Tổng quan luận án

Vấn đề an toàn thực phẩm tại Việt Nam là một thực trạng được xã hội đặc biệt quan tâm khi xuất hiện nhiều vụ việc vi phạm liên quan đến thực phẩm không bảo đảm tiêu chuẩn an toàn tại các cơ sở chế biến, trang trại chăn nuôi, chợ và bếp ăn tập thể. Trong đó, hai nhóm nguy cơ chính được ghi nhận gồm: việc sử dụng trái phép và tồn dư các chất kích thích tăng trọng thuộc nhóm beta-agonist (chất tạo nạc) trong chăn nuôi gia súc; và việc lạm dụng hoặc sử dụng sai quy cách các chất phụ gia thực phẩm như chất điều chỉnh độ acid, chất bảo quản và chất tạo ngọt tổng hợp.

Việc kiểm nghiệm an toàn thực phẩm tại Việt Nam hiện chủ yếu dựa vào các phương pháp sắc ký hiện đại như sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS), sắc ký ion (IC) và sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ (LC/MS/MS). Tuy nhiên, các hệ thống thiết bị này đòi hỏi kinh phí đầu tư ban đầu rất lớn, chi phí bảo trì và hóa chất dung môi cao, chủ yếu tập trung tại các cơ quan kiểm nghiệm tuyến trung ương như Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia hoặc một số trung tâm tuyến tỉnh. Các cơ sở kiểm nghiệm vừa và nhỏ ở địa phương thường thiếu trang thiết bị chuyên sâu để sàng lọc, phát hiện kịp thời các vi phạm tại hiện trường hoặc vùng chăn nuôi.

Khoảng trống nghiên cứu được tác giả xác định là sự thiếu vắng các quy trình phân tích đồng thời có chi phí thấp, thao tác đơn giản nhưng vẫn đạt độ tin cậy để phục vụ kiểm tra thực phẩm và mẫu sinh học ở tuyến cơ sở. Phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện (CE-C4D) sở hữu nhiều ưu điểm: thiết bị nhỏ gọn, lượng mẫu và dung môi tiêu tốn ít, chi phí đầu tư và vận hành thấp, linh kiện có thể thay thế sẵn có tại Việt Nam. Dù vậy, ứng dụng của CE-C4D trong phân tích phụ gia thực phẩm và nhóm chất beta-agonist trên thế giới và tại Việt Nam còn rất hạn chế.

Mục tiêu của luận án là nghiên cứu phát triển ứng dụng của phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện (CE-C4D) nhằm xác định một số phụ gia thực phẩm và beta-agonist, bao gồm:

  • Phân tích đồng thời bốn chất điều chỉnh độ acid, bảo quản thực phẩm: acid formic, acid acetic, acid propionic, acid butyric.
  • Phân tích đồng thời bốn chất tạo ngọt tổng hợp: acesulfam kali, aspartam, cyclamat natri, saccharin.
  • Phân tích đồng thời ba chất thuộc nhóm beta-agonist: salbutamol, metoprolol, ractopamin.

Nội dung nghiên cứu của luận án được triển khai qua bốn phần:

  1. Nghiên cứu khảo sát phương pháp CE-C4D nhằm xác định một số phụ gia thực phẩm: tìm các điều kiện thích hợp để xác định đồng thời bốn acid hữu cơ (acid formic, acid acetic, acid propionic, acid butyric), bốn chất tạo ngọt (acesulfam kali, aspartam, cyclamat natri, saccharin) và ba chất thuộc nhóm beta-agonist (salbutamol, ractopamin, metoprolol).
  2. Nghiên cứu khảo sát phương pháp chiết pha rắn (SPE) làm sạch và làm giàu salbutamol trong mẫu nước tiểu và mẫu thịt lợn nhằm xác định bằng phương pháp CE-C4D.
  3. Nghiên cứu áp dụng các điều kiện thích hợp đã khảo sát được để phân tích một số phụ gia thực phẩm trong các mẫu thực tế, đặc biệt là chất tạo nạc salbutamol trong quy trình khép kín từ thức ăn chăn nuôi đến nước tiểu lợn và thịt lợn.
  4. Đánh giá độ tin cậy và triển vọng của phương pháp CE-C4D trong việc phân tích một số chỉ tiêu liên quan đến an toàn thực phẩm, so sánh, đối chứng kết quả phân tích mẫu thực tế với kết quả phân tích bằng các phương pháp phân tích tiêu chuẩn như HPLC, LC/MS/MS.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng phân tích: 4 acid hữu cơ mạch ngắn (formic, acetic, propionic, butyric); 4 chất tạo ngọt nhân tạo không sinh năng lượng (acesulfam kali, aspartam, cyclamat natri, saccharin); 3 hợp chất thuộc nhóm beta-agonist (salbutamol, metoprolol, ractopamin).
  • Đối tượng nền mẫu: Mẫu thực phẩm tiêu dùng (rượu, cà phê hạt, nước giải khát, thạch, chè đỗ đen); mẫu nông nghiệp và sinh học (thức ăn chăn nuôi gia súc, nước tiểu lợn, thịt lợn).
  • Phạm vi không gian và thời gian: Nghiên cứu thực nghiệm được thực hiện tại Bộ môn Hóa Phân tích, Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, phối hợp cùng Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia. Luận án hoàn thành năm 2017, thu thập dữ liệu mẫu thực tế và số liệu giám sát trong giai đoạn 2012-2015 tại Việt Nam.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Trong chương tổng quan, tác giả hệ thống hóa các nghiên cứu đã công bố trong và ngoài nước về phương pháp xác định phụ gia thực phẩm và beta-agonist qua nhiều kỹ thuật phân tích:

Các phương pháp sắc ký (HPLC, GC, IC):

  • Đối với acid hữu cơ: Tormo và Izco (2004) dùng RP-HPLC với detector UV xác định 11 acid hữu cơ trong sữa, ghi nhận giới hạn phát hiện (LOD) của acid formic là 0,037 mM, acid acetic là 0,050 mM, acid propionic là 0,133 mM, acid butyric là 0,457 mM. Sturza và cộng sự (2012) dùng HPLC-SPD xác định 6 acid trong rượu. Kritsunankul và cộng sự (2009) dùng HPLC-UV phân tích acid trong rượu với LOD của acid acetic là 175 mg/l. Yang và Choong (2001) dùng GC-FID xác định các acid hữu cơ bay hơi C2-C12 trong thực phẩm với LOD của acid acetic là 1,25 ng, acid propionic là 0,25 ng, acid butyric là 0,5 ng. Hayenga (2011) ứng dụng sắc ký ion (IC) detector UV phân tích acid trong rượu và nước trái cây.
  • Đối với chất tạo ngọt: Wasik và cộng sự (2007) dùng HPLC-ELSD phân tích 9 chất tạo ngọt trong đồ uống và sữa chua với LOD < 15 µg/g. Serdar và Knežević (2011) dùng HPLC-DAD phân tích 4 chất tạo ngọt trong đồ uống với LOD đạt 0,3 mg/l (Ace-K), 0,4 mg/l (Sac), 0,5 mg/l (Asp và Cyc). Zhu và cộng sự (2005) dùng IC-UV phân tích 4 chất tạo ngọt trong nước giải khát với LOD từ 0,019 đến 0,87 mg/l. Chen và cộng sự (1997) kết hợp IC với detector UV và detector độ dẫn để xác định 4 chất tạo ngọt và acid citric.
  • Đối với beta-agonist: Zhang và cộng sự (2006) dùng HPLC-ESI-MS xác định salbutamol trong nước tiểu đạt LOD 3 ng/ml. Zheng và cộng sự (2010) dùng HPLC-ESI-MS/MS xác định salbutamol và ractopamin trong thịt lợn với LOD lần lượt là 0,11 và 0,07 µg/kg. Zhai và cộng sự (2009) dùng HPLC-ESI-MS/MS phân tích 11 beta-agonist trong thịt lợn, LOD của salbutamol và ractopamin đạt 0,01 ng/g. Yan và cộng sự (2012) dùng HPLC-UV xác định salbutamol trong xúc xích đạt LOD 0,2 ng/g. Sai và cộng sự (2012) xác định 25 beta-agonist và 25 thuốc chẹn beta trong thức ăn chăn nuôi bằng HPLC-ESI-MS/MS. Xiu-Juan và cộng sự (2013) dùng HPLC-Q/TOF MS xác định 12 beta-agonist với LOD từ 1 đến 5 ng/ml. Reig và cộng sự (2005) dùng GC-MS phân tích salbutamol trong nước tiểu bò (LOD 1 ng/ml) và thức ăn chăn nuôi (LOD 2,5 ng/ml). Sniegocki và cộng sự (2005) dùng GC-MS xác định salbutamol trong nước tiểu động vật với LOD 0,024 ng/ml.

Phương pháp quang phổ, điện hóa và miễn dịch sinh học:

  • Quang phổ UV-Vis: Llamas và cộng sự xác định Sac, Asp và Ace-K kết hợp hồi quy đa biến (PLS) đạt LOD từ 2 đến 25 mg/l. Turak và Ozgur dùng UV-Vis xác định đồng thời Ace-K và Asp ở bước sóng 242 nm và 227 nm.
  • Cảm biến điện hóa: Lin và cộng sự tổng hợp màng poly-ACBK/GO-nafion trên điện cực cacbon thủy tinh (GCE) quét dòng 8 beta-agonist với LOD từ 0,58 đến 1,46 ng/ml. Rajkumar và cộng sự dùng điện cực GCE biến tính poly taurine/ZrO2 xác định salbutamol và ractopamin trong thịt lợn và nước tiểu người.
  • Kỹ thuật sinh học: Kỹ thuật ELISA và enzym immunoassay (EIA) của Meyer và cộng sự được dùng để sàng lọc salbutamol và clenbuterol dựa trên phản ứng liên kết kháng nguyên - kháng thể.

Phương pháp điện di mao quản (CE):

  • Peres và cộng sự (2009), Galli và Barbas (2004), Hudson và cộng sự (2012), Santalad và cộng sự (2007), Mato và cộng sự (2006, 2007) sử dụng CZE-UV và CZE-PDA phân tích acid hữu cơ trong các nền mẫu đồ uống, cà phê, rượu. Mai TD và Hauser (2011) ứng dụng CZE-C4D xác định anion hữu cơ trong nước giải khát với đệm His-Mes 90 mM/90 mM, đạt LOD của format là 2,5 µM (0,11 ppm) và acetat là 2,5 µM (0,15 ppm). Kubáň và cộng sự (2014) dùng CZE-C4D với đệm His-Mes 50 mM/50 mM xác định format đạt LOD 0,6 µM (27,6 ppb).
  • Đối với chất tạo ngọt: Lin và cộng sự (2000), Frazier và cộng sự (2000) dùng kỹ thuật MECC. Herrmannová và cộng sự (2006) dùng điện di đẳng tốc độ (ITP) đo độ dẫn. Schuster và cộng sự (1994) dùng CZE-UV-Vis. Stojkovic và cộng sự (2013) dùng CZE-C4D với đệm Tris/Ches (400 mM/150 mM, pH 9,1). Bergamo và cộng sự (2011) dùng CZE-C4D với đệm Tris/His (100 mM/10 mM) phân tích Asp, Ace-K, Cyc, Sac trong nước giải khát.
  • Đối với beta-agonist: Wang và cộng sự (2010), Zhou và cộng sự (2001), Bazylak và cộng sự (2009), Mikus và cộng sự (2005), Chevolleau và cộng sự (1995) dùng CE với các detector đo ampe, đo thế, UV. Anurukvorakun và cộng sự (2006, 2010) dùng NACE-MS xác định beta-agonist trong thịt lợn đạt LOD 0,3 ppb. Felix và cộng sự (2006) dùng CZE-C4D xác định salbutamol trong dược phẩm (LOD 2,39 ppm). Gao và cộng sự (2014) dùng CZE-C4D kết hợp kỹ thuật làm giàu online trên cột để phân tích beta-agonist trong thức ăn chăn nuôi với LOD đạt 0,02 mg/l.

Tình hình nghiên cứu trong nước và vị trí lựa chọn của luận án: Tại Việt Nam, các quy chuẩn kỹ thuật quốc gia (QCVN 4:2010/BYT) và tiêu chuẩn quốc gia phần lớn vẫn áp dụng phương pháp chuẩn độ thể tích đơn lẻ: chuẩn độ acid acetic và acid propionic bằng NaOH 1 M; chuẩn độ acesulfam kali bằng acid pecloric 0,1 M; chuẩn độ saccharin bằng NaOH 0,1 M; TCVN 7812-2:2007 dùng chuẩn độ và khối lượng xác định acid formic. Mới chỉ có TCVN 8471:2010 sử dụng HPLC-UV để xác định đồng thời aspartam, saccharin và acesulfam kali. Đối với nhóm beta-agonist, công tác kiểm nghiệm chủ yếu sử dụng kit ELISA để sàng lọc tại địa phương hoặc gửi mẫu phân tích trên hệ thống LC/MS/MS có chi phí rất cao tại các viện nghiên cứu lớn.

Khoảng trống mà luận án lựa chọn giải quyết là xây dựng các quy trình phân tích đồng thời bằng CE-C4D trên thiết bị được triển khai tại Việt Nam nhằm định lượng phụ gia thực phẩm đạt độ nhạy theo ngưỡng quy định, đồng thời kết hợp kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) để khắc phục nhược điểm về độ nhạy của detector C4D, cho phép định lượng salbutamol trong các nền mẫu sinh học phức tạp như nước tiểu và thịt lợn.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án dựa trên cơ sở lý thuyết về điện di mao quản (Capillary Electrophoresis - CE) và cơ chế phát hiện của detector độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện (Capitively Coupled Contactless Conductivity Detector - C4D).

  • Điện di mao quản vùng (CZE): Dưới tác dụng của điện trường ngoài có cường độ $E$ sinh ra bởi hiệu điện thế cao $V$ đặt vào hai đầu mao quản silica nung chảy, các phần tử mang điện tích di chuyển với vận tốc phụ thuộc vào điện tích và kích thước ion. Bề mặt trong của mao quản silica chứa các nhóm silanol (Si-OH) phân ly thành $SiO^-$ ở điều kiện pH dung dịch đệm thích hợp, hình thành lớp điện tích kép và tạo ra dòng điện di thẩm thấu (EOF). Dòng EOF đẩy toàn bộ dung dịch đệm cùng các ion về phía cực xác định.
  • Detector độ dẫn không tiếp xúc (C4D): Cấu tạo gồm hai điện cực hình trụ bằng kim loại đặt cách nhau một khoảng hở nhỏ và bao quanh bên ngoài ống mao quản. Nguồn điện áp xoay chiều tần số cao được cấp vào điện cực kích thích. Thành mao quản đóng vai trò như lớp điện môi tạo thành hai tụ điện ghép nối tiếp với điện trở của đoạn dung dịch nằm giữa hai điện cực. Tín hiệu đo là dòng xoay chiều đi qua hệ, phản ánh độ dẫn điện tổng của dung dịch bên trong lòng mao quản. Khi vùng chất phân tích di chuyển qua vị trí detector, độ dẫn điện thay đổi so với độ dẫn của dung dịch đệm nền, tạo thành pic tín hiệu mà không làm điện cực tiếp xúc trực tiếp với hóa chất, tránh hiện tượng bám bẩn hoặc ăn mòn bề mặt điện cực.

Thiết bị và hóa chất thực nghiệm:

  • Thiết bị chính: Hệ thống CE-C4D do Công ty 3Sanalysis chế tạo và lắp ráp tại Việt Nam. Mao quản silica nung chảy có đường kính trong (ID) từ 25 đến 50 µm.
  • Thiết bị đối chứng: Hệ thống HPLC sử dụng detector mảng diod quang (DAD) hoặc UV; hệ thống LC/MS/MS tại Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia.
  • Hóa chất chuẩn: Acid formic, acid acetic, acid propionic, acid butyric; acesulfam kali (Ace-K), aspartam (Asp), cyclamat natri (Cyc), saccharin (Sac); salbutamol (Sal), metoprolol (Met), ractopamin (Rac).
  • Dung dịch đệm điện di: Khảo sát các hệ đệm His/Mes (Histidine / 2-morpholin-4-ylethanesulfonic acid), Tris/Ches (Tris / N-Cyclohexyl-2-aminoetanesulfonic acid), Tris/His, Arg/Mes (Arginine / Mes), Arg/CAPS (Arginine / N-cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid).

Phương pháp thực nghiệm và kỹ thuật phân tích:

  • Phương pháp khảo sát điều kiện điện di: Khảo sát thành phần và nồng độ chất đệm, giá trị pH của đệm; khảo sát ảnh hưởng của điện thế tách ($V$); khảo sát chế độ bơm mẫu thủy tĩnh dựa trên sự chênh lệch chiều cao và thời gian bơm mẫu (giây).
  • Phương pháp xử lý mẫu thực phẩm: Các mẫu dạng lỏng (rượu, nước giải khát) được làm loãng, ly tâm và lọc qua màng lọc thích hợp; mẫu dạng rắn hoặc bán rắn (cà phê hạt, thạch) được chiết tách lỏng - rắn bằng nước cất hoặc dung môi trước khi đưa vào hệ điện di.
  • Phương pháp chiết pha rắn (SPE) đối với mẫu sinh học: Xây dựng quy trình SPE trên các loại cột chiết (như pha đảo C18, trao đổi cation mạnh SCX hoặc hỗn hợp MCX), khảo sát điều kiện pH nạp mẫu để giữ chất phân tích, khảo sát dung môi rửa loại bỏ tạp chất nền và hệ dung môi rửa giải để thu hồi salbutamol từ mẫu nước tiểu lợn và thịt lợn.
  • Đánh giá độ tin cậy của phương pháp: Xây dựng phương trình đường chuẩn tuyến tính theo diện tích pic ($S_{pic}$), tính hệ số tương quan ($R^2$); xác định giới hạn phát hiện của thiết bị (LOD), giới hạn định lượng của thiết bị (LOQ), giới hạn phát hiện của phương pháp (MDL), giới hạn định lượng của phương pháp (MQL); đánh giá độ lặp lại qua độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) đối với thời gian di chuyển ($t_{dc}$) và diện tích pic; đánh giá độ đúng thông qua hiệu suất thu hồi (độ thu hồi %).
Nhóm thông số Thông số khảo sát Mục tiêu kỹ thuật
Đệm điện di Thành phần, nồng độ, pH Đảm bảo độ phân giải pic ($R_s$), dòng EOF ổn định và chênh lệch độ dẫn tối ưu
Điện thế tách Giá trị thế cao áp ($V$, kV) Rút ngắn thời gian phân tích, hạn chế nhiệt Joule trong mao quản
Bơm mẫu Chiều cao, thời gian bơm Đảm bảo lượng mẫu nạp đủ để phát hiện pic mà không làm giãn rộng pic
Xử lý mẫu Chiết SPE (cột chiết, pH, dung môi) Loại bỏ tạp chất nền sinh học, làm giàu nồng độ chất phân tích
Thẩm định LOD, LOQ, MDL, RSD%, Độ thu hồi Xác nhận độ tin cậy và khả năng ứng dụng thực tế

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Một số chất phụ gia và beta-agonist trong sản xuất thực phẩm

Chương này trình bày lý thuyết tổng quan về ba nhóm hợp chất nghiên cứu, các phương pháp phân tích đã có và cơ sở kỹ thuật của hệ CE-C4D:

  1. Nhóm bốn acid hữu cơ điều chỉnh độ acid và bảo quản:
  • Acid formic ($HCOOH$): Khối lượng phân tử (KLPT) 46,03 g/mol; pKa = 3,8; nhiệt độ nóng chảy 8,4 °C; nhiệt độ sôi 100,8 °C. Có tác dụng chống nấm mốc, vi khuẩn trong cà phê, rượu vang; dùng trong thức ăn gia súc để ức chế E.Coli. Nồng độ cao gây ức chế cytocrom oxidat trong tế bào, tổn thương thần kinh thị giác. Thông tư 27/2012/TT-BYT quy định hàm lượng tối đa trong nước chấm là 200 mg/kg, trong đồ uống hương liệu là 100 mg/kg.
  • Acid acetic ($CH_3COOH$): KLPT 60,05 g/mol; pKa = 4,8; nhiệt độ nóng chảy 16,0 °C; nhiệt độ sôi 118,0 °C. Thường dùng ở nồng độ 5,0 - 7,0 % (giấm ăn), làm chất điều chỉnh độ acid và bảo quản đồ hộp, gia vị, rượu. Quy định giới hạn trong thực phẩm dinh dưỡng cho trẻ đến 36 tháng tuổi là 500 mg/kg; TCVN 7045:2002 quy định tổng acid bay hơi quy về acid acetic trong rượu vang tối đa là 1,5 g/l.
  • Acid propionic ($C_2H_5COOH$): KLPT 74,08 g/mol; pKa = 4,9; nhiệt độ nóng chảy -21,0 °C; nhiệt độ sôi 141,0 °C. Dùng bảo quản thực phẩm và thức ăn gia súc ở pH 5,0 - 6,0 với hàm lượng lên đến 0,1 %; chống mốc trong bánh mì (hàm lượng 0,5 - 0,7 % gây vị đắng). Quy định tối đa trong fomat tươi là 3000 mg/kg.
  • Acid butyric ($C_3H_7COOH$): KLPT 88,11 g/mol; pKa = 4,8; nhiệt độ nóng chảy -7,9 °C; nhiệt độ sôi 163,5 °C. Chủ yếu dùng điều chế các este butanoat tạo hương thơm cho thực phẩm.
  1. Nhóm bốn chất tạo ngọt nhân tạo không sinh năng lượng:
  • Acesulfam kali (Ace-K, INS 950, $C_4H_4KNO_4S$): KLPT 201,2 g/mol; pKa = 2,0; nhiệt độ nóng chảy 225,0 °C; độ ngọt gấp 200 lần đường saccharose 10 %; chỉ số ADI từ 0 - 15 mg/kg thể trọng; giới hạn trong 69 nhóm thực phẩm từ 110 - 5000 mg/kg.
  • Aspartam (Asp, INS 951, $C_{14}H_{18}N_2O_5$): KLPT 294,3 g/mol; pKa1 = 3,2, pKa2 = 7,8; nhiệt độ nóng chảy 246,0 °C; độ ngọt gấp 133 lần saccharose; ADI từ 0 - 40 mg/kg thể trọng; giới hạn trong 73 nhóm thực phẩm từ 200 - 6000 mg/kg.
  • Cyclamat natri (Cyc, INS 952, $C_6H_{12}NNaO_3S$): KLPT 201,2 g/mol; pKa = 1,7; nhiệt độ nóng chảy 265,0 °C; ADI từ 0 - 11 mg/kg thể trọng; giới hạn trong 36 nhóm thực phẩm từ 250 - 3000 mg/kg.
  • Saccharin (Sac, INS 954, $C_7H_5NNaO_3S$): KLPT 205,2 g/mol; pKa = 1,6; nhiệt độ nóng chảy 228,8 °C; thường dùng ở nồng độ 0,02 - 0,5 %; ADI từ 0 - 5 mg/kg thể trọng; giới hạn trong 67 nhóm thực phẩm từ 80 - 2500 mg/kg.
  1. Nhóm các hợp chất beta-agonist:
  • Salbutamol ($C_{13}H_{21}NO_3$): KLPT 239,31 g/mol; pKa = 9,3 và 10,7; nhiệt độ nóng chảy 151 °C; tan trong methanol. Tác dụng giãn phế quản trong điều trị hen suyễn. Khi bị lạm dụng trong chăn nuôi để tăng tỷ lệ nạc, giảm mỡ, tồn dư salbutamol trong thịt và nội tạng gây ngộ độc, tim đập nhanh, run cơ, đau đầu, tăng huyết áp. Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đã ban hành Quyết định năm 2002 và Thông tư 57/2012/TT-BNNPTNT nghiêm cấm sử dụng hoàn toàn trong chăn nuôi.
  • Metoprolol ($C_{15}H_{25}NO_3$): KLPT 267,36 g/mol; pKa = 9,7 và 14,1; nhiệt độ nóng chảy 120 °C; thuốc điều trị loạn nhịp tim và đau thắt ngực.
  • Ractopamin ($C_{18}H_{23}NO_3$): KLPT 301,38 g/mol; pKa = 9,4; nhiệt độ nóng chảy 165 °C; chất chủ vận beta-adrenergic thúc đẩy tạo nạc, bị cấm sử dụng trong chăn nuôi tại Việt Nam.
  1. Nguyên lý phương pháp điện di mao quản và detector C4D: Trình bày lịch sử phát triển từ Tiselius (1937), Hjerten (1967), Jorgenson (1980); phân loại các kỹ thuật CE (CZE, MECC, ITP, CGE, IEF); bản chất dòng điện tích thẩm thấu EOF; nguyên lý mạch điện tương đương của khối cảm biến C4D gồm tụ điện ghép nối tiếp tạo ra bởi thành mao quản silica và sự biến thiên độ dẫn tín hiệu xoay chiều.

Chương 2. Thực nghiệm và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết thiết bị, quy trình chuẩn bị hóa chất và phương pháp phân tích:

  • Hệ thiết bị CE-C4D: Cấu hình thiết bị của 3Sanalysis, hệ bơm mẫu áp suất thủy tĩnh dựa trên độ chênh lệch chiều cao và điều khiển thời gian; nguồn cao thế tạo điện trường tách; mao quản silica trần được rửa kích hoạt định kỳ bằng dung dịch NaOH, nước cất và dung dịch đệm.
  • Thiết bị đối chứng: Hệ thống HPLC sắc ký pha đảo với detector UV/DAD; hệ thống sắc ký lỏng hai lần khối phổ (LC/MS/MS) dùng nguồn ion hóa phun sương điện tử (ESI).
  • Hóa chất và chất chuẩn: Các muối chuẩn và dung dịch chuẩn gốc của 4 acid hữu cơ, 4 chất tạo ngọt và 3 beta-agonist; các hóa chất đệm phân tích gồm Histidine, Mes, Tris, Ches, Arginine, CAPS.
  • Quy trình khảo sát điều kiện điện di: Lần lượt tối ưu hóa thành phần đệm nền (loại chất điện ly, nồng độ, pH), điện thế tách cao áp và các thông số nạp mẫu (chiều cao nạp mẫu tính bằng cm, thời gian bơm mẫu tính bằng giây).
  • Phương pháp tiền xử lý mẫu:
    • Mẫu thực phẩm: Pha loãng đối với đồ uống lỏng, lọc qua màng kích thước lỗ 0,45 µm; chiết lỏng - rắn với mẫu cà phê hạt và thạch.
    • Mẫu sinh học và thức ăn chăn nuôi: Thức ăn chăn nuôi được chiết tách và xử lý ảnh hưởng của các ion kim loại cản trở; mẫu nước tiểu lợn và mẫu thịt lợn được đồng nhất hóa, xử lý sơ bộ và đưa qua cột chiết pha rắn (SPE) để làm sạch nền mẫu và làm giàu nồng độ salbutamol. Tác giả khảo sát các loại cột SPE, pH dung dịch mẫu nạp, dung môi rửa loại bỏ tạp chất và dung môi rửa giải.
  • Phương pháp thẩm định quy trình: Đánh giá khoảng tuyến tính, LOD, LOQ, MDL, MQL, độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) của thời gian di chuyển và diện tích pic, độ thu hồi chất phân tích thêm chuẩn.

Chương 3. Kết quả và thảo luận

Nội dung chương 3 được cấu trúc thành ba phần nghiên cứu thực nghiệm chính:

  1. Xác định đồng thời acid formic, acid acetic, acid propionic, acid butyric bằng CE-C4D:
  • Khảo sát điều kiện phân tích: Đánh giá tỷ lệ và nồng độ của hệ đệm His/Mes, ảnh hưởng của thế tách, chiều cao và thời gian bơm mẫu đến diện tích pic ($S_{pic}$) và thời gian di chuyển ($t_{dc}$) của 4 acid. Xác lập điều kiện thích hợp cho phép tách hoàn toàn 4 pic phân tích với độ phân giải tốt.
  • Thẩm định phương pháp: Xây dựng đường chuẩn cho từng acid, xác định giá trị LOD, LOQ của thiết bị. Đánh giá độ lặp lại và độ thu hồi trên mẫu nền cà phê hạt.
  • Phân tích mẫu thực tế: Định lượng hàm lượng 4 acid trong các mẫu cà phê hạt, rượu và nước giải khát. Tiến hành phân tích đối chứng song song trên các mẫu thực bằng phương pháp tiêu chuẩn HPLC để so sánh và đánh giá tương quan kết quả giữa hai phương pháp.
  1. Xác định đồng thời bốn chất tạo ngọt acesulfam kali, aspartam, cyclamat natri, saccharin bằng CE-C4D:
  • Khảo sát điều kiện điện di: Đánh giá ảnh hưởng của pH và các hệ đệm khác nhau gồm Tris/Ches, Tris/His, Arg/Mes, Arg/CAPS; so sánh hiệu quả tách tại pH = 9,2. Khảo sát ảnh hưởng của điện thế tách và thời gian bơm mẫu đến độ tách và thời gian di chuyển của 4 chất tạo ngọt.
  • Thẩm định phương pháp: Xây dựng đường chuẩn tuyến tính theo diện tích pic, xác định LOD, LOQ của thiết bị. Đánh giá độ lặp lại (RSD%) và độ thu hồi (%) trên mẫu thạch thêm chuẩn.
  • Phân tích mẫu thực tế: Ứng dụng quy trình phân tích định lượng 4 chất tạo ngọt trong các sản phẩm nước giải khát, thạch và nước chè đỗ đen (áp dụng phương pháp thêm chuẩn đối với saccharin). So sánh đối chứng hàm lượng xác định được bằng CE-C4D với phương pháp HPLC tiêu chuẩn.
  1. Xác định salbutamol, metoprolol, ractopamin và quy trình SPE làm giàu salbutamol:
  • Khảo sát điều kiện điện di cho 3 beta-agonist: Khảo sát ảnh hưởng của pH đệm, thành phần và nồng độ đệm điện di, điện thế tách và thời gian bơm mẫu đến tín hiệu và thời gian di chuyển của Sal, Met, Rac. Lập điều kiện phân tích thích hợp.
  • Phân tích trong thức ăn chăn nuôi: Khảo sát và loại trừ ảnh hưởng cản trở của các cation kim loại có mặt trong thức ăn chăn nuôi. Định lượng Sal và Rac trong mẫu thức ăn chăn nuôi thực tế.
  • Phát triển quy trình chiết pha rắn (SPE) đối với salbutamol trong mẫu nước tiểu lợn: Khảo sát lựa chọn loại cột chiết SPE; khảo sát ảnh hưởng của pH mẫu nạp đến khả năng lưu giữ salbutamol; lựa chọn dung môi rửa tạp chất và dung môi rửa giải để đạt hiệu suất thu hồi cao. Xác định giới hạn phát hiện của phương pháp (MDL), đánh giá độ lặp lại và độ thu hồi trên mẫu nước tiểu lợn. Phân tích các mẫu nước tiểu thu thập thực tế.
  • Nghiên cứu quy trình SPE làm giàu salbutamol trong mẫu thịt lợn: Khảo sát loại cột chiết, tối ưu hóa các hệ dung môi rửa tạp chất bậc 1, 2, 3 và 4, 5, 6; lựa chọn điều kiện rửa giải thích hợp. Đánh giá MDL, độ lặp lại và hiệu suất thu hồi trên mẫu thịt lợn. Phân tích mẫu thịt lợn thực tế và đối chứng kết quả trực tiếp với phương pháp sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ (LC/MS/MS).

Kết quả và những đóng góp mới

Các kết quả và đóng góp mới của luận án được tác giả tổng hợp trên hai phương diện khoa học và thực tiễn:

Về mặt khoa học:

  • Luận án là công trình nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam ứng dụng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc (CE-C4D) để xây dựng hoàn chỉnh quy trình phân tích đồng thời các nhóm chất phụ gia thực phẩm (chất điều chỉnh độ acid, bảo quản thực phẩm và chất tạo ngọt) và nhóm chất tạo nạc beta-agonist.
  • Đóng góp thêm dữ liệu thực nghiệm vào số lượng ít ỏi các công bố quốc tế về việc ứng dụng detector C4D trong phân tích các nhóm hợp chất hữu cơ này.
  • Xây dựng thành công giải pháp kết hợp kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) với kỹ thuật CE-C4D để xử lý và làm giàu mẫu, khắc phục nhược điểm về độ nhạy của detector C4D khi phân tích lượng vết salbutamol trong các nền mẫu sinh học phức tạp (nước tiểu lợn, thịt lợn).

Về mặt thực tiễn:

  • Đưa ra các quy trình phân tích có chi phí đầu tư và vận hành thấp, sử dụng lượng hóa chất và mẫu rất nhỏ, dựa trên hệ thiết bị CE-C4D được chế tạo với linh kiện sẵn có tại Việt Nam.
  • Quy trình phân tích 4 acid hữu cơ và 4 chất tạo ngọt có độ tin cậy tương đương phương pháp tiêu chuẩn HPLC, phù hợp để áp dụng kiểm soát hàm lượng phụ gia thực phẩm theo quy chuẩn tại các cơ sở kiểm nghiệm vừa và nhỏ.
  • Quy trình phân tích salbutamol bằng CE-C4D kết hợp SPE được chứng minh có khả năng kiểm soát khép kín chuỗi chăn nuôi: từ mẫu thức ăn chăn nuôi, mẫu nước tiểu gia súc trước khi xuất bán, đến mẫu thịt lợn tại lò mổ và chợ. Kết quả phân tích đối chứng cho thấy sự tương thích tốt với phương pháp tiêu chuẩn LC/MS/MS, mở ra giải pháp kiểm tra, giám sát chất cấm tại các trạm thú y và phòng xét nghiệm tuyến địa phương.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất:

  • Kiến nghị đưa hệ thiết bị CE-C4D vào ứng dụng thực tế tại các trung tâm kiểm nghiệm thực phẩm và thú y tuyến tỉnh hoặc tuyến huyện nhằm tăng cường năng lực kiểm tra nhanh tại chỗ.
  • Đề xuất mở rộng nghiên cứu áp dụng các quy trình CE-C4D đã xây dựng sang các nhóm phụ gia và các chất cấm khác trong nông nghiệp và thực phẩm.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu:

  • Giới hạn phát hiện tự nhiên của detector độ dẫn không tiếp xúc (C4D) đối với các hợp chất hữu cơ kích thước phân tử lớn vẫn còn kém hơn so với detector khối phổ chuyên dụng (MS, MS/MS), do đó khi phân tích dư lượng ở mức nồng độ ppb trong nền mẫu sinh học (thịt lợn), phương pháp bắt buộc phải trải qua công đoạn tiền xử lý và làm giàu mẫu bằng cột chiết pha rắn (SPE) nhiều bước.
  • Nghiên cứu chưa tích hợp được kỹ thuật làm giàu trực tiếp trên mao quản (online preconcentration) trong quy trình phân tích mẫu thực tế phức tạp của thịt lợn, mà mới áp dụng quy trình chiết tách offline.

Hướng nghiên cứu tiếp:

  • Nghiên cứu áp dụng kỹ thuật làm giàu mẫu online trên cột mao quản (như kỹ thuật tập trung vùng mẫu bằng stacking hoặc sweeping) nhằm nâng cao độ nhạy của phương pháp CE-C4D thêm hàng chục lần mà không cần thao tác chiết SPE phức tạp.
  • Tiếp tục mở rộng phạm vi áp dụng của hệ thiết bị CE-C4D sang các đối tượng chất phân tích khác như kháng sinh tồn dư, các dẫn xuất beta-agonist khác và các anion vô cơ trong thực phẩm.

Giá trị tham khảo

Luận án có giá trị tham khảo chuyên môn đối với các nhóm đối tượng:

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên các ngành Hóa phân tích, Hóa học thực phẩm, Độc chất học và Thú y: Cung cấp tài liệu tham khảo chi tiết về lý thuyết điện di mao quản vùng, nguyên lý hoạt động của detector độ dẫn không tiếp xúc C4D, cũng như phương pháp luận trong việc tối ưu hóa thành phần đệm điện di.
  • Cán bộ phân tích tại các phòng thí nghiệm kiểm nghiệm an toàn thực phẩm, trung tâm thú y tuyến tỉnh và tuyến huyện: Tham khảo quy trình phân tích thực nghiệm để triển khai trên các hệ thiết bị CE-C4D chi phí thấp thay cho các thiết bị sắc ký đắt tiền.
  • Cơ quan quản lý nhà nước về an toàn thực phẩm và thú y: Tham khảo dữ liệu đánh giá đối chứng giữa CE-C4D với HPLC và LC/MS/MS làm cơ sở xem xét bổ sung các phương pháp phân tích thay thế phục vụ giám sát vệ sinh an toàn thực phẩm tại cơ sở.

Các phần đáng tham khảo nhất trong luận án gồm: hệ thống bảng tối ưu hóa thành phần đệm điện di (His/Mes, Tris/Ches, Arg/Mes, Arg/CAPS) ở Chương 2 và Chương 3; quy trình chiết pha rắn (SPE) tối ưu để tách làm sạch salbutamol trong mẫu nước tiểu và thịt lợn; dữ liệu thẩm định phương pháp (LOD, LOQ, MDL, RSD%, độ thu hồi) và số liệu phân tích đối chứng giữa CE-C4D với HPLC và LC/MS/MS.

Câu hỏi thường gặp

1. Bốn acid hữu cơ điều chỉnh độ acid và bảo quản thực phẩm được tách bằng hệ đệm nào và trong điều kiện nào trên hệ CE-C4D?
Bốn acid hữu cơ (formic, acetic, propionic, butyric) được tách đồng thời bằng kỹ thuật điện di mao quản vùng (CZE) sử dụng hệ đệm điện di His/Mes (Histidine / 2-morpholin-4-ylethanesulfonic acid). Tác giả đã khảo sát chi tiết nồng độ, tỷ lệ của đệm His/Mes, kết hợp tối ưu hóa thế tách cao áp và thời gian bơm mẫu thủy tĩnh để đạt được sự phân tách hoàn toàn bốn pic tín hiệu với độ lặp lại và độ thu hồi cao.

2. Bốn chất tạo ngọt tổng hợp (Ace-K, Asp, Cyc, Sac) được khảo sát phân tích ở vùng pH nào và hệ đệm nào cho kết quả tốt nhất?
Bốn chất tạo ngọt được khảo sát phân tích ở môi trường kiềm nhằm đảm bảo các chất này phân ly thành các anion mang điện tích âm. Tác giả đã so sánh bốn hệ đệm điện di khác nhau ở pH = 9,2 gồm Tris/Ches, Tris/His, Arg/Mes và Arg/CAPS, từ đó lựa chọn được điều kiện đệm thích hợp nhất để tách sắc nét và đồng thời cả bốn chất tạo ngọt trong sản phẩm nước giải khát, thạch và nước chè đỗ đen.

3. Tại sao việc định lượng salbutamol trong mẫu nước tiểu và thịt lợn bằng CE-C4D bắt buộc phải kết hợp kỹ thuật chiết pha rắn (SPE)?
Detector C4D có độ nhạy phát hiện tự nhiên ở mức nồng độ ppm, phù hợp với ngưỡng quy định của phụ gia thực phẩm nhưng chưa đủ nhạy để phát hiện trực tiếp dư lượng cực nhỏ của salbutamol (thường ở mức nồng độ ppb) trong nền mẫu sinh học phức tạp. Bên cạnh đó, nước tiểu và thịt lợn chứa hàm lượng lớn các ion vô cơ và protein gây nhiễu tín hiệu độ dẫn. Kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) đóng vai trò loại bỏ toàn bộ tạp chất nền gây cản trở và làm giàu nồng độ salbutamol lên nhiều lần trước khi nạp vào mao quản điện di.

4. Luận án đã sử dụng những phương pháp tiêu chuẩn nào để phân tích đối chứng và kiểm chứng độ tin cậy của phương pháp CE-C4D?
Luận án sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với detector UV/DAD theo các tiêu chuẩn hiện hành để phân tích đối chứng hàm lượng của bốn acid hữu cơ và bốn chất tạo ngọt trong các mẫu thực phẩm thực tế. Đối với chất tạo nạc salbutamol trong mẫu nước tiểu và thịt lợn, kết quả phân tích bằng quy trình SPE kết hợp CE-C4D được so sánh đối chứng trực tiếp với phương pháp sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ (LC/MS/MS) tại Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Nguyễn Thị Quỳnh Hoa đã nghiên cứu phát triển thành công phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện (CE-C4D) để xác định đồng thời 4 acid hữu cơ, 4 chất tạo ngọt tổng hợp và 3 hợp chất beta-agonist. Bằng việc kết hợp quy trình chiết pha rắn (SPE) để làm sạch và làm giàu mẫu, tác giả đã giải quyết được hạn chế về độ nhạy của detector C4D, cho phép định lượng chính xác chất tạo nạc salbutamol trong các nền mẫu sinh học phức tạp từ thức ăn chăn nuôi, nước tiểu lợn đến thịt lợn. Các kết quả phân tích trên mẫu thực tế đạt độ tin cậy và có sự tương thích cao khi so sánh đối chứng với các phương pháp tiêu chuẩn như HPLC và LC/MS/MS, khẳng định tính khả thi của việc ứng dụng hệ thiết bị CE-C4D chi phí thấp trong công tác kiểm soát an toàn thực phẩm tại Việt Nam.