Nghiên cứu Tạo Vi Nang Đa Nhân Chứa Lactobacillus plantarum

Nghiên cứu tạo vi nang đa nhân chứa Lactobacillus plantarum, mở ra tiềm năng ứng dụng probiotic. Tìm hiểu quy trình, kết quả và đánh giá khả năng bảo vệ vi sinh vật.

• Tác giả: Lưu Thị Thơ
• Người hướng dẫn: ThS. Lê Ngọc Khánh
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược sĩ
• Đề tài: Nghiên cứu Tạo Vi Nang Đa Nhân Chứa Lactobacillus Plantarum
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1.1. Đại cương về probiotic
• 1.1.1. Khái niệm probiotic
• 1.1.2. Các vi sinh vật probiotic phổ biến
• 1.1.3. Tác dụng và cơ chế tác dụng của probiotic
• 1.2. Vi khuẩn Lactobacillus plantarum
• 1.2.1. Đặc điểm hình thái, sinh lý, điều kiện nuôi cấy
• 1.2.2. Vai trò của Lactobacillus plantarum với sức khỏe con người
• 1.2.3. Xu hướng và tiềm năng mới về Lactobacillus plantarum
• 1.3. Đại cương về vi nang probiotic
• 1.3.1. Khái niệm
• 1.3.2. Nguyên liệu tạo vi nang
• 1.3.2.1. Alginat
• 1.3.2.2. Đặc điểm cấu trúc của Alginat
• 1.3.2.3. Cấu trúc gel Alginat với sự có mặt của ion Calci
• 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Nguyên liệu và thiết bị
• 2.1.1. Vi sinh vật
• 2.1.2. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ
• 2.1.3. Các môi trường sử dụng trong nghiên cứu
• 2.1.4. Các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu
• 2.2. Nội dung nghiên cứu
• 2.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của các thành phần trong công thức đến một số đặc tính của vi nang đa nhân
• 2.2.2. Đánh giá khả năng bảo vệ và giải phóng VSV của vi nang đa nhân tới vị trí đại tràng
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Phương pháp tiệt khuẩn
• 2.3.2. Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào
• 2.3.3. Phương pháp tạo vi nang theo nguyên lí tách pha đông tụ
• 2.3.4. Phương pháp đông khô
• 2.3.5. Phương pháp pha loãng liên tục xác định số lượng VSV
• 2.3.6. Phương pháp xác định số lượng VSV trong vi nang đông khô
• 2.3.7. Phương pháp đánh giá khả năng bảo vệ vi nang đa nhân trong môi trường dịch tiêu hóa mô phỏng
• 2.3.8. Phương pháp đánh giá khả năng giải phóng VSV trong môi trường đại tràng mô phỏng
• 2.3.9. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN
• 3.1. Khảo sát ảnh hưởng của các thành phần trong công thức đến một số đặc tính của vi nang đa nhân
• 3.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của tinh bột ở dịch bao gói đến một số đặc tính vi nang đa nhân
• 3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của Chitosan đến khả năng bảo vệ vi nang đa nhân trong điều kiện tiêu hóa mô phỏng
• 3.2. Đánh giá khả năng bảo vệ và giải phóng VSV của vi nang đa nhân tới vị trí đại tràng
• 3.2.1. Tạo vi nang đa nhân chứa VSV
• 3.2.2. Đánh giá khả năng giải phóng VSV của vi nang đa nhân trong môi trường đại tràng mô phỏng
• 3.2.3. So sánh khả năng bảo vệ và khả giải phóng VSV giữa vi nang đa nhân và vi nang thường
• KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Tóm tắt

I. Probiotic và Lactobacillus Plantarum Tổng Quan Quan Trọng

Trong bối cảnh sức khỏe đường ruột ngày càng được quan tâm, các sản phẩm probiotic hỗ trợ sức khỏe đã bùng nổ trên thị trường. Ngày càng có nhiều nghiên cứu khám phá ra những tác dụng có lợi mới của các vi sinh vật sống này. Đặc biệt, Lactobacillus Plantarum đã chứng minh được các tác động tích cực, bao gồm cải thiện khối u đại trực tràng, ngăn ngừa và điều trị bệnh viêm loét đại tràng, giảm tổn thương đường ruột và cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột. Tuy nhiên, để đạt được những tác động này, cần đảm bảo số lượng vi khuẩn sống sót đủ lớn khi đưa vào cơ thể. Các yếu tố như nhiệt độ, độ ẩm, áp suất trong quá trình chế biến và bảo quản, cũng như tác động của đường tiêu hóa, có thể làm giảm đáng kể số lượng vi khuẩn sống sót, làm giảm hiệu quả điều trị.

1.1. Khái Niệm và Tiêu Chuẩn Đánh Giá Probiotic Hiện Nay

Thuật ngữ probiotic có nghĩa là “dành cho sự sống”, dùng để chỉ các vi khuẩn có liên quan đến tác dụng có lợi cho con người và động vật. Tổ chức Nông lương Liên Hợp Quốc (FAO) và Tổ chức Y tế thế giới (WHO) định nghĩa probiotic là những vi sinh vật sống mà khi đưa vào cơ thể với một lượng lớn sẽ đem lại tác động có lợi cho sức khỏe vật chủ. Một vi sinh vật có tiềm năng là probiotic phải đáp ứng các tiêu chuẩn như: có nguồn gốc rõ ràng, không gây bệnh, có đặc tính probiotic, dễ nuôi cấy, ổn định trong bảo quản và có tỷ lệ sống sót cao. “Probiotic là những vi sinh vật sống mà khi đưa vào cơ thể với một lượng lớn sẽ đem lại tác động có lợi cho sức khỏe vật chủ” [31].

1.2. Tổng Hợp Các Vi Sinh Vật Probiotic Phổ Biến Nhất

Thị trường ngày càng chứng kiến sự gia tăng của các sản phẩm thực phẩm chứa probiotic với nhiều chủng đa dạng. Các chủng thường được thương mại hóa bao gồm Lactobacillus spp. (acidophilus, plantarum, reuterie, casei), Saccharomyces spp. (boulardii), và Bacillus spp. Mỗi chủng probiotic có những tác dụng cụ thể khác nhau, nhưng nhìn chung, chúng không chỉ có lợi trong việc điều chỉnh rối loạn hệ vi khuẩn đường ruột và sức khỏe tiêu hóa mà còn đóng vai trò phòng ngừa và điều trị bổ trợ các bệnh chuyển hóa, viêm đại tràng và ung thư đại trực tràng.

II. Thách Thức Bảo Vệ Probiotic Qua Môi Trường Tiêu Hóa

Các tác động có lợi của probiotic đối với sức khỏe chỉ đạt được khi chúng được đưa vào cơ thể với số lượng đủ lớn và còn sống sót. Quá trình chế biến, bảo quản và đặc biệt là môi trường khắc nghiệt của đường tiêu hóa (acid dạ dày, enzyme, muối mật) là những thách thức lớn đối với sự sống sót của vi sinh vật. Điều này đòi hỏi các phương pháp bảo vệ hiệu quả để đảm bảo probiotic đến được vị trí mong muốn trong đường ruột với số lượng đủ để phát huy tác dụng.

2.1. Tác Động Tiêu Cực Của Môi Trường Tiêu Hóa Đến Probiotic

Môi trường đường tiêu hóa là một rào cản lớn đối với sự thành công của probiotic. Việc duy trì khả năng sống sót trong dạ dày là một thách thức vì hầu hết các chế phẩm sinh học đều chết hoặc mất chức năng ở môi trường acid. Đồng thời, trong quá trình sản xuất và bảo quản, probiotic còn có thể bị ảnh hưởng tiêu cực bởi các yếu tố như nhiệt độ, hoạt độ nước và các thành phần thực phẩm khác. Cần có một hệ thống phân phối probiotic lý tưởng để bảo vệ chúng khỏi các điều kiện bất lợi [37].

2.2. Yêu Cầu Đối Với Hệ Thống Phân Phối Probiotic Lý Tưởng

Một hệ thống phân phối probiotic lý tưởng cần bảo vệ probiotic khỏi các điều kiện bất lợi trong quá trình sản xuất, bảo quản và trong môi trường acid dạ dày. Hệ thống này phải đảm bảo đủ lượng men vi sinh đạt đến vị trí tác dụng. Cần xây dựng công thức vi khuẩn probiotic trong phạm vi 108–109 CFU/g để tiêu thụ và duy trì hiệu quả điều trị là 106 –107 CFU/g ở ruột [45].

III. Tạo Vi Nang Đa Nhân Giải Pháp Bảo Vệ Probiotic Tối Ưu

Phương pháp tạo vi nang đa nhân nổi lên như một giải pháp tiềm năng để bảo vệ probiotic khỏi các tác động bất lợi của môi trường tiêu hóa. Vi nang đa nhân có khả năng bao bọc và giải phóng hoạt chất tốt hơn so với vi nang thông thường, giúp tăng cường khả năng sống sót của probiotic khi đi qua dạ dày và giải phóng chúng tại vị trí thích hợp trong ruột.

3.1. Vi Nang Đa Nhân Là Gì Ưu Điểm So Với Vi Nang Thông Thường

Vi nang là những tiểu phân kết tụ hình cầu hoặc không xác định, thành phần gồm dược chất được bao trong một màng polyme. Vi nang đa nhân là vi nang chứa nhiều nhân bên trong, giúp tăng cường khả năng bảo vệ và giải phóng hoạt chất. So với vi nang thông thường, vi nang đa nhân có khả năng bảo vệ probiotic tốt hơn khỏi acid dạ dày và các enzyme tiêu hóa, đồng thời giúp giải phóng probiotic một cách kiểm soát tại vị trí mong muốn trong ruột.

3.2. Vật Liệu Tiềm Năng Cho Tạo Vi Nang Alginate và Chitosan

Alginate và Chitosan là hai vật liệu phổ biến được sử dụng để tạo vi nang. Alginate, chiết xuất từ tảo biển nâu, có khả năng tạo gel thông qua liên kết ngang ion với các cation hóa trị II như Ca2+. Chitosan, có nguồn gốc từ chitin, có đặc tính kháng khuẩn và khả năng bám dính vào niêm mạc ruột, giúp tăng cường sự sống sót và hiệu quả của probiotic. Việc kết hợp cả hai vật liệu này có thể tạo ra vi nang với khả năng bảo vệ và giải phóng probiotic tối ưu.

IV. Nghiên Cứu Tạo Vi Nang Đa Nhân Chứa Lactobacillus Plantarum

Nghiên cứu này tập trung vào việc tạo vi nang đa nhân chứa Lactobacillus Plantarum và đánh giá khả năng bảo vệ và giải phóng vi sinh vật này tới vị trí đại tràng. Mục tiêu là khảo sát ảnh hưởng của các thành phần cấu tạo đến đặc tính vi nang đa nhân và đánh giá khả năng bảo vệ và giải phóng vi sinh vật của vi nang đa nhân chứa Lactobacillus Plantarum tới vị trí đại tràng. Nghiên cứu đã sử dụng các phương pháp tạo vi nang theo nguyên lý tách pha đông tụ và đánh giá khả năng bảo vệ trong môi trường dịch tiêu hóa mô phỏng và khả năng giải phóng trong môi trường đại tràng mô phỏng.

4.1. Phương Pháp Tạo Vi Nang Đa Nhân Chứa Lactobacillus Plantarum

Nghiên cứu sử dụng phương pháp tạo vi nang theo nguyên lý tách pha đông tụ. Quá trình bao gồm các bước: chuẩn bị hỗn dịch tế bào Lactobacillus Plantarum, tạo vi nang bằng cách nhỏ giọt dung dịch alginate chứa tế bào vào dung dịch CaCl2 để tạo gel, và sau đó phủ lớp chitosan lên bề mặt vi nang. Các vi nang sau đó được đông khô để bảo quản.

4.2. Đánh Giá Khả Năng Bảo Vệ và Giải Phóng VSV Của Vi Nang

Khả năng bảo vệ vi nang đa nhân được đánh giá trong môi trường dịch tiêu hóa mô phỏng (dạ dày và ruột non). Khả năng giải phóng vi sinh vật được đánh giá trong môi trường đại tràng mô phỏng. Số lượng vi sinh vật sống sót sau các giai đoạn này được xác định bằng phương pháp pha loãng liên tục và đếm khuẩn lạc. So sánh khả năng sống sót và giải phóng VSV giữa vi nang đa nhân và vi nang thường.

V. Kết Quả Vi Nang Đa Nhân Bảo Vệ Giải Phóng Probiotic Tối Ưu

Nghiên cứu cho thấy vi nang đa nhân có khả năng bảo vệ Lactobacillus Plantarum tốt hơn so với vi nang thông thường trong môi trường dịch tiêu hóa mô phỏng. Các thành phần trong công thức, đặc biệt là sự hiện diện của chitosan, đóng vai trò quan trọng trong việc tăng cường khả năng bảo vệ. Vi nang đa nhân cũng cho thấy khả năng giải phóng vi sinh vật một cách hiệu quả trong môi trường đại tràng mô phỏng.

5.1. Ảnh Hưởng Của Tinh Bột và Chitosan Đến Đặc Tính Vi Nang

Nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của tinh bột ở dịch bao gói và Chitosan đến một số đặc tính vi nang đa nhân. Kết quả cho thấy việc sử dụng tinh bột hồ hóa và bổ sung Chitosan giúp tăng cường khả năng bảo vệ vi nang đa nhân trong điều kiện tiêu hóa mô phỏng. Khả năng giữ cấu trúc của một số mẫu vi nang đa nhân trong dịch tiêu hóa mô phỏng cũng được đánh giá.

5.2. So Sánh Khả Năng Bảo Vệ Giữa Vi Nang Đa Nhân và Vi Nang Thường

So sánh số lượng VSV bao gói trong vi nang đa nhân và vi nang thường sau đông khô cho thấy vi nang đa nhân bảo vệ VSV tốt hơn. Nghiên cứu cũng so sánh khả năng giải phóng VSV ở môi trường đại tràng mô phỏng của các mẫu vi nang đa nhân và vi nang thường, kết quả cho thấy vi nang đa nhân giải phóng VSV hiệu quả hơn.

VI. Tương Lai Ứng Dụng và Nghiên Cứu Tiếp Theo Về Probiotic

Nghiên cứu này mở ra tiềm năng ứng dụng rộng rãi của vi nang đa nhân chứa Lactobacillus Plantarum trong các sản phẩm thực phẩm chức năng và dược phẩm. Các nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào việc tối ưu hóa công thức và quy trình tạo vi nang, đánh giá hiệu quả lâm sàng của sản phẩm trên người, và khám phá các ứng dụng mới của vi nang probiotic trong điều trị các bệnh liên quan đến đường ruột.

6.1. Triển Vọng Ứng Dụng Vi Nang Probiotic Trong Thực Phẩm

Việc ứng dụng vi nang probiotic trong thực phẩm chức năng mở ra tiềm năng lớn trong việc cải thiện sức khỏe đường ruột cho người tiêu dùng. Các sản phẩm như sữa chua, đồ uống, bánh kẹo có thể được bổ sung vi nang probiotic để tăng cường lợi ích sức khỏe. Nghiên cứu cần tiếp tục đánh giá tính ổn định của vi nang trong các sản phẩm thực phẩm khác nhau.

6.2. Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo Về Hệ Thống Phân Phối Probiotic

Các hướng nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào việc phát triển các hệ thống phân phối probiotic tiên tiến hơn, chẳng hạn như sử dụng các vật liệu polyme có khả năng phản ứng với môi trường ruột để giải phóng probiotic một cách chính xác tại vị trí mong muốn. Nghiên cứu cũng nên khám phá các phương pháp tạo vi nang với kích thước nhỏ hơn và khả năng bám dính vào niêm mạc ruột tốt hơn để tăng cường hiệu quả của probiotic.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trong lĩnh vực chăm sóc sức khỏe, các chế phẩm men vi sinh (probiotic) ngày càng được ứng dụng rộng rãi nhờ khả năng cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, hỗ trợ điều hòa miễn dịch và cải thiện các bệnh lý tiêu hóa. Đối với loài Lactobacillus plantarum, nhiều công bố khoa học gần đây đã chứng minh vai trò sinh học quan trọng của vi khuẩn này trong việc cải thiện các bệnh lý liên quan đến đại trực tràng, bao gồm việc ức chế khối u đại trực tràng, giảm viêm loét đại tràng, củng cố hàng rào biểu mô ruột và phục hồi hệ vi sinh có lợi.

Tuy nhiên, hiệu quả sinh học của probiotic chỉ đạt được khi lượng vi khuẩn sống sót đưa vào cơ thể đạt ngưỡng tối thiểu từ $10^8 - 10^9\text{ CFU/g}$ để duy trì mật độ điều trị từ $10^6 - 10^7\text{ CFU/g}$ tại vị trí tác dụng trong đường ruột (theo khuyến cáo của FAO/WHO). Trong thực tế, các yếu tố bất lợi từ quá trình sản xuất (nhiệt độ, áp suất, độ ẩm) và đặc biệt là môi trường acid khắc nghiệt tại dạ dày (pH thấp) cùng hệ enzyme tiêu hóa làm suy giảm nghiêm trọng tỷ lệ sống sót của tế bào vi khuẩn tự do trước khi đến được đại tràng. Để giải quyết rào cản này, việc ứng dụng kỹ thuật tạo vi nang đa nhân (polynuclear microcapsule) phân tán các nhân con chứa lợi khuẩn vào trong một ma trận bao ngoài nhiều lớp giúp tăng cường bảo vệ và kiểm soát giải phóng vi sinh vật hướng đích.

Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ với đề tài "Nghiên cứu tạo vi nang đa nhân chứa Lactobacillus plantarum" của tác giả Lưu Thị Thơ được thực hiện nhằm giải quyết 2 mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

1. Khảo sát ảnh hưởng các thành phần cấu tạo đến đặc tính vi nang đa nhân.
2. Đánh giá khả năng bảo vệ và giải phóng vi sinh vật của vi nang đa nhân chứa Lactobacillus plantarum tới vị trí đại tràng.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum do Bộ môn Công nghệ sinh học Dược cung cấp; các tá dược tạo màng bao gồm Natri alginat, tinh bột (dạng thường và dạng hồ hóa), Chitosan, Calci clorid và các môi trường nuôi cấy, môi trường tiêu hóa mô phỏng.
• Phạm vi nghiên cứu: Thực nghiệm bào chế và đánh giá in vitro tại Bộ môn Công nghệ sinh học Dược – Khoa Công nghệ sinh học – Trường Đại học Dược Hà Nội; tập trung vào khảo sát các thông số tạo vi nang, đánh giá hình thái thể chất sau đông khô, độ rã và mật độ vi sinh vật sống sót qua 3 giai đoạn dịch tiêu hóa mô phỏng (dạ dày pH 2,5 trong 2 giờ; dịch ruột pH 6,8 trong 4 giờ; dịch đại tràng pH 7,4 trong 3 giờ).

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và nguyên lý vật liệu bao gói

Nghiên cứu ứng dụng các nguyên lý tạo phức và liên kết chéo của các polymer tự nhiên tương thích sinh học:

• Alginat: Polysaccharide tự nhiên gồm các đơn vị acid $\beta$-D-mannuronic (M) và acid $\alpha$-L-guluronic (G). Khi tiếp xúc với cation hóa trị hai ($\text{Ca}^{2+}$), các nhóm carboxylate ($-\text{COO}^-$) của đơn vị guluronat tạo liên kết ngang ion tạo thành mạng lưới hydrogel theo mô hình "vỉ trứng" (egg-box model), bẫy giữ vi sinh vật bên trong.
• Chitosan: Polycation mạch thẳng tích điện dương, tạo phức liên kết tĩnh điện bề mặt với polyanion Alginat tích điện âm. Lớp màng bán thấm tạo thành giữa Alginat và Chitosan làm giảm tính thấm của dịch acid dạ dày và hạn chế sự khuếch tán ion $\text{H}^+$ vào bên trong nhân vi nang.
• Tinh bột (dạng thường và dạng hồ hóa): Đóng vai trò chất độn củng cố cấu trúc gel Alginat, lấp đầy các lỗ xốp, tăng cường độ bền cơ học và hạn chế hiện tượng co ngót, sụp đổ mạng gel trong quá trình đông khô.
• Mô hình vi nang đa nhân: Cấu trúc phân tán nhiều vi nang nhân nhỏ (chứa tế bào vi khuẩn) bên trong một khối gel Alginat - tinh bột lớn hơn và được bao phủ bởi lớp màng Chitosan bên ngoài, tạo nên hàng rào bảo vệ kép.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

• Phương pháp tiệt khuẩn: Tiệt khuẩn nhiệt ẩm bằng nồi hấp ở nhiệt độ $115^\circ\text{C}$ trong 20 phút đối với dụng cụ, môi trường nuôi cấy và các dung dịch polymer.
• Phương pháp nuôi cấy và thu sinh khối tế bào: Hoạt hóa và nhân giống L. plantarum trong môi trường MRS lỏng ở $37^\circ\text{C}$, $5%\text{ CO}_2$ trong 24 giờ. Thu sinh khối vi khuẩn bằng phương pháp ly tâm ở tốc độ 4000 vòng/phút trong 10 phút.
• Phương pháp tạo vi nang theo nguyên lý tách pha đông tụ ion:
  • Tạo vi nang nhân: Phối trộn sinh khối vi khuẩn vào hỗn hợp Natri alginat 3% - tinh bột hồ hóa 5%, đùn qua kim tiêm $25\text{G}\times 1"$ vào dung dịch $\text{CaCl}_2\text{ 2%}$, ngâm 30 phút để gel hóa hoàn toàn, rửa nước cất và ngâm tiếp trong dung dịch Chitosan 0,4% trong 30 phút.
  • Tạo vi nang đa nhân: Phân tán các vi nang nhân vào dịch bao gói (Natri alginat 3% kết hợp tinh bột theo tỷ lệ thể tích 1:5), đùn qua xylanh 50 ml (đầu nhỏ giọt khoảng 4 mm) vào dung dịch $\text{CaCl}_2\text{ 2%}$ (ngâm 30 phút), sau đó vớt ra và ngâm phủ tiếp trong dung dịch Chitosan ở các nồng độ khảo sát ($0,4% - 3%$) trong 30 phút kết hợp khuấy từ.
  • Tạo vi nang thường (đối chứng): Đùn trực tiếp hỗn dịch Alginat 3% - tinh bột hồ hóa 3% chứa sinh khối qua xylanh 50 ml vào $\text{CaCl}_2\text{ 2%}$, sau đó phủ Chitosan.
• Phương pháp đông khô: Tiền đông mẫu ở $-70^\circ\text{C}$ trong 24 giờ trong tủ âm sâu, tiếp tục làm khô trong máy đông khô ở nhiệt độ $-50^\circ\text{C}$, áp suất 0,100 mbar trong 24 giờ.
• Phương pháp phá vi nang và định lượng vi sinh vật sống: Hòa tan 0,20 g vi nang đông khô vào 20 ml dung dịch Natri citrat 2% trên máy khuấy từ ($400 - 500\text{ vòng/phút}$) để giải phóng hoàn toàn vi khuẩn. Tiến hành pha loãng bậc 10 liên tục trong nước cất tiệt khuẩn, cấy trải $10\ \mu\text{l}$ dịch lên bề mặt đĩa thạch MRS, ủ ở $37^\circ\text{C}$, $5%\text{ CO}_2$ trong 24 giờ, đếm khuẩn lạc và tính mật độ vi sinh vật theo đơn vị $\log\text{ CFU/g}$.
• Phương pháp đánh giá in vitro trong môi trường dịch tiêu hóa mô phỏng: Ủ 0,20 g vi nang đông khô tuần tự qua:
  1. Dịch dạ dày mô phỏng ($\text{pH } 2,5$) trong 2 giờ;
  2. Dịch ruột mô phỏng ($\text{pH } 6,8$) trong 4 giờ;
  3. Dịch đại tràng mô phỏng ($\text{pH } 7,4$) trong 3 giờ. Quá trình thử nghiệm diễn ra trong máy lắc ổn nhiệt ở $37^\circ\text{C}$, tốc độ lắc 75 vòng/phút. Sau mỗi giai đoạn, đánh giá hình thái, độ rã của vi nang và xác định số lượng vi sinh vật sống sót giải phóng ra môi trường.
• Phương pháp xử lý số liệu: Thống kê và tính toán giá trị trung bình ($\bar{x}$) cùng độ lệch chuẩn ($\text{SD}$) trên phần mềm Microsoft Excel với công thức $\bar{x} = \text{AVERAGE}(\log A)$ và $\text{SD} = \text{STDEVA}(\log A)$.

---

Nội dung chính theo từng chương

Tổng quan

Chương 1 tổng hợp các cơ sở lý luận về probiotic và vi khuẩn Lactobacillus plantarum. Văn bản trình bày chi tiết về phân loại học, đặc điểm hình thái học (dạng trực khuẩn, Gram dương, không sinh bào tử, kỵ khí không bắt buộc, sinh trưởng mạnh trên môi trường MRS) và tiềm năng y dược học mới của L. plantarum trong việc cải thiện các bệnh lý đường tiêu hóa như hội chứng ruột kích thích (IBS), viêm đại tràng và ung thư đại trực tràng (CRC) thông qua việc sản sinh acid indole-3-lactic kích thích đáp ứng miễn dịch tế bào $\text{T CD8}^+$.

Chương này cũng phân tích các hệ phân phối bảo vệ probiotic, cấu trúc và tính chất của Alginat, Chitosan, tinh bột, đồng thời điểm luận các nghiên cứu tạo vi nang đa nhân trên thế giới và tại Việt Nam (như nghiên cứu hạt Alginat vi nang đa nhân của Zhang và cộng sự năm 2023, kỹ thuật phun điện nạp nhũ tương kép của Karakas và cộng sự năm 2023, và nghiên cứu vi nang đa nhân Saccharomyces boulardii của Mai Thị Linh năm 2021).

Nguyên liệu, thiết bị, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả toàn bộ danh mục hóa chất đạt tiêu chuẩn Dược dụng/Tinh khiết hóa học, các thiết bị chính (máy đông khô Christ Alpha, tủ âm sâu $-80^\circ\text{C}$, tủ ấm $\text{CO}_2$ Sanyo, máy ly tâm Sartorius) và thành phần các môi trường (MRS lỏng, MRS thạch, các dung dịch mô phỏng dạ dày $\text{pH } 2,5$, dịch ruột $\text{pH } 6,8$, dịch đại tràng $\text{pH } 7,4$). Chương này thiết lập chi tiết quy trình thực nghiệm gồm 2 nội dung lớn: khảo sát công thức tạo vỏ vi nang và đánh giá khả năng bảo vệ, giải phóng vi khuẩn tại đại tràng mô phỏng.

Thực nghiệm, kết quả, bàn luận

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm thu được từ quá trình khảo sát công thức và đánh giá sinh học in vitro:

1. Khảo sát ảnh hưởng của các thành phần trong công thức đến đặc tính vi nang đa nhân

• Ảnh hưởng của tinh bột ở dịch bao gói: Khảo sát tinh bột không hồ hóa (TB 1%, 3%, 5%) và tinh bột hồ hóa (TBHH 1%, 3%, 5%) trong dịch bao Alginat 3%:
  • Khi nồng độ tinh bột thấp (1%), độ nhớt dịch bao thấp làm các nhân con bị lắng xuống đáy đầu đùn, vi nang đa nhân tạo thành không chứa đều nhân con (mẫu TB1).
  • Khi nồng độ tinh bột quá cao (5%), độ nhớt quá lớn khiến dịch bao bị kéo đuôi hình giọt nước, gây khó khăn cho thao tác tạo hạt (mẫu TB3, TBHH3).
  • Các mẫu TB2, TBHH1, TBHH2 cho vi nang hình cầu đồng đều, dễ đùn.
  • Sau đông khô, mẫu chứa tinh bột hồ hóa 3% (A1-TBHH2) hạn chế tối đa hiện tượng co ngót, giữ được độ xốp và độ cầu tốt hơn so với tinh bột không hồ hóa nhờ khả năng liên kết hydro đồng nhất với Alginat.
  • Trong dịch tiêu hóa mô phỏng, mẫu TBHH2 duy trì cấu trúc tốt hơn trong dịch ruột $\text{pH } 6,8$ (bắt đầu nứt sau 1,5 giờ và rã sau 3 giờ) so với mẫu TB2 (rã hoàn toàn sau 1 giờ) và TBHH1.

Mẫu khảo sát	Đặc điểm tạo hạt và thể chất vi nang tươi	Khả năng giữ cấu trúc trong dịch ruột mô phỏng (pH 6,8)
TB1 (TB 1%)	Nhân con sa lắng, vi nang không chứa nhân con	-
TB2 (TB 3%)	Hạt cầu đẹp, dễ đùn, kích thước đồng đều	Rã vỏ sau 30 phút, nhân con rã hoàn toàn sau 1 giờ
TB3 (TB 5%)	Độ nhớt cao, xuất hiện đuôi giọt nước	-
TBHH1 (TBHH 1%)	Hạt cầu đều, nhân phân tán tốt, dễ đùn	Rã vỏ sau 1 giờ, nhân con rã hoàn toàn sau 2 giờ
TBHH2 (TBHH 3%)	Hạt cầu đẹp, thao tác dễ dàng, đồng nhất	Nứt sau 1,5 giờ, rã thành mảng lớn sau 3 giờ
TBHH3 (TBHH 5%)	Kéo đuôi thành chuỗi dài, khó kiểm soát	-

• Ảnh hưởng của lớp phủ Chitosan: Khảo sát các nồng độ Chitosan 0,4%, 1%, 2%, 3% (ký hiệu TBHH2-C0,4 đến TBHH2-C3):
  • Sau 2 giờ trong dịch dạ dày mô phỏng ($\text{pH } 2,5$), tất cả các mẫu đều không rã và chỉ trương nở nhẹ.
  • Sau 4 giờ trong dịch ruột mô phỏng ($\text{pH } 6,8$): Mẫu TBHH2-C0,4 bị rã hoàn toàn; mẫu TBHH2-C1 rã hết vỏ ngoài và bộc lộ nhân con; mẫu TBHH2-C2 rã một phần vỏ ngoài; mẫu TBHH2-C3 giữ nguyên vẹn hình thái vi nang. Do đó, các mẫu TBHH2-C1, C2, C3 đều bảo vệ được nhân con chứa vi khuẩn đưa tới đại tràng.

2. Đánh giá khả năng bảo vệ và giải phóng vi sinh vật tới đại tràng

• Số lượng vi sinh vật bao gói sau đông khô: Sinh khối nuôi cấy ban đầu đạt khoảng $10\log\text{ CFU/g}$. Sau khi tạo vi nang đa nhân và đông khô, số lượng tế bào sống sót trong các mẫu đạt:
  • TBHH2-C1: $8,59 \pm 0,06\log\text{ CFU/g}$
  • TBHH2-C2: $8,72\log\text{ CFU/g}$
  • TBHH2-C3: $8,67\log\text{ CFU/g}$
• Khả năng giải phóng tại đại tràng mô phỏng: Sau khi đi qua liên hoàn dịch dạ dày (2 giờ), dịch ruột (4 giờ) và chuyển sang dịch đại tràng (3 giờ), số lượng vi khuẩn sống sót giải phóng ra môi trường đạt:
  • TBHH2-C1: $6,63\log\text{ CFU/g}$
  • TBHH2-C2: $7,04\log\text{ CFU/g}$
  • TBHH2-C3: $7,30\log\text{ CFU/g}$ Tất cả các mẫu vi nang đa nhân đều đáp ứng tiêu chuẩn của FAO/WHO ($> 6 - 7\log\text{ CFU/g}$).
• So sánh vi nang đa nhân và vi nang thường (đơn lớp):
  • Mẫu vi nang thường SS1 (phủ Chitosan 1%) bị rã hoàn toàn ở dịch ruột, không thu nhận được mẫu tại đại tràng.
  • Các mẫu vi nang thường SS2 và SS3 khi tới đại tràng chỉ giải phóng lần lượt $5,32\log\text{ CFU/g}$ và $5,76\log\text{ CFU/g}$ (thấp hơn ngưỡng yêu cầu điều trị).
  • Vi nang đa nhân (TBHH2-C2 và TBHH2-C3) vượt trội hơn hẳn dạng vi nang thường nhờ cấu trúc màng kép bảo vệ nhân con khỏi sự trao đổi ion giữa $\text{Ca}^{2+}$ và $\text{H}^+$, ngăn chặn rò rỉ vi khuẩn trong môi trường acid dạ dày.

Kết luận và đề xuất

Chương 4 đúc kết các kết luận thực nghiệm về công thức tối ưu và đề xuất các nội dung nghiên cứu mở rộng trong tương lai.

---

Kết quả và đóng góp

Bảng tổng hợp số liệu thực nghiệm chính

Mẫu nghiên cứu	Loại vi nang	Nồng độ Chitosan vỏ ngoài (%)	Số lượng VSV sau đông khô ($\log\text{ CFU/g}$)	Số lượng VSV giải phóng tại đại tràng ($\log\text{ CFU/g}$)	Đánh giá khả năng đáp ứng ngưỡng FAO/WHO ($>6\log\text{ CFU/g}$)
TBHH2-C1	Đa nhân	1,0%	$8,59 \pm 0,06$	6,63	Đạt
TBHH2-C2	Đa nhân	2,0%	8,72	7,04	Đạt
TBHH2-C3	Đa nhân	3,0%	8,67	7,30	Đạt
SS1	Thường (đơn lớp)	1,0%	$7,76 \pm 0,10$	Không xác định (bị rã ở ruột)	Không đạt
SS2	Thường (đơn lớp)	2,0%	$8,1 - 8,2$	5,32	Không đạt
SS3	Thường (đơn lớp)	3,0%	$8,1 - 8,2$	5,76	Không đạt

Đóng góp của đề tài

• Đóng góp kỹ thuật: Xây dựng thành công công thức và quy trình bào chế vi nang đa nhân bảo vệ Lactobacillus plantarum bằng phương pháp tách pha đông tụ ion kết hợp đông khô với thành phần:
  • Nhân con: Natri alginat 3% – tinh bột hồ hóa 5% – sinh khối vi khuẩn, gel hóa với $\text{CaCl}_2\text{ 2%}$ và phủ Chitosan 0,4%.
  • Dịch bao ngoài: Natri alginat 3% – tinh bột hồ hóa 3%, gel hóa với $\text{CaCl}_2\text{ 2%}$ và phủ Chitosan nồng độ $1% - 3%$.
• Đóng góp khoa học: Chứng minh được tính ưu việt của cấu trúc vi nang đa nhân so với vi nang đơn lớp truyền thống trong việc bảo vệ tế bào vi khuẩn sống sót qua môi trường acid dạ dày và dịch ruột, giải phóng lượng vi khuẩn sống tại đại tràng đạt trên $7\log\text{ CFU/g}$, mở ra tiềm năng ứng dụng sản xuất chế phẩm probiotic giải phóng kéo dài hướng đích đại tràng.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận đã thẳng thắn chỉ ra các giới hạn nghiên cứu do điều kiện thời gian và đề xuất các hướng triển khai tiếp theo:

• Hạn chế:
  • Chưa tiến hành theo dõi độ ổn định và tỷ lệ sống sót của vi sinh vật trong vi nang đa nhân theo thời gian bảo quản dài hạn ở các điều kiện nhiệt độ, độ ẩm khác nhau.
  • Các môi trường tiêu hóa mô phỏng in vitro mới chỉ thiết lập theo giá trị pH và hệ đệm, chưa bổ sung đầy đủ các enzyme tiêu hóa (như pepsin, pancreatin) và muối mật để mô phỏng sát thực tế sinh lý đường tiêu hóa.
• Hướng nghiên cứu tiếp theo:
  • Theo dõi độ ổn định của vi nang đa nhân trong quá trình bảo quản để đánh giá hạn dùng và khả năng duy trì mật độ sống của vi khuẩn.
  • Tiếp tục thử nghiệm đánh giá khả năng bảo vệ và giải phóng vi sinh vật trong môi trường dịch tiêu hóa mô phỏng có bổ sung muối mật và các enzyme tiêu hóa.

---

Giá trị tham khảo

• Đối tượng sử dụng: Khóa luận là tài liệu tham khảo chuyên môn giá trị cho sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu viên thuộc các ngành Dược học (chuyên ngành Bào chế và Công nghệ Dược phẩm), Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm.
• Nội dung tham khảo trọng tâm:
  • Quy trình chi tiết và thông số kỹ thuật tạo vi nang đa nhân theo phương pháp tách pha đông tụ ion sử dụng hệ polymer Alginat - Tinh bột hồ hóa - Chitosan.
  • Phương pháp luận và quy trình bố trí thí nghiệm đánh giá độ bền, độ rã và mật độ vi sinh vật sống sót qua mô hình dịch tiêu hóa in vitro liên hoàn 3 giai đoạn (dạ dày - ruột non - đại tràng).
  • Phương pháp xử lý và giải phóng vi sinh vật từ vi nang đông khô bằng dung dịch đệm Natri citrat 2% phục vụ định lượng chính xác bằng kỹ thuật cấy đếm khuẩn lạc.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao nghiên cứu lựa chọn tinh bột hồ hóa 5% cho công thức nhân con thay vì tinh bột không hồ hóa 10% như một số nghiên cứu trước đây?

Trong quá trình thực nghiệm, nồng độ tinh bột hồ hóa 10% tạo ra hỗn hợp có độ nhớt quá cao, gây tắc đầu kim và không thể đùn tạo hạt. Khi giảm nồng độ tinh bột hồ hóa xuống 5%, hỗn dịch đạt độ nhớt phù hợp để tạo hạt qua đầu kim $25\text{G}\times 1"$, đồng thời tinh bột sau hồ hóa liên kết đồng nhất với nền Alginat tạo cấu trúc gel bền vững, giảm thiểu hiện tượng co ngót sau đông khô tốt hơn so với tinh bột không hồ hóa.

2. Nồng độ Chitosan ở lớp vỏ ngoài ảnh hưởng như thế nào đến khả năng giữ cấu trúc vi nang trong dịch ruột mô phỏng?

Nồng độ Chitosan quyết định độ dày và tính liên tục của lớp màng bán thấm polycation-polyanion bao quanh vi nang:

• Ở nồng độ thấp (0,4%), màng bao quá mỏng khiến hạt bị rã hoàn toàn trong dịch ruột $\text{pH } 6,8$.
• Ở nồng độ 1%, vỏ ngoài rã ra và giải phóng các nhân con nguyên vẹn.
• Ở nồng độ 2%, vi nang rã một phần vỏ ngoài.
• Ở nồng độ 3%, vi nang giữ nguyên vẹn hình thái cấu trúc qua 4 giờ trong dịch ruột mô phỏng.

3. Cơ chế nào giúp vi nang đa nhân bảo vệ vi sinh vật tốt hơn vi nang thường trong môi trường acid dạ dày?

Trong vi nang thường, sự tiếp xúc trực tiếp với môi trường acid gây ra hiện tượng trao đổi ion giữa $\text{Ca}^{2+}$ trong mạng Alginat với ion $\text{H}^+$, làm phá vỡ cấu trúc "vỉ trứng" và làm rò rỉ vi khuẩn ra ngoài môi trường acid. Đối với vi nang đa nhân, vi khuẩn nằm hoàn toàn trong các nhân con bên trong; lớp vỏ Alginat - tinh bột và màng bao Chitosan bên ngoài đóng vai trò hàng rào bảo vệ kép, ngăn cản ion $\text{H}^+$ xâm nhập vào nhân, giữ cho phức hợp $\text{Ca}^{2+}$ - Alginat của nhân con không bị phá hủy.

4. Các thông số kỹ thuật chính của quá trình đông khô vi nang trong nghiên cứu là gì?

Quá trình đông khô gồm 2 giai đoạn:

• Tiền đông: Đông lạnh mẫu vi nang tươi trong tủ âm sâu ở $-70^\circ\text{C}$ trong thời gian 24 giờ để đông rắn hoàn toàn.
• Làm khô: Làm khô thăng hoa trong buồng lạnh của hệ thống máy đông khô Christ Alpha ở nhiệt độ $-50^\circ\text{C}$ và áp suất $0,100\text{ mbar}$ trong 24 giờ.

5. Kết quả giải phóng vi khuẩn tại đại tràng của các mẫu vi nang đa nhân có đáp ứng tiêu chuẩn probiotic theo quy chuẩn quốc tế không?

Có. Theo hướng dẫn của FAO/WHO, chế phẩm probiotic cần giải phóng tại ruột mật độ tối thiểu $6 - 7\log\text{ CFU/g}$ để phát huy tác dụng điều trị. Sau khi đi qua chuỗi dịch tiêu hóa mô phỏng, cả ba mẫu vi nang đa nhân TBHH2-C1, TBHH2-C2 và TBHH2-C3 đều giải phóng lượng vi khuẩn sống lần lượt là $6,63\log\text{ CFU/g}$; $7,04\log\text{ CFU/g}$ và $7,30\log\text{ CFU/g}$, hoàn toàn đáp ứng tiêu chuẩn trên.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Lưu Thị Thơ đã xây dựng thành công quy trình tạo vi nang đa nhân chứa Lactobacillus plantarum bằng phương pháp tách pha đông tụ ion kết hợp đông khô với hệ tá dược Natri alginat, tinh bột hồ hóa và Chitosan. Kết quả thực nghiệm in vitro chứng minh cấu trúc vi nang đa nhân có khả năng bảo vệ vượt trội tế bào vi khuẩn sống sót qua môi trường dịch dạ dày và dịch ruột mô phỏng so với dạng vi nang đơn lớp. Lượng vi sinh vật giải phóng tại môi trường đại tràng mô phỏng đạt từ $6,63 - 7,30\log\text{ CFU/g}$, đáp ứng đầy đủ tiêu chuẩn chế phẩm probiotic theo khuyến cáo của FAO/WHO. Đề tài cung cấp cơ sở khoa học và thực nghiệm quan trọng cho việc phát triển các dạng bào chế probiotic giải phóng kéo dài hướng đích đại tràng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Trong thời gian gần đây, các sản phẩm probiotic hỗ trợ sức khỏe đã có sự bùng nổ vượt trội và ngày càng phổ biến hơn trên thị trường [49]. Ngày càng có nhiều công bố phát hiện ra các tác dụng có lợi mới của những vi sinh vật sống này. Đối với loài Lactobacillus plantarum, các nghiên cứu mới đây đã chứng minh được các tác động tích cực của chúng, trong đó có thể kể đến những tác dụng mới phát hiện như cải thiện khối u đại trực tràng, ngăn ngừa và điều trị bệnh viêm loét đại tràng, giảm tổn thương đường ruột, cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột… [33], [38], [55] Tuy nhiên, các tác động “vàng” tới sức khỏe con người này chỉ có thể đạt được khi các chế phẩm probiotic được đưa vào cơ thể với số lượng đủ lớn [31]. Các yếu tố trong quá trình chế biến và bảo quản như nhiệt độ, độ ẩm, áp suất.; hay tác động của đường tiêu hóa là những yếu tố bất lợi có thể làm giảm đáng kể số lượng vi khuẩn sống sót, làm giảm hiệu quả điều trị [15].

Do đó, yêu cầu then chốt là nâng cao hiệu quả bảo vệ vi sinh vật trong quá trình sản xuất, đồng thời giữ gìn khả năng sống sót của VSV trước những tác động bất lợi của đường tiêu hóa và đưa chúng tới được vị trí thích hợp trong đường ruột. Phương pháp tạo vi nang đa nhân được tiến hành trên nhiều hoạt chất cho kết quả khả quan trong việc bao bọc và giải phóng hoạt chất so với vi nang thường [24]. Tiếp nối hướng nghiên cứu bao gói tạo chế phẩm probiotic này, đề tài “ Nghiên cứu tạo vi nang đa nhân chứa Lactobacillus plantarum” được thực hiện với mục tiêu cụ thể sau:  Khảo sát ảnh hưởng các thành phần cấu tạo đến đặc tính vi nang đa nhân.  Đánh giá khả năng bảo vệ và giải phóng vi sinh vật của vi nang đa nhân chứa Lactobacillus plantarum tới vị trí đại tràng.1 Đại cương về probiotic 1.1 Khái niệm probiotic Thuật ngữ probiotic là một từ tương đối mới có nghĩa là “dành cho sự sống” và hiện nay nó được sử dụng để đặt tên cho các vi khuẩn có liên quan đến tác dụng có lợi cho con người và động vật.

Để chỉ ra bản chất vi sinh vật của men vi sinh, Fuller (1989) đã định nghĩa lại từ này là “Một chất bổ sung thức ăn có chứa vi sinh vật sống có tác dụng có lợi cho vật chủ bằng cách cải thiện sự cân bằng đường ruột của vật chủ” [32]. Nhận ra việc không đồng thuận và chính xác trong định nghĩa probiotic gây ra nhiều bất lợi, năm 2001, Hội nghị tư vấn chuyên gia của Tổ chức Nông lương Liên Hợp Quốc (FAO) và Tổ chức Y tế thế giới (WHO) thống nhất một định nghĩa chung: “Probiotic là những vi sinh vật sống mà khi đưa vào cơ thể với một lượng lớn sẽ đem lại tác động có lợi cho sức khỏe vật chủ” [31]. Xu hướng thị trường gần đây gia tăng mạnh mẽ các sản phẩm bảo vệ sức khỏe nguồn gốc từ probiotic. Một vi sinh vật có tiềm năng là probiotic thì phải đáp ứng được các tiêu chuẩn sau: [17] - Có nguồn gốc rõ ràng, thuần chủng (VSV phải được phân lập tới cấp chủng, có định danh chính xác, lưu trữ tại ngân hàng giống quốc tế).

- Không gây bệnh cho vật chủ, không sinh độc tính (thuộc nhóm GRAS an toàn và lành tính, không liên quan đến bệnh tật, không mang các gen đề kháng kháng sinh có thể truyền được).