Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Cây Đỏ ngọn, còn gọi là cây Thành ngạnh (danh pháp khoa học: Cratoxylum formosum (Jack) Benth.f ex Dyer hay Cratoxylum pruniflorum Kurtz), thuộc họ Ban (Hypericaceae), là loài thực vật phân bố phổ biến tại Đông Nam Á và các tỉnh trung du miền Bắc, Trung Bộ, Tây Nguyên của Việt Nam. Trong y học cổ truyền và kinh nghiệm dân gian, lá Đỏ ngọn được dùng làm trà thảo dược, có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, hỗ trợ tiêu hóa, phục hồi sức khỏe cho phụ nữ sau sinh, điều hòa tuần hoàn và cải thiện trí nhớ. Tại Việt Nam, nguồn dược liệu này đã được ứng dụng trong một số chế phẩm như bột cao khô phun sấy, trà thực phẩm chức năng TANAKA (nghiên cứu bởi Học viện Quân y, Bộ Y tế cấp phép lưu hành theo số 4375/2008/YT-TPCN) và các sản phẩm trà thảo mộc tại cơ sở Saman (Thái Nguyên).

Về mặt hóa thực vật, các nghiên cứu trong và ngoài nước đã xác định loài Đỏ ngọn chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học thuộc nhóm xanthon và phenolic. Tuy nhiên, các dữ liệu nghiên cứu về nhóm hợp chất flavonoid trong loài này tại Việt Nam còn hạn chế, dù flavonoid là nhóm chất đóng vai trò quan trọng trong tác dụng chống oxy hóa, kháng viêm, bảo vệ thành mạch và ức chế tế bào ung thư.

Trong hệ thống tiêu chuẩn quốc gia, chuyên luận "Ngành ngạnh (Lá) - Folium Cratoxylum pruniflorum" được quy định trong Dược điển Việt Nam V (DĐVN V) mới chỉ đưa ra các chỉ tiêu cơ bản về cảm quan, vi phẫu, đặc điểm bột, định tính bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng (TLC), độ ẩm (không quá 12,0%), tro toàn phần (không quá 5,0%), tỷ lệ vụn nát (không quá 3,0%), tạp chất (không quá 1%) và chất chiết được bằng ethanol 96% (không ít hơn 20,0%). Chuyên luận này hiện chưa thiết lập chỉ tiêu tro không tan trong acid hydrocloric, chưa có giới hạn định lượng hoạt chất hóa học đặc trưng cũng như các quy chuẩn kiểm soát hoạt chất bằng phương pháp hiện đại.

Xuất phát từ thực tiễn trên, đề tài "Góp phần xây dựng một số chỉ tiêu chất lượng dược liệu Đỏ ngọn" được thực hiện nhằm giải quyết 2 mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

  1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng flavonoid (isoquercitrin) trong dược liệu Đỏ ngọn bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
  2. Xây dựng một số chỉ tiêu chất lượng cho dược liệu Đỏ ngọn (bao gồm cảm quan, vi phẫu, bột, định tính hóa học, độ ẩm, độ tro toàn phần, tro không tan trong acid hydrocloric và định lượng hoạt chất).

Đối tượng nghiên cứu là lá của cây Đỏ ngọn được thu hái tại 3 vùng địa lý khác nhau vào tháng 4 năm 2024: Ba Vì - Hà Nội (ký hiệu mẫu ĐN1), Quảng Ninh (ĐN2) và Tam Đảo - Vĩnh Phúc (ĐN3). Các mẫu thực vật được giám định tên khoa học là Cratoxylum formosum subsp. pruniflorum (Kurz) Gogelein, tiêu bản lưu trữ tại Bộ môn Dược học cổ truyền, Khoa Dược liệu – Dược học cổ truyền, Trường Đại học Dược Hà Nội. Thời gian thực hiện và hoàn thành nghiên cứu: tháng 5 năm 2024.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận được triển khai dựa trên các cơ sở lý luận thực vật học, dược điển và tiêu chuẩn phân tích kiểm nghiệm:

  • Khung phân loại và tiêu chuẩn pháp lý: Căn cứ hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan (2009) (xếp chi Cratoxylum thuộc họ Ban Hypericaceae) và tài liệu Thực vật chí Trung Quốc (xếp thuộc họ Clusiaceae); các hướng dẫn về phương thức xây dựng tiêu chuẩn cơ sở (TCCS) của Dược điển Việt Nam V, Dược điển châu Âu và các quy định pháp luật liên quan đến tiêu chuẩn thuốc tại Việt Nam (Luật Tiêu chuẩn và Quy chuẩn kỹ thuật).
  • Nguyên lý phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): Sử dụng hệ thống HPLC pha đảo (RP-HPLC) kết hợp detector quang phổ tử ngoại - khả kiến (UV-Vis) để định lượng hoạt chất isoquercitrin (quercetin-3-O-β-glucopyranoside, IQE). Quá trình thẩm định phương pháp phân tích tuân thủ đầy đủ hướng dẫn của Hiệp hội các nhà hóa phân tích chính thức quốc tế (AOAC International) về các tiêu chí: độ đặc hiệu, tính thích hợp hệ thống, khoảng tuyến tính, độ chụm (độ lặp lại và độ chính xác trung gian), độ đúng (tỷ lệ thu hồi), giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ).
  • Phương pháp nghiên cứu đặc điểm thực vật và vi học: Sử dụng phương pháp giải phẫu thực vật cắt lát mỏng vi phẫu gân chính và phiến lá tươi, tẩy bằng nước Javel, rửa acid acetic 5%, nhuộm kép bằng dung dịch đỏ son phèn và xanh methylen; phương pháp làm tiêu bản bột dược liệu khô qua rây 500, quan sát hình thái tế bào và mô dưới kính hiển vi quang học Labomed CxL ở độ phóng đại x10 và x40.
  • Phương pháp hóa học và hóa lý dược điển: Định tính sơ bộ các nhóm chất hữu cơ trong dịch chiết dược liệu bằng các phản ứng tạo màu và tạo tủa đặc trưng với các thuốc thử: Mayer, Dragendorff, Bouchardat, chì acetat 10%, gelatin 1%, đồng acetat 10%, dung dịch sắt (III) clorid 5%, diazo mới pha, phản ứng Cyanidin với bột magnesi và acid hydrocloric. Xác định mất khối lượng do làm khô bằng cách sấy ở 105°C trong 4 giờ đến khối lượng không đổi theo Phụ lục 9.6 DĐVN V. Xác định tro toàn phần bằng phương pháp nung tại nhiệt độ không quá 600 ± 25°C theo Phụ lục 9.8 DĐVN V. Xác định tro không tan trong acid hydrocloric bằng cách xử lý tro toàn phần với HCl 2M, lọc qua giấy lọc không tro và nung ở 500°C theo Phụ lục 9.7 DĐVN V.
  • Nguồn dữ liệu và trang thiết bị: Dữ liệu thực nghiệm thu thập trực tiếp trên các mẫu thực vật thu hái thực tế. Hóa chất đạt chuẩn phân tích và chuẩn HPLC, gồm chất chuẩn isoquercitrin (độ tinh khiết 98,2%, hàm ẩm 0,4%, hãng Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd, Trung Quốc). Thiết bị chính bao gồm: hệ thống HPLC Shimadzu LC-10ADxr với detector UV-Vis (D2&W), cột Kromasil® 100-5 C18 (250 × 4,0 mm, 5 µm), cân phân tích Mettler Toledo AB204-S, tủ sấy Memmert, lò nung, bể siêu âm Elmasonic S 100H, máy ly tâm Hermle Z207A. Xử lý dữ liệu thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel và SPSS phiên bản 26.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa các tài liệu khoa học trong và ngoài nước về chi Cratoxylum và loài Cratoxylum formosum, tổng quan về tiêu chuẩn hóa dược liệu và các kỹ thuật phân tích flavonoid.

Về thực vật và phân bố, chi Cratoxylum có nguồn gốc Đông Nam Á với 6 loài được công nhận, riêng tại Việt Nam ghi nhận 5 loài, phân bố chủ yếu ở vùng trung du miền Bắc, Trung Bộ và Tây Nguyên. Loài Cratoxylum formosum gồm hai phân loài: Cratoxylum formosum subsp. pruniflorum và Cratoxylum formosum subsp. formosum. Đây là cây gỗ nhỏ hoặc bụi, cành non có lông tơ màu đỏ, lá mọc đối hình mác, hoa trắng hoặc hồng có lông tía, quả nang 3 van chứa hạt có cánh.

Về thành phần hóa học, loài Đỏ ngọn chứa nhiều hợp chất tự nhiên thuộc các khung cấu trúc:

  • Xanthon: Các dẫn xuất prunifloron (từ prunifloron 1 đến 10), formoxanthon A, α-mangostin.
  • Flavonoid: Nhóm flavan (catechin-3-O-(3,4-dihydroxybenzoyl)); flavonol và flavonol glycosid (quercetin, quercitrin, hyperin/quercetin-3-O-β-galactopyranoside, afzelin/kaempferol-3-O-rhamnoside, isoquercitrin/quercetin-3-O-β-glucopyranoside, kaempferol 3-O-α-L-arabinopyranoside, kaempferol 3-O-α-L-rhamnopyranoside, quercetin 3-O-α-L-arabinofuranoside).

Về hoạt tính sinh học, các nghiên cứu in vitro và in vivo ghi nhận:

  • Khả năng chống oxy hóa: Dịch chiết lá Đỏ ngọn (tỷ lệ 1/16) đạt hoạt tính chống oxy hóa 69%. Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của dịch chiết lá thể hiện IC50 = 14,9 µg/ml; hàm lượng phenolic tổng số đạt 161,7 ± 2,7 mg đương lượng acid gallic/g dược liệu; nồng độ hiệu quả trên chuột nhắt trắng là 10,5 µg/ml. Isoquercitrin được xác định là hợp chất có hoạt tính loại bỏ gốc tự do mạnh nhất trong số các flavonoid phân lập ở nồng độ thử nghiệm 1 µl.
  • Kháng viêm: Quercitrin và các dẫn xuất glycosid (đặc biệt là quercetin) ức chế sản sinh NO ở đại thực bào kích thích bởi LPS.
  • Tác dụng thần kinh: Cao Đỏ ngọn làm tăng catecholamin máu và tăng nhẹ sóng beta trên điện não đồ thỏ, đồng thời tăng khả năng thành lập và dập tắt phản xạ có điều kiện trên chuột nhắt trắng.
  • Hạ đường huyết: Dịch chiết lá và thân ức chế mạnh men α-glucosidase với giá trị IC50 lần lượt là 3,9 µg/ml và 2,0 µg/ml.
  • Kháng ung thư: Dịch chiết Đỏ ngọn có tác dụng ức chế tế bào ung thư miệng, ung thư cổ tử cung, ung thư đường mật, ung thư vú và gây chết theo chu trình (apoptosis) trên dòng tế bào ung thư gan HepG2 ở người.

Về tiêu chuẩn hóa, chương này phân tích các chỉ tiêu kiểm nghiệm dược liệu theo DĐVN V và Dược điển châu Âu, chỉ rõ sự thiếu hụt của chuyên luận Ngành ngạnh trong DĐVN V khi chưa có chỉ tiêu tro không tan trong acid và định lượng hoạt chất. Đồng thời, tác giả tổng kết các phương pháp định lượng flavonoid trong Đỏ ngọn, so sánh phương pháp đo quang phổ tử ngoại - khả kiến (UV-Vis) tạo phức với AlCl3 (đo ở bước sóng 415 nm theo quercetin chuẩn) với phương pháp HPLC pha đảo sử dụng detector UV.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn nguyên liệu, trang thiết bị, hóa chất và quy trình thực nghiệm được thiết kế thành 2 nội dung chính:

Nội dung 1 tập trung vào xây dựng và thẩm định quy trình định lượng isoquercitrin bằng HPLC:

  • Khảo sát các điều kiện sắc ký: bước sóng phát hiện (quét phổ UV từ 190 nm đến 600 nm); lựa chọn pha động (khảo sát hệ methanol - dung dịch đệm acid phosphoric 0,1% và hệ acetonitril - dung dịch đệm acid phosphoric 0,1%); khảo sát nhiệt độ cột (25°C và 40°C).
  • Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình xử lý mẫu chiết xuất: dung môi chiết (ethanol 50%, 70%, 96% và methanol 50%, 70%, 100%), phương pháp chiết (chiết hồi lưu so với chiết siêu âm), số lần chiết (1, 2, 3 lần) và thời gian chiết (10, 20, 30, 40 phút).
  • Thẩm định phương pháp theo hướng dẫn của AOAC đối với các tiêu chí: độ đặc hiệu (so sánh mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn và đối chiếu phổ UV); tính thích hợp hệ thống (tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn IQE 6,25 µg/ml, yêu cầu RSD của thời gian lưu và diện tích pic ≤ 2%); khoảng tuyến tính (khảo sát 6 nồng độ từ 1,5625 µg/ml đến 50 µg/ml, yêu cầu hệ số tương quan R ≥ 0,995, hệ số chắn Y% ≤ 2,0%, độ chệch ≤ 15%); độ chụm (độ lặp lại với n = 6 mẫu trong ngày, yêu cầu RSD ≤ 3%; độ chính xác trung gian với 12 mẫu trong 2 ngày khác nhau, yêu cầu RSD ≤ 6%); độ đúng (phương pháp thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ 150%, 200%, 300%, yêu cầu tỷ lệ thu hồi từ 90% đến 108%, RSD ≤ 2%); xác định LOD (tỷ lệ S/N = 3) và LOQ (tỷ lệ S/N = 10 hoặc 3,3 × LOD).

Nội dung 2 thiết kế các phương pháp nghiên cứu xây dựng chỉ tiêu chất lượng:

  • Nghiên cứu cảm quan, giải phẫu vi phẫu lá tươi và soi đặc điểm vi học của bột dược liệu sấy khô tán mịn.
  • Phản ứng định tính hóa học xác định các nhóm hợp chất tự nhiên.
  • Xác định tỷ lệ mất khối lượng do làm khô ở 105°C trong 4 giờ.
  • Xác định tỷ lệ tro toàn phần (nung ở 600 ± 25°C) và tro không tan trong acid hydrocloric 2M (nung ở 500°C).
  • Định lượng hàm lượng IQE trên các mẫu dược liệu thu thập từ các địa phương.

Chương 3: Thực nghiệm, kết quả và bàn luận

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được từ các nội dung đã đề ra:

1. Kết quả lựa chọn điều kiện sắc ký:

  • Bước sóng hấp thụ tử ngoại: Phổ quét UV của chất chuẩn IQE cho 3 cực đại hấp thụ tại 204 nm, 255 nm và 353 nm. Bước sóng 255 nm được lựa chọn do tại bước sóng này pic IQE có chiều cao vượt trội, pic cân đối, hạn chế ảnh hưởng của đường nền so với bước sóng 204 nm và 353 nm.
  • Pha động: Qua khảo sát 2 hệ dung môi methanol - đệm H3PO4 0,1% và 3 hệ acetonitril (ACN) - đệm H3PO4 0,1%, hệ dung môi gradient ACN - đệm H3PO4 0,1% (Hệ 5) được lựa chọn:
    • Từ 0 đến 25 phút: 15% ACN và 85% đệm H3PO4 0,1% (rửa giải đẳng dòng để tách pic IQE).
    • Từ 28 đến 38 phút: 95% ACN và 5% đệm H3PO4 0,1% (rửa sạch cột).
    • Từ 40 đến 55 phút: 15% ACN và 85% đệm H3PO4 0,1% (cân bằng lại cột cho lần tiêm kế tiếp).
  • Nhiệt độ cột: Khảo sát tại 25°C và 40°C cho thấy ở 40°C thời gian lưu của IQE rút ngắn còn 16,55 phút (so với 19,79 phút ở 25°C), đồng thời áp suất hệ thống giảm từ 135 bar xuống 121 bar. Do đó, nhiệt độ cột 40°C được chọn.

2. Kết quả xây dựng quy trình xử lý mẫu:

  • Dung môi chiết: Chiết bằng ethanol 70% cho hàm lượng IQE cao nhất (đạt trung bình 0,094%), vượt trội hơn methanol 100% (thấp nhất) và các tỷ lệ cồn khác.
  • Phương pháp chiết: Chiết hồi lưu đạt hàm lượng IQE trung bình 0,106%, cao hơn phương pháp chiết siêu âm.
  • Số lần chiết: Chiết 2 lần cho hàm lượng IQE tối ưu (0,106%), tương đương với chiết 3 lần nhưng tiết kiệm dung môi và thời gian thao tác.
  • Thời gian chiết: Hàm lượng IQE tăng nhanh từ 10 phút đến 20 phút, sau đó ổn định ở mức 0,106% từ 20 đến 40 phút. Do đó, thời gian chiết được chọn là 20 phút.
  • Quy trình xử lý mẫu chuẩn hóa: Cân chính xác khoảng 0,2 g bột dược liệu vào bình nón 100 ml, thêm 20 ml EtOH 70%, chiết hồi lưu 20 phút, lọc nóng dịch chiết qua bông vào bình định mức 50 ml. Gộp bông và bã dược liệu, chiết lần 2 tương tự. Gộp các dịch chiết, thêm dung môi vừa đủ 50 ml, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm trước khi tiêm sắc ký.

3. Kết quả thẩm định phương pháp phân tích:

  • Độ đặc hiệu: Mẫu trắng không có pic tại thời gian lưu của IQE. Sắc ký đồ mẫu thử xuất hiện pic IQE tách biệt hoàn toàn khỏi các pic phụ cận (hệ số phân giải Rs > 1,5). Phổ UV của pic IQE trong mẫu thử có độ tương đồng cao với mẫu chuẩn với hệ số match đạt 0,9972.
  • Khoảng tuyến tính: Thiết lập trong khoảng nồng độ từ 1,53 đến 49,10 µg/ml, phương trình hồi quy tuyến tính: $y = 42189x + 3202,3$ với hệ số tương quan $R = 0,9999$. Hệ số chắn tại nồng độ 6,14 µg/ml là 1,2% (đáp ứng yêu cầu ≤ 2,0%), độ chệch nồng độ dao động từ -9,59% đến 5,14% (nằm trong giới hạn ±15%).
  • Tính thích hợp hệ thống: Phân tích 6 lần mẫu chuẩn IQE 6,25 µg/ml cho thời gian lưu trung bình 15,927 phút với RSD = 0,11%; diện tích pic trung bình đạt 266425,67 mAU.s với RSD = 0,09%; hệ số bất đối xứng là 1,145; số đĩa lý thuyết đạt 5968 đĩa (yêu cầu > 5000).
  • Độ chụm:
    • Độ lặp lại (ngày 1, n = 6): hàm lượng IQE trung bình 0,0998%, RSD = 2,58%.
    • Độ lặp lại (ngày 2, n = 6): hàm lượng IQE trung bình 0,1025%, RSD = 1,67%.
    • Độ chính xác trung gian (n = 12 trong 2 ngày): hàm lượng IQE trung bình 0,1011% (g/g), RSD = 2,50% (đáp ứng tiêu chuẩn AOAC cho khoảng hàm lượng ≥ 0,1% là RSD < 6%). Phân tích thống kê ANOVA cho thấy giá trị sig ≥ 0,05, khẳng định sai khác giữa 2 ngày không có ý nghĩa thống kê.
  • Độ đúng (tỷ lệ thu hồi): Phương pháp thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ (150%, 200%, 300%) cho tỷ lệ thu hồi dao động từ 91,5% đến 98,6%, tỷ lệ thu hồi trung bình đạt 95,4% với RSD = 2,21% (đạt yêu cầu 90 - 108% của AOAC).
  • Giới hạn phát hiện và định lượng: Giá trị LOD được xác định là 0,38 µg/ml (tỷ lệ S/N = 3); giá trị LOQ đạt 1,25 µg/ml (tính bằng 3,3 × LOD, tại nồng độ 1,53 µg/ml có tỷ lệ S/N = 11).

4. Kết quả xây dựng một số chỉ tiêu chất lượng dược liệu Đỏ ngọn:

  • Cảm quan: Lá nguyên hình mác hoặc bầu dục, gốc thuôn, đầu nhọn, dài 7–12 cm, rộng 3–4 cm. Mặt trên có lông nhỏ, dày hơn ở mặt dưới, lá non màu hồng đỏ mang lông tơ, cuống lá ngắn. Bột dược liệu có màu xanh rêu nhạt, mùi hơi hắc, vị ngọt.
  • Đặc điểm vi phẫu: Gân chính có mặt trên lõm, mặt dưới lồi. Mô dày gồm 3–4 lớp tế bào sát biểu bì dưới và 5–7 lớp sát biểu bì trên. Mô mềm chứa nhiều tinh thể calci oxalat hình cầu gai và hình khối. Bó libe-gỗ xếp hình cung, bao quanh bởi các bó sợi mô cứng thành dày; libe bắt màu hồng, gỗ bắt màu xanh gồm các mạch gỗ xếp thành hàng thẳng. Phiến lá có biểu bì mang lông che chở đa bào, mô giậu gồm 1 lớp tế bào hình chữ nhật xếp vuông góc biểu bì.
  • Đặc điểm vi học bột: Kính hiển vi ghi nhận mảnh biểu bì mang lỗ khí đứng riêng lẻ hoặc tập trung thành đám; rải rác có lông che chở đơn bào; sợi thành dày xếp thành bó; mảnh mô mềm tế bào đa giác thành mỏng; mảnh mạch xoắn, mạch vạch, mạch điểm; tinh thể calci oxalat hình cầu gai và hình khối.
  • Định tính hóa học: Phản ứng định tính cho kết quả âm tính (-) với acid hữu cơ, đường khử, glycosid tim, acid amin; phản ứng dương tính rất rõ (+++) với caroten.
  • Kết quả kiểm nghiệm các chỉ tiêu hóa lý trên 3 mẫu dược liệu:
Chỉ tiêu phân tích Mẫu ĐN1 (Ba Vì) Mẫu ĐN2 (Quảng Ninh) Mẫu ĐN3 (Tam Đảo) Giá trị trung bình
Độ ẩm (%) 6,54 6,13 7,26 6,64 ± 0,57
Tro toàn phần (%) 3,45 3,42 4,15 3,67 ± 0,36
Tro không tan trong acid HCl (%) 1,38 1,25 1,31 1,31 ± 0,06

Dựa trên kết quả thực nghiệm, tác giả đề xuất: Giới hạn độ ẩm không quá 12,0%; Tro toàn phần không quá 5,0%; Tro không tan trong acid hydrocloric không quá 3,0%; Hàm lượng isoquercitrin trong dược liệu khô kiệt không ít hơn 0,080%.

Chương 4: Bàn luận

Chương 4 tập trung phân tích sâu cơ sở khoa học của các lựa chọn kỹ thuật trong quá trình thực nghiệm:

Về điều kiện sắc ký, việc chọn bước sóng 255 nm được lý giải dựa trên độ hấp thụ phân tử của khung flavonol trong cấu trúc isoquercitrin. Dù chất chuẩn có cực đại tại 204 nm và 353 nm, bước sóng 204 nm dễ bị nhiễu bởi các liên kết đôi của tạp chất phân cực trong dịch chiết thực vật, còn tại 353 nm cường độ hấp thụ của IQE thấp. Tại 255 nm, pic IQE đạt chiều cao lớn nhất, cân đối và sắc nét, tạo điều kiện thuận lợi cho việc tích phân diện tích pic chính xác.

Đối với hệ pha động, việc chuyển từ hệ dung môi methanol sang acetonitril kết hợp đệm acid phosphoric 0,1% đã giải quyết được nhược điểm thời gian lưu quá dài (ở hệ methanol, thời gian lưu lên tới 54,93 phút, gây lãng phí dung môi). Acetonitril có độ nhớt thấp hơn methanol, giúp giảm áp suất làm việc của cột và tăng hiệu quả rửa giải. Môi trường đệm acid phosphoric 0,1% giúp ức chế sự phân ly của các nhóm phenolic hydroxyl trên khung flavonoid, ngăn ngừa hiện tượng kéo đuôi pic, tạo pic đối xứng với hệ số bất đối xứng đạt 1,145. Việc tăng nhiệt độ cột lên 40°C giúp giảm độ nhớt pha động, hạ áp suất cột từ 135 bar xuống 121 bar và rút ngắn thời gian lưu của IQE từ 19,79 phút xuống 16,55 phút.

Về quy trình xử lý mẫu, tác giả giải thích hiệu quả chiết xuất của ethanol 70% dựa trên hằng số điện môi và liên kết hydro. Isoquercitrin là một flavonoid glycosid có tính phân cực trung bình; hỗn hợp ethanol và nước ở tỷ lệ 70:30 tạo ra môi trường có độ phân cực tương đồng nhất với hoạt chất, giúp trích ly tối đa mà không hòa tan quá nhiều tạp chất hữu cơ kém phân cực như khi dùng cồn tuyệt đối, cũng không làm tủa hoạt chất do cơ chế bao gói. Phương pháp chiết hồi lưu tại nhiệt độ sôi của dung môi (70–80°C) làm tăng chuyển động nhiệt và độ khuếch tán của phân tử hoạt chất qua màng tế bào thực vật, cho hiệu suất cao hơn phương pháp siêu âm ở nhiệt độ phòng hoặc nhiệt độ ấm (50–55°C). Số lần chiết được khống chế ở 2 lần và thời gian 20 phút vì sau điểm bão hòa khuếch tán, việc tăng thêm số lần hoặc kéo dài thời gian chỉ làm hòa tan thêm các tạp chất cao phân tử, gây phức tạp cho quá trình xử lý dịch chiết và định lượng sắc ký.

Chương 5: Kết luận và đề xuất

Khóa luận kết luận đã hoàn thành toàn diện 2 mục tiêu nghiên cứu đề ra:

  1. Đã xây dựng và thẩm định thành công quy trình định lượng isoquercitrin trong lá Đỏ ngọn bằng HPLC pha đảo. Phương pháp đạt độ đặc hiệu cao, khoảng tuyến tính từ 1,53 đến 49,10 µg/ml ($R = 0,9999$), độ chụm đạt yêu cầu (RSD độ lặp lại ngày 1 là 2,58%, ngày 2 là 1,67%, độ chính xác trung gian 2,50%), độ đúng cao với tỷ lệ thu hồi 95,4% (RSD = 2,21%), giới hạn phát hiện LOD = 0,38 µg/ml và giới hạn định lượng LOQ = 1,25 µg/ml.
  2. Đã nghiên cứu và bổ sung các dữ liệu khoa học về chỉ tiêu chất lượng dược liệu Đỏ ngọn gồm: đặc điểm cảm quan, hình thái vi phẫu lá, vi học bột dược liệu, phản ứng hóa học định tính (xác nhận sự có mặt của caroten), xác định độ ẩm trung bình (6,64 ± 0,57%), tro toàn phần (3,67 ± 0,36%) và tro không tan trong acid hydrocloric (1,31 ± 0,06%).

Từ các kết quả trên, tác giả đề xuất:

  • Bổ sung chỉ tiêu tro không tan trong acid hydrocloric (giới hạn không quá 3,0%) vào tiêu chuẩn chất lượng dược liệu Đỏ ngọn.
  • Đề xuất đưa chỉ tiêu định lượng hoạt chất isoquercitrin vào tiêu chuẩn cơ sở và chuyên luận Dược điển Việt Nam với giới hạn hàm lượng không ít hơn 0,080% tính theo dược liệu khô kiệt.

Kết quả và đóng góp

Khóa luận đã thu thập và xử lý các số liệu thực nghiệm định lượng chi tiết, được tổng hợp trong các bảng sau:

Thông số thẩm định phương pháp HPLC Kết quả thực nghiệm Tiêu chuẩn chấp nhận (AOAC)
Bước sóng phát hiện 255 nm Cực đại hấp thụ thích hợp
Thời gian lưu trung bình ($t_R$) 15,927 phút (RSD = 0,11%) RSD ≤ 2,0%
Diện tích pic chuẩn ($S_{pic}$) 266425,67 mAU.s (RSD = 0,09%) RSD ≤ 2,0%
Hệ số bất đối xứng ($A_s$) 1,145 0,8 – 1,5
Số đĩa lý thuyết ($N$) 5968 đĩa > 5000 đĩa
Hệ số tương quan tuyến tính ($R$) 0,9999 ($y = 42189x + 3202,3$) $R \ge 0,995$
Hệ số chắn tại nồng độ 6,14 µg/ml 1,2% $Y% \le 2,0%$
Độ lặp lại ($RSD_r$, n = 6) Ngày 1: 2,58%; Ngày 2: 1,67% $\le 3,0%$
Độ chính xác trung gian ($RSD_R$, n = 12) 2,50% (Hàm lượng TB = 0,1011%) $\le 6,0%$
Tỷ lệ thu hồi trung bình ($R$) 95,4% (dao động 91,5% – 98,6%) 90,0% – 108,0%
Độ lệch chuẩn tỷ lệ thu hồi RSD = 2,21% $\le 2,0%$ (tiệm cận tiêu chuẩn)
Giới hạn phát hiện (LOD) 0,38 µg/ml S/N = 3
Giới hạn định lượng (LOQ) 1,25 µg/ml S/N = 10, tính bằng 3,3 × LOD
Chỉ tiêu chất lượng dược liệu Đỏ ngọn Kết quả thực nghiệm (TB ± SD) Ngưỡng chỉ tiêu đề xuất
Độ ẩm (Mất khối lượng do làm khô) 6,64 ± 0,57% Không quá 12,0%
Tro toàn phần 3,67 ± 0,36% Không quá 5,0%
Tro không tan trong acid HCl 1,31 ± 0,06% Không quá 3,0%
Hàm lượng Isoquercitrin (khô kiệt) Đạt ngưỡng phân tích thực nghiệm Không ít hơn 0,080%

Về mặt đóng góp khoa học, đề tài đã giải quyết được khoảng trống kỹ thuật trong tiêu chuẩn kiểm nghiệm lá Đỏ ngọn tại Việt Nam. So với chuyên luận Ngành ngạnh trong DĐVN V vốn chỉ dừng lại ở các chỉ tiêu thử nghiệm sơ bộ và định tính TLC bán định lượng, nghiên cứu này đã thiết lập thành công quy trình định lượng HPLC cụ thể cho một hoạt chất flavonoid điểm chỉ (marker) là isoquercitrin. Đồng thời, nghiên cứu cung cấp số liệu thực nghiệm đầu tiên về chỉ tiêu tro không tan trong acid hydrocloric trên các mẫu Đỏ ngọn phía Bắc, tạo cơ sở thực nghiệm vững chắc để các nhà quản lý và doanh nghiệp nâng cấp tiêu chuẩn cơ sở và hoàn thiện chuyên luận Dược điển.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận ghi nhận một số hạn chế gắn liền với phạm vi nghiên cứu thực nghiệm:

  • Số lượng mẫu nghiên cứu còn hạn chế, mới chỉ khảo sát trên 3 mẫu thu hái tại 3 địa phương miền Bắc (Ba Vì, Quảng Ninh, Tam Đảo) trong cùng một thời điểm thu hái (tháng 4 năm 2024), chưa bao quát được sự biến thiên hàm lượng hoạt chất theo các mùa trong năm và các vùng sinh thái khác (như miền Trung hay Tây Nguyên).
  • Nghiên cứu mới chỉ tập trung định lượng đơn lẻ một hoạt chất flavonoid là isoquercitrin, chưa mở rộng định lượng đồng thời các hoạt chất flavonoid khác (quercitrin, rutin, quercetin) hoặc các xanthon đặc trưng (prunifloron, formoxanthon A).
  • Chưa tiến hành khảo sát các chỉ tiêu về an toàn dược liệu nâng cao theo thông lệ kiểm nghiệm quốc tế như: dư lượng thuốc bảo vệ thực vật, hàm lượng kim loại nặng (chì, cadmi, thủy ngân, arsen) và giới hạn vi nấm độc tố (mycotoxin).

Hướng nghiên cứu tiếp theo được đề xuất:

  • Mở rộng thu thập mẫu dược liệu trên nhiều vùng phân bố sinh thái khác nhau tại Việt Nam và theo dõi hàm lượng hoạt chất theo các giai đoạn sinh trưởng, mùa thu hái trong năm nhằm xác định thời điểm thu hoạch tối ưu.
  • Tiếp tục phát triển và thẩm định phương pháp sắc ký phân tích đồng thời nhiều hợp chất điểm chỉ (đa cấu tử) thuộc cả hai nhóm flavonoid và xanthon.
  • Triển khai đầy đủ các chỉ tiêu kiểm nghiệm độ an toàn sinh học và tồn dư hóa chất phục vụ cho việc chuẩn hóa dược liệu xuất khẩu hoặc sản xuất dược phẩm quy mô công nghiệp.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo hữu ích cho:

  • Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh ngành Dược: Đặc biệt thuộc các chuyên ngành Dược liệu, Dược học cổ truyền, Kiểm nghiệm thuốc và Độc chất, Hóa phân tích dược phẩm; làm tài liệu tham khảo về quy trình thiết kế khảo sát điều kiện chiết xuất và các bước thẩm định phương pháp phân tích sắc ký HPLC theo tiêu chuẩn quốc tế AOAC.
  • Cán bộ kiểm nghiệm tại các viện và trung tâm kiểm nghiệm: Cung cấp thông số vận hành HPLC chi tiết (cột, pha động gradient, nhiệt độ, bước sóng) và các đặc điểm mô học giải phẫu vi phẫu, đặc điểm soi bột lá Đỏ ngọn phục vụ công tác kiểm nghiệm kiểm tra chất lượng dược liệu thật - giả và phòng chống nhầm lẫn.
  • Doanh nghiệp và cơ sở sản xuất dược phẩm, thực phẩm chức năng: Ứng dụng quy trình chiết xuất hồi lưu bằng cồn 70% để nâng cao hiệu suất thu hồi hoạt chất, đồng thời áp dụng các chỉ tiêu chất lượng đề xuất (tro không tan trong acid $\le 3,0%$, hàm lượng isoquercitrin $\ge 0,080%$) để xây dựng và thẩm định Tiêu chuẩn cơ sở (TCCS) cho nguyên liệu đầu vào và các chế phẩm từ lá Đỏ ngọn.

Các phần có giá trị tham khảo cao nhất trong văn bản gồm: quy trình xử lý mẫu chiết hồi lưu bằng ethanol 70%; bảng điều kiện sắc ký gradient và bộ dữ liệu thẩm định độ đặc hiệu, tính thích hợp hệ thống, độ lặp lại và độ đúng theo AOAC; hệ thống mô tả giải phẫu vi phẫu và đặc điểm bột lá kèm hình ảnh minh họa chi tiết.

Câu hỏi thường gặp

1. Vì sao tác giả lựa chọn isoquercitrin làm chất điểm chỉ (marker) để xây dựng quy trình định lượng HPLC trong lá Đỏ ngọn?
Dựa trên tổng quan các nghiên cứu dược lý và hóa thực vật, flavonoid trong lá Đỏ ngọn thể hiện nhiều tác dụng sinh học giá trị như chống oxy hóa, kháng viêm và bảo vệ thành mạch. Trong số các flavonoid phân lập được từ loài này (như quercitrin, hyperin, afzelin, isoquercitrin), các thử nghiệm in vitro (tiêu biểu là nghiên cứu của Choi và cộng sự, 2014) đã chứng minh isoquercitrin có khả năng loại bỏ gốc tự do mạnh nhất ở nồng độ thử nghiệm. Do đó, isoquercitrin là hợp chất đại diện tiêu biểu về mặt tác dụng sinh học để làm chất điểm chỉ kiểm soát chất lượng dược liệu.

2. Quy trình xử lý mẫu tối ưu để trích ly isoquercitrin từ lá Đỏ ngọn được xác lập qua các thông số nào?
Qua khảo sát thực nghiệm 4 yếu tố ảnh hưởng, quy trình xử lý mẫu tối ưu được xác lập gồm: dung môi chiết là ethanol 70% (cho hàm lượng IQE đạt 0,094%, cao hơn các nồng độ cồn khác và methanol); phương pháp chiết hồi lưu ở nhiệt độ sôi của dung môi (cho hàm lượng 0,106%, vượt trội so với chiết siêu âm); số lần chiết là 2 lần (chiết kiệt hoạt chất, tương đương 3 lần chiết nhưng tiết kiệm dung môi); thời gian mỗi lần chiết là 20 phút (thời điểm đạt cân bằng khuếch tán hoạt chất ổn định).

3. Điều kiện sắc ký HPLC tối ưu được khóa luận thiết lập gồm những thông số cụ thể nào?
Hệ thống sắc ký sử dụng cột Kromasil® 100-5 C18 ($250 \times 4,0$ mm, 5 µm); detector UV-Vis đặt tại bước sóng 255 nm; nhiệt độ cột duy trì ở 40°C; tốc độ dòng 1,0 ml/phút; thể tích tiêm mẫu 20 µl. Pha động vận hành theo chương trình gradient giữa kênh A (dung dịch đệm acid phosphoric 0,1%) và kênh B (acetonitril): từ 0 đến 25 phút chạy đẳng dòng 15% ACN để tách pic IQE (thời gian lưu khoảng 15,93 phút); từ 28 đến 38 phút nâng lên 95% ACN để rửa cột; từ 40 đến 55 phút đưa về 15% ACN để ổn định cột.

4. Những chỉ tiêu kiểm nghiệm chất lượng nào được tác giả đề xuất bổ sung so với chuyên luận Ngành ngạnh hiện hành trong Dược điển Việt Nam V?
Tác giả đề xuất bổ sung 2 chỉ tiêu quan trọng mà DĐVN V chưa quy định:

  • Tro không tan trong acid hydrocloric: Giới hạn đề xuất không quá 3,0% (kết quả thực nghiệm trên 3 mẫu đạt trung bình 1,31 ± 0,06%).
  • Định lượng hoạt chất: Giới hạn hàm lượng isoquercitrin đề xuất không được ít hơn 0,080% tính theo dược liệu khô kiệt, xác định bằng phương pháp HPLC pha đảo.

5. Kết quả thẩm định quy trình định lượng HPLC theo tiêu chuẩn AOAC đạt các chỉ số kỹ thuật then chốt nào?
Phương pháp đạt độ tương quan tuyến tính cao ($R = 0,9999$) trong khoảng nồng độ 1,53 – 49,10 µg/ml; tính thích hợp hệ thống có RSD của diện tích pic là 0,09% và thời gian lưu là 0,11%, số đĩa lý thuyết đạt 5968 đĩa; độ chụm trung gian đạt RSD = 2,50% (đáp ứng tiêu chuẩn AOAC < 6%); độ đúng có tỷ lệ thu hồi trung bình đạt 95,4% (RSD = 2,21%); giới hạn phát hiện LOD = 0,38 µg/ml và giới hạn định lượng LOQ = 1,25 µg/ml.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ của tác giả Lê Quỳnh Hương đã hoàn thành việc xây dựng và thẩm định quy trình định lượng hoạt chất isoquercitrin trong lá Đỏ ngọn bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC-UV) đạt đầy đủ các tiêu chuẩn thẩm định của AOAC. Công trình đồng thời khảo sát toàn diện và chuẩn hóa các chỉ tiêu chất lượng dược liệu bao gồm cảm quan, vi phẫu, bột, định tính hóa học, độ ẩm, tro toàn phần và tro không tan trong acid hydrocloric trên các mẫu thực vật thu hái tại Ba Vì, Quảng Ninh và Tam Đảo. Các kết quả thực nghiệm là nguồn dữ liệu khoa học trực tiếp hỗ trợ việc hoàn thiện tiêu chuẩn cơ sở tại các đơn vị sản xuất và đóng góp căn cứ thực tiễn để nâng cấp chuyên luận Ngành ngạnh trong Dược điển Việt Nam.