Tổng quan luận án

Công trình nghiên cứu mang tên "Nghiên cứu phân tích đánh giá hàm lượng kháng sinh họ betalactam trong đối tượng dược phẩm và sinh học bằng phương pháp phân tích hiện đại" do nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Ánh Tuyết thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của GS. Phạm Hùng Việt và PGS. Nguyễn Văn Ri tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội (bảo vệ năm 2013, chuyên ngành Hóa phân tích, mã số: 62 44 29 01).

Kháng sinh họ $\beta$-lactam (bao gồm các phân nhóm chính như penicillin và cephalosporin) giữ vai trò then chốt trong điều trị các bệnh lý nhiễm khuẩn ở người và động vật. Tuy nhiên, tình trạng lạm dụng thuốc kháng sinh, sử dụng không đúng liều lượng và phác đồ điều trị đã dẫn đến tình trạng gia tăng vi khuẩn đề kháng thuốc và làm tích tụ dư lượng kháng sinh trong cơ thể cũng như môi trường. Việc phân tích định lượng chính xác nồng độ kháng sinh trong dịch sinh học (máu, nước tiểu) có ý nghĩa thiết thực nhằm kiểm tra nồng độ thuốc thực tế trong cơ thể so với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC), phục vụ thiết lập phác đồ điều trị hiệu quả và hỗ trợ kiểm tra chất lượng song hành với các chuyên luận trong dược điển.

Các phương pháp phân tích truyền thống hoặc đơn lẻ gặp nhiều khó khăn khi phân tích đồng thời nhiều hoạt chất trên các nền mẫu sinh học phức tạp chứa nhiều tạp chất gây nhiễu. Luận án lựa chọn giải quyết khoảng trống nghiên cứu về việc xây dựng hệ thống phương pháp phân tích hiện đại dựa trên kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (RP-HPLC với detector UV và detector huỳnh quang) và kỹ thuật điện di mao quản điện động học kiểu mixen (MEKC) kết hợp chiết pha rắn (SPE) để tách và định lượng đồng thời nhiều kháng sinh họ $\beta$-lactam trong dược phẩm và mẫu sinh học.

Mục tiêu tổng quát của luận án là nghiên cứu và tối ưu hóa các điều kiện thực nghiệm của kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao và điện di mao quản để tách, định lượng đồng thời một số kháng sinh họ $\beta$-lactam trong đối tượng dược phẩm và sinh học (đặc biệt là nước tiểu). Luận án triển khai 5 nội dung nghiên cứu cụ thể sau:

  1. Nghiên cứu và chọn các điều kiện tối ưu (thông số thiết bị, pha tĩnh, pha động) để tách và xác định đồng thời 5 kháng sinh họ $\beta$-lactam bằng kỹ thuật RP-HPLC với detector UV; đánh giá phương pháp và ứng dụng trên mẫu dược phẩm, nước tiểu.
  2. Nghiên cứu điều kiện tối ưu tạo dẫn xuất huỳnh quang của $\beta$-lactam với thuốc thử 7-Fluoro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole (NBD-F) để tách và xác định đồng thời 3 kháng sinh $\beta$-lactam bằng kỹ thuật RP-HPLC/detector huỳnh quang.
  3. Ứng dụng phương pháp RP-HPLC/detector huỳnh quang để phân tích mẫu dược phẩm và các mẫu sinh học gồm nước tiểu và huyết thanh.
  4. Nghiên cứu lựa chọn các điều kiện tối ưu (thông số thiết bị, kích thước mao quản, thế điện di, dung dịch đệm) để tách và xác định đồng thời 7 chất kháng sinh $\beta$-lactam bằng kỹ thuật điện di mao quản điện động học mixen (MEKC).
  5. Ứng dụng phương pháp MEKC xác định hàm lượng kháng sinh $\beta$-lactam trong mẫu dược phẩm và mẫu nước tiểu.

Đối tượng nghiên cứu của luận án gồm các kháng sinh nhóm penicillin (Penicillin G, Oxacillin, Amoxicillin, Ampicillin, Cloxacillin) và nhóm cephalosporin (Cephalexin - thế hệ I, Cefaclor - thế hệ II, Cefixim - thế hệ III). Phạm vi nền mẫu phân tích bao gồm các chế phẩm thuốc viên thương mại trên thị trường và các mẫu dịch sinh học (mẫu nước tiểu thu nhận từ người tình nguyện sau khi uống thuốc 5–6 giờ, mẫu huyết thanh).

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án tổng quan hệ thống lịch sử phát triển của kháng sinh từ phát hiện của Alexander Fleming năm 1928 đối với nấm Penicillium notatum, cấu trúc hóa học cơ bản gồm nhân axit 6-aminopenicillanic (6-APA) ở penicillin và nhân axit 7-aminocephalosporinic (7-ACA) ở cephalosporin, cùng các tính chất hóa lý, hằng số phân ly axit ($pK_a$ dao động từ 2,6 đến 2,8) và tính chất quang học (hấp thụ cực đại trong vùng tử ngoại 220–260 nm, không phát huỳnh quang tự nhiên).

Tác giả điểm lại các số liệu dịch tễ học về tình hình lạm dụng và đề kháng kháng sinh trên thế giới và tại Việt Nam:

  • Chương trình toàn cầu Alexander (1996–1997) ghi nhận tỷ lệ Streptococcus pneumoniae kháng penicillin cao tại Hồng Kông (53,1%), Pháp (30,6%), Mexico (27,2%), Ireland (13,8%). Giai đoạn 1998–2000 trên 26 quốc gia cho thấy tỷ lệ này tiếp tục tăng: Hồng Kông (69,9%), Pháp (40,5%), Israel (29,7%), Nhật Bản (28,5%), Mỹ (25%).
  • Nghiên cứu đa quốc gia Protek (1999–2000) ghi nhận tỷ lệ đề kháng penicillin ở châu Á đạt 53,4% (Hàn Quốc 71,5%, Hồng Kông 57,1%, Nhật Bản 44,5%).
  • Các nghiên cứu của mạng lưới ANSORP (2000–2001) chỉ ra tỷ lệ S. pneumoniae đề kháng penicillin tại Việt Nam là 71%, Hàn Quốc 55%, Hồng Kông 43%, Đài Loan 39%; tỷ lệ kháng macrolides tại Việt Nam tăng từ 65% (1996–1997) lên 88% (1998–2001).
  • Tại Việt Nam, nghiên cứu của Nguyễn Kim Phượng (1997) tại Hải Phòng cho thấy 69% bệnh nhân được kê kháng sinh nhưng 71% không dùng đúng liều lượng và thời gian dưới 5 ngày. Thống kê tại Bệnh viện Bạch Mai ghi nhận hơn 70% trường hợp dị ứng do kháng sinh. Báo cáo tại Bệnh viện Nhi Trung ương cho biết chi phí mua kháng sinh chiếm 60% tổng kinh phí thuốc, với tỷ lệ kháng ampicillin của E. coli là 88% và Klebsiella là gần 97%. Nghiên cứu của Phạm Hùng Vân và cộng sự trên 204 chủng S. pneumoniae tại 10 bệnh viện ghi nhận 80% kháng penicillin (38% kháng hoàn toàn, 42% kháng vừa).

Về các phương pháp phân tích định lượng $\beta$-lactam, tác giả tổng kết các công trình trước đây:

  • Phương pháp quang học: Đo độ hấp thụ sau khi tạo dẫn xuất hoặc tạo phức kim loại, như phản ứng tạo $\alpha$-acetamidocephalexin đo ở 335 nm, tạo phức với $PdCl_2$ ở 335 nm để xác định amoxicillin và ampicillin, tạo phức $Cu^{2+}$ phát huỳnh quang với ampicillin của Fernández-González, hoặc phản ứng hóa phát quang luminol-$K_3Fe(CN)_6$ của Wei Liu. Các phương pháp này nhìn chung có độ chọn lọc hạn chế khi phân tích đồng thời hỗn hợp.
  • Phương pháp điện hóa: Sử dụng cảm biến điện thế phân tích amoxicillin (Santos), cực phổ quét thế tuyến tính xác định cephalexin (Li và Chen, Yet Benner, Fogg, Xu) hay điện cực màng mỏng kim cương pha Bo (Chailapakul). Hầu hết các nghiên cứu điện hóa chỉ tập trung vào từng chất riêng lẻ (chủ yếu là cephalexin).
  • Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): Tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam quy định RP-HPLC detector UV cho từng chất đơn lẻ (cephalexin ở 254 nm, amoxicillin ở 220 nm). Các nghiên cứu quốc tế sử dụng HPLC/MS (Cha Yang trong nước thải; Blanchflower trong thịt, sữa) hoặc HPLC huỳnh quang (Ang phân tích amoxicillin và ampicillin; Wenhong Luo tạo dẫn xuất salicylaldehyde).
  • Điện di mao quản (CE): Biyang Deng xác định amoxicillin trong nước tiểu; Valcárcel dùng MEKC tách 6 kháng sinh trong nước thải chăn nuôi; Attila Gaspar dùng CZE tách 14 cephalosporin; Bailon-Perez dùng MEKC/CZE tách 7 đến 9 kháng sinh trong nước và dược phẩm.
  • Chiết pha rắn (SPE): Kỹ thuật sử dụng cột pha đảo C18 (Takeba), Oasis HLB (Cha Yang) và Oasis MAX (trao đổi anion) để làm sạch và làm giàu mẫu sinh học, môi trường.

Vị trí của luận án: Luận án là công trình nghiên cứu hệ thống đầu tiên tại Việt Nam về tách và xác định đồng thời nhiều kháng sinh họ $\beta$-lactam, ứng dụng kỹ thuật RP-HPLC detector huỳnh quang với phản ứng tạo dẫn xuất NBD-F trên mẫu sinh học và phát triển phương pháp MEKC phân tích đồng thời 7 kháng sinh $\beta$-lactam kết hợp chiết pha rắn Oasis® HLB.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết

Luận án dựa trên các nguyên lý hóa học phân tích và hóa lý hiện đại:

  • Cấu trúc và tính chất axit-bazơ: Kháng sinh $\beta$-lactam chứa đồng thời nhóm cacboxyl ($-\text{COOH}$) và nhóm thế amin ($-\text{NH}_2$), có $pK_a$ nằm trong khoảng 2,6–2,8, tan được trong dung môi phân cực và dung dịch đệm thích hợp.
Kháng sinh Ký hiệu Phân nhóm / Thế hệ $pK_{a1}$
Penicillin G PENG Penicillin tự nhiên 2,74
Oxacillin OXA Penicillin kháng penicillinase 2,72
Amoxicillin AMO Penicillin phổ rộng 2,80
Ampicillin AMP Penicillin phổ rộng 2,70
Cloxacillin CLO Penicillin bán tổng hợp 2,70
Cephalexin CEP Cephalosporin thế hệ I 2,60
Cefaclor CEC Cephalosporin thế hệ II —
Cefixim CEF Cephalosporin thế hệ III 2,75
  • Sắc ký pha đảo (RP-HPLC): Dựa trên sự phân bố của các chất tan ít phân cực giữa pha tĩnh không phân cực (cột silica gắn mạch octadecyl $C_{18}$) và pha động phân cực (hỗn hợp đệm axetat, axetonitril, metanol). Tốc độ dịch chuyển phụ thuộc vào hệ số lưu giữ $k'$: $$k' = \frac{t_R - t_0}{t_0}$$
  • Nguyên lý phát hiện huỳnh quang: Tận dụng phản ứng dẫn xuất hóa nhóm amin của $\beta$-lactam với thuốc thử NBD-F tạo phức huỳnh quang có bước sóng kích thích $\lambda_{Ex} = 470\text{ nm}$ và bước sóng phát xạ $\lambda_{Em} = 530\text{ nm}$. Cường độ huỳnh quang $I_q$ tỷ lệ tuyến tính với nồng độ chất $C$: $$I_q = k \cdot L \cdot C$$
  • Điện di mao quản điện động học mixen (MEKC): Sử dụng chất hoạt động bề mặt mang điện âm (natri dodecyl sunfat - SDS) ở nồng độ cao hơn nồng độ mixen tới hạn (CMC) trong dung dịch đệm kiềm (borat). Các chất phân tích phân bố vi mô giữa pha tĩnh giả (mixen chuyển động ngược dòng điện thẩm thấu EOF) và pha động nước dưới tác dụng của điện trường cao áp.
  • Chiết pha rắn (SPE) với pha tĩnh Oasis® HLB: Pha tĩnh trùng hợp từ hai monome tỷ lệ 1:1 là N-vinylpyrolidon (ưa nước) và divinylbenzen (kỵ nước), có thể tích lỗ rỗng $1,3\text{ cm}^3/\text{g}$ và diện tích bề mặt $810\text{ m}^2/\text{g}$, cho phép lưu giữ đồng thời các phân tử phân cực và không phân cực trong dải pH rộng.

Thiết bị và phương pháp thực nghiệm

  1. Hệ thống thiết bị chính:
    • Hệ thống HPLC Model LC-20AD của hãng Shimadzu, tích hợp detector UV-Vis và detector huỳnh quang.
    • Hệ thống điện di mao quản CE Model 1602A của hãng Agilent.
    • Cột sắc ký phân tích Supelcosil RP-$C_{18}$ ($250\text{ mm} \times 4,6\text{ mm}$, kích thước hạt $5\ \mu\text{m}$) của hãng Supelco.
    • Cột chiết pha rắn Oasis® HLB ($60\text{ mg}, 3\text{ ml}$).
  2. Phương pháp xử lý mẫu:
    • Mẫu dược phẩm: Nghiền mịn 10 viên nang lấy mẫu đại diện ($20\text{ mg}$), hòa tan trong $20\text{ ml}$ MeOH, rung siêu âm, lọc qua màng lọc $0,45\ \mu\text{m}$, pha loãng bằng pha động.
    • Mẫu nước tiểu (phương pháp RP-HPLC/UV): Lấy $1,5–2\text{ ml}$ nước tiểu (thu từ 2 người tình nguyện từ 20–25 tuổi sau uống thuốc 5–6 giờ), ly tâm $15\text{ phút}$ ở $10.000\text{ rpm}$, lấy $50\ \mu\text{l}$ dịch trong phối trộn với $150\ \mu\text{l}$ etanol tuyệt đối, $300\ \mu\text{l}$ n-hexan và axit tricloaxetic (TCA) để tủa protein, ly tâm, lọc màng $0,45\ \mu\text{m}$, thổi khô bằng dòng khí $N_2$, hòa tan lại cặn bằng $500\ \mu\text{l}$ pha động sắc ký.
    • Mẫu sinh học (nước tiểu và huyết thanh cho HPLC huỳnh quang và MEKC): Xử lý làm sạch và làm giàu qua cột Oasis® HLB theo quy trình 4 bước: hoạt hóa cân bằng cột $\rightarrow$ nạp mẫu $\rightarrow$ rửa giải tạp chất bằng hỗn hợp $H_2O + 5%\text{ MeOH}$ $\rightarrow$ rửa giải chất phân tích bằng MeOH nguyên chất $\rightarrow$ thổi khô và hòa tan lại.
  3. Xử lý số liệu và định lượng:
    • Định lượng theo phương pháp thêm chuẩn thông qua phương trình hồi quy tuyến tính $y = a + bx$.
    • Tính toán hàm lượng chất trong mẫu phân tích: $$m = V \cdot C_x \cdot F \cdot 10^{-3}\ (\text{mg})$$
    • Đánh giá độ lệch phần trăm so với hàm lượng ghi trên nhãn thuốc: $$C% = \frac{m_i - m_n}{m_n} \cdot 100$$
    • Đánh giá các thông số thẩm định: khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ lặp lại (RSD), hiệu suất thu hồi (Recovery).

Nội dung chính theo từng chương

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Chương 1 trình bày tổng quan cấu trúc hóa học, phân loại penicillin và cephalosporin, cơ chế tác dụng diệt khuẩn thông qua ức chế sinh tổng hợp peptidoglycan vách tế bào vi khuẩn và hoạt hóa enzym murein hydroxylase. Tác giả phân tích cơ chế kháng thuốc thông qua việc vi khuẩn tiết ra enzym $\beta$-lactamase thủy phân mở vòng $\beta$-lactam và các cơ chế kháng gián tiếp khác. Chương này cung cấp bức tranh toàn cảnh về thực trạng lạm dụng kháng sinh tại Việt Nam và các số liệu báo động quốc tế từ các chương trình Alexander, Protek, ANSORP. Đồng thời, chương 1 tổng kết các phương pháp phân tích hóa học hiện đại đã được áp dụng, làm nổi bật ưu thế của kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao, điện di mao quản và chiết pha rắn trong phân tích vết kháng sinh.

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương 2 thiết lập toàn bộ quy trình nghiên cứu thực nghiệm:

  • Lựa chọn pha tĩnh $C_{18}$ và khảo sát tối ưu pha động cho hệ RP-HPLC/UV (pH dung dịch đệm axetat từ 3,5 đến 5,0; tỷ lệ ACN/MeOH/đệm axetat; nồng độ đệm từ 6 đến 12 mM; tốc độ dòng từ 0,6 đến 1,2 ml/phút).
  • Khảo sát các điều kiện dẫn xuất hóa huỳnh quang với NBD-F: nhiệt độ phản ứng (50–80°C), thời gian phản ứng (8–15 phút), lượng dư thuốc thử NBD-F ($100\ \mu\text{g/ml}$ với thể tích 20–100 $\mu$l).
  • Thiết lập quy trình tối ưu cho MEKC: khảo sát thành phần đệm borat, pH đệm, nồng độ chất hoạt động bề mặt SDS, nồng độ đệm, thời gian tiêm mẫu, thế điện di cao áp và nhiệt độ mao quản.
  • Xây dựng chi tiết quy trình xử lý mẫu thực tế (dược phẩm, nước tiểu, huyết thanh) kết hợp kỹ thuật tủa protein và làm sạch qua cột chiết pha rắn Oasis® HLB.
Thông số khảo sát HPLC/Huỳnh quang Dải giá trị khảo sát Điều kiện cố định
pH dung dịch đệm 4,0; 4,5; 5,0; 5,5 Nồng độ chuẩn $1\ \mu\text{g/ml}$, đệm $10\text{ mM}$, dòng $1,0\text{ ml/phút}$, ACN/MeOH/đệm (25/25/70 v/v/v)
Tỷ lệ dung môi hữu cơ/đệm (v/v) 45/55; 50/50; 55/45 Đệm $10\text{ mM}$, dòng $1,0\text{ ml/phút}$, tỷ lệ ACN/MeOH = 1/1 (v/v), pH tối ưu
Tỷ lệ ACN/MeOH/đệm (v/v/v) 15/35/50; 20/30/50; 25/25/50; 30/20/50 Nồng độ chuẩn $1\ \mu\text{g/ml}$, đệm $10\text{ mM}$, dòng $1,0\text{ ml/phút}$, pH và tỷ lệ hữu cơ/đệm tối ưu
Nồng độ đệm axetat (mM) 8; 10; 12; 15 Các điều kiện tối ưu đã chọn, nồng độ chuẩn $1\ \mu\text{g/ml}$
Tốc độ pha động (ml/phút) 0,8; 0,9; 1,0; 1,2 Các điều kiện tối ưu đã chọn, nồng độ chuẩn $1\ \mu\text{g/ml}$

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được trên các hệ thống phân tích:

  1. Hệ thống RP-HPLC detector UV:
    • Điều kiện tối ưu xác định đồng thời 5 kháng sinh $\beta$-lactam: cột Supelcosil RP-$C_{18}$ ($250\text{ mm} \times 4,6\text{ mm}, 5\ \mu\text{m}$), pha động đệm axetat $10\text{ mM}$ (pH 3,50), tỷ lệ phối trộn ACN/MeOH/đệm là 10/20/70 (v/v/v), tốc độ dòng $0,8\text{ ml/phút}$, nhiệt độ cột $30^\circ\text{C}$, thể tích tiêm $20\ \mu\text{l}$, detector UV bước sóng $225\text{ nm}$.
    • Phương pháp đạt độ tuyến tính cao trong khoảng nồng độ $0,10–2,0\ \mu\text{g/ml}$, độ lặp lại và độ chính xác được đánh giá tại 3 mức nồng độ $0,15\ \mu\text{g/ml}$, $0,40\ \mu\text{g/ml}$ và $0,80\ \mu\text{g/ml}$.
    • Ứng dụng phân tích thành công hàm lượng kháng sinh trong viên thuốc và mẫu nước tiểu người tình nguyện.
  2. Hệ thống RP-HPLC detector huỳnh quang:
    • Điều kiện tạo dẫn xuất tối ưu với NBD-F cho 3 kháng sinh (CEP, CEC, AMP): phản ứng ổn định tại nhiệt độ và thời gian tối ưu, đo huỳnh quang ở bước sóng kích thích $470\text{ nm}$ và phát xạ $530\text{ nm}$.
    • Đường chuẩn tuyến tính trong khoảng nồng độ $0,05–2,0\ \mu\text{g/ml}$.
    • Đạt hiệu suất thu hồi cao trên các nền mẫu sinh học phức tạp (nước tiểu và huyết thanh).
  3. Kỹ thuật điện di mao quản MEKC:
    • Tối ưu hóa thành công các thông số vận hành: nồng độ SDS, pH và nồng độ đệm borat, thời gian bơm mẫu, thế điện di và nhiệt độ mao quản.
    • Tách và định lượng đồng thời 7 kháng sinh $\beta$-lactam với khoảng tuyến tính từ $1–10\text{ ppm}$ (1–10 $\mu$g/ml).
    • Phân tích định lượng chính xác amoxicillin và cephalexin trong mẫu nước tiểu người tình nguyện sau khi làm sạch bằng cột Oasis® HLB.
  4. So sánh các phương pháp: Đánh giá đối chiếu giữa MEKC, RP-HPLC/UV và RP-HPLC/huỳnh quang về giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ chọn lọc, độ lặp lại và khả năng ứng dụng thực tế trên từng loại nền mẫu.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học và thực tiễn

  1. Luận án là công trình nghiên cứu hệ thống đầu tiên tại Việt Nam xây dựng đồng bộ các phương pháp phân tích tách và định lượng đồng thời các chất kháng sinh họ $\beta$-lactam bằng các công cụ phân tích hiện đại.
  2. Thiết lập quy trình phân tích kháng sinh họ $\beta$-lactam trên nền mẫu sinh học (nước tiểu, huyết thanh) bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo ghép nối detector huỳnh quang (RP-HPLC/FL) thông qua phản ứng tạo dẫn xuất với thuốc thử NBD-F; đây là hướng nghiên cứu lần đầu tiên được triển khai tại Việt Nam.
  3. Xây dựng và chuẩn hóa thành công phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu mixen (MEKC) cho phép tách và định lượng đồng thời 7 hoạt chất kháng sinh họ $\beta$-lactam trong cả mẫu chế phẩm dược phẩm và mẫu nước tiểu kết hợp kỹ thuật chiết pha rắn trên cột Oasis® HLB.

Kiến nghị và khả năng ứng dụng

  • Ứng dụng các quy trình phân tích đã xây dựng tại các phòng kiểm nghiệm dược phẩm để kiểm tra chất lượng thuốc lưu hành song hành cùng các chuyên luận trong Dược điển.
  • Triển khai phân tích giám sát nồng độ thuốc kháng sinh trong dịch sinh học (máu, nước tiểu) tại các cơ sở y tế nhằm đánh giá dược động học lâm sàng, hỗ trợ bác sĩ điều chỉnh liều lượng và phác đồ điều trị phù hợp cho từng cá thể bệnh nhân, hạn chế nguy cơ kháng thuốc và giảm thiểu độc tính trên thận.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế: Phương pháp tạo dẫn xuất huỳnh quang với NBD-F chỉ áp dụng đối với các kháng sinh $\beta$-lactam có nhóm amin tự do trong cấu trúc (như ampicillin, cephalexin, cefaclor) mà chưa mở rộng cho toàn bộ các dẫn xuất khác trong họ. Khảo sát phân tích trên mẫu sinh học thực tế mới được tiến hành trên cỡ mẫu người tình nguyện hạn chế (2 người tình nguyện).
  • Hướng nghiên cứu tiếp: Mở rộng nghiên cứu quy trình phân tích cho các kháng sinh $\beta$-lactam thế hệ mới hơn (các cephalosporin thế hệ IV, carbapenem, monobactam), khảo sát trên tập mẫu lâm sàng lớn hơn và nghiên cứu kết nối với các kỹ thuật khối phổ (LC-MS/MS) để phân tích dư lượng ở mức siêu vết trên đa dạng các nền mẫu môi trường và thực phẩm.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên khảo cho:

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Hóa phân tích, Hóa dược, Kiểm nghiệm thuốc và Độc chất học.
  • Các giảng viên, nhà nghiên cứu tại các trường đại học khối tự nhiên, y dược và các viện nghiên cứu chuyên ngành.
  • Cán bộ kỹ thuật tại các viện kiểm nghiệm thuốc, trung tâm kiểm nghiệm dược phẩm – mỹ phẩm, phòng xét nghiệm hóa sinh lâm sàng tại các bệnh viện.

Các nội dung có giá trị tham khảo chuyên sâu:

  • Quy trình tối ưu hóa pha động và điều kiện vận hành RP-HPLC cho nhóm hợp chất có tính phân cực và phân ly axit.
  • Quy trình dẫn xuất hóa tạo chất phát huỳnh quang với thuốc thử NBD-F.
  • Kỹ thuật phân tách bằng điện di mao quản MEKC sử dụng chất tạo mixen SDS.
  • Quy trình chiết tách, làm sạch và làm giàu mẫu dịch sinh học bằng cột chiết pha rắn Oasis® HLB.

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án nghiên cứu những kháng sinh cụ thể nào thuộc họ $\beta$-lactam?
Luận án tập trung vào 8 kháng sinh đại diện thuộc hai phân nhóm chính:

  • Nhóm penicillin: Penicillin G (PENG), Oxacillin (OXA), Amoxicillin (AMO), Ampicillin (AMP), Cloxacillin (CLO).
  • Nhóm cephalosporin: Cephalexin (CEP - thế hệ I), Cefaclor (CEC - thế hệ II), Cefixim (CEF - thế hệ III).

2. Điều kiện tối ưu để tách và xác định đồng thời 5 kháng sinh $\beta$-lactam bằng RP-HPLC detector UV là gì?
Điều kiện tối ưu gồm: cột phân tích Supelcosil RP-$C_{18}$ ($250\text{ mm} \times 4,6\text{ mm}, 5\ \mu\text{m}$); pha động gồm ACN/MeOH/đệm axetat $10\text{ mM}$ pH 3,50 theo tỷ lệ 10/20/70 (v/v/v); tốc độ dòng $0,8\text{ ml/phút}$; nhiệt độ cột tách $30^\circ\text{C}$; thể tích mẫu tiêm $20\ \mu\text{l}$; bước sóng phát hiện UV là $225\text{ nm}$.

3. Thuốc thử nào được sử dụng trong kỹ thuật RP-HPLC detector huỳnh quang và các bước sóng đo là bao nhiêu?
Thuốc thử được sử dụng để tạo dẫn xuất huỳnh quang là 7-Fluoro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole (NBD-F). Phép đo huỳnh quang được thực hiện tại bước sóng kích thích $\lambda_{Ex} = 470\text{ nm}$ và bước sóng phát xạ $\lambda_{Em} = 530\text{ nm}$ để xác định đồng thời 3 kháng sinh CEP, CEC và AMP.

4. Kỹ thuật điện di mao quản MEKC phân tích được đồng thời bao nhiêu chất kháng sinh và sử dụng hệ đệm nào?
Kỹ thuật MEKC trong luận án đã tối ưu hóa để tách và xác định đồng thời 7 chất kháng sinh họ $\beta$-lactam trong khoảng tuyến tính từ $1–10\text{ ppm}$ (1–10 $\mu$g/ml). Hệ chất nền điện di sử dụng dung dịch đệm borat kết hợp với chất hoạt động bề mặt tạo mixen là natri dodecyl sunfat (SDS).

5. Cột chiết pha rắn (SPE) nào được lựa chọn để xử lý mẫu sinh học và cơ chế giữ chất là gì?
Luận án sử dụng cột chiết pha rắn Oasis® HLB ($60\text{ mg}, 3\text{ ml}$). Pha tĩnh này được đồng trùng hợp từ N-vinylpyrolidon (ưa nước) và divinylbenzen (kỵ nước), kết hợp cơ chế chiết pha đảo và tương tác ưa nước, giúp giữ và làm sạch hiệu quả các kháng sinh $\beta$-lactam từ nền mẫu nước tiểu và huyết thanh.

Kết luận

Luận án của tác giả Nguyễn Thị Ánh Tuyết đã xây dựng thành công các quy trình phân tích hiện đại, có độ chọn lọc và độ tin cậy cao để tách và định lượng đồng thời các kháng sinh họ $\beta$-lactam trong mẫu dược phẩm và mẫu sinh học. Việc kết hợp các kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (detector UV và detector huỳnh quang tạo dẫn xuất NBD-F), điện di mao quản điện động học mixen (MEKC) và kỹ thuật làm sạch mẫu bằng chiết pha rắn Oasis® HLB đã giải quyết hiệu quả bài toán phân tích hỗn hợp kháng sinh trên nền mẫu phức tạp. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học và quy trình thực nghiệm có giá trị thực tiễn cao phục vụ công tác kiểm nghiệm dược phẩm cũng như giám sát điều trị y tế tại Việt Nam.