid (thử nghiệm các hệ tác nhân hoạt hóa khác như HATU, COMU hoặc phương pháp chuyển thành clorid acid) nhằm nâng cao hiệu suất tổng hợp các chất mục tiêu.
- Mở rộng tổng hợp thêm các dẫn chất mới với các nhóm thế đa dạng hơn trên vòng benzyl hoặc biến đổi các vị trí khác trên khung benzimidazol nhằm thiết lập mối tương quan cấu trúc - tác dụng (SAR) chi tiết.
- Tiến hành các thử nghiệm sinh học chuyên sâu hơn ở mức độ phân tử, bao gồm đánh giá sự suy thoái của các protein cơ chất phụ thuộc HSP90 (Her2, EGFR, Akt) và xác định nồng độ biểu hiện của HSF-1, HSP70 qua kỹ thuật Western blot để chứng minh thực nghiệm khả năng không kích hoạt phản ứng sốc nhiệt HSR.
Giá trị tham khảo
Khóa luận là tài liệu tham khảo chuyên khảo hữu ích cho sinh viên, học viên sau đại học và các nghiên cứu viên thuộc chuyên ngành Hóa dược, Hóa hữu cơ, Dược lý học và Thiết kế thuốc hỗ trợ bởi máy tính (CADD).
Các nội dung có giá trị ứng dụng cao gồm:
- Quy trình thực nghiệm chi tiết về phương pháp đóng vòng dị vòng benzimidazol sử dụng tác nhân rẻ tiền, dễ kiếm và dễ tinh chế là $\text{NaHSO}_3$.
- Phương pháp luận kết hợp thiết kế thuốc in silico (dựng mô hình tương đồng SWISS-MODEL, docking phân tử trên MOE và phân tích tương tác trên Discovery Studio) với quy trình tổng hợp hóa học thực nghiệm và kiểm tra hoạt tính in vitro bằng thử nghiệm MTT.
- Bộ thông số phổ hoàn chỉnh ($^1\text{H-NMR}$ đo ở tần số cao 600 MHz, $^{13}\text{C-NMR}$ 126 MHz, ESI-MS và FT-IR) của các hợp chất trung gian và sản phẩm đích làm chuẩn so sánh trong hóa học tổng hợp các dẫn chất tương tự.
Câu hỏi thường gặp
1. Tại sao nghiên cứu lại tập trung phát triển chất ức chế nhắm vào miền đầu C (CTD) của HSP90 thay vì miền đầu N (NTD)?
Các chất ức chế miền đầu N cạnh tranh với ATP (như geldanamycin, radicicol) kích hoạt phản ứng sốc nhiệt (HSR) làm giải phóng yếu tố HSF-1, dẫn đến tăng tổng hợp bù trừ các protein HSP90 và HSP70, gây độc tính quá liều và khiến các thử nghiệm lâm sàng thất bại. Ngược lại, việc ức chế tại miền đầu C làm gián đoạn bộ máy chaperon mà không gây ra phản ứng sốc nhiệt HSR.
2. Tác nhân nào được sử dụng để đóng vòng tạo khung benzimidazol trong khóa luận và ưu điểm của nó là gì?
Nghiên cứu sử dụng natri bisulfit ($\text{NaHSO}_3$) phản ứng với ortho-phenylendiamin và 4-nitrobenzaldehyd trong dung môi DMAC ở 120°C. Tác nhân này có khả năng kết hợp tốt với aldehyd, phản ứng thực hiện đơn giản, thời gian ngắn, tan tốt trong nước nên dễ dàng loại bỏ hoàn toàn trong quá trình rửa chiết tinh chế sản phẩm.
3. Khung cấu trúc của 3 chất mục tiêu được thiết kế dựa trên cơ sở khoa học nào?
Cấu trúc được thiết kế dạng lai dựa trên chuỗi dẫn chất NCT (kết hợp deguelin và novobiocin). Trong đó, phần acid 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-carboxylic cùng cầu nối amid được giữ nguyên để tạo liên kết hydro với Ser677 và Lys615 tại túi liên kết pck1b của HSP90; đồng thời dị vòng benzimidazol mang nhóm thế carbamoyl và các nhóm benzyl thế được đưa vào để tăng cường tương tác $\pi$ và liên kết hydro bổ sung.
4. Mô hình protein HSP90 dùng trong mô phỏng docking phân tử được xây dựng như thế nào?
Do cấu trúc tinh thể thực nghiệm miền đầu C của HSP90 người chưa có độ phân giải cao (< 3 Å), nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật xây dựng mô hình tương đồng (homology modeling) trên webserver SWISS-MODEL. Mô hình được xây dựng dựa trên sự kết hợp giữa khuôn mẫu protein HSP90 người (PDB ID: 3Q6M) và cấu trúc đầy đủ của HSP90 vi khuẩn E. coli (PDB ID: 2CG9).
5. Hoạt tính gây độc tế bào in vitro được đánh giá trên các dòng tế bào nào và sử dụng phương pháp gì?
Hoạt tính được đánh giá trên hai dòng tế bào ung thư người là ung thư vú MDA-MB-231 và ung thư phổi A549 bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang học MTT ở bước sóng 570 nm sau 72 giờ ủ chất thử, với doxorubicin và dẫn chất NCT-58 được sử dụng làm chất đối chiếu.
Kết luận
Khóa luận tốt nghiệp của cử nhân Trần Hoàng Anh đã thiết kế, tổng hợp thành công 3 dẫn chất mới thuộc nhóm 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-carboxamid chứa khung benzimidazol (CT-239, CT-404, CT-406) với cấu trúc được khẳng định qua hệ thống phổ FT-IR, ESI-MS, $^1\text{H-NMR}$ và $^{13}\text{C-NMR}$. Nghiên cứu đã thực hiện đánh giá hoạt tính độc tế bào in vitro trên hai dòng tế bào ung thư vú MDA-MB-231 và ung thư phổi A549, đồng thời giải thích cơ chế gắn kết phân tử tại túi pck1b miền đầu C của HSP90 qua mô hình tương đồng in silico. Kết quả của đề tài đóng góp dữ liệu thực nghiệm có giá trị cho định hướng phát triển các tác nhân ức chế chọn lọc miền đầu C HSP90 nhằm hạn chế phản ứng sốc nhiệt trong hóa trị liệu ung thư.
