Nghiên cứu bào chế và cơ chế giải phóng dược chất từ vi cầu Leuprolid acetat

Nghiên cứu bào chế và giải phóng dược chất từ vi cầu Leuprolid acetat là một lĩnh vực quan trọng trong ngành… 60 trang · Trường Đại Học Dược Hà Nội · 2022.

• Tác giả: Vũ Thị Hồng Hạnh
• Người hướng dẫn: PGS.TS Trần Thị Hải Yến
• Trường học: Trường Đại Học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược
• Đề tài: Nghiên Cứu Bào Chế Và Giải Phóng Dược Chất Từ Vi Cầu Leuprolid Acetat
• Loại tài liệu: Khóa Luận Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 1.1. DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
• 1.2. DANH MỤC CÁC BẢNG
• 1.3. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ
• 2. ĐẶT VẤN ĐỀ
• 3. TỔNG QUAN VỀ LEUPROLID ACETAT
• 3.1. Công thức hóa học
• 3.2. Tính chất vật lý, hóa học
• 3.3. Ứng dụng trong điều trị
• 4. TỔNG QUAN VỀ VI CẦU PLGA
• 4.1. Vi cầu PLGA-LA
• 4.2. Phương pháp bào chế vi cầu PLGA bằng nhũ hóa kép kết hợp bốc hơi dung môi
• 4.3. Tổng quan về đông khô vi cầu PLGA
• 4.4. Tổng quan về cơ chế giải phóng dược chất từ vi cầu PLGA
• 5. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 5.1. Nguyên vật liệu, thiết bị sử dụng
• 5.2. Nội dung nghiên cứu
• 5.2.1. Bào chế vi cầu PLGA - LA bằng phương pháp nhũ hóa kép kết hợp bốc hơi dung môi
• 5.2.2. Khảo sát một số yếu tố công thức ảnh hưởng đến đặc tính của vi cầu PLGA - LA đông khô
• 5.2.3. Nghiên cứu cơ chế giải phóng dược chất từ vi cầu PLGA - LA
• 5.3. Phương pháp nghiên cứu
• 5.3.1. Phương pháp bào chế vi cầu PLGA-LA
• 5.3.2. Phương pháp đánh giá một số đặc tính của vi cầu đông khô PLGA-LA
• 5.3.3. Phương pháp đánh giá giải phóng dược chất in vitro điều kiện dài hạn
• 5.3.4. Phương pháp đánh giá giải phóng dược chất in vitro điều kiện cấp tốc
• 5.3.5. Phương pháp xử lý số liệu
• 6. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
• 6.1. Khảo sát ảnh hưởng của tá dược đông khô đến vi cầu PLGA - LA đông khô
• 6.1.1. Điều kiện và thông số của quy trình đông khô
• 6.1.2. Ảnh hưởng của tá dược đông khô đến vi cầu đông khô PLGA-LA
• 6.1.3. Ảnh hưởng của nồng độ D-manitol vi cầu đông khô PLGA-LA
• 6.2. Khảo sát ảnh hưởng của loại polyme PLGA đến khả năng giải phóng dược chất từ vi cầu PLGA - LA
• 6.2.1. Kết quả giải phóng in vitro của vi cầu PLGA - LA điều kiện dài hạn
• 6.2.2. Kết quả giải phóng in vitro của vi cầu PLGA - LA ở điều kiện cấp tốc
• 7. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC
• A. DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Tóm tắt

I. Tổng quan về Nghiên cứu bào chế Leuprolid acetat

Nghiên cứu bào chế và giải phóng dược chất từ vi cầu Leuprolid acetat là một lĩnh vực quan trọng trong ngành dược phẩm. Leuprolid acetat, một chất chủ vận GnRH, được sử dụng để điều trị nhiều rối loạn liên quan đến hormon. Việc bào chế dược chất này dưới dạng vi cầu giúp cải thiện hiệu quả điều trị và giảm thiểu tác dụng phụ. Nghiên cứu này tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình bào chế và đánh giá khả năng giải phóng dược chất từ vi cầu PLGA.

1.1. Ứng dụng của Leuprolid acetat trong y học

Leuprolid acetat được chỉ định trong điều trị ung thư tuyến tiền liệt, ung thư vú, và các rối loạn khác. Việc sử dụng vi cầu PLGA giúp kéo dài thời gian giải phóng dược chất, từ đó nâng cao hiệu quả điều trị.

1.2. Tính chất vật lý và hóa học của Leuprolid acetat

Leuprolid acetat có dạng bột kết tinh màu trắng, dễ hút ẩm và tan tốt trong nước. Tính chất này ảnh hưởng đến quá trình bào chế và giải phóng dược chất từ vi cầu.

II. Thách thức trong bào chế vi cầu Leuprolid acetat

Bào chế vi cầu Leuprolid acetat gặp nhiều thách thức, bao gồm việc kiểm soát kích thước vi cầu và hiệu suất vi cầu hóa. Các yếu tố như nồng độ polymer, loại tá dược và quy trình bào chế đều ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm cuối cùng. Việc tối ưu hóa các yếu tố này là cần thiết để đảm bảo hiệu quả điều trị.

2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến kích thước vi cầu

Kích thước vi cầu ảnh hưởng đến khả năng giải phóng dược chất. Các yếu tố như tỷ lệ pha dầu và pha nước trong quy trình nhũ hóa có thể điều chỉnh để đạt được kích thước mong muốn.

2.2. Khó khăn trong quy trình bào chế

Quy trình bào chế vi cầu thường phức tạp và yêu cầu kiểm soát chặt chẽ các thông số. Việc duy trì tính ổn định của dược chất trong quá trình sản xuất cũng là một thách thức lớn.

III. Phương pháp bào chế vi cầu PLGA chứa Leuprolid acetat

Phương pháp nhũ hóa kép kết hợp bốc hơi dung môi là kỹ thuật chính được sử dụng để bào chế vi cầu PLGA chứa Leuprolid acetat. Phương pháp này cho phép giữ lại dược chất bên trong vi cầu và kiểm soát quá trình giải phóng dược chất một cách hiệu quả.

3.1. Quy trình nhũ hóa kép W O W

Quy trình nhũ hóa kép W/O/W giúp tạo ra nhũ tương ổn định, từ đó hình thành vi cầu với kích thước đồng đều. Dược chất được hòa tan trong pha nước nội, trong khi PLGA được hòa tan trong dung môi hữu cơ.

3.2. Bốc hơi dung môi và đông khô

Sau khi tạo nhũ tương, dung môi hữu cơ được loại bỏ bằng cách bốc hơi, và vi cầu được đông khô để bảo quản. Quy trình này giúp tăng cường độ ổn định của vi cầu và dược chất.

IV. Cơ chế giải phóng dược chất từ vi cầu PLGA

Cơ chế giải phóng dược chất từ vi cầu PLGA phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm khuếch tán, hòa tan và ăn mòn. Hiểu rõ cơ chế này giúp tối ưu hóa quy trình bào chế và cải thiện hiệu quả điều trị.

4.1. Khuếch tán và hòa tan

Khuếch tán là cơ chế chính giúp dược chất ra ngoài vi cầu. Khi vi cầu hấp thụ nước, dược chất hòa tan và khuếch tán qua các lỗ xốp trong cấu trúc vi cầu.

4.2. Ăn mòn bề mặt và toàn bộ

Ăn mòn bề mặt xảy ra khi lớp polyme tan trong môi trường, trong khi ăn mòn toàn bộ diễn ra đồng nhất bên trong vi cầu. Cả hai cơ chế này đều ảnh hưởng đến tốc độ giải phóng dược chất.

V. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng vi cầu PLGA chứa Leuprolid acetat có khả năng giải phóng dược chất kéo dài, giúp cải thiện hiệu quả điều trị. Kết quả này mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các sản phẩm dược phẩm có tính năng tương tự.

5.1. Đánh giá hiệu quả giải phóng dược chất

Kết quả giải phóng in vitro cho thấy vi cầu PLGA có khả năng giải phóng dược chất ổn định trong thời gian dài, phù hợp với yêu cầu điều trị.

5.2. Ứng dụng trong điều trị lâm sàng

Việc ứng dụng vi cầu PLGA chứa Leuprolid acetat trong điều trị các bệnh lý liên quan đến hormon hứa hẹn sẽ nâng cao hiệu quả điều trị và cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân.

VI. Kết luận và triển vọng tương lai

Nghiên cứu bào chế và giải phóng dược chất từ vi cầu Leuprolid acetat đã mở ra nhiều cơ hội mới trong lĩnh vực dược phẩm. Việc tối ưu hóa quy trình bào chế và hiểu rõ cơ chế giải phóng sẽ giúp phát triển các sản phẩm dược phẩm hiệu quả hơn trong tương lai.

6.1. Hướng nghiên cứu tiếp theo

Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng giải phóng dược chất từ vi cầu, nhằm nâng cao hiệu quả điều trị.

6.2. Tương lai của vi cầu trong ngành dược

Vi cầu PLGA có tiềm năng lớn trong việc phát triển các sản phẩm dược phẩm mới, đặc biệt là trong điều trị các bệnh lý mãn tính và kéo dài.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Leuprolid acetat (LA) là một nonapeptid tổng hợp có cấu trúc tương tự và hiệu lực chủ vận mạnh hơn hormon giải phóng gonadotropin (GnRH) tự nhiên. Hoạt chất này được chỉ định trong điều trị các bệnh lý và rối loạn phụ thuộc hormon giới tính bao gồm: ung thư tuyến tiền liệt giai đoạn muộn, ung thư vú giai đoạn muộn ở phụ nữ tiền và sau mãn kinh, lạc nội mạc tử cung, u xơ tử cung và dậy thì sớm phụ thuộc gonadotropin. Về mặt dược động học, LA có thời gian bán thải ngắn, do đó các dạng thuốc tiêm giải phóng quy ước đòi hỏi phải tiêm hàng ngày. Trong khi đó, liệu trình điều trị các bệnh lý nêu trên thường kéo dài từ vài tháng đến vài năm, gây ra sự bất tiện đáng kể, làm giảm mức độ tuân thủ điều trị của người bệnh và ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả trị liệu.

Để khắc phục hạn chế này, việc thiết kế dạng thuốc tiêm giải phóng kéo dài chứa LA nạp trong vi cầu polyme phân hủy sinh học poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) là giải pháp bào chế cần thiết. Tuy nhiên, quy trình sản xuất hệ phân phối vi cầu polyme rất phức tạp. Các nghiên cứu trước đây tại Bộ môn Bào chế – Trường Đại học Dược Hà Nội đã chế tạo thành công vi cầu PLGA-LA với hiệu suất vi cầu hóa đạt trên 50% và bước đầu ghi nhận đặc tính giải phóng kéo dài. Dù vậy, những công trình này chưa đánh giá đầy đủ ảnh hưởng của các yếu tố thuộc về công thức bào chế (như loại polyme, khối lượng phân tử, tỷ lệ phối hợp polyme và tá dược đông khô) đến khả năng và cơ chế giải phóng dược chất từ vi cầu.

Xuất phát từ thực tiễn trên, tác giả Vũ Thị Hồng Hạnh đã thực hiện khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ với đề tài: "Nghiên cứu bào chế và cơ chế giải phóng dược chất từ vi cầu leuprolid acetat đông khô". Đề tài tập trung vào hai mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

1. Khảo sát một số yếu tố công thức ảnh hưởng đến đặc tính của vi cầu PLGA - LA đông khô.
2. Nghiên cứu cơ chế giải phóng dược chất từ vi cầu PLGA - LA đông khô (trong cả điều kiện dài hạn và điều kiện cấp tốc).

• Đối tượng nghiên cứu: Vi cầu PLGA nạp dược chất leuprolid acetat đông khô (sử dụng các loại polyme PLGA 50:50 khối lượng phân tử 7–17 kDa, PLGA 50:50 khối lượng phân tử 24–38 kDa, PLGA 75:25 khối lượng phân tử 4–15 kDa) và chế phẩm đối chiếu Lucrin Depot PDS 3,75 mg (hãng Dược phẩm Takeda, Nhật Bản).
• Phạm vi nghiên cứu: Đề tài được triển khai thực nghiệm tại Bộ môn Bào chế phối hợp với Bộ môn Hóa phân tích, Bộ môn Công nghiệp Dược và Bộ môn Vật lý – Hóa lý thuộc Trường Đại học Dược Hà Nội; hoàn thành và nghiệm thu vào tháng 6 năm 2022.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và mô hình nghiên cứu

• Đặc tính dược chất và polyme: Leuprolid acetat ($C_{59}H_{84}N_{16}O_{12}$, khối lượng phân tử 1269,45 g/mol) là một peptid mang điện tích dương ở pH trung tính hoặc acid nhẹ, tan tốt trong nước, acid acetic và DMSO. Polyme PLGA phân hủy sinh học thông qua phản ứng thủy phân các liên kết este trong môi trường nước tạo acid lactic và acid glycolic. Tỷ lệ monome acid lactic/acid glycolic (LA/GA) và khối lượng phân tử (KLPT) quyết định tính kỵ nước, mức độ hấp thu nước, nhiệt độ chuyển hóa thủy tinh ($T_g$) và tốc độ suy thoái của khung polyme. LA tích điện dương có khả năng tương tác tĩnh điện với nhóm tận cùng carboxylic tích điện âm ($pK_a \approx 3,8$) của mạch PLGA.
• Cơ chế giải phóng dược chất từ vi cầu PLGA: Bao gồm ba cơ chế chính: khuếch tán qua hệ thống kênh/lỗ xốp, khuếch tán qua ma trận polyme, và giải phóng do sự ăn mòn polyme (ăn mòn toàn bộ hoặc ăn mòn bề mặt). Đồ thị giải phóng thường tuân theo mô hình ba pha (pha giải phóng ồ ạt ban đầu – burst release, pha giải phóng chậm – lag phase, và pha giải phóng nhanh – erosion phase) hoặc mô hình hai pha (pha burst release và pha giải phóng ổn định liên tục).
• Mô hình thử giải phóng in vitro: Bao gồm thử nghiệm dài hạn ở điều kiện sinh lý ($37^\circ\text{C}$, đệm PBS pH 7,4) và thử nghiệm cấp tốc ở nhiệt độ nâng cao ($50 \pm 0,5^\circ\text{C}$, dung dịch Tween 80 0,02%) nhằm rút ngắn thời gian đánh giá, so sánh với tiêu chuẩn của chế phẩm đối chiếu Lucrin Depot PDS 3,75 mg (tiêu chuẩn giải phóng cấp tốc: 1 giờ giải phóng $\le 25%$; 7 giờ giải phóng $45 - 75%$; 30 giờ giải phóng $\ge 85%$).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Quy trình / Chỉ tiêu	Phương pháp thực hiện	Thiết bị & Điều kiện cụ thể
Bào chế vi cầu	Nhũ hóa kép nước/dầu/nước ($W_1/O/W_2$) kết hợp bốc hơi dung môi	- Pha nước nội ($W_1$): LA 60 mg, Gelatin type B 6,6 mg trong 0,6 ml đệm phosphat pH 7,4. - Pha dầu ($O$): PLGA 360 mg trong 4 ml DCM. - Đồng nhất hóa tạo NT1: 12.000 vòng/phút trong 5 phút (ngâm nước đá). - Đồng nhất hóa tạo NT2: thêm 10 ml PVA 1,5% – NaCl 1,5%, 4.000 vòng/phút trong 40 giây. - Pha loãng và rắn hóa: thêm 20 ml PVA 1,5% – NaCl 1,5%, sục khí $N_2$ (20 ml/phút, 30 phút). - Thu hồi: Ly tâm lạnh 5.000 vòng/phút (5 phút, $5^\circ\text{C}$), rửa nước cất 2 lần.
Đông khô vi cầu	Thăng hoa và giải hấp phụ chân không	- Phân tán bột nhão vi cầu trong 10 ml dung dịch D-mannitol 1,25% (kl/tt), rây qua rây 125 µm, đóng lọ 2 ml. - Tiền đông ở $-70^\circ\text{C}$ trong 7 giờ. - Thăng hoa ở $-50^\circ\text{C}$, áp suất 0,04 mbar trong 24 giờ trên máy đông khô Alpha 1-2 LD Plus.
Đánh giá hình thái bề mặt	Kính hiển vi điện tử quét (SEM)	- Máy Regulus8100 – HITACHI. - Mẫu sấy chân không $40^\circ\text{C}$ trong 24 giờ, phủ Platin 35 giây, điện thế 1 – 1,5 kV, độ phóng đại $3.000\times - 10.000\times$.
Đo kích thước tiểu phân (KTTP)	Tán xạ ánh sáng laser	- Thiết bị MasterSizer 3000E; xác định kích thước trung bình theo thể tích $D[4,3]$ (µm) và độ phân tán Span.
Định lượng LA & Hiệu suất vi cầu hóa ($EE%$)	Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)	- Hệ thống HPLC Shimadzu 20A, cột InertSustain C18 ($5\ \mu\text{m},\ 4,6 \times 250\ \text{mm}$). - Pha động: Đệm amoni dihydrophosphat 0,03M pH 4,0 : ACN = 75:25 (tt/tt); nhiệt độ cột $25^\circ\text{C}$; tốc độ dòng 0,8 ml/phút; detector UV 280 nm. - Xử lý mẫu: Vi cầu được hòa tan trong DMSO và siêu âm 15 phút.
Giải phóng in vitro dài hạn	Phương pháp lấy mẫu và phân tách (sample and separate)	- Môi trường: Đệm PBS pH 7,4 chứa 0,02% Tween 80 và 0,02% natri diazid; nhiệt độ $37^\circ\text{C}$, lắc ngang 125 vòng/phút. - Lấy mẫu tại các ngày: 1, 4, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56. - Đo huỳnh quang trên máy Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer ($\lambda_{ex} = 280\ \text{nm}, \lambda_{em} = 356\ \text{nm}$).
Giải phóng in vitro cấp tốc	Phương pháp lấy mẫu và phân tách gia nhiệt	- Môi trường: Dung dịch Tween 80 0,02% trong nước; nhiệt độ $50 \pm 0,5^\circ\text{C}$, lắc ngang 125 vòng/phút. - Lấy mẫu tại các thời điểm: 1, 4, 7, 24, 30, 48, 54 giờ. - Đo huỳnh quang ($\lambda_{ex} = 280\ \text{nm}, \lambda_{em} = 356\ \text{nm}$).
Xử lý số liệu	Thống kê mô tả	- Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần ($n=3$). Số liệu xử lý trên Microsoft Excel 2016, biểu diễn dạng Giá trị trung bình $\pm$ Độ lệch chuẩn (TB $\pm$ SD).

---

Nội dung chính theo từng chương

Tổng quan về Leuprolid acetat, vi cầu PLGA và cơ chế giải phóng dược chất

Chương 1 hệ thống hóa cơ sở lý thuyết chuyên sâu về hoạt chất, dạng bào chế và động học phân hủy polyme:

• Leuprolid acetat: Cấu trúc phân tử nonapeptid $p\text{Glu}^1\text{-His}^2\text{-Trp}^3\text{-Ser}^4\text{-Tyr}^5\text{-D-Leu}^6\text{-Leu}^7\text{-Arg}^8\text{-Pro}^9\text{-NHEt}$, trong đó acid amin dạng D góp phần làm tăng độ bền sinh học. LA tác động kích thích mạnh thụ thể tuyến yên gây tăng tiết LH và FSH trong 3 ngày đầu, sau đó ức chế hoàn toàn trục tuyến yên – tuyến sinh dục theo cơ chế "feedback âm" khi sử dụng liều điều trị liên tục.
• Hệ vi cầu PLGA: Phân tích ưu nhược điểm của phương pháp nhũ hóa kép $W_1/O/W_2$ kết hợp bốc hơi dung môi và phương pháp đông khô. Đông khô giúp hạn chế thủy phân peptid và tạo sản phẩm xốp mịn dễ hoàn nguyên, nhưng cần tối ưu hóa loại và nồng độ tá dược tạo khung.
• Cơ chế giải phóng: Phân tích bản chất các pha giải phóng. Pha burst release phụ thuộc vào lượng thuốc tự do hoặc liên kết lỏng lẻo ở bề mặt; pha lag xuất hiện do tốc độ hydrat hóa polyme chậm hoặc do sự kết tụ vi cầu ở trạng thái dẻo; pha erosion diễn ra khi mạch polyme bị thủy phân đến khối lượng phân tử tới hạn (khoảng 20 kDa), cấu trúc vi cầu bị phá vỡ hoàn toàn và giải phóng lượng thuốc còn lại theo động học bậc không biểu kiến.

Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 trình bày chi tiết về xuất xứ, tiêu chuẩn chất lượng của 21 loại hóa chất/nguyên liệu và 14 trang thiết bị thực nghiệm:

• Toàn bộ hóa chất như Leuprolid acetat, Gelatin type B đều đạt tiêu chuẩn Dược điển Châu Âu (EP8); Natri clorid, Nước pha tiêm đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam V (DĐVN V); các loại polyme PLGA (50:50, 7–17 kDa; 50:50, 24–38 kDa; 75:25, 4–15 kDa) từ hãng Sigma-Aldrich (Đức).
• Thiết lập quy trình 4 giai đoạn chuẩn bị pha nước/pha dầu, nhũ hóa sơ cấp/thứ cấp, đóng rắn/thu hồi và đông khô vi cầu.
• Thiết lập và thẩm định các phương pháp định lượng LA bằng HPLC và đo quang phổ huỳnh quang (phương trình tuyến tính có hệ số tương quan $R > 0,995$).

Thực nghiệm và kết quả

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm về tối ưu tá dược đông khô và khảo sát cơ chế giải phóng dược chất:

1. Khảo sát tá dược đông khô và nồng độ D-mannitol

Khảo sát ảnh hưởng của các tá dược tạo khung (D-mannitol, lactose, saccarose ở nồng độ 1,25% kl/tt và mẫu không dùng tá dược) cho thấy D-mannitol tạo bánh đông khô xốp, mịn, màu trắng đục, không co ngót và phân tán lại hoàn toàn tạo hỗn dịch đồng nhất. Tiếp tục khảo sát giảm nồng độ D-mannitol từ 10% (ở các nghiên cứu trước) xuống 1,25% (kl/tt) cho thấy kích thước tiểu phân và độ phân tán Span trước và sau đông khô biến thiên không đáng kể, đồng thời loại bỏ hiện tượng che lấp bề mặt vi cầu khi chụp ảnh SEM.

2. Khảo sát giải phóng in vitro ở điều kiện dài hạn ($37^\circ\text{C}$, 56 ngày)

Nghiên cứu tiến hành so sánh hai mẫu vi cầu:

• Mẫu M5 (phối hợp PLGA 50:50 7–17 kDa và PLGA 50:50 24–38 kDa theo tỷ lệ 7:3): Giải phóng theo mô hình 3 pha. Pha burst (ngày 0–4) giải phóng 27,42%; pha giải phóng ổn định (ngày 4–21) đạt tổng 50,80%; pha giải phóng nhanh do ăn mòn polyme (ngày 21–28) giải phóng thêm 24,08%; sau đó tiếp tục ăn mòn chậm đến ngày 56 đạt tổng lượng giải phóng 92,18%. Ảnh SEM cho thấy ở ngày 21 vi cầu vỡ thành các mảnh nhỏ, giải phóng ồ ạt dược chất trong lõi.
• Mẫu M7 (phối hợp PLGA 50:50 24–38 kDa và PLGA 75:25 4–15 kDa theo tỷ lệ 3:7): Giải phóng theo mô hình 2 pha. Pha burst (ngày 0–4) giải phóng 33,92%; pha giải phóng ổn định kéo dài từ ngày 4 đến ngày 56 (ngày 21 đạt 51,25%, ngày 56 đạt 88,60%). Do PLGA 75:25 có tỷ lệ acid lactic cao hơn nên kỵ nước hơn, tốc độ thủy phân chậm hơn; ảnh SEM cho thấy ở ngày 28 vi cầu vỡ thành các mảng lớn và ăn mòn từ từ, không tạo pha giải phóng nhanh đột ngột.

3. Khảo sát giải phóng in vitro ở điều kiện cấp tốc ($50^\circ\text{C}$, 54 giờ)

• Nhóm phối hợp PLGA (50:50) 7–17 kDa và PLGA (50:50) 24–38 kDa (M4 tỷ lệ 8:2; M5 tỷ lệ 7:3; M6 tỷ lệ 6:4): Cả 3 mẫu đều giải phóng theo mô hình 3 pha (burst 0–7 giờ, lag 7–24 giờ, giải phóng nhanh sau 24 giờ). Tăng tỷ lệ polyme KLPT thấp làm tăng lượng thuốc nạp và tăng giải phóng ban đầu. Mẫu M5 đạt tỷ lệ giải phóng 63,44% ở 30 giờ. Tuy nhiên, cả 3 mẫu đều có pha lag kéo dài và chưa đạt tiêu chuẩn $\ge 85%$ ở 30 giờ. Ảnh SEM chỉ ra ở $50^\circ\text{C}$ (trên $T_g$), các vi cầu bị mềm dẻo, kết tụ thành khối làm giảm diện tích tiếp xúc với môi trường và hình thành lớp màng bề mặt ("skin") cản trở khuếch tán.
• Nhóm phối hợp PLGA 50:50 với PLGA (75:25) 4–15 kDa và đơn polyme PLGA 75:25:
  • Mẫu M8 (PLGA 50:50 7–17 kDa : PLGA 75:25 4–15 kDa = 7:3) có pha burst 1 giờ cao (28,37% > 25%) và pha lag kéo dài (30 giờ chỉ đạt 55,72%).
  • Mẫu M7 đạt 65,20% ở 30 giờ.
  • Mẫu M9 (sử dụng 100% PLGA 75:25 khối lượng phân tử thấp 4–15 kDa): Đạt kết quả tối ưu nhất với mô hình giải phóng 2 pha liên tục, không xuất hiện pha lag. Tỷ lệ giải phóng tại 1 giờ đạt 21,99% (đáp ứng tiêu chuẩn $\le 25%$), tại 30 giờ đạt 83,68% (tiệm cận mức tiêu chuẩn $\ge 85%$ của chế phẩm đối chiếu Lucrin Depot).

Ảnh SEM mẫu M9 cho thấy ngay thời điểm ban đầu bề mặt vi cầu đã có hệ thống lỗ xốp dày đặc; sau 4 giờ, sự tích tụ các oligomer có tính acid trong lõi đã gây ra hiện tượng tự xúc tác phân hủy từ bên trong, tạo các lỗ xốp kích thước lớn trong lòng vi cầu (lớn hơn lỗ xốp ở ngoại vi) giúp dược chất khuếch tán liên tục ra ngoài mà không bị kết tụ.

Kết luận và kiến nghị

Chương 4 đúc kết các kết luận khoa học về quy trình đông khô, ảnh hưởng của bản chất và tỷ lệ polyme đến mô hình giải phóng (2 pha và 3 pha), đồng thời kiến nghị tiếp tục chuẩn hóa quy trình bào chế để tối ưu hóa hoàn toàn tiêu chuẩn giải phóng cấp tốc.

---

Kết quả và đóng góp

Bảng tổng hợp các công thức vi cầu và đặc tính giải phóng

Mẫu	Thành phần & Tỷ lệ Polyme	Mô hình giải phóng	% Giải phóng cấp tốc ($50^\circ\text{C}$) Thời điểm 1h / 7h / 30h	% Giải phóng dài hạn ($37^\circ\text{C}$) Thời điểm 4 ngày / 21 ngày / 56 ngày
M4	PLGA (50:50) 7-17k : PLGA (50:50) 24-38k (8:2)	3 pha (Burst - Lag - Nhanh)	1h: cao; 7h: ~45%; 30h: <63%	Không thử nghiệm dài hạn
M5	PLGA (50:50) 7-17k : PLGA (50:50) 24-38k (7:3)	3 pha (Dài hạn & Cấp tốc)	1h: đạt; 7h: ~48%; 30h: 63,44%	4 ngày: 27,42% 21 ngày: 50,80% 56 ngày: 92,18%
M6	PLGA (50:50) 7-17k : PLGA (50:50) 24-38k (6:4)	3 pha (Pha lag kéo dài nhất)	1h: thấp; 7h: thấp; 30h: thấp nhất	Không thử nghiệm dài hạn
M7	PLGA (50:50) 24-38k : PLGA (75:25) 4-15k (3:7)	2 pha (Burst - Ổn định)	1h: 23,31%; 7h: đạt; 30h: 65,20%	4 ngày: 33,92% 21 ngày: 51,25% 56 ngày: 88,60%
M8	PLGA (50:50) 7-17k : PLGA (75:25) 4-15k (7:3)	3 pha (Burst cao, Lag dài)	1h: 28,37% (>25%); 7h: đạt; 30h: 55,72%	Không thử nghiệm dài hạn
M9	100% PLGA (75:25) 4-15 kDa	2 pha (Giải phóng liên tục)	1h: 21,99% (≤25%); 7h: đạt; 30h: 83,68%	Không thử nghiệm dài hạn
Đối chiếu	Lucrin Depot PDS 3,75 mg (Takeda)	Tiêu chuẩn cấp tốc	1h: $\le 25%$; 7h: 45 – 75%; 30h: $\ge 85%$	Giải phóng kéo dài 1 tháng

Các phát hiện và đóng góp khoa học chính

1. Làm sáng tỏ cơ chế giải phóng qua phân tích hình thái vi mô (SEM):
   • Giai đoạn Burst release: Dược chất tự do hoặc nằm sát bề mặt hòa tan và khuếch tán nhanh qua hệ thống kênh, lỗ xốp bề mặt hình thành ngay khi tiếp xúc môi trường.
   • Giai đoạn Lag phase: Do sự dẻo hóa polyme ở nhiệt độ thử nghiệm gây kết tụ các vi cầu thành đám lớn làm giảm diện tích tiếp xúc với nước, kết hợp với sự hình thành cấu trúc màng đặc khít ("skin") ở bề mặt.
   • Giai đoạn Erosion: Sự thủy phân liên kết este sinh ra các oligomer acid tích tụ trong lõi hạt gây hiện tượng tự xúc tác phân hủy nội tại, hình thành các khoang rỗng lớn bên trong lòng vi cầu trước khi phá vỡ toàn bộ cấu trúc polyme.
2. Cải tiến công thức đông khô: Xác lập được nồng độ D-mannitol 1,25% (kl/tt) là nồng độ tối ưu, vừa bảo vệ cấu trúc hạt, không làm biến đổi phân bố KTTP, vừa tạo bánh đông khô xốp mịn và không gây cản trở việc quan sát vi cấu trúc bằng SEM như nồng độ 10% ở các nghiên cứu trước.
3. Lựa chọn loại polyme tối ưu: Chứng minh việc sử dụng 100% polyme PLGA (75:25) khối lượng phân tử thấp 4–15 kDa (mẫu M9) giúp triệt tiêu hoàn toàn pha lag không mong muốn, tạo động học giải phóng 2 pha liên tục và đạt độ tương thích cao nhất với chế phẩm thương mại Lucrin Depot ở điều kiện thử cấp tốc (83,68% sau 30 giờ).

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Do điều kiện trang thiết bị và thời gian nghiên cứu thực nghiệm có hạn, công thức tối ưu M9 dù đã đạt mức giải phóng 83,68% ở thời điểm 30 giờ trong điều kiện cấp tốc nhưng vẫn chưa đạt ngưỡng tuyệt đối $\ge 85%$ theo tiêu chuẩn của nhà sản xuất Lucrin Depot.
• Hướng nghiên cứu tiếp: Tác giả kiến nghị tiếp tục nghiên cứu sâu hơn, chuẩn hóa các thông số kỹ thuật của quy trình bào chế (tốc độ khuấy, tỷ lệ thể tích các pha, thông số chu trình đông khô) nhằm hoàn thiện công thức vi cầu PLGA-LA đạt hoàn toàn các tiêu chuẩn giải phóng cấp tốc tương đương với chế phẩm đối chiếu thương mại.

---

Giá trị tham khảo

• Đối tượng sử dụng: Khóa luận là tài liệu tham khảo chuyên khảo hữu ích cho sinh viên, học viên cao học, nghiên cứu sinh ngành Dược học (chuyên ngành Bào chế và Công nghệ Dược phẩm, Hóa phân tích), cũng như các kỹ thuật viên, nghiên cứu viên đang phát triển hệ phân phối thuốc giải phóng kéo dài chứa hoạt chất sinh học (peptid, protein).
• Nội dung giá trị:
  • Quy trình chi tiết phương pháp nhũ hóa kép $W_1/O/W_2$ kết hợp bốc hơi dung môi để nạp các dược chất peptid tan trong nước.
  • Bộ thông số kỹ thuật đông khô vi cầu PLGA (tiền đông $-70^\circ\text{C}$ trong 7 giờ, thăng hoa $-50^\circ\text{C}$ ở áp suất 0,04 mbar trong 24 giờ với tá dược D-mannitol 1,25%).
  • Phương pháp xây dựng và thẩm định mô hình thử nghiệm giải phóng in vitro dài hạn (56 ngày) và cấp tốc ($50^\circ\text{C}$) ứng dụng kỹ thuật quang phổ huỳnh quang và kính hiển vi điện tử quét SEM để giải thích cơ chế động học giải phóng.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Quy trình bào chế vi cầu PLGA-LA trong nghiên cứu được thực hiện qua những giai đoạn chính nào?

Quy trình gồm 4 giai đoạn:

1. Chuẩn bị pha nước nội $W_1$ (LA 60 mg, Gelatin 6,6 mg trong 0,6 ml đệm phosphat pH 7,4) và pha dầu $O$ (PLGA 360 mg trong 4 ml DCM).
2. Tạo nhũ tương sơ cấp $W_1/O$ bằng máy đồng nhất hóa (12.000 vòng/phút, 5 phút), sau đó tạo nhũ tương kép $W_1/O/W_2$ với 10 ml dung dịch PVA 1,5% – NaCl 1,5% (4.000 vòng/phút, 40 giây) trong điều kiện ngâm nước đá.
3. Pha loãng với 20 ml dung dịch PVA 1,5% – NaCl 1,5%, sục khí $N_2$ (20 ml/phút, 30 phút) để làm bay hơi DCM và rắn hóa vi cầu; ly tâm lạnh (5.000 vòng/phút, 5 phút, $5^\circ\text{C}$) và rửa 2 lần bằng nước cất.
4. Phân tán bột nhão vi cầu trong dung dịch D-mannitol 1,25%, rây qua rây 125 µm, đóng lọ 2 ml và tiến hành đông khô.

2. Tại sao nghiên cứu lại giảm nồng độ tá dược đông khô D-mannitol từ 10% xuống 1,25% (kl/tt)?

Ở nồng độ 10% (sử dụng trong các nghiên cứu trước), lượng tá dược tạo khung quá lớn bám dính dày đặc trên bề mặt hạt, gây khó khăn lớn cho việc quan sát hình thái vi cấu trúc và hệ thống lỗ xốp của vi cầu trên kính hiển vi điện tử quét SEM. Khảo sát thực nghiệm cho thấy nồng độ D-mannitol 1,25% (kl/tt) vẫn đảm bảo tạo bánh đông khô đẹp, xốp mịn, không co ngót, dễ phân tán lại hoàn toàn, không làm thay đổi phân bố KTTP và Span, đồng thời cho phép quan sát rõ nét bề mặt và mặt cắt vi cầu dưới kính hiển vi SEM.

3. Sự khác biệt về mô hình giải phóng in vitro dài hạn giữa mẫu M5 (PLGA 50:50) và mẫu M7 (PLGA 75:25) là gì?

• Mẫu M5 (PLGA 50:50): Giải phóng theo mô hình 3 pha. Do tỷ lệ acid glycolic cao hơn (thân nước hơn), tốc độ thủy phân liên kết este diễn ra nhanh, làm vi cầu vỡ thành các mảnh nhỏ sau 21 ngày, tạo nên một pha giải phóng nhanh (rapid phase) từ ngày 21 đến ngày 28 (giải phóng 24,08%) trước khi ăn mòn hoàn toàn ở ngày 56 (tổng giải phóng 92,18%).
• Mẫu M7 (chứa 70% PLGA 75:25): Giải phóng theo mô hình 2 pha. Acid lactic có nhóm methyl kỵ nước làm giảm tính thấm nước và làm chậm tốc độ suy thoái polyme. Vi cầu vỡ thành các mảng lớn và cốt polyme bị ăn mòn rất chậm từ ngày 28 đến ngày 56, duy trì tốc độ giải phóng ổn định liên tục mà không tạo pha bùng phát nhanh (tổng giải phóng đạt 88,60% ở ngày 56).

4. Nguyên nhân nào gây ra hiện tượng pha lag (trì hoãn giải phóng) ở các công thức M4, M5, M6 và M8 trong điều kiện cấp tốc?

Hiện tượng pha lag kéo dài ở các mẫu này được giải thích bởi hai cơ chế:

1. Ở nhiệt độ thử cấp tốc ($50 \pm 0,5^\circ\text{C}$), nhiệt độ môi trường vượt quá nhiệt độ chuyển hóa thủy tinh ($T_g$) của polyme, khiến các chuỗi PLGA chuyển sang trạng thái dẻo và làm các hạt vi cầu bị kết tụ thành các khối/mảng lớn, làm giảm mạnh diện tích bề mặt tiếp xúc trực tiếp với môi trường hòa tan.
2. Quá trình hydrat hóa ban đầu tạo ra cấu trúc màng dày đặc ("skin") ở bề mặt ngoài của vi cầu, ngăn cản nước thấm sâu vào lõi và cản trở sự khuếch tán của phân tử dược chất ra ngoài cho đến khi polyme bị ăn mòn và nứt vỡ.

5. Công thức bào chế nào cho khả năng giải phóng in vitro cấp tốc tối ưu nhất và cơ chế giải phóng của mẫu này diễn ra như thế nào?

Công thức tối ưu nhất là Mẫu M9 (sử dụng 100% PLGA 75:25 khối lượng phân tử 4–15 kDa). Mẫu này giải phóng theo mô hình 2 pha liên tục, không có pha lag; đạt tỷ lệ giải phóng 21,99% tại 1 giờ (đáp ứng tiêu chuẩn $\le 25%$) và 83,68% tại 30 giờ (tiệm cận tiêu chuẩn $\ge 85%$ của Lucrin Depot).

Cơ chế giải phóng của M9: Sự kết hợp giữa tỷ lệ LA:GA = 75:25 và khối lượng phân tử thấp giúp tạo hệ thống lỗ xốp dày đặc ngay từ đầu; trong quá trình thử nghiệm, các oligomer acid sinh ra trong lòng vi cầu tích tụ lại gây hiện tượng tự xúc tác làm tăng tốc độ ăn mòn từ bên trong lõi hạt, mở rộng các kênh dẫn ra ngoài, giúp dược chất khuếch tán liên tục mà không bị kết tụ hạt.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Vũ Thị Hồng Hạnh đã hoàn thiện quy trình bào chế vi cầu đông khô nạp leuprolid acetat bằng phương pháp nhũ hóa kép $W_1/O/W_2$ kết hợp bốc hơi dung môi với tá dược tạo khung tối ưu D-mannitol 1,25% (kl/tt). Nghiên cứu đã làm sáng tỏ ảnh hưởng cốt lõi của tỷ lệ monome LA/GA và khối lượng phân tử polyme PLGA đến động học giải phóng in vitro ở cả điều kiện dài hạn và cấp tốc, chỉ ra vai trò của hiện tượng tự xúc tác phân hủy nội tại và kết tụ hạt qua hình thái học SEM. Kết quả thực nghiệm đã xác định công thức M9 (100% PLGA 75:25, 4–15 kDa) có đặc tính giải phóng liên tục 2 pha tiệm cận gần nhất với chế phẩm đối chiếu Lucrin Depot PDS 3,75 mg, cung cấp dữ liệu khoa học có giá trị cao cho việc phát triển các dạng thuốc tiêm giải phóng kéo dài chứa hoạt chất peptid.

Trích đoạn nội dung tài liệu

BỘ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI vũ THỊ HỒNG HẠNH NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ Cơ CHÉ GIẢI PHÓNG DƯỢC CHẤT TỪ VI CẦU LEUPROLID ACETAT ĐÔNG KHÔ KHÓA LUẬN • TỐT NGHIỆP • DƯỢC • sĩ HÀ NỘI - 2022 BỘ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI vũ THỊ HỒNG HẠNH Mã sinh viên: 1701174 NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ Cơ CHÉ GIẢI PHÓNG DƯỢC CHẤT TỪ VI CẦU LEUPROLID ACETAT ĐÔNG KHÔ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ Người hướng dẫn: 1. Trần Thị Hải Yến 2. Bùi Thị Thương Nơi thực hiện: Bộ môn Bào Chế HÀ NỘI - 2022 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và bày tỏ lòng kính trọng đến: PGS.TS Trần Thị Hải Yến Là người đã tận tâm chỉ dẫn, hết lòng giúp đỡ, quan tâm và tạo điều kiện cho em thực hiện khóa luận này. Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến ThS.

Bùi Thị Thu’O’ng - người đã luôn quan tâm và hỗ trợ em trong quá trình làm đề tài. Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể các thầy cô, các anh chị kĩ thuật viên tại bộ môn Bào chế, bộ môn Hóa phân tích, bộ môn Công nghiệp Dược, bộ môn Vật lý Hóa lý đã nhiệt tình giúp đỡ, hướng dẫn em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận này. Em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các thầy cô trong Ban Giám hiệu nhà trường, các phòng ban và cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã tạo điều kiện cho em được học tập tiếp thu kiến thức trong suổt 5 năm qua. Cuối cùng, em cảm ơn gia đình - nguồn động lực to lớn để em luôn cố gắng học tập và nghiên cứu.

Em cũng xin chân thành cảm ơn bạn bè, tập thể sinh viên đà cùng đồng hành, động viên em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Hà Nội, ngày 27 tháng 6 năm 2022 Sinh viên khóa 72 Vũ Thị Hồng Hạnh MỤC LỤC DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẲT. 6 DANH MỤC CÁC BẢNG. 7 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, sơ ĐÒ, ĐÒ THỊ.

Tổng quan về Leuprolid acetat. Công thức hóa học. Tính chất vật lý, hóa học. ứng dụng trong điều trị.

Tổng quan về vi cầu PLGA. Phương pháp bào chế vi cầu PLGA bằng nhũ hóa kép kết hợp bốc hơi dung môi. Tổng quan về đông khô vi cầu PLGA. Tổng quan về cơ chế giải phóng dược chất từ vi cầu PGLA.

Một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng giải phóng dược chat in vitro. Đánh giá cơ chê giải phóng dược chât in-vitro từ vi câu giải phóng kéo dài ở điều kiện cấp tốc. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CÚƯ. Nguyên vật liệu, thiết bị sử dụng.

Nguyên vật liệu. Nội dung nghiên cứu. Bào chế vi cầu PLGA - LA bằng phương pháp nhũ hóa kép kết họp bốc hơi dung môi. Khảo sát một số yếu tố công thức ảnh hưởng đến đặc tính của vi cầu PLGA - LA đông khô.

Nghiên cứu cơ chế giải phóng dược chất từ vi cầu PLGA - LA. Phương pháp nghiên cứu. Phương pháp bào chế vi cầu PLGA-LA. Phương pháp đánh giá một số đặc tính của vi cầu đông khô PLGA-LA.

Phương pháp đánh giá giải phóng dược chất in vitro điều kiện dài hạn. Phương pháp đánh giá giải phóng dược chất in vitro điều kiện cấp tốc. Phương pháp xử lý số liệu. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ.

Khảo sát ảnh hưởng của tá dược đông khô đến vi cầu PLGA - LA đông khô. Điều kiện và thông số của quy trình đông khô. Ảnh hưởng của tá dược đông khô đến vi cầu đông khô PLGA-LA. Ành hưởng của nồng độ D- manitol vi cầu đông khô PLGA- LA.