MỞ ĐẦU Ngày nay, khi xã hội ngày càng phát triển thì vấn đề sức khỏe của con người ngày càng được quan tâm, đặc biệt là các sản phẩm liên quan trực tiếp đến sức khỏe con người. Trong y học hiện đại, các β - Lactam là thuốc kháng sinh tổng hợp quan trọng chữa bệnh con người, thú y từ khi chúng được giới thiệu vào thị trường vào năm 1938 và là loại kháng sinh được dùng nhiều nhất hiện nay. Nhờ các thuốc kháng sinh mà y học có thể loại bỏ được các dịch bệnh nguy hiểm như dịch hạch, tả, thương hàn, và điều trị hiệu quả nhiều bệnh gây ra bởi vi khuẩn. Nhưng, nếu liều lượng và cách dùng kháng sinh không đúng sẽ dễ bị vi khuẩn nhờn thuốc, kháng thuốc, từ đó việc chữa trị càng khó khăn.
Ngoài ra, còn gây lãng phí cho người bệnh vì có những bệnh do vi rút không chữa được bằng kháng sinh nhưng vẫn dùng kháng sinh, gây khó khăn cho việc chuẩn đoán các bệnh và ảnh hưởng tới sức khỏe người bệnh. Đối với những người cao tuổi , lươ ̣ng dư kháng sinh trong nư ớc tiểu nhiề u, còn gây ra các bệnh về thận. Đồng thời, lươ ̣ng dư này thải ra môi trường sẽ gây lên những hâ ̣u quả vô cùng nghiêm tro ̣ng. Vì vậy, kiểm soát và phân tích thuốc kháng sinh đối với người bệnh là biện pháp cần thiết để nâng cao hiệu quả sử dụng chúng.
Có rất nhiều phương pháp tách khác nhau. Trong đó, phương pháp tách sắc ký là phương pháp tách chọn lọc có độ nhạy cao, lượng mẫu bơm ít, thời gian phân tích ngắn. Tách và xác định đồng thời kháng sinh β - Lactam bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng detector huỳnh quang trong mẫu sinh học và dược phẩm là một hướng nghiên cứu mới, với những ưu điểm của nó ngày càng được áp dụng nhiều trong các phòng thí nghiệm và phân tích mẫu dịch vụ. Trên cơ sở đó, chúng tôi chọn đề tài là: “Nghiên cứu điều kiện phân tích thuốc kháng sinh họ β - Lactam trong các mẫu sinh học và dƣợc phẩm ”.
Chuyên ngành Hoá Phân tích 8 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung CHƢƠNG 1. Kháng sinh β - Lactam 1. Định nghĩa Là các kháng sinh mà phân tử chứa vòng β-Lactam. Gồm các nhóm: penicillin, cephalosporin, monobactam, cacbapenem trong đó hai nhóm sử dụng phổ biến và lớn nhất là penicillin và cephalosporin.
Các penicillin thu được từ môi trường nuôi cấy nấm Penicilium notatum và Penicillium chryrogenum, bán tổng hợp từ axit 6-amino penicillanic (6APA). Các cephalosporin tự nhiên được phân lập từ môi trường nuôi cấy nấm Cephalosporium acremonium và bán tổng hợp từ axit 7-amino cephalosporinic (7ACA) xuất phát từ các kháng sinh thiên nhiên [1]. Cấu trúc và phân loại * Các penicillin Các penicillin đều có cấu trúc cơ bản gồm 2 vòng: vòng thiazolidin, vòng β- Lactam S R CO N 4 CH3 H 6 5 3 7 1 N 2 CH3 O COOM Hình 1. Công thức cấu tạo các kháng sinh penicillin Tên gọi chung công thức của các penicillin khi chưa có gốc R là: (2S,5R,6R 3,3-dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.0]heptane-2-carboxylic acid Khi thay thế R bằng các gốc khác nhau, những cacbon bất đối có cấu hình 2S, 5R, 6R ta có các penicilin có độ bền, dược động học và phổ kháng khuẩn khác nhau.
Với M là gốc cation thường là: K, Na, H. Nhóm kháng sinh penicillin được chia thành 3 nhóm chính với hoạt tính khác nhau [1]. Chuyên ngành Hoá Phân tích 9 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung Bảng 1. Phân loại và cấu trúc một số penicillin Tên kháng sinh R Hoạt tính Gồm các Penicillin tự Nhóm penicillin PenicillinG CH2- nhiên và dẫn chất.Phổ tự nhiên (PENG) hẹp: vi khuẩn gram(+).
Benzyl Benzathin Không kháng β- lactamase CH3 Nhóm penicillin kháng penicilliiase C- Oxacillin N O Là các Penicillin bán (OXA) 6-[(5-methyl-3-phenyl-1,2-oxazole-4- tổng hợp. Phổ hẹp như carbonyl)amino] nhóm I. Kháng O Cl N C- penicilliiase, không tác động vào vòng β – Cloxacillin CH3 Lactam được. phenylacetyl]amino) Không kháng β- NH2NH2 Amoxicill CH- lactamase và (AMO) penicilliiase HO 6-{[(2R)-2-amino-2-(4- hydroxyphenyl)-acetyl]amino} Chuyên ngành Hoá Phân tích 10 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung * Các cephalosporin Các cephalosporin cấu trúc chung gồm 2 vòng: vòng β-Lactam 4 cạnh gắn với 1 dị vòng 6 cạnh, những cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R.
Khác nhau bởi các gốc R R2 S R1 CO N 1 7 6 2 H 8 3 N5 4 R3 O COOM Hình 1. Công thức cấu tạo các kháng sinh cephalosporin Tên gọi chung của các cephalosporin khi chưa có gốc R là: (6R,7R) 8-oxo-5- thia-1-azabicyclo[4.0]oct-2-ene-2-carboxylic acid Khi thay đổi các gốc R, những cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R được các cephalosporin có độ bền, tính kháng khuẩn và dược động học khác nhau. Dựa vào khổ kháng khuẩn, chia các cephalosporin thành 4 thế hệ. Các cephalosporin thế hệ trước tác dụng trên vi khuẩn gram dương mạnh hơn, nhưng trên gram âm yếu hơn thế hệ sau [1].
Phân loại và cấu trúc của các cephalosporin Kháng sinh R1 R2 R3 I: tác dụng Cephalexin CH- mạnh nhất H -CH3 (CEP) NH2 trên vi khuẩn gram (+), yếu Cephapirin SCH2- H -CH2-OCOCH3 nhất trên gram (-). Không bền và N N N dễ bị β- Cephazolin N CH2- H lactamase phá N N -CH2 S CH3 hủy Chuyên ngành Hoá Phân tích 11 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung II: tác dụng Cefaclor CH- yếu hơn trên H Cl (CEF) NH2 vi khuẩn gram (+), mạnh hơn trên gram (-) so HO CH- Cefprozil H -CH=CH-CH3 với thế hệ I. NH2 Bền với β- lactamase. III: tác dụng H2N N yếu hơn trên Cefixim S N H -CH=CH2 vi khuẩn HOOCCH2O gram (+) so với thế hệ I, tác dụng H2N N mạnh trên + gram (-).
Bền Ceftazidim S N H -CH2 N HOOCC(CH3)2O với β- lactamase IV: hoạt phổ tác dụng như H2N N thế hệ III + nhưng tốt hơn Cefepim S N H -H2C N và kháng CH3O CH3 nhiều β- lactamase hơn Chuyên ngành Hoá Phân tích 12 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung 1. Tính chất vật lý và hoá học Các β-lactam thường ở dạng bột kết tinh màu trắng, dạng axit ít tan trong nước, dạng muối natri và kali dễ tan; tan được trong metanol và một số dung môi hữu cơ phân cực vừa phải. Tan trong dung dịch axit và kiềm loãng do đa phần chứa đồng thời nhóm –COOH và –NH2. Cực đại hấp phụ chủ yếu do nhân phenyl, tùy vào cấu trúc khác làm dạng phổ thay đổi (đỉnh phụ, vai, sự dịch chuyển sang bước sóng ngắn hoặc dài, giảm độ hấp thụ).
Các β-lactam là các axit với nhóm –COOH có pKa= 2,5-2,8 tùy vào cấu trúc phân tử. Trong môi trường axit, kiềm, β-lactamase có tác dụng phân cắt khung phân tử, mở vòng β-lactam làm kháng sinh mất tác dụng. Hằng số axit của các kháng sinh nghiên cứu [2] Tên kháng Tên kháng pKa1 Tên kháng sinh pKa1 pKa1 sinh sinh AMP 2,7 CEP 2,6 CEF 2,75 1. Tác dụng Cơ chế: Các penicillin có khả năng acyl hóa các D- alanin tranpeptidase, làm cho quá trình tổng hợp peptidoglycan không được thực hiện.
Sinh tổng hợp vách tế bào bị ngừng lại và ít tác dụng trên vi khuẩn gram (-). Mặc khác, các penicillin còn hoạt hóa enzim tự phân giải murein hydroxylase làm tăng phân hủy vách tế bào, kết quả là vi khuẩn bị tiêu diệt. Ngăn cản xây dựng và giảm độ bền của màng tế bào vi khuẩn nên chủ yếu kìm hãm sự tồn tại và phát triển của vi khuẩn. Các kháng sinh β-lactam có hoạt phổ rộng [13].
Chuyên ngành Hoá Phân tích 13 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung Kháng thuốc: Vi khuẩn sinh ra các β-lactamase, là enzim có tác dụng mở vòng β-lactam, theo phản ứng ái nhân vào nhóm C=O, làm kháng sinh mất tác dụng. Tất cả các cách kháng không sinh ra β-lactamase để thực hiện gọi là kháng gián tiếp (được gọi là kháng methicillin) [13] Độc tính: Các kháng sinh β-lactam độc tính thấp, nhưng cũng dễ gây dị ứng thuốc: dị ứng, mày đay, vàng da, gây độc với thận, rối loạn tiêu hóa…nguy hiểm nhất là sốc phản vệ [13]. Thuốc không dùng cho trẻ sơ sinh và bà mẹ trong thời kỳ cho con bú. Chống chỉ định dị ứng với thành phần của thuốc.
Đánh giá tác dụng kháng sinh: Theo đơn vị tác dụng: 1 IU là tác dụng của 0,6 g penicillin G natri tinh khiết trên một chủng mẫu tụ cầu. Hoạt lục của 1mg chất này là 1667 IU. 1 IU sẽ ứng với 0,672 g penicillin G kali tinh khiết, với 1mg chất này ứng với 1585 IU [13]. Điều chế Sinh tổng hợp: Là phương pháp chủ yếu nuôi cấy chủng nấm Penicillium nonatum hoặc Penicillium chrysogennum trong môi trường và điều kiện thích hợp.
Chiết xuất dạng kết tinh và muối natri hoặc kali. Để cho hiệu suất cao thường gây đột biến bằng mù tạt, tia X hoặc tia UV, rồi chọn lọc lấy chủng nấm tốt theo ý muốn, đồng thời thêm vào môi trường nuôi cấy các tiền chất thích hợp để định hướng cho quá trình sinh tổng hợp. Ví dụ khi sản xuất penicillin G, tiền chất thêm vào là acid phenylacetic. Tuy nhiên không phải tiền chất nào cũng định hướng được quá trình lên men.
Trong môi trường nuôi cấy có tạo ra các acid amin → peptid → polypeptide. Penicillin tạo thành từ một tripeptid, sau đó acyl hoá bởi men. Chuyên ngành Hoá Phân tích 14 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung Bán tổng hợp: Các penicillin bán tổng hợp bằng cách chế tạo acid 6-amino penicillanic (A6AP). Nuôi cấy nấm penicillium không thêm tiền chất, khi đó môi trường dồi dào A6AP, chiết lấy trực tiếp.
Tách phần phenylacetyl (C6H5-CH2-CO-) khỏi phân tử penicillin G bằng acylase thích hợp rồi chiết lấy A6AP. Acyl hoá A6AP với clorid acid trong môi trường acetone, có mặt triethylamin để hấp thu HCl giải phóng ra trong phản ứng được penicillin khác. Tổng hợp hoá học: Chưa được ứng dụng rộng rãi. Tình hình lạm dụng kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay Ta biết rằng, có nhiều loại kháng sinh khác nhau, tác động bằng các cơ chế khác nhau đối với các vi trùng khác nhau.
Kháng sinh chỉ có tác dụng với các bệnh do vi trùng (bacteria), không có tác dụng với các bệnh do siêu vi (virus). Để điều trị bệnh nhiễm trùng cần biết loại vi trùng gây bệnh để chọn kháng sinh thích hợp. Vì thiếu hiểu biết và vì tin tưởng sai lầm, nên ở khắp nơi trên thế giới, nhất là ở các nước đang phát triển, người ta đã dùng kháng sinh quá nhiều, cả khi không cần thiết, không đúng chỉ định và không đúng cách.