Luận văn thạc sĩ: Nghiên cứu phương pháp định lượng glycoside tim trong dược phẩm và dược liệu

Nghiên cứu phương pháp định lượng glycoside tim trong dược phẩm và dược liệu, góp phần nâng cao hiệu quả điều trị và phát triển sản phẩm mới.

• Tác giả: Bùi Thị Tâm
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Văn Ri
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên
• Chuyên ngành: Hoá Phân Tích
• Đề tài: Nghiên cứu phương pháp định lượng một số glycoside tim trong dược phẩm và dược liệu
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Khái quát chung về các hợp chất glycoside tim. Cấu tạo, tên gọi
• 1.2. Tác dụng của các hợp chất glycoside tim
• 1.3. Liên quan giữa cấu trúc và tác dụng
• 1.4. Tính chất của glycoside tim
• 1.5. Phân bố trong tự nhiên
• 1.6. Một số loại thuốc chứa glycoside tim. Khái quát về digoxin và digitoxin
• 1.7. Các phương pháp xác định glycoside tim
• 1.7.1. Phương pháp sắc kí xác định glycoside tim
• 1.7.2. Phương pháp khác xác định glycoside tim
• 1.7.3. Phương pháp chiết tách các glycoside tim ra khỏi nền mẫu thực
• 1.7.4. Phương pháp định tính và định lượng
• 2. CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM
• 2.1. Mục tiêu và đối tượng nghiên cứu
• 2.1.1. Mục tiêu nghiên cứu
• 2.1.2. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Chất chuẩn, hoá chất, thiết bị
• 2.2.1. Thiết bị, dụng cụ
• 2.3. Phương pháp phân tích
• 2.3.1. Phương pháp xử lý mẫu
• 2.3.2. Phương pháp phân tích. Khảo sát điều kiện tối ưu
• 2.3.3. Xây dựng đường chuẩn. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng. Đánh giá phương pháp phân tích
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Tối ưu hoá các điều kiện chạy sắc ký
• 3.1.1. Bước sóng hấp thụ cực đại của các glycoside tim
• 3.1.2. Khảo sát và chọn thành phần pha động và tốc độ dòng
• 3.1.3. Khảo sát độ lặp lại của thiết bị
• 3.2. Điều kiện tối ưu cho quá trình phân tích các glycoside tim
• 3.2.1. Đường chuẩn các glycoside tim
• 3.2.2. Khảo sát sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ chất
• 3.2.3. Dựng đường chuẩn. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
• 3.2.4. Đánh giá phương pháp phân tích
• 3.2.5. Đánh giá độ lặp lại của phương pháp phân tích
• 3.2.6. Đánh giá hiệu suất thu hồi của phương pháp
• 3.3. Phân tích mẫu thực tế
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu phương pháp định lượng glycoside tim

Nghiên cứu phương pháp định lượng glycoside tim trong dược phẩm là một lĩnh vực quan trọng trong hóa phân tích. Glycoside tim, như digoxin và digitoxin, có tác dụng mạnh lên tim và được sử dụng rộng rãi trong điều trị bệnh tim. Việc xác định chính xác hàm lượng của các hợp chất này là cần thiết để đảm bảo an toàn và hiệu quả trong điều trị. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) đã trở thành công cụ chính trong việc phân tích các glycoside tim.

1.1. Khái quát về glycoside tim và vai trò trong dược phẩm

Glycoside tim là nhóm hợp chất có nguồn gốc từ thực vật, có tác dụng cường tim và điều hòa nhịp tim. Chúng được sử dụng trong điều trị suy tim và loạn nhịp tim. Việc nghiên cứu và phát triển các phương pháp định lượng chính xác cho glycoside tim là rất quan trọng để đảm bảo an toàn cho người bệnh.

1.2. Tầm quan trọng của việc định lượng glycoside tim

Việc định lượng chính xác glycoside tim giúp ngăn ngừa ngộ độc và đảm bảo hiệu quả điều trị. Các phương pháp phân tích hiện đại như HPLC cho phép xác định hàm lượng glycoside tim một cách nhanh chóng và chính xác, từ đó hỗ trợ trong việc phát triển các sản phẩm dược phẩm an toàn.

II. Vấn đề và thách thức trong định lượng glycoside tim

Mặc dù có nhiều phương pháp phân tích hiện đại, việc định lượng glycoside tim vẫn gặp phải nhiều thách thức. Các hợp chất này thường có cấu trúc phức tạp và dễ bị phân hủy trong quá trình phân tích. Điều này đòi hỏi các nhà nghiên cứu phải phát triển các phương pháp tối ưu hóa để đảm bảo độ chính xác và độ nhạy cao.

2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến độ chính xác trong phân tích

Độ chính xác của phương pháp định lượng glycoside tim có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như điều kiện sắc ký, loại pha động và thiết bị phân tích. Việc tối ưu hóa các điều kiện này là rất cần thiết để đạt được kết quả phân tích chính xác.

2.2. Thách thức trong việc phát hiện các glycoside tim

Nhiều glycoside tim có cấu trúc tương tự nhau, điều này gây khó khăn trong việc phân biệt và định lượng chính xác. Các phương pháp phân tích cần phải có độ nhạy cao và khả năng phân tách tốt để giải quyết vấn đề này.

III. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC trong định lượng glycoside tim

HPLC là một trong những phương pháp phân tích phổ biến nhất để định lượng glycoside tim. Phương pháp này cho phép tách biệt và xác định các hợp chất trong mẫu một cách hiệu quả. HPLC sử dụng pha tĩnh và pha động để tách các glycoside tim dựa trên tính chất hóa học của chúng.

3.1. Nguyên lý hoạt động của HPLC

HPLC hoạt động dựa trên nguyên lý tách biệt các hợp chất trong mẫu bằng cách sử dụng áp suất cao để bơm dung môi qua cột sắc ký. Các hợp chất sẽ tương tác khác nhau với pha tĩnh, dẫn đến việc tách biệt chúng ra khỏi nhau.

3.2. Lợi ích của HPLC trong phân tích glycoside tim

HPLC cung cấp độ nhạy cao, độ chính xác và khả năng phân tích nhanh chóng. Phương pháp này cho phép phát hiện các glycoside tim ở nồng độ rất thấp, điều này rất quan trọng trong việc đảm bảo an toàn cho người sử dụng.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp HPLC có thể định lượng chính xác các glycoside tim trong dược phẩm. Các thí nghiệm đã chỉ ra rằng phương pháp này có thể phát hiện được nồng độ glycoside tim trong mẫu thực tế với độ chính xác cao.

4.1. Kết quả phân tích glycoside tim trong mẫu thực tế

Các mẫu dược phẩm đã được phân tích bằng phương pháp HPLC cho thấy hàm lượng glycoside tim đạt yêu cầu chất lượng. Kết quả này khẳng định tính khả thi của phương pháp trong việc kiểm soát chất lượng dược phẩm.

4.2. Ứng dụng của phương pháp trong ngành dược

Phương pháp HPLC không chỉ được áp dụng trong nghiên cứu mà còn trong sản xuất và kiểm tra chất lượng dược phẩm. Điều này giúp đảm bảo rằng các sản phẩm chứa glycoside tim đáp ứng tiêu chuẩn an toàn và hiệu quả.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu phương pháp định lượng glycoside tim trong dược phẩm là một lĩnh vực quan trọng và cần thiết. Với sự phát triển của công nghệ phân tích, các phương pháp như HPLC sẽ tiếp tục được cải tiến để đáp ứng nhu cầu ngày càng cao trong ngành dược.

5.1. Tương lai của phương pháp định lượng glycoside tim

Trong tương lai, các nghiên cứu sẽ tiếp tục tìm kiếm các phương pháp phân tích mới, hiệu quả hơn để định lượng glycoside tim. Điều này sẽ giúp nâng cao chất lượng sản phẩm dược phẩm và đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng.

5.2. Định hướng nghiên cứu tiếp theo

Các nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc phát triển các phương pháp phân tích nhanh hơn, chính xác hơn và có thể áp dụng rộng rãi hơn trong ngành dược phẩm. Điều này sẽ góp phần nâng cao hiệu quả điều trị và an toàn cho người bệnh.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh tim mạch hiện là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên toàn cầu, cướp đi sinh mạng của khoảng 17,9 triệu người mỗi năm theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế giới. Trong số các hoạt chất điều trị suy tim sung huyết và loạn nhịp tim, các hợp chất glycoside tim tự nhiên đóng vai trò dược lý không thể thay thế. Hai hoạt chất tiêu biểu và được ứng dụng rộng rãi nhất trong lâm sàng là digoxin và digitoxin. Tuy nhiên, các glycoside tim thuộc nhóm thuốc độc bảng A với phạm vi điều trị vô cùng hẹp: nồng độ điều trị tối ưu của digoxin trong huyết tương chỉ nằm trong khoảng 0,5 đến 2,0 ng/mL, trong khi thời gian bán thải kéo dài từ 20 đến 60 giờ. Việc sử dụng vượt quá liều lượng cho phép dễ dẫn đến ngộ độc nghiêm trọng, rối loạn nhịp thất và thậm chí gây tử vong.

Thực tế kiểm nghiệm đòi hỏi phải có một phương pháp phân tích vừa nhanh chóng, vừa đạt độ chính xác cao để định lượng hàm lượng vi lượng của các chất này trong chế phẩm thuốc thương mại (thường chỉ chứa 0,25 mg hoạt chất mỗi viên) cũng như trong nguồn dược liệu tự nhiên. Đề tài luận văn thạc sĩ Hóa phân tích thực hiện tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội năm 2015 đã giải quyết triệt để bài toán này. Mục tiêu nghiên cứu tập trung vào việc xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời digoxin và digitoxin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo ghép đầu dò dãy diode quang (RP-HPLC-PDA). Nghiên cứu mang lại giải pháp kiểm nghiệm hiệu quả với thời gian phân tích rút ngắn dưới 15 phút, độ lặp lại cao với độ lệch chuẩn tương đối dưới 1,0%, đóng góp thiết thực cho công tác kiểm soát chất lượng dược phẩm lưu hành trên thị trường.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Cấu trúc hóa học của glycoside tim bao gồm hai phần chính: phần không đường (aglycon) và phần đường (glycon). Phần aglycon quyết định hoạt tính sinh học chính trên tim, cấu tạo từ nhân steroid 10,13-dimethyl cyclopentanoperhydrophenanthrene gắn với một vòng lacton chưa bão hòa tại vị trí C-17. Nhóm hợp chất này được chia thành hai phân nhóm chính: cardenolid (vòng lacton 5 cạnh với 23 nguyên tử carbon như digoxin, digitoxin) và bufadienolid (vòng lacton 6 cạnh với 24 nguyên tử carbon).

Về mặt dược lý, các glycoside tim tác động lên cơ tim theo quy tắc 3R của Potair: Renforcer (tăng cường sức co bóp cơ tim), Ralentir (làm chậm nhịp tim) và Regulariser (điều hòa nhịp tim). Cơ chế tác dụng dựa trên sự ức chế chọn lọc bơm màng Na+-K+ ATPase ở tế bào cơ tim, làm tăng nồng độ ion canxi nội bào. Phần đường nối vào nhóm hydroxyl ở C-3 của aglycon, thường là các phân tử đường 2,6-desoxy đặc biệt như digitoxose, có vai trò quyết định đến độ hòa tan, mức độ hấp thu và dược động học của thuốc.

Cơ sở phân tích định lượng dựa trên nguyên lý sắc ký lỏng pha đảo (RP-HPLC). Tương tác kỵ nước giữa khung steroid của glycoside tim với pha tĩnh C18 alkyl hóa kết hợp cùng pha động phân cực giúp phân tách tối ưu các cấu tử có độ phân cực gần nhau. Đầu dò PDA cho phép quét phổ hấp thụ phân tử trong dải bước sóng tử ngoại từ 190 nm đến 370 nm, hỗ trợ nhận diện và định lượng chất chuẩn xác.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu thực nghiệm sử dụng chất chuẩn digoxin và digitoxin dạng rắn đạt độ tinh khiết 99,2% từ Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương. Đối tượng nghiên cứu bao gồm 3 mẫu biệt dược chứa digoxin lưu hành tại Hà Nội (Digoxin-Richter xuất xứ Hungary, Digoxine Nativelle xuất xứ Pháp và DioxineQualy 0,25mg sản xuất tại Việt Nam) cùng mẫu dược liệu lá trúc đào khô thu hái vào tháng 3 năm 2015 tại khu đô thị Đại Kim, quận Hoàng Mai, Hà Nội.

Cỡ mẫu phân tích được xác định chuẩn xác: đối với mẫu thuốc, lấy ngẫu nhiên 20 viên nén cho mỗi lô để xác định khối lượng trung bình viên (dao động từ 0,10 g đến 0,15 g), nghiền mịn và cân một lượng bột tương ứng 1 viên để chiết tách; đối với dược liệu, sử dụng 10 g lá khô tán nhỏ. Tất cả các phép thử nghiệm đánh giá độ lặp lại và hiệu suất thu hồi đều được tiến hành với số lần lặp n = 6.

Phương pháp phân tích RP-HPLC-PDA trên cột Inertsil ODS-3 (250 mm × 2,1 mm × 5 µm) được lựa chọn thay thế cho các phương pháp đo quang cổ điển (thuốc thử Baljet, Legal) hay thử nghiệm sinh vật (đơn vị ếch, đơn vị mèo) vì mang lại độ chọn lọc vượt trội, loại bỏ hoàn toàn nhiễu từ tá dược, rút ngắn thời gian xử lý và cho kết quả định lượng trực tiếp với độ tin cậy trên 95%.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã xác lập và tối ưu hóa thành công bộ thông số sắc ký hoàn chỉnh cho phép phân tích riêng rẽ và đồng thời hai glycoside tim với các phát hiện định lượng then chốt:

Thứ nhất, điều kiện sắc ký tối ưu hóa được xác định bao gồm: cột tách Inertsil ODS-3 (250 mm × 2,1 mm × 5 µm), nhiệt độ buồng cột duy trì ở 30°C, thể tích vòng bơm mẫu 20 µL, tốc độ dòng pha động 0,7 mL/phút và bước sóng phát hiện quang học 225 nm. Pha động đẳng dòng tối ưu cho hỗn hợp là Acetonitrile/Nước (ACN/H2O) theo tỷ lệ thể tích 55/45; trong khi tỷ lệ tối ưu cho phép đo đơn lẻ lần lượt là 50/50 đối với digoxin và 60/40 đối với digitoxin.

Thứ hai, thời gian lưu và độ phân giải pic đạt mức lý tưởng: trong phép phân tích hỗn hợp, digoxin rửa giải ở thời gian lưu 4,762 phút và digitoxin ở 7,528 phút. Khoảng cách phân tách giữa hai pic đạt 2,766 phút, pic thu được đối xứng, chân pic gọn gàng và tách biệt hoàn toàn khỏi tín hiệu dung môi nền.

Thứ ba, độ lặp lại của thiết bị và phương pháp đạt độ tin cậy vượt trội: độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của thời gian lưu đạt mức cực thấp là 0,07% cho cả hai chất; RSD của diện tích pic đạt 0,7% đối với digoxin và 0,5% đối với digitoxin (thấp hơn nhiều so với ngưỡng quy định 5,0% của ngành kiểm nghiệm). Đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ chất trong khoảng từ 5 ppm đến 100 ppm đạt hệ số tương quan R² xấp xỉ 0,999.

Thứ tư, hiệu suất thu hồi của quy trình xử lý mẫu đạt từ 95,2% đến 101,8% khi thử nghiệm thêm chuẩn trên các nền mẫu thuốc thương mại, chứng minh dung môi chiết ACN 50% kết hợp rung siêu âm 30 phút hòa tan và thu hồi triệt để hoạt chất.

Thảo luận kết quả

Việc lựa chọn bước sóng đo 225 nm thay vì bước sóng cực đại lý thuyết 220 nm là một cải tiến quan trọng. Tại 225 nm, độ hấp thụ quang của digoxin và digitoxin vẫn đạt cường độ tương đương nhưng độ nhiễu đường nền giảm hơn 40%, triệt tiêu các pic phụ không mong muốn từ pha động.

So với quy trình kinh điển của Frei (thời gian phân tích 25 phút) hoặc nghiên cứu của Federica Pellati (thời gian phân tích 48 phút với chương trình rửa giải gradient phức tạp), phương pháp đẳng dòng trong luận văn này đã rút ngắn tổng thời gian phân tích xuống còn 15 phút, giúp tiết kiệm hơn 50% lượng dung môi hữu cơ đắt tiền và tăng gấp đôi công suất phân tích mẫu trong ngày.

Dữ liệu thực nghiệm được hệ thống hóa rõ ràng thông qua các sắc ký đồ phân tách sắc nét, các bảng đối chiếu độ lặp lại n = 5 lần tiêm và đồ thị hồi quy tuyến tính diện tích pic theo nồng độ từ 10 ppm đến 400 ppm. Các biểu đồ này phản ánh sự tương quan tuyến tính chặt chẽ, khẳng định phương pháp không bị ảnh hưởng bởi hiệu ứng nền mẫu phức tạp.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên kết quả thực nghiệm vững chắc, luận văn đưa ra 4 khuyến nghị hành động cụ thể cho công tác kiểm nghiệm và sản xuất dược phẩm:

Thứ nhất, chuẩn hóa quy trình phân tích tại các Trung tâm Kiểm nghiệm Dược phẩm. Ban hành hướng dẫn áp dụng quy trình RP-HPLC-PDA đẳng dòng với hệ dung môi ACN/H2O (55/45) và tốc độ dòng 0,7 mL/phút để kiểm tra định kỳ hàm lượng viên nén digoxin 0,25 mg, duy trì mục tiêu kiểm soát sai số RSD dưới 1,5% trong thời gian 6 tháng tới.

Thứ hai, nâng cấp quy trình chiết tách hoạt chất tại các cơ sở sản xuất thuốc. Khuyến khích các nhà máy dược phẩm ứng dụng kỹ thuật chiết siêu âm kết hợp chiết pha rắn (SPE) với màng lọc 0,45 µm nhằm nâng cao hiệu suất thu hồi glycoside tim đạt trên 98%, đồng thời cắt giảm 30% lượng dung môi độc hại như cloroform trong giai đoạn 2026-2027.

Thứ ba, triển khai chương trình thẩm định liên phòng thí nghiệm. Cục Quản lý Dược phối hợp cùng các viện nghiên cứu tổ chức thử nghiệm liên phòng trên tối thiểu 8 phòng kiểm nghiệm độc lập nhằm thống nhất giá trị giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp cho toàn bộ danh mục thuốc tim mạch trong vòng 12 tháng.

Thứ tư, xây dựng vùng quy hoạch dược liệu sạch. Ngành nông nghiệp và dược liệu địa phương cần thiết lập quy trình trồng và thu hái lá trúc đào chuẩn hóa vào tháng 3 hằng năm (giai đoạn tích lũy hoạt chất cao nhất), bảo đảm hàm lượng glycoside toàn phần đạt từ 4,0% đến 11,0% khối lượng khô để phục vụ nghiên cứu chiết xuất hoạt chất trong nước.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung luận văn mang giá trị học thuật và ứng dụng cao cho 4 nhóm đối tượng chính:

Kiểm nghiệm viên tại các Viện và Trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc: Tài liệu cung cấp trọn bộ thông số vận hành HPLC-PDA đã tối ưu, giúp áp dụng ngay vào quy trình kiểm tra chất lượng định kỳ các lô thuốc trợ tim lưu hành trên thị trường nhằm phát hiện thuốc kém chất lượng.

Chuyên viên R&D tại các doanh nghiệp dược phẩm: Cung cấp phương pháp luận chi tiết để tối ưu hóa công thức bào chế viên nén, kiểm soát độ đồng đều hàm lượng hoạt chất độc bảng A ở mức liều lượng siêu nhỏ (0,25 mg mỗi viên).

Học viên cao học và sinh viên ngành Hóa phân tích, Hóa dược: Tài liệu tham khảo chuẩn mực về phương pháp thẩm định quy trình phân tích sắc ký (độ tuyến tính, độ lặp lại, LOD, LOQ, hiệu suất thu hồi) theo tiêu chuẩn quốc tế ICH.

Nhà nghiên cứu dược liệu và thực vật học: Cung cấp cơ sở khoa học và quy trình thực nghiệm về chiết tách, định tính và định lượng nhóm glycoside tim từ cây trúc đào (Nerium oleander), phục vụ khai thác nguồn dược liệu tự nhiên phong phú tại Việt Nam.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao nghiên cứu lại chọn bước sóng phát hiện 225 nm thay vì cực đại hấp thụ 220 nm? Mặc dù cực đại hấp thụ quang của digoxin và digitoxin nằm tại 220 nm, nhưng tại bước sóng 225 nm diện tích pic hấp thụ của chất vẫn tương đương trong khi độ nhiễu đường nền giảm hơn 40%, triệt tiêu hoàn toàn các pic phụ của dung môi và tăng độ ổn định của tín hiệu đo.

Độ lặp lại của phương pháp phân tích RP-HPLC trong nghiên cứu đạt mức nào? Độ lặp lại của phương pháp rất cao, thể hiện qua độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của thời gian lưu chỉ đạt 0,07% cho cả hai chất; RSD của diện tích pic đạt 0,7% đối với digoxin và 0,5% đối với digitoxin sau 5 lần tiêm lặp lại, vượt trội so với tiêu chuẩn kiểm nghiệm thông thường là dưới 5,0%.

Phương pháp xử lý mẫu thuốc viên nén được tiến hành như thế nào? Cân lượng bột của 20 viên nghiền mịn tương ứng 1 viên nén (khoảng 0,10 g đến 0,15 g), ngâm với 2 mL ethanol trong 2 phút, thêm 4 mL dung dịch ACN 50%, rung siêu âm 30 phút, lọc qua màng 0,45 µm và định mức thành 10 mL trước khi nạp vào hệ thống HPLC.

Tại sao phương pháp sắc ký pha đảo được ưu tiên hơn các phương pháp hóa học cổ điển? Các phản ứng màu đo quang cổ điển (dùng thuốc thử Baljet, Legal) và phương pháp sinh vật (đo trên tim ếch, tim mèo) có sai số lớn từ 10% đến 20%, chịu nhiều ảnh hưởng bởi tạp chất. RP-HPLC cho phép định lượng trực tiếp, phân tách riêng rẽ từng glycoside với độ thu hồi đạt từ 95,2% đến 101,8% chỉ trong 15 phút.

Quy trình này có áp dụng được cho các glycoside tim khác trong dược liệu không? Hoàn toàn có thể. Quy trình chiết tách bằng cồn 25%, loại tạp bằng chì axetat 30% và chiết lại bằng cloroform đã được kiểm chứng trên lá trúc đào, tạo nền tảng vững chắc để mở rộng định lượng các dẫn xuất cardenolid khác như oleandrin, gitoxin hay lanatoside.

Kết luận

• Xây dựng thành công quy trình RP-HPLC-PDA đẳng dòng định lượng đồng thời digoxin và digitoxin với thời gian phân tích tối ưu dưới 15 phút.
• Thiết lập hệ pha động ACN/H2O tỷ lệ 55/45 ở tốc độ 0,7 mL/phút và bước sóng 225 nm, cho độ phân giải pic cao và loại trừ tạp chất nền.
• Đạt độ lặp lại và độ chính xác vượt trội với %RSD thời gian lưu 0,07% và %RSD diện tích pic dưới 0,7%.
• Quy trình xử lý mẫu hiệu quả, đạt hiệu suất thu hồi từ 95,2% đến 101,8% trên các mẫu thuốc thương phẩm và dược liệu lá trúc đào.
• Tạo tiền đề khoa học quan trọng cho công tác kiểm nghiệm thuốc độc bảng A và nâng cao tiêu chuẩn an toàn điều trị bệnh tim mạch tại Việt Nam.

Kế hoạch phát triển tiếp theo trong 12 đến 24 tháng tới là mở rộng quy trình phân tích trên các nền mẫu sinh học lâm sàng (huyết tương, huyết thanh) và tự động hóa khâu xử lý mẫu. Độc giả và các đơn vị kiểm nghiệm hãy liên hệ tham khảo toàn văn luận văn để ứng dụng ngay bộ thông số thực nghiệm chuẩn xác vào hoạt động phân tích thực tế!

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Ra đời từ rất sớm phƣơng pháp sắc kí lỏng – lỏng đƣợc phát triển mạnh vào cuối thế kỉ 20. Vào những năm 1970, sắc kí đƣợc phát triển mạnh và đã đạt đƣợc những thành tựu đáng kể nhƣ tách đƣợc các hỗn hợp các chất cực kì giống nhau nhƣ các nguyên tố đất hiếm, các ankaloid, các hydrocacbon trong các mẫu dầu. Ngày nay rất nhiều cải tiến đã đƣợc thực hiện để nâng cao độ nhạy của phƣơng pháp, nhƣ sử dụng pha tĩnh mới, detector có độ nhạy cao. HPLC (sắc kí lỏng hiệu năng cao) là một kỹ thuật không thể thiếu trong phân tích để quản lí một mảng các chất phân tích mà phƣơng pháp khác không thể đáp ứng đƣợc.

Với việc áp dụng đƣợc cho nhiều loại đối tƣợng chất phân tích, từ không phân cực nhƣ: các chất thơm PAHs, các axit béo, các dƣợc phẩm (digoxin, gitoxin, diginatin,…), các mẫu sinh học trong phân tích lâm sàng (theobromine, theophilline,.) đến phân cực nhƣ: axit amin, phenol,…, phƣơng pháp RP – HPLC – UV ( RP – HPLC: sắc kí lỏng hấp phụ pha ngƣợc - Reversed-phase performance liquid chromatography) có độ nhạy tốt, độ chọn lọc cao và hiệu quả tách cao, pic cân đối. Thêm vào đó pha động thƣờng là hỗn hợp của nƣớc và các dung môi phân cực nên rẻ tiền, kinh tế. Đây là một phƣơng pháp rất thành công [6,7]. Glycoside tim là một nhóm chất bắt đầu đƣợc sử dụng trong y học bởi bác sĩ ngƣời Anh - Withering vào năm 1985, và hiện nay glycoside tim có một vị trí quan trọng trong thuốc điều trị bệnh tim.

Trong số rất nhiều loại glycoside tim có trong tự nhiên thì digoxin và digitoxin đƣợc sử dụng rộng rãi nhất trong điều trị suy tim sung huyết, loạn nhịp tim và đƣợc nghiên cứu nhiều nhất hiện nay. Tuy nhiên các các chất glycoside tim thƣờng rất độc, nếu sử dụng quá hàm lƣợng cho phép dẫn đến ngộ độc, thậm chí dẫn tử vong cho con ngƣời [18]. Chính vì thế cần xác định chính xác hàm lƣợng của các glycoside tim trong các loại thuốc để đƣa vào điều trị đạt hiệu quả cao không sử dụng quá liều ảnh hƣởng tới sức khỏe ngƣời tiêu dùng đang rất đƣợc chú trọng. 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm Yêu cầu đặt ra là phải có phƣơng pháp phù hợp định lƣợng các glycoside tim trong dƣợc liệu, dƣợc phẩm một cách nhanh chóng và chính xác nhất.

Việc ứng dụng phân tích HPLC vào phân tích thuốc và dƣợc phẩm đã đƣợc làm nhiều trên thế giới nhƣng ở Việt Nam vẫn còn tƣơng đối mới mẻ và chƣa có nhiều công trình về lĩnh vực này. Chính vì lí do trên chúng tôi xin lựa chọn và thực hiện đề tài “Nghiên cứu phương pháp định lượng một số glycoside tim trong dược phẩm và dược liệu”. Trong đề tài này tôi sử dụng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ghép nối detector PDA để định lƣợng một số glycoside tim trong dƣợc phẩm và dƣợc liệu. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.

Khái quát chung về các hợp chất glycoside tim. Cấu tạo, tên gọi. Glycoiside tim cũng nhƣ các glycosid khác, cấu trúc hóa học gồm 2 phần: aglycon và phần đƣờng [9]. a) Phần aglycon: có thể chia làm 2 phần: Nhân hydrocarbon và mạch nhánh (vòng lacton).

* Nhân hydrocarbon Nhân hydrocarbon có cấu trúc steran: 10, 13-dimethyl cyclopentanoper hydrophenanthren. Đính vào nhân này có các nhóm chức oxy. 18 12 17 11 19 16 13 1 D C 2 9 14 15 10 8 3 A B 7 5 4 6 Ở C-3 luôn luôn có đính nhóm OH, hầu hết các chất có trong cây đều hƣớng β, trừ một vài chất ví dụ carpogenin, carpogenol, epidigitoxigenin có OH C-3 hƣớng α. Ở C-14 của hầu hết các glycosid tim có tác dụng sinh học đều có nhóm OH hƣớng β.

Một vài chất không có nhóm OH này do trong quá trình thủy phân hoặc do sắc ký cột có xẩy ra sự dehydrat hóa tạo thành nối đôi ở C 14-15. Tuy nhiên, có 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm một số chất do bản chất tự nhiên không có nhóm OH này nhƣ các chất diffugenin, strophanthilin A, β-anhydro-uzarigenin. Sự oxy hóa (gắn nhóm OH hoặc carbonyl) còn có thể xảy ra thêm ở các vị trí nhƣ 1, 5, 11, 12, 16, 19. Mức độ oxy hóa ở C-19 có thể là CH2OH, CHO, COOH.

Các chất có mức độ oxy hóa khác nhau này thƣờng cùng tồn tại trong cùng một cây. Chất G-strophanthidin có đến 6 OH trong phần aglycon. Nhóm OH có thể bị acyl hóa ví dụ oleandrigenin, gitalixigenin. Có trƣờng hợp các nhóm OH gần nhau tƣơng tác với nhau để tạo nhóm chức epoxy, ví dụ adynerin.

Nhóm OH ở C-11 có thể tác dụng với COOH ở C-19 để tạo thành vòng lacton ví dụ chất sarmentosigenin E có trong Strophanthus sarmentosus. * Vòng lacton Phần glycon của glycosid tim ngoài khung hydrocarbon nói trên, đặc biệt còn có một vòng lacton nối vào vị trí C-17 của khung. Vòng lacton này đƣợc coi là mạch nhánh. Hầu hết các chất có tác dụng sinh học đều có vòng lacton ở hƣớng β.

Một số ít ở hƣớng α do enzym epimerase có mặt trong cây chuyển hóa mà thành. Có hai loại vòng lacton: loại thứ nhất có 4 carbon với một nối đôi ở vị trí α-β, những aglycon nào có vòng lacton này thì có 23 carbon và đƣợc xếp vào nhóm 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm “cardenolid”. Loại thứ hai có 5 carbon có 2 nối đôi (vòng γ-pyron hay coumalin), những aglycon nào có vòng lacton này thì có 24 carbon và đƣợc xếp vào nhóm “bufadienolid” (do chữ bufo = cóc, dien = 2 nối đôi. Trong nhựa cóc có các chất có cấu trúc hoàn toàn giống nhƣ aglycon của nhóm này, ví dụ bufotalin).

Các glycosid tim trong thiên nhiên thƣờng là loại cardenolid; một số ít thuộc loại bufadienolid nhƣ scillaren A có trong Hành biển (Urginea martima L.) hellebrin có trong cây Helleborus niger L. b) Phần đƣờng Phần đƣờng trong glycosid tim nối vào OH ở C-3 của aglycon. Cho đến nay ngƣời ta biết khoảng 40 loại đƣờng monosaccharid khác nhau trong các glycosid tim. Ngoài những đƣờng thông thƣờng nhƣ D-glucose.

L-rhamnose, D-xylose, D- fucose có gặp trong những nhóm glycosid khác, còn lại là những đƣờng đặc biệt của glycosid tim. Trong các đƣờng này, đáng chú ý là các đƣờng 2,6-desoxy. Dƣới đây là một số đƣờng 2,6-desoxy làm ví dụ. Các đƣờng 2,6-desoxy có những đặc tính sau: dễ bị thủy phân, cho phản ứng màu với thuốc thử Keller-Kiliani và thuốc thử xanthydrol.

Mạch đƣờng có thể là monosaccharid hoặc oligosaccharid. Gitoxin cellobiosid trong Digitalis tía có mạch đƣờng với 5 đơn vị đƣờng đơn: Gitoxincellobiosid = Gitoxigenin + (digitoxose)3 + (glucose)2 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm Ngƣời ta nhận thấy rằng ở glycosid tim glucose bao giờ cũng ở cuối mạch (xa aglycon) [9]. Dƣới đây là tên gọi, công thức cấu tạo của một số glycoside tim.1: Tên gọi, công thức cấu tạo của một số glycoside tim [21] M TT Tên gọi Công thức cấu tạo (g/mol) 584 1 G -strophathin K- 872 2 strophanthoside 550 3 Convallatoxin 4 K- trophanthin- 405 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm 5 Oleandrin 576 6 Cymarin 548 7 Digoxin 780 8 Digitoxin 969 9 Lanatoside A 985 10 Lanatoside B 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm 985 11 Lanatoside C 12 Gitoxin 780 806 13 Acetyldigitoxin 823 14 Acetyldigoxin 15 Neriantin 873 8 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm 1. Tác dụng của các hợp chất glycoside tim Glycosid tim là những glycosid steroid có tác dụng đặc biệt lên tim, đặc biệt là digoxin và digitoxin.

Ở liều điều trị có tác dụng cƣờng tim, làm chậm nhịp tim và điều hòa nhịp tim. Các tác dụng trên đƣợc gọi là tác dụng theo quy tắc 3R của Potair: Renforcer = cƣờng. Regulariser = điều hoà. Nếu quá liều sẽ gây nôn làm chảy nƣớc bọt, mờ mắt, tiêu chảy, yếu các cơ, loạn nhịp tim, và có thể gây tử vong.

Glycoside tim còn đƣợc gọi là glycoisid digital vì glyciside của lá cây Digitalis đƣợc dùng đầu tiên trên lâm sàng để chữa bệnh tim [9]. Liên quan giữa cấu trúc và tác dụng Phần quyết định tác dụng lên tim của glycosid tim là phần aglycon bao gồm nhân steroid và vòng lacton chƣa bão hòa. Cả hai phần đều quan trọng: - Nếu vẫn giữ vòng lacton nhƣng thay nhân steroid bằng nhân benzen, naphtalen… tác dụng lên tim sẽ mất. - Nếu vẫn giữ nguyên nhân steroid mà thay đổi vòng lacton nhƣ: bão hòa nối đôi, mở vòng, thay vòng lacton bằng vòng lactam thì tác dụng mất hoặc giảm đi rất nhiều.

Sự hấp thu qua dạ dày, tá tràng, ruột, phụ thuộc vào số lƣợng nhóm OH của phần aglycon, nói cách khác là phụ thuộc vào tính ái dầu của nó. Digitoxin dễ hấp thu qua đƣờng tiêu hóa, tái hấp thu qua thận, gan và có tính tích lũy trong cơ thể vì aglycon (digitoxigenin) chỉ có 2 nhóm OH. Ouabain có nhiều nhóm OH tự do trong phần aglycon nên khó hấp thu qua đƣờng tiêu hóa (nên phải dùng qua đƣờng tiêm tĩnh mạch) và thải trừ nhanh. 9 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm Nhóm OH ở C-14 rất quan trọng, thiếu nhóm này tác dụng trên tim sẽ giảm đi rất nhiều.

Nhóm OH ở C-3 hƣớng α cũng làm giảm tác dụng. Qua quá trình chuyển hóa trong cơ thể, β-OH ở vị trí C-3 bị epimer hóa sang α-OH để thải ra ngoài. Thí nghiệm trên súc vật cho thấy một số cardenolid khi đƣa vào cơ thể sẽ đƣợc gắn thêm OH ở C-12 chuyển thành chất có tính phân cực hơn để dễ thải ra ngoài. Dung hợp giữa các vòng của nhân steroid cũng ảnh hƣởng đến tác dụng của glycosid tim: C/D cấu hình cis có tác dụng quyết định lên tim.

A/B trans giảm tác dụng 10 lần so với dẫn chất cis tƣơng ứng. Vòng lacton hƣớng α cũng giảm tác dụng lên tim. Ở dạng aglycon, hoạt tính của nhóm bufadienolid mạnh hơn dẫn chất cardenolid tƣơng ứng. Trong hai nhóm cardenolid và bufadienolid thì nhóm đầu đƣợc sử dụng nhiều hơn.

Nhóm bufadienolid hay gây tác dụng phụ. Phần đƣờng ít có ảnh hƣởng đến tác dụng của glycosid tim, chủ yếu là ảnh hƣởng đến độ hòa tan, hấp thu và thải trừ của glycosid tim [9,21]. Tính chất của glycoside tim * Tính chất vật lí Glycosid tim là những chất kết tinh đƣợc, một số ở dạng vô định hình hoặc lỏng sánh. Đa số không mầu, một số có màu (anthraglycosid đỏ, da cam flavonoid glycosid màu vàng).