Nghiên Cứu Tạo Nguyên Liệu Probiotic Dạng Vi Nang Phối Hợp Alginat và Carrageenan

Nghiên cứu phát triển nguyên liệu probiotic dạng vi nang kết hợp alginat và carrageenan, mở ra tiềm năng ứng dụng trong ngành thực phẩm.

• Tác giả: Khổng Thị Ngọc Anh
• Người hướng dẫn: PGS. Đàm Thanh Xuân
• Trường học: Trường Đại Học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược sĩ
• Đề tài: Nghiên Cứu Nguyên Liệu Probiotic Dạng Vi Nang Phối Hợp Alginat và Carrageenan
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ƠN
• DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Đại cương về Probiotic
• 1.1.1. Khái niệm và lịch sử về Probiotic
• 1.1.2. Vai trò của Probiotic với sức khỏe con người
• 1.1.3. Loài Lactobacillus acidophilus
• 1.1.4. Tiềm năng của loài Lactobacillus acidophilus
• 1.2. Đại cương về vi nang probiotic
• 1.2.1. Khái niệm
• 1.2.2. Phương pháp vi nang hóa
• 1.2.2.1. Phương pháp vi nang hóa bằng tách pha đông tụ
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Nguyên liệu và thiết bị
• 2.1.1. Vi sinh vật
• 2.1.2. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ
• 2.1.3. Các môi trường sử dụng trong nghiên cứu
• 2.1.4. Các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu
• 2.2. Nội dung nghiên cứu
• 2.2.1. Khảo sát quá trình tạo vi nang phối hợp Alginat và Carrageenan
• 2.2.2. Nghiên cứu cải thiện thể chất và đánh giá khả năng bao gói Lactobacillus acidophilus của vi nang phối hợp Alginat và Carrageenan
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Phương pháp tiệt khuẩn
• 2.3.2. Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào
• 2.3.3. Phương pháp nhỏ giọt đông tụ tạo vi nang phối hợp Alginat và Carrageenan
• 2.3.4. Phương pháp đông khô
• 2.3.5. Phương pháp định tính tinh bột
• 2.3.6. Phương pháp phá hạt vi nang xác định số lượng vi sinh vật
• 2.3.7. Phương pháp pha loãng liên tục xác định số lượng vi sinh vật
• 3. CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN
• 3.1. Khảo sát quá trình tạo vi nang phối hợp Alginat - Carrageenan và đánh giá hình thái vi nang
• 3.2. Khảo sát khả năng tạo vi nang phối hợp sử dụng dung dịch đông tụ KCl
• 3.3. Khảo sát khả năng tạo vi nang phối hợp sử dụng dung dịch đông tụ CaCl2
• 3.4. Bổ sung chất độn cải thiện thể chất và đánh giá khả năng bao gói Lactobacillus acidophilus của vi nang phối hợp Alginat và Carrageenan
• 3.5. Bước đầu bổ sung tinh bột vào vi nang probiotic phối hợp và đánh giá thể chất vi nang sau đông khô
• 3.6. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến thể chất vi nang phối hợp sau đông khô
• 3.7. Đánh giá khả năng bao gói Lactobacillus acidophilus của vi nang phối hợp Alginat, Carrageenan và tinh bột
• KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Probiotic Vi Nang Alginat Carrageenan Tổng Quan Nghiên Cứu

Probiotic là những vi sinh vật sống, khi được đưa vào cơ thể với một lượng đủ lớn, sẽ mang lại lợi ích sức khỏe cho vật chủ. Nghiên cứu trong hai thập kỷ qua đã chứng minh việc bổ sung probiotic giúp tối ưu hóa hệ vi sinh vật đường ruột, ngăn ngừa và điều trị một số rối loạn đường ruột nhẹ. Nhận thức được tác dụng tích cực này, nhu cầu sử dụng chế phẩm probiotic tăng cao, thúc đẩy đầu tư và phát triển sản phẩm mới. Các nỗ lực nghiên cứu hiện nay tập trung vào tìm kiếm nguyên liệu tạo vi nang probiotic mới, tăng cường khả năng sống sót của vi sinh vật trong môi trường tiêu hóa, và hướng giải phóng vi sinh vật tại vị trí đích. Các polyme sinh học từ rong biển, như alginat và carrageenan, nổi bật với độc tính thấp, khả năng tương thích sinh học cao và khả năng phân hủy sinh học tốt, hứa hẹn nhiều tiềm năng. Nghiên cứu này tập trung vào việc tạo nguyên liệu probiotic dạng vi nang phối hợp alginat và carrageenan.

1.1. Probiotic Định nghĩa Lịch sử và Ứng dụng Tiềm năng

Probiotic, có nguồn gốc từ Hy Lạp, mang ý nghĩa “thân thiện với đời sống con người”. Khái niệm này đã phát triển qua nhiều năm, và được Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và Tổ chức Nông lương Liên Hợp Quốc (FAO) định nghĩa năm 2002 là “vi sinh vật sống mang lại tác động có lợi khi đưa vào cơ thể”. Tuy định nghĩa mới xuất hiện gần đây, việc sử dụng thực phẩm lên men chứa vi sinh vật sống đã có từ hàng ngàn năm trước. Probiotic có tiềm năng lớn trong việc cân bằng hệ vi sinh đường ruột, giảm cholesterol máu, phòng ngừa tiêu chảy, bảo vệ hệ tiết niệu-sinh dục, và chống lại các tác nhân gây bệnh. Nghiên cứu về probiotic vẫn tiếp tục mở rộng, hướng đến các ứng dụng mới trong việc chống viêm, chống dị ứng, chống béo phì và tăng cường hấp thu dinh dưỡng.

1.2. Tổng quan về Lactobacillus acidophilus Loài Probiotic Phổ biến

Lactobacillus acidophilus là một trong những loài vi sinh vật probiotic phổ biến nhất. Nó thuộc họ Lactobacillaceae, chi Lactobacillus và nhóm vi khuẩn sinh acid lactic (LAB). Loài này tồn tại trong đường tiêu hóa và âm đạo của người và động vật. Về hình thái, Lactobacillus acidophilus là trực khuẩn hình que, Gram dương, không di động và không sinh bào tử. Điều kiện nuôi cấy tối ưu là 37°C, kỵ khí không bắt buộc và pH khoảng 5,0 đến 6,0. Loài này có tiềm năng lớn trong công nghiệp dược phẩm và thực phẩm. Sinh khối tạo chế phẩm probiotic giúp tạo môi trường acid và cạnh tranh vị trí bám với vi khuẩn gây hại. Các chất chuyển hóa thứ cấp như exopolysaccharid và bacteriocin có vai trò chống oxy hóa, kháng khuẩn và bảo quản thực phẩm.

II. Thách Thức Bảo Vệ Probiotic Nghiên Cứu Vi Nang Hóa

Vi nang hóa probiotic là một giải pháp hiệu quả để bảo vệ các vi sinh vật sống trong quá trình sản xuất, bảo quản và tiêu hóa. Vi nang (microcapsule) là những tiểu phân có kích thước từ 1 đến 5000 µm, chứa dược chất (hoặc dược chất và tá dược) được bao trong một màng polyme. Trong ứng dụng probiotic, vi nang hóa giúp bảo vệ vi sinh vật khỏi các yếu tố bất lợi như pH thấp, muối mật và nhiệt độ cao. Từ đó, tăng cường khả năng sống sót của chúng khi đi qua đường tiêu hóa và đến được vị trí đích để phát huy tác dụng. Tuy nhiên, việc lựa chọn vật liệu tạo vi nang phù hợp và đảm bảo độ bền cơ học của màng bao vẫn là một thách thức.

2.1. Vi Nang Probiotic Ưu điểm Vượt trội và Hạn chế Cần Khắc phục

Vi nang probiotic mang lại nhiều ưu điểm so với các dạng bào chế khác. Chúng cho phép phối hợp các chủng vi sinh vật khác nhau trong cùng một sản phẩm, tăng độ ổn định của hoạt chất và che giấu mùi vị khó chịu. Lớp polyme tạo vỏ bảo vệ vi sinh vật khỏi môi trường khắc nghiệt của đường tiêu hóa, đảm bảo chúng đến được vị trí tác động. Tuy nhiên, vi nang probiotic cũng có một số nhược điểm. Chúng đòi hỏi điều kiện bảo quản đặc biệt về độ ẩm và nhiệt độ. Độ bền cơ học của màng bao cần được tối ưu hóa để bảo vệ vi sinh vật mà không cản trở quá trình giải phóng. Ngoài ra, việc lựa chọn nguyên liệu tạo màng cần đảm bảo an toàn và không bị tạp nhiễm.

2.2. Phương pháp Vi Nang Hóa Các Yếu tố Ảnh hưởng đến Hiệu quả

Vi nang hóa probiotic là một phương pháp cố định tế bào, trong đó tế bào vi sinh vật sống được bẫy trong một lớp vỏ polyme. Có nhiều phương pháp tạo vi nang khác nhau, bao gồm phương pháp hóa học, hóa lý, tĩnh điện và cơ học. Việc lựa chọn phương pháp phụ thuộc vào tính chất của nguyên liệu, đặc điểm sinh trưởng của vi sinh vật và kích thước vi nang mong muốn. Phương pháp vi nang hóa bằng tách pha đông tụ là một lựa chọn phổ biến, dựa trên nguyên tắc giảm độ tan của polyme trong nước để tạo thành lớp vỏ bao quanh tế bào vi sinh vật.

III. Alginat và Carrageenan Giải Pháp Vi Nang Probiotic Tự Nhiên

Alginat và carrageenan là các polyme sinh học có nguồn gốc từ rong biển, được ứng dụng rộng rãi trong y sinh và dược phẩm. Chúng có nhiều đặc tính ưu việt như độc tính thấp, khả năng tương thích sinh học cao và khả năng phân hủy sinh học tốt. Các vật liệu này dễ dàng điều chỉnh dựa trên các chỉ số hóa lý, giúp chúng trở thành lựa chọn lý tưởng cho việc tạo vi nang probiotic. Alginat tạo gel khi tiếp xúc với các ion hóa trị hai như canxi, trong khi carrageenan có khả năng tạo gel ở nhiệt độ thấp.

3.1. Alginat Cấu trúc Tính chất và Ứng dụng trong Vi Nang Hóa

Alginat là một polysaccharid tự nhiên được chiết xuất từ tảo nâu. Cấu trúc của alginat bao gồm các đơn vị acid D-mannuronic (M) và acid L-guluronic (G) liên kết với nhau. Alginat có khả năng tạo gel khi tiếp xúc với các ion hóa trị hai như canxi, tạo thành mạng lưới ba chiều bao bọc và bảo vệ các tế bào vi sinh vật. Gel alginat có độ xốp cao, cho phép các chất dinh dưỡng và chất thải khuếch tán qua màng, duy trì sự sống của vi sinh vật bên trong. Nồng độ alginate ảnh hưởng đến kích thước vi nang và khả năng bảo vệ probiotic.

3.2. Carrageenan Phân loại Đặc điểm và Vai trò trong Vi Nang

Carrageenan cũng là một polysaccharid sulfat hóa được chiết xuất từ tảo đỏ. Có ba loại carrageenan chính là kappa (κ), iota (ι) và lambda (λ), khác nhau về số lượng nhóm sulfate và khả năng tạo gel. Kappa-carrageenan tạo gel cứng và giòn khi có mặt các ion kali, trong khi iota-carrageenan tạo gel mềm và đàn hồi. Carrageenan có thể được sử dụng một mình hoặc kết hợp với alginat để tạo ra các vi nang có đặc tính mong muốn. Sự kết hợp giữa alginat và carrageenan có thể cải thiện độ bền cơ học và khả năng kiểm soát giải phóng của vi nang probiotic. Một số nghiên cứu đã sử dụng carrageenan kết hợp với các vật liệu khác để tạo vi nang probiotic.

IV. Nghiên Cứu Tạo Vi Nang Alginat Carrageenan Phương Pháp và Kết Quả

Nghiên cứu này khảo sát quá trình tạo vi nang phối hợp alginat và carrageenan để bao gói Lactobacillus acidophilus. Mục tiêu là tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến hình thái và khả năng bao gói của vi nang. Các yếu tố này bao gồm tỷ lệ alginat và carrageenan, loại dung dịch đông tụ (KCl hoặc CaCl2) và việc bổ sung chất độn như tinh bột. Các vi nang được đánh giá về hình thái, kích thước, độ bền cơ học và khả năng bảo vệ vi sinh vật trong môi trường mô phỏng dịch tiêu hóa.

4.1. Khảo sát Quá trình Tạo Vi Nang Ảnh hưởng của Dung dịch Đông tụ

Dung dịch đông tụ đóng vai trò quan trọng trong quá trình tạo gel và hình thành vi nang. Nghiên cứu đã so sánh việc sử dụng KCl và CaCl2 làm dung dịch đông tụ. KCl tạo ra các vi nang có cấu trúc xốp hơn so với CaCl2. CaCl2 tạo ra các vi nang có bề mặt mịn hơn và độ bền cơ học cao hơn. Tỷ lệ alginat và carrageenan cũng ảnh hưởng đến hình thái và kích thước vi nang. Các tỷ lệ khác nhau được thử nghiệm để tìm ra điều kiện tối ưu cho việc tạo vi nang.

4.2. Cải thiện Thể Chất Vi Nang Bổ sung Tinh bột và Đánh giá Khả năng Bao gói

Tinh bột được bổ sung vào hỗn hợp alginat và carrageenan để cải thiện thể chất của vi nang sau khi đông khô. Tinh bột giúp giảm sự co rút và nứt nẻ của vi nang trong quá trình đông khô, cải thiện độ bền cơ học. Nghiên cứu đã khảo sát ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến thể chất và khả năng bao gói của vi nang. Kết quả cho thấy nồng độ tinh bột tối ưu giúp cải thiện đáng kể thể chất của vi nang mà không ảnh hưởng đến khả năng sống sót của Lactobacillus acidophilus.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Lý do chọn đề tài và bối cảnh thực tiễn

Probiotic được định nghĩa là các vi sinh vật sống mang lại lợi ích cho sức khỏe vật chủ khi được đưa vào cơ thể với số lượng đầy đủ. Các nghiên cứu thực nghiệm đã chứng minh việc bổ sung probiotic hỗ trợ tối ưu hóa hệ vi sinh vật đường ruột, hỗ trợ phòng ngừa và điều trị các rối loạn tiêu hóa phổ biến như tiêu chảy, táo bón, đầy hơi và đau bụng. Bên cạnh tác dụng trên đường tiêu hóa, các chủng probiotic (đặc biệt là Lactobacillus acidophilus) còn thể hiện tiềm năng trong việc giảm cholesterol máu, ức chế vi khuẩn gây bệnh thông qua sản sinh acid hữu cơ và bacteriocin, tăng cường miễn dịch và phòng ngừa nhiễm trùng đường tiết niệu - sinh dục.

Tuy nhiên, hiệu quả điều trị của probiotic phụ thuộc trực tiếp vào tỷ lệ sống sót của tế bào khi đi qua môi trường acid khắc nghiệt của dạ dày và dịch mật ở ruột non trước khi đến vị trí tác dụng. Để khắc phục nhược điểm này, kỹ thuật vi nang hóa cố định tế bào được nghiên cứu nhằm tạo màng bao bảo vệ vi sinh vật. Các polyme tự nhiên có nguồn gốc từ rong biển như Alginat và Carrageenan thu hút nhiều sự quan tâm nhờ các đặc tính: độc tính thấp, độ tương thích sinh học cao, khả năng phân hủy sinh học và khả năng tạo cấu trúc gel bền vững. Việc phối hợp hai polyme này nhằm tận dụng ưu điểm của từng chất mang để tạo ra hệ vi nang bảo vệ lợi khuẩn có thể chất ổn định sau quá trình đông khô.

Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu

Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ của tác giả Khổng Thị Ngọc Anh (Trường Đại học Dược Hà Nội, năm 2023) xác định hai mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

1. Khảo sát quá trình tạo vi nang phối hợp Alginat - Carrageenan và đánh giá hình thái vi nang.
2. Bổ sung chất độn cải thiện thể chất và đánh giá khả năng bao gói Lactobacillus acidophilus của vi nang phối hợp Alginat và Carrageenan.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu:
  • Chủng vi sinh vật: Lactobacillus acidophilus ATCC 4356.
  • Nguyên liệu tạo màng và chất độn: Natri alginat (tiêu chuẩn cơ sở - Ấn Độ), Carrageenan (tiêu chuẩn cơ sở - Việt Nam), Tinh bột sắn (tiêu chuẩn cơ sở - Việt Nam).
  • Tác nhân đông tụ: Dung dịch Calci clorid ($CaCl_2$) 3% và dung dịch Kali clorid ($KCl$) 3%.
• Phạm vi nghiên cứu: Đề tài được thực hiện tại Bộ môn Công nghệ sinh học Dược, Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Dược Hà Nội; hoàn thành vào tháng 06/2023. Nghiên cứu tập trung vào quy trình điều chế vi nang quy mô phòng thí nghiệm bằng phương pháp nhỏ giọt đông tụ kết hợp kỹ thuật đông khô, khảo sát đặc tính hình thái, độ rã, tính giải phóng tinh bột và khả năng sống sót của vi khuẩn sau đông khô.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết và mô hình khoa học

Khóa luận tiếp cận trên nền tảng các lý thuyết vi sinh học và kỹ thuật bào chế hiện đại:

• Định nghĩa chuẩn về Probiotic: Tiếp cận theo định nghĩa của Tổ chức Nông Lương Liên Hợp Quốc (FAO) và Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) công bố năm 2002, được duy trì bởi Hiệp hội Khoa học Quốc tế về Probiotic và Prebiotic (ISAPP): "Probiotic là những vi sinh vật sống mà khi đưa vào cơ thể với một lượng lớn sẽ đem lại tác động có lợi cho sức khỏe vật chủ". Số lượng tế bào sống giải phóng tại ruột cần đạt tối thiểu từ $10^6$ đến $10^7\text{ CFU/g}$.
• Đặc điểm chủng vi khuẩn Lactobacillus acidophilus: Trực khuẩn Gram dương hình que, kích thước $0,6\text{–}0,9 \times 1,5\text{–}6,0\ \mu\text{m}$, không di động, không sinh bào tử, phản ứng catalase âm tính, kỵ khí không bắt buộc, nhiệt độ phát triển tối ưu $37^\circ\text{C}$, có khả năng chuyển hóa lactose thành acid lactic.
• Cơ chế tạo gel của Alginat: Polysaccharid cấu tạo từ các khối acid $\alpha\text{-L-guluronic (G)}$ và acid $\beta\text{-D-mannuronic (M)}$. Khối G tham gia liên kết phối trí với các cation hóa trị II (đặc biệt là $\text{Ca}^{2+}$) tạo cấu trúc mạng hydrogel ba chiều không tan theo mô hình "vỉ trứng" (egg-box model).
• Cơ chế tạo gel của Carrageenan: Polysaccharid mạch thẳng chứa các đơn vị galactan-galactose mang nhóm este-sulfat ($15\text{–}40%$). Trong đó, $\kappa\text{-carrageenan}$ chuyển đổi cấu trúc từ cuộn sang xoắn kép và hình thành gel cứng khi có mặt của ion $\text{K}^+$, đồng thời có thể liên kết tĩnh điện với ion $\text{Ca}^{2+}$.
• Nguyên lý phối hợp polyme và chất độn: Quá trình đông khô (lyophilization) loại bỏ nước bằng sự thăng hoa ở nhiệt độ và áp suất thấp thường để lại các khoang rỗng làm vi nang bị co rút, xốp và hút ẩm mạnh. Tinh bột sắn được sử dụng làm chất độn (chất bảo vệ) lấp đầy các khoảng trống, gia cố độ bền cơ học và giảm hiện tượng hút ẩm của vi nang sau đông khô.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Nghiên cứu áp dụng các quy trình thực nghiệm được chuẩn hóa:

Quy trình thực nghiệm	Điều kiện và thông số kỹ thuật chi tiết
Tiệt khuẩn nhiệt ẩm	Áp dụng cho dụng cụ, môi trường và dung dịch polyme: Hấp tiệt trùng ở nhiệt độ $115^\circ\text{C}$ trong 20 phút hoặc $121^\circ\text{C}$ trong 20 phút (với môi trường MRS).
Tiệt khuẩn Tyndall	Áp dụng cho tinh bột sắn để tránh hồ hóa: Đun cách thủy ở $80^\circ\text{C}$ trong 1 giờ, sau đó ủ ấm $37^\circ\text{C}$ trong 24 giờ; lặp lại liên tục trong 3 ngày.
Nuôi cấy và thu sinh khối	Nuôi cấy L. acidophilus trong môi trường MRS lỏng ở $37^\circ\text{C}$, $5%\text{ CO}_2$ trong 24 giờ. Thu sinh khối tế bào bằng phương pháp ly tâm ở tốc độ 4000 vòng/phút trong 10 phút.
Nhỏ giọt đông tụ	Phân tán sinh khối vào hỗn dịch Alginat - Carrageenan (hoặc hỗn dịch có bổ sung tinh bột). Dùng pipet Pasteur (đường kính đầu nhỏ $\approx 2\text{ mm}$) nhỏ giọt vào dung dịch muối đông tụ ($CaCl_2\ 3%$ hoặc $KCl\ 3%$). Ngâm cố định hạt trong dung dịch 1 giờ, vớt và rửa lại bằng dung dịch $NaCl\ 0,9%$.
Đông khô (Lyophilization)	Tiền đông sâu ở $-80^\circ\text{C}$ trong 24 giờ; đông khô trên hệ thống Christ alpha (Đức) ở nhiệt độ buồng lạnh $-50^\circ\text{C}$, áp suất $0,100\text{ mbar}$ trong 24 giờ. Bảo quản mẫu ở $2\text{–}8^\circ\text{C}$.
Đánh giá độ rã và cấu trúc	Ủ $0,2\text{ g}$ vi nang trong $20\text{ ml}$ dịch dạ dày mô phỏng (SGF, pH 1,2) trong 1 giờ và dịch ruột mô phỏng (SIF, pH 6,8) trong 2 giờ; lắc ổn nhiệt ở $37^\circ\text{C}$, tốc độ 75 vòng/phút.
Định tính tinh bột rò rỉ	Nhỏ 2–3 giọt thuốc thử Lugol vào $10\text{ ml}$ dịch ủ SGF để phát hiện sự thất thoát tinh bột thông qua phản ứng tạo phức màu xanh tím đặc trưng.
Phá hạt và đếm CFU	Cân chính xác $0,20\text{ g}$ vi nang đông khô, hòa tan hoàn toàn trong $20\text{ ml}$ dung dịch Natri citrat 2% (kl/tt) bằng máy khuấy từ (400–500 vòng/phút). Pha loãng liên tục theo cơ số 10, cấy $10\ \mu\text{l}$ dịch lên đĩa thạch MRS, ủ $37^\circ\text{C}$, $5%\text{ CO}_2$ trong 48 giờ để đếm khuẩn lạc.

Số lượng vi sinh vật sống sót ($X$, đơn vị $\text{CFU/g}$) được tính theo công thức: $$X = \frac{A_n \times 10^n + A_{n+1} \times 10^{n+1} + A_{n+2} \times 10^{n+2}}{3 \times m \times V}$$ (Trong đó: $A_n$ là số khuẩn lạc trung bình ở độ pha loãng $10^n$; $m$ là khối lượng mẫu cân; $V$ là thể tích dịch cấy trải trên mỗi đĩa).

---

Nội dung chính theo từng chương

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

Chương 1 hệ thống hóa cơ sở lý luận về chế phẩm sinh học probiotic và kỹ thuật vi nang hóa:

• Đại cương về probiotic và loài Lactobacillus acidophilus: Trình bày lịch sử phát triển, vai trò đối với sức khỏe (cân bằng hệ vi sinh đường ruột, giảm cholesterol máu, ức chế vi khuẩn ngoại lai, chống dị ứng, chống viêm) và các sản phẩm trao đổi chất có giá trị sinh học như bacteriocin (nisin, pediocin), exopolysaccharid.
• Kỹ thuật vi nang hóa: Phân tích ưu nhược điểm của các dạng vi nang, nguyên lý phương pháp tách pha đông tụ đơn và phức. Phân tích ưu điểm của phương pháp nhỏ giọt đông tụ là quy trình đơn giản, ít gây tổn thương tế bào vi sinh vật nhưng nhược điểm là kích thước hạt tạo thành còn tương đối lớn ($2\text{–}5\text{ mm}$).
• Nguyên liệu sinh học: Trình bày cấu trúc hóa học, cơ chế tạo gel và tính chất lý hóa của Alginat và Carrageenan (các phân loại $\lambda, \iota, \kappa\text{-carrageenan}$). Tổng hợp các nghiên cứu trong và ngoài nước về sự tương tác giữa Alginat và Carrageenan, cho thấy tại Việt Nam nguồn rong sụn Kappaphycus alvarezii chứa hàm lượng cao Carrageenan chủ yếu mới dùng làm thực phẩm, chưa có công bố trong nước về hệ vi nang phối hợp Alginat - Carrageenan bao gói lợi khuẩn.

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương 2 mô tả chi tiết quy chuẩn thực nghiệm:

• Hóa chất và chủng giống: Sử dụng chủng Lactobacillus acidophilus ATCC 4356; Natri alginat, Carrageenan, tinh bột sắn, Glucose, Pepton, Cao thịt, Cao nấm men, Triamoni citrat, các muối khoáng ($\text{MgSO}_4, \text{MnSO}_4, \text{KH}_2\text{PO}_4, \text{NaCl}, \text{CaCl}_2, \text{KCl}$) và hệ đệm pha chế SGF (pH 1,2), SIF (pH 6,8).
• Môi trường nuôi cấy: Thành phần môi trường MRS lỏng gồm Glucose $20\text{ g}$, Pepton $10\text{ g}$, Cao thịt $10\text{ g}$, Cao nấm men $5\text{ g}$, Natri acetat $5\text{ g}$, Triamoni citrat $2\text{ g}$, $\text{KH}_2\text{PO}_4\ 2\text{ g}$, $\text{MgSO}_4\ 0,2\text{ g}$, $\text{MnSO}_4\ 0,05\text{ g}$, nước cất vừa đủ $1000\text{ ml}$ (pH 6,0). Môi trường MRS thạch bổ sung thêm $2%$ agar.
• Thiết bị nghiên cứu: Nồi hấp tiệt trùng ALP (Nhật Bản), tủ cấy vô trùng Sanyo (Nhật Bản), hệ thống đông khô Christ alpha (Đức), tủ âm sâu $-80^\circ\text{C}$ (LG), máy ly tâm Sartorius (Đức), máy lắc ổn nhiệt KWF (Trung Quốc).

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN

1. Khảo sát quá trình tạo vi nang phối hợp Alginat - Carrageenan

Tác giả tiến hành khảo sát khả năng tạo hạt vi nang với hai loại dung dịch muối đông tụ ở nồng độ cố định tổng polyme là $2,5%$ (kl/tt):

Khảo sát với dung dịch đông tụ $KCl\ 3%$:

• Các công thức khảo sát: Mẫu đối chứng C1 (Alginat $2,5%$), C2 (Carrageenan $2,5%$) và các mẫu phối hợp Carrageenan : Alginat gồm CA-K1 ($0,5% : 2,0%$), CA-K2 ($1,0% : 1,5%$), CA-K3 ($1,5% : 1,0%$), CA-K4 ($2,0% : 0,5%$).
• Kết quả: Mẫu C1 không tạo hạt; mẫu C2 và CA-K4 bị đông đặc ngay ở nhiệt độ phòng, không thể nhỏ giọt. Các mẫu CA-K1 tạo hạt kéo đuôi mềm; CA-K2 hạt cầu dẹt; CA-K3 hạt cầu đều và chắc.
• Bàn luận: Do chỉ có Carrageenan tạo gel với ion $\text{K}^+$, còn Alginat không tạo liên kết với $\text{K}^+$. Do đó, hạt hình thành bản chất chỉ là khung gel của Carrageenan đơn độc, không đạt được mục tiêu phối hợp cả hai polyme.

Khảo sát với dung dịch đông tụ $CaCl_2\ 3%$:

• Khảo sát các mẫu phối hợp Carrageenan : Alginat gồm CA-C1 ($0,5% : 2,0%$), CA-C2 ($1,0% : 1,5%$), CA-C3 ($1,5% : 1,0%$) và CA-C4 ($2,0% : 0,5%$).

Mẫu vi nang	Nồng độ Carrageenan	Nồng độ Alginat	Kết quả tạo hạt tươi	Hình thái vi nang sau đông khô
CA-C1	$0,5%$	$2,0%$	Hạt cầu đều, bề mặt nhẵn bóng, không kéo đuôi, tạo hạt nhanh.	Co rút thể tích, dúm dó dạng vảy xốp, hút ẩm mạnh, dính đĩa petri.
CA-C2	$1,0%$	$1,5%$	Hạt cầu đều, bề mặt nhẵn, kích thước đồng nhất.	Co rút thể tích, dạng vảy rỗng xốp, hút ẩm mạnh, dính đĩa petri.
CA-C3	$1,5%$	$1,0%$	Độ nhớt dung dịch cao, hạt tạo thành bị dẹt, kích thước hạt lớn.	Co rút thể tích, dạng vảy rỗng xốp, hút ẩm mạnh, dính đĩa petri.
CA-C4	$2,0%$	$0,5%$	Dung dịch quá đặc, đông tụ ngay trước khi nhỏ giọt, không tạo hạt.	Không thực hiện được.

• Đánh giá trong dịch tiêu hóa mô phỏng: Sau 1 giờ ủ trong SGF (pH 1,2), cả ba mẫu CA-C1, CA-C2, CA-C3 đều trương nở nhưng giữ nguyên vẹn cấu trúc, không nứt vỡ. Khi chuyển sang ủ trong SIF (pH 6,8), sau 15 phút bắt đầu xuất hiện vết nứt vỡ; sau 2 giờ hạt rã ra nhưng dịch vẫn còn các mảnh cấu trúc.

2. Bổ sung chất độn cải thiện thể chất vi nang

Nhằm khắc phục hiện tượng co rút thể tích và hút ẩm sau đông khô, tinh bột sắn được bổ sung vào công thức:

Khảo sát bước đầu với tinh bột $1%$ (kl/tt):

• Bổ sung $1%$ tinh bột vào các mẫu CA-C1, CA-C2, CA-C3 giúp hạt tươi có màu trắng đục đặc trưng. Sau đông khô, hạt giữ được hình dạng cầu, giảm co rút, giảm hút ẩm và có thể tách rời khỏi đĩa petri.
• Thử nghiệm rò rỉ tinh bột trong SGF (pH 1,2) sau 1 giờ kết hợp thuốc thử Lugol: Dịch ủ của mẫu CA-C1 và CA-C2 không đổi màu (âm tính - tinh bột không bị thất thoát); mẫu CA-C3 xuất hiện màu xanh tím ở đáy ống nghiệm (dương tính - có sự thất thoát tinh bột). Nguyên nhân do Carrageenan kém bền và phân hủy ở $\text{pH} < 5$, khi hàm lượng Carrageenan cao ($1,5%$) làm màng bao bị rò rỉ trong môi trường acid. Tác giả lựa chọn tỷ lệ CA-C2 để khảo sát tiếp theo.

Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ tinh bột ($0%\text{–}8%$ trên nền mẫu CA-C2):

Nồng độ tinh bột	Độ cầu của hạt	Thể chất vi nang sau đông khô
$0%$	$+$	Đồng nhất, dúm dó dạng vảy, xốp rỗng, hút ẩm mạnh, dính đĩa petri.
$1%$	$++$	Đồng nhất, hình cầu không đều, xốp, bề mặt nhăn, giảm hút ẩm, tách được khỏi đĩa.
$4%$	$+++$	Đồng nhất, hình cầu không đều, xốp, bề mặt bớt nhăn, không hút ẩm ở $2\text{–}8^\circ\text{C}$.
$6%$	$++++$	Đồng nhất, hình cầu tròn đều, xốp, bề mặt nhẵn mịn, hoàn toàn không hút ẩm.
$8%$	$++$	Đồng nhất, hình cầu không đều, bề mặt nhăn lại, không hút ẩm.

Bàn luận: Mẫu bổ sung $6%$ tinh bột cho thể chất cảm quan tốt nhất. Tuy nhiên, ở nồng độ $6%$, hỗn dịch có độ nhớt quá cao gây cản trở thao tác nhỏ giọt và kéo dài thời gian tạo hạt. Do đó, nồng độ tinh bột $1%$ được chọn để tiếp tục thử nghiệm bao gói vi khuẩn nhằm đảm bảo tính đồng nhất giữa các mẫu.

3. Đánh giá khả năng bao gói Lactobacillus acidophilus

Sau khi tạo vi nang phối hợp Alginat, Carrageenan và $1%$ tinh bột có chứa vi khuẩn, tiến hành đông khô và phá hạt để xác định mật độ vi khuẩn sống sót:

Mẫu vi nang phối hợp ($+ 1%\text{ tinh bột}$)	Mật độ vi sinh vật ($\text{CFU/g}$)	Mật độ vi sinh vật ($\log\text{ CFU/g}$)
CA-C1 ($0,5%\text{ Car} : 2,0%\text{ Alg}$)	$6,00 \times 10^6$	$6,78$
CA-C2 ($1,0%\text{ Car} : 1,5%\text{ Alg}$)	$4,50 \times 10^7$	$7,65$
CA-C3 ($1,5%\text{ Car} : 1,0%\text{ Alg}$)	$2,20 \times 10^8$	$8,34$

Nhận xét và bàn luận: Cả ba mẫu đều đạt tiêu chuẩn khuyến nghị của WHO/FAO về số lượng lợi khuẩn sống trong chế phẩm ($\ge 6\log\text{ CFU/g}$). Mật độ sống sót tăng dần từ CA-C1 đến CA-C3, được giải thích do sự tăng nồng độ Carrageenan làm tăng độ nhớt hỗn dịch, giúp hạn chế sự khuếch tán thất thoát của tế bào vi khuẩn ra dung dịch muối đông tụ trong quá trình nhỏ giọt.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính kèm số liệu thực nghiệm

1. Xác định tác nhân đông tụ: Chứng minh dung dịch $CaCl_2\ 3%$ là tác nhân đông tụ tạo gel phối hợp hiệu quả giữa Alginat và Carrageenan, trong khi dung dịch $KCl\ 3%$ chỉ tạo gel đơn độc với Carrageenan.
2. Xác định tỷ lệ polyme tạo hạt: Thiết lập được các tỷ lệ phối hợp Carrageenan : Alginat tạo được hạt hình cầu hoàn chỉnh trong $CaCl_2\ 3%$ là $1:4\ (0,5% : 2,0%)$, $2:3\ (1,0% : 1,5%)$ và $3:2\ (1,5% : 1,0%)$. Tỷ lệ $4:1$ bị đông đặc, không nhỏ giọt được.
3. Cải thiện thể chất sau đông khô: Việc bổ sung tinh bột sắn ($1%\text{–}8%$) giúp khắc phục hoàn toàn hiện tượng co rút dạng vảy và tính hút ẩm của vi nang Alginat - Carrageenan. Công thức $6%$ tinh bột cho hình thái cầu nhẵn mịn tối ưu; công thức $1%$ tinh bột đảm bảo độ nhớt phù hợp cho thao tác nhỏ giọt.
4. Hiệu quả bao gói vi khuẩn sống: Mật độ Lactobacillus acidophilus trong vi nang đông khô đạt từ $6,00 \times 10^6\text{ CFU/g}\ (6,78\log\text{ CFU/g})$ đến $2,20 \times 10^8\text{ CFU/g}\ (8,34\log\text{ CFU/g})$, đáp ứng yêu cầu số lượng vi sinh vật sống của chế phẩm probiotic.

Giải pháp và kiến nghị kỹ thuật

• Khuyến nghị sử dụng công thức phối hợp Carrageenan $1,0%$ và Alginat $1,5%$ (mẫu CA-C2) kết hợp tinh bột sắn để cân bằng giữa độ nhớt thao tác, độ bền cấu trúc trong môi trường acid dạ dày và hiệu quả bao gói vi sinh vật.
• Sử dụng phương pháp tiệt khuẩn gián đoạn Tyndall cho tinh bột nhằm ngăn chặn hiện tượng hồ hóa gây biến tính chất mang trước khi tạo nang.

Đóng góp về mặt học thuật và thực tiễn

• Khóa luận là công trình nghiên cứu thực nghiệm bước đầu tại Việt Nam khảo sát sự kết hợp giữa hai polyme nguồn gốc rong biển tự nhiên (Alginat và Carrageenan) để tạo hệ chất mang vi nang cố định probiotic.
• Cung cấp các thông số kỹ thuật thực nghiệm chi tiết về sự biến đổi thể chất, tương tác hóa lý và khả năng bảo vệ tế bào vi khuẩn trong suốt quá trình đông tụ ion và đông khô thăng hoa.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Các hạn chế ghi nhận từ thực nghiệm

• Phương pháp nhỏ giọt đông tụ thủ công bằng đầu pipet Pasteur ($2\text{ mm}$) tạo kích thước hạt tương đối lớn, khó ứng dụng trực tiếp để dập viên hoặc đóng nang cứng quy mô công nghiệp.
• Mẫu CA-C3 có hàm lượng Carrageenan cao ($1,5%$) bị rò rỉ tinh bột trong môi trường dịch dạ dày nhân tạo (SGF, pH 1,2) do Carrageenan kém bền trong môi trường acid mạnh.
• Khóa luận mới đánh giá sự biến đổi hình thái/độ rã và rò rỉ tinh bột trong SGF/SIF, chưa tiến hành định lượng tỷ lệ sống sót thực tế của vi khuẩn sau khi ủ qua các mốc thời gian trong dịch tiêu hóa mô phỏng.

Hướng nghiên cứu mở rộng

Tác giả đề xuất các hướng phát triển tiếp theo:

1. Đánh giá chi tiết khả năng bảo vệ vi sinh vật trong môi trường dịch dạ dày mô phỏng (SGF) và động học giải phóng vi sinh vật trong môi trường dịch ruột mô phỏng (SIF).
2. Nghiên cứu kỹ thuật bao đa lớp (ví dụ phủ thêm màng polyme ngoài) nhằm tăng cường độ bền cơ học và bảo vệ vi khuẩn tối ưu trong suốt hành trình qua đường tiêu hóa.

---

Giá trị tham khảo

Đối tượng thụ hưởng tài liệu

• Sinh viên và học viên chuyên ngành Dược học, Công nghệ sinh học Dược, Bào chế - Sinh dược học: Tài liệu tham khảo hữu ích về kỹ thuật vi nang hóa bằng phương pháp nhỏ giọt đông tụ ion và quy trình đông khô mẫu sinh học.
• Nhà nghiên cứu và phát triển sản phẩm (R&D) trong ngành Dược phẩm - Thực phẩm chức năng: Dữ liệu thực nghiệm hỗ trợ phát triển nguyên liệu probiotic dạng rắn từ nguồn polyme thiên nhiên tái tạo.

Các nội dung có giá trị ứng dụng cao

• Bảng tỷ lệ nồng độ phối hợp Alginat - Carrageenan và dung dịch muối đông tụ $CaCl_2\ 3%$.
• Quy trình tiệt khuẩn Tyndall cho tinh bột và quy trình phá hạt giải phóng vi sinh vật bằng Natri citrat $2%$ để đếm CFU chuẩn xác.
• Phương pháp luận đánh giá thể chất vi nang trước và sau đông khô khi bổ sung tá dược độn.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao dung dịch $KCl\ 3%$ không thể dùng để tạo vi nang phối hợp Alginat và Carrageenan?

Vì ion $\text{K}^+$ chỉ tương tác tạo gel cứng với $\kappa\text{-carrageenan}$, trong khi Alginat chỉ tạo liên kết phối trí với các cation hóa trị II (như $\text{Ca}^{2+}, \text{Ba}^{2+}$) mà không tạo gel với $\text{K}^+$. Do đó, khi nhỏ giọt vào $KCl\ 3%$, Alginat không tham gia vào mạng lưới gel, hạt thu được chỉ là gel Carrageenan đơn độc.

2. Nguyên nhân nào khiến vi nang sau đông khô không có tinh bột bị biến dạng dúm dó và dính đĩa?

Trong quá trình đông khô, các tinh thể nước đá thăng hoa trực tiếp từ thể rắn sang thể hơi dưới áp suất giảm ($0,100\text{ mbar}$), để lại các khoảng trống lớn trong cấu trúc hạt. Mạng lưới Alginat - Carrageenan không có chất độn nâng đỡ sẽ bị co rút thể tích tạo dạng vảy rỗng xốp, đồng thời cấu trúc này có tính hút ẩm rất mạnh làm hạt dính chặt vào đáy đĩa petri ở nhiệt độ bảo quản $2\text{–}8^\circ\text{C}$.

3. Tinh bột sắn đóng vai trò gì và nồng độ nào cho thể chất vi nang đông khô tốt nhất?

Tinh bột sắn đóng vai trò là chất độn gia cố cơ học, lấp đầy các khoảng trống do nước thăng hoa để lại, giúp hạt giữ được cấu trúc hình cầu và giảm tính hút ẩm. Khảo sát từ $0%\text{ đến }8%$ cho thấy nồng độ $6%$ tinh bột cho hạt vi nang có độ cầu đều nhất, bề mặt nhẵn mịn và không hút ẩm. Tuy nhiên, nồng độ $1%$ được chọn cho khảo sát vi sinh để tránh làm hỗn dịch quá đặc gây khó thao tác.

4. Mẫu vi nang CA-C3 có hiện tượng rò rỉ tinh bột trong môi trường dạ dày mô phỏng (SGF) do đâu?

Alginat có tính kháng acid tốt ở pH thấp, ngược lại Carrageenan kém bền và dễ bị thủy phân ở $\text{pH} < 5$. Ở mẫu CA-C3, nồng độ Carrageenan tăng lên ($1,5%$) và Alginat giảm xuống ($1,0%$), dẫn đến màng gel bị suy yếu trong SGF (pH 1,2), Carrageenan bị phân hủy tạo khe hở khiến tinh bột khuếch tán ra ngoài, làm dương tính với thuốc thử Lugol.

5. Số lượng vi khuẩn L. acidophilus sau đông khô trong các mẫu vi nang đạt được là bao nhiêu?

Mật độ vi khuẩn sống sót sau đông khô trong ba mẫu CA-C1, CA-C2, CA-C3 bổ sung $1%$ tinh bột lần lượt đạt $6,00 \times 10^6\text{ CFU/g}\ (6,78\log\text{ CFU/g})$, $4,50 \times 10^7\text{ CFU/g}\ (7,65\log\text{ CFU/g})$ và $2,20 \times 10^8\text{ CFU/g}\ (8,34\log\text{ CFU/g})$. Tất cả các mẫu đều vượt mức yêu cầu tối thiểu của WHO/FAO ($6\log\text{ CFU/g}$).

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ của tác giả Khổng Thị Ngọc Anh đã xây dựng thành công quy trình tạo nguyên liệu probiotic dạng vi nang phối hợp giữa Natri alginat và Carrageenan bằng phương pháp nhỏ giọt đông tụ trong dung dịch $CaCl_2\ 3%$. Việc bổ sung chất độn tinh bột sắn đã giải quyết hiệu quả nhược điểm co rút thể chất và hút ẩm sau quá trình đông khô. Chế phẩm vi nang tạo thành đảm bảo độ bền trong môi trường acid dạ dày nhân tạo và duy trì mật độ sống sót của Lactobacillus acidophilus đạt từ $6,78\text{ đến }8,34\log\text{ CFU/g}$, mở ra tiềm năng ứng dụng các nguồn polyme tự nhiên từ rong biển trong công nghệ bào chế men vi sinh.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Đại cương về Probiotic 1. Khái niệm và lịch sử về Probiotic Probiotic có nguồn gốc từ Hy Lạp và đã có nhiều định nghĩa khác nhau trong những năm qua. Theo nghĩa gốc, “biotic” xuất phát từ chữ “life” có nghĩa là đời sống và “pro” là thân thiện trong tiếng Hy Lạp, vì vậy có thể hiểu probiotic là “thân thiện với đời sống con người”.

Cho đến năm 1974, Parker sử dụng khái niệm “Các vi sinh vật và các chất góp phần cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột”. Định nghĩa này liên quan đến việc sử dụng men vi sinh đối với hệ vi sinh đường ruột nhưng bao gồm cả các chất nghĩa rộng như kháng sinh. Trong một nổ lực cải thiện định nghĩa, Fuller (1989) đã định nghĩa lại chế phẩm sinh học probiotic là “Một chất bố sung thức ăn có chứa vi sinh vật sống có ảnh hưởng có lợi đến vật chủ bằng cách cải thiện sự cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột của nó” [29]. Mặc dù thuật ngữ probiotic có liên quan đến chất bổ sung thức ăn chứa vi sinh vật mới chỉ được định nghĩa từ năm 1989 tuy nhiên lịch sử chứng minh rằng nó đã tồn tại từ hàng ngàn năm trước.

Những bức tranh trên tường có từ 2500 trước Công nguyên cho rằng người Sumari có thói quen dùng sữa lên men - đây được coi là thực phẩm đầu tiên có chứa vsv sống lên men [58]. Thuật ngừ Probiotic được Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và Tổ chức Nông lương Liên Hợp Quốc (FAO) đưa ra khái niệm hoàn chỉnh nhất năm 2002 như sau: “Probiotic là những vi sinh vật sống mà khi đưa vào cơ thể với một lượng lớn sẽ đem lại tác động có lợi cho sức khoe vật chủ” [30]. Khái niệm này được duy trì bởi Hiệp hội khoa học quốc tế về Probiotic và Prebiotic (ISAPP) và được sử dụng trong hầu hết các ấn phẩm khoa học. Vai trò của Probiotic với sức khỏe con người Probiotic được biết đến với định nghĩa “thân thiện với con người” bởi những lợi ích đáng kể đã được chứng minh.

Sự có mặt của probiotic trong đường tiêu hóa có tác dụng cạnh tranh, ức chế và loại trừ các vsv có hại trong đường ruột, duy trì cân bằng hệ vi sinh đường ruột [9]. Ngoài tiềm năng điều trị các bệnh lý đường tiêu hóa, Probiotic đã và đang được khai thác, nghiên cứu và phát triến nhờ một số tác động có lợi khác đến sức khoe con người. Giảm nồng độ cholesterol trong máu. Theo kết quả nghiên cứu của Pereira D.A và cộng sự, các sản phẩm chứa chủng probiotic thích hợp có khả năng làm hạ cholesterol máu do đó hỗ trợ ngăn ngừa nguy cơ tim mạch [54].

Trong đó, các loài 2 Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei và Bifidobacterium longum cũng đã được báo cáo là có tác dụng hạ mỡ máu [38]. Phòng ngừa và điều trị bệnh tiêu chảy. Theo nghiên cứu của Gill Harsharnjit s (2004), dùng đồng thời men vi sinh cho bệnh nhân đang điều trị kháng sinh bao gồm cả ngắn hạn và dài hạn làm giảm tỷ lệ mắc bệnh tiêu chảy do tác dụng phụ của kháng sinh [36]. Thử nghiệm hiệu quả phòng và điều trị tiêu chảy do kháng sinh đã được tiến hành trên các probiotic khác nhau bao gồm Lactobacillus rhamnosus GG, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus và nâm men [27].

Phòng ngừa bệnh lý tiết niệu - sinh dục: Mất cân bằng hệ vi sinh tại âm đạo và đường tiết niệu gây thay đối pH, tạo môi trường thuặn lợi cho sự sinh trưởng và phát triển của một số vsv gây bệnh - là yếu tố nguy cơ của bệnh lý nhiễm trùng đường tiết niệu và âm đạo. Các nghiên cứu bố sung Lactobacillus spp. nói riêng và sản phẩm probiotic nói chung đã được thực hiện chứng minh vai trò giúp cân bằng hệ vi sinh và cải thiện tình trạng bệnh lý [63]. Chống lại tác nhân gây bệnh: Trong điều kiện bình thường, probiotic có thể tổng họp các chất chuyển hóa có hoạt tính kháng khuẩn như: exopolysaccharid, bacteriocin và các acid hữu cơ.

Hơn nữa, probiotic cũng sử dụng cơ chế kết tụ tạo điều kiện cho việc đào thải mầm bệnh ra khỏi hệ tiêu hóa. Sự đối kháng cũng liên quan đến việc sản xuất acid acetic và acid lactic trong quá trình chuyển hóa carbohydrat, tạo điều kiện cho pH môi trường thấp hơn và ức chế sự phát triển của một số vi sinh vật gây bệnh [57]. Ngoài những lợi ích kế trên, probiotic cũng đang được chú trọng nghiên cứu và phát triển với một số mục tiêu khác như: chống viêm nhiễm đường tiêu hóa [56]; chống dị ứng [66]; chống béo phì; tăng cường hấp thu dinh dưỡng [34]. Loài Lactobacillus acidophilus Loài Lactobacillus acidophilus là một trong những loài vi sinh vật probiotic phổ biến nhất hiện nay, thuộc họ Lactobacillaceae, chi Lactobacillus, nhóm vi khuẩn sinh acid lactic (LAB), tồn tại trong đường tiêu hóa, âm đạo của người và động vật [11].

Đặc điếm hình thái: trực khuân hình que, kích thước 0,6-0,9x1,5-6,0 pm, Gram dương, tồn tại đơn lẻ hoặc xếp đôi hay chuỗi ngắn, không di động, không sinh bào tử, phản ứng catalase âm tính, có khả năng chuyển hóa đường lactose tạo ra sản phẩm L(+) lactic [70]. Anh dưới kính hiên vi điện tử b. Anh dưới kính hiên vi thường Hình 1.1: Vi khuân Lactobacillus acidophilus [46] Điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của Lactobacillus acidophilus là 37°c, tối đa trong khoảng 43 - 48 °C, không phát triển trong khoảng 20 - 22 °C, kỵ khí không bắt buộc, có khả năng chịu được điều kiện pH khoảng 5,0 đến 6,0 trong 24-36 giờ [11]. Tiềm năng của loài Lactobacillus acidophilus Hiện nay đã có nhiều sự quan tâm và nghiên cứu về vi khuẩn Lactic (Lactic acid bacteria, LAB) nói chung và loài Lactobacillus acidophilus nói riêng chỉ ra những tiềm năng lớn về các sản phấm lên men từ vsv này được áp dụng trong công nghiệp dược phẩm và thực phẩm.

Một số ứng dụng chính được nghiên cứu như sau: Sinh khối tạo chế phẩm probiotic đem lại nhiều tác động có lợi đối với sức khỏe: tạo môi trường acid thuận lợi cho hệ vi sinh đường ruột đồng thời ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh Gram (-); Cạnh tranh vị trí bám và thức ăn làm giảm số lượng vsv hoặc nấm gây hại ở ruột non [72]; Có khả năng sinh lactase - enzym thúc đẩy quá trình chuyển hóa sữa ở trẻ [31]. Các chất chuyển hóa thứ cấp có tiềm năng trong công nghiệp dược phẩm như: Exopolysaccharid có vai trò chống oxy hóa, kháng khuấn, kháng khối u, tăng cường miễn dịch là sản phẩm chuyển hóa của loài Lactobacillus acidophilus [44]. Sản phẩm trao đổi chất ngoại bào Bacteriocin phục vụ cho các mục đích khác nhau như cải thiện cấu trúc, mùi vị, bảo quản thực phấm cũng như có tác dụng đối với sức khỏe con người [33]. Nisin và pediocin là một số bacteriocin mang đặc tính kháng khuẩn, chống lại các vi khuẩn Gram (+) được sử dụng phổ biến làm chất bảo quản mang lại tiềm năng lớn trong công nghiệp thực phẩm.

Ngoài ra, bacteriocin được cho là đóng góp vào khả năng ức chế vi khuẩn gây hại, đây là một đặc tính quan trọng được áp dụng như giống khởi động trong thực phẩm lên men [19], [33]. Đại cương về vi nang probiotic 1. Khái niệm Vi nang (microcapsule) là những tiểu phân kết tụ hình cầu hoặc không xác định, thành phần gồm dược chất (hoặc dược chất và tá dược) được bao trong một màng 4 polyme thiên nhiên hoặc tông hợp; có kích thước trong khoảng từ 1 tới 5000 pm (trong thực tế thường điều chế vi nang trong khoảng 100 - 2000 pm) [4]. Vi nang chứa dược chât dang lỏng Vi nang nhiêu lớp vỏ Vi nang đa nhân Vi nang trong vi nang Hình 1.2: Các mô hình vi nang [4] ứng dụng quan điểm về vi nang, vi nang probiotic ra đời với nguyên tắc tạo vi nang kích thước nhở chứa một hoặc hỗn hợp polyme tạo vỏ và khối nhân là vsv probiotic nhằm bảo vệ vsv đồng thời giải phóng tại vị trí thích hợp trong đường tiêu hóa.

> Ưu điểm: Vi nang được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực bào chế thuốc nói chung và tạo hệ phân phối thuốc nói riêng nhờ những ưu điểm vượt trội: (i) Giúp phối họp các hoạt chất có tính tương kỵ bằng cách vi nang hóa từng loại hoạt chất trước khi phối hợp vào dạng thuốc; (ii) Tăng độ ổn định của hoạt chất do lớp bao giúp cách ly dược chất với những điều kiện bất lợi của môi trường; (iii) ứng dụng điều chế dạng giải phóng kéo dài, thuốc tác động tại đích, phóng thích có kiếm soát; (iv) Che giấu mùi vị của dược chất [4]. Từ quan điểm vi sinh học, vi nang probiotic bao gói vsv mang lại những lợi ích tương đương, có vai trò quan trọng nhằm bảo vệ và giải phóng vi sinh vặt tại vị trí thích họp trong đường tiêu hóa: (i) Vi nang probiotic cho phép thiết kế lõi kép bố sung đồng thời hai hoặc nhiều hơn các chúng vsv probiotic khác nhau. Nghiên cứu của Cheng Zhao và cộng sự (2020) đã khảo sát quá trình tạo men vi sinh dạng bào chế vi nang bao bọc Lactobacillus spp và Bacillus subtilis hỗ trợ bệnh lý Hội chứng chuyển hóa (MetS) nhằm bố sung hai loại vsv trên. Theo nghiên cứu, việc phối hợp đồng thời hai loài được cho rằng có sự tương hồ lẫn nhau tạo mối quan hệ cộng sinh có lợi giữa các lợi khuẩn: Bacillus subtilis tiêu thụ oxy, cung cấp môi trường khí thích hợp cho Lactobacillus thúc đẩy chức năng của men vi sinh [26].3: Vi nang kép và quá trình vận chuyên trong đường tiêu hóa [26] (ii) Lóp polyme tạo vỏ trong vi nang probiotic có cấu tạo như một màng bán thấm hình cầu giúp tế bào vsv được cách ly với môi trường xung quanh, bảo vệ và làm giảm sự tổn thất số lượng tế bào vsv, bằng cách này chúng sẽ được bảo vệ tốt hơn trong các điều kiện bất lợi như pH thấp, muối mật.

và chỉ giải phóng vsv tại vị trí mong muốn [45]. (iii) Nguyên liệu tạo vi nang mang các đặc điểm cấu trúc và tính chất vật lý, hóa học khác nhau là nguyên lý để nghiên cứu khả năng bao tan và giải phóng vsv tại vị trí đích trong đường tiêu hóa. (iv) Nguyên liệu thường là các polyme tự nhiên, an toàn và lành tính đối với người sử dụng.