Tổng quan luận án
Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu
Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, sở hữu hệ thực vật bậc cao phong phú với hơn 10.000 loài, trong đó có khoảng 3.200 loài cây được sử dụng trong y học dân tộc làm thuốc chữa bệnh. Chi Trắc (Dalbergia) thuộc họ Đậu (Fabaceae) là một trong ba chi có số lượng loài đa dạng nhất. Nhiều loài trong chi này như Trắc hoàng đàn (Dalbergia assamica Benth.), Trắc lá (Dalbergia foliacea Wall. ex Benth.), Cẩm lai một hạt (Dalbergia candenatensis), Dalbergia rimosa, Dalbergia sissoo, Dalbergia odorifera được sử dụng rộng rãi trong y học dân gian ở nhiều quốc gia để điều trị các chứng bệnh như đau đầu, ho suyễn, phong thấp, nhiễm trùng, tiêu chảy, sốt rét, ung nhọt, gãy xương và chảy máu cam. Trong y học cổ truyền, các loài này còn được dùng làm thuốc giảm đau, chống ho, chống viêm, hạ sốt, kháng khuẩn, điều hòa tim mạch.
Tại Việt Nam, lõi gỗ cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) có giá trị kinh tế cao và được ghi nhận sử dụng làm thuốc. Các nghiên cứu quốc tế trên loài Sưa Hải Nam (Dalbergia odorifera) cho thấy phần lõi gỗ được ứng dụng trong điều trị các bệnh tim mạch như suy tim, viêm cơ tim, xơ vữa động mạch và nhồi máu cơ tim. Tuy nhiên, loài Sưa ở Việt Nam (Dalbergia tonkinensis Prain) vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ và toàn diện về các mặt thực vật học, thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học. Các nghiên cứu về hóa học đối với loài này trong nước trước đây chỉ mang tính sơ bộ và mới ghi nhận phân lập được 3 hợp chất. Do đó, luận án được thực hiện nhằm nghiên cứu có hệ thống và toàn diện loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) tại Việt Nam.
Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu
Mục tiêu tổng quát của luận án là nghiên cứu cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) về các mặt: thực vật học (đặc điểm vi phẫu, trình tự gen), thành phần hóa học và hoạt tính sinh học.
Để hoàn thành mục tiêu nêu trên, luận án đã xác định và triển khai các nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể được đánh số như sau:
- Thu thập mẫu thực vật của loài nghiên cứu; thực hiện nghiên cứu thực vật học thông qua khảo sát đặc điểm vi phẫu thân, lá, bột dược liệu và phân tích trình tự DNA các vùng gen chỉ thị.
- Nghiên cứu thành phần hóa học của loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain): điều chế cặn chiết tổng, chiết phân bố phân đoạn bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau, phân lập các hợp chất sạch từ cặn chiết bằng các phương pháp sắc ký; xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp hóa lý và phổ hiện đại.
- Đánh giá hoạt tính sinh học: khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và hoạt tính ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase của cao chiết tổng, các cao phân đoạn và một số hợp chất sạch phân lập từ cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) ở Việt Nam.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) thuộc chi Trắc (Dalbergia), họ Đậu (Fabaceae), bao gồm các bộ phận: vỏ thân, lá và lõi gỗ. Loài thực vật này được xác định tên khoa học bởi TS. Nguyễn Quốc Bình (Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam) và lưu giữ mẫu tiêu bản tại Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật cùng Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên (ký hiệu mẫu C-561 và C-612). Đây là loài thực vật rừng nguy cấp thuộc nhóm IA theo Nghị định 32/2006/NĐ-CP và nhóm Sẽ nguy cấp (V) theo Sách Đỏ Việt Nam (năm 1996).
- Phạm vi không gian: Mẫu nghiên cứu chính được thu hái tại đường Mai Hắc Đế, thành phố Buôn Ma Thuột, tỉnh Đắk Lắk (tọa độ $12^\circ 45' 59''\text{N} - 108^\circ 19' 31''\text{E}$). Mẫu lá đối chứng dùng cho nghiên cứu DNA được thu hái tại đường Hoàng Quốc Việt, quận Cầu Giấy, Hà Nội (tọa độ $21^\circ 01' 42''\text{N} - 105^\circ 51' 12''\text{E}$, ký hiệu C-564-L).
- Phạm vi thời gian: Mẫu thực vật phục vụ nghiên cứu được thu hái vào hai đợt: tháng 01 năm 2015 và tháng 03 năm 2016.
Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án
Khái quát về phân loại và đặc điểm thực vật
Theo hệ thống phân loại APG (Angiosperm Phylogeny Group), họ Đậu (Fabaceae, đồng nghĩa: Leguminosae) là họ thực vật có hoa lớn thứ ba trên thế giới với khoảng 730 chi và 19.400 loài, phân bố chủ yếu ở các phân họ Trinh nữ (Mimosoideae) và phân họ Đậu (Faboideae). Trong đó, chi Trắc (Dalbergia) theo cơ sở dữ liệu The Plant List (tính đến tháng 12/2018) có 647 loài, với 304 loài đã được công nhận chính thức. Tại Việt Nam, chi này hiện đã thống kê được khoảng 27 loài.
Về hình thái thực vật, các loài thuộc chi Dalbergia là cây gỗ từ nhỏ đến lớn, cây bụi hoặc dây leo thân gỗ. Cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) là cây gỗ trung bình hoặc lớn, cao từ 15–25 m, đường kính thân đạt 0,5–0,7 m; vỏ xám hoặc nâu xám, thịt vỏ nâu vàng có mùi tanh nhẹ. Lá kép lông chim một lần lẻ mọc cách, mang từ 7–17 lá chét hình trứng hoặc bầu dục (dài 4–5 cm, rộng 2,5–3 cm). Cụm hoa là chùy dạng xim ở nách lá, đài hoa hình chuông có 5 cánh xẻ 2 môi, tràng hoa 5 cánh màu trắng; nhị 10 hợp thành 2 bó. Quả đậu dẹt thuôn dài 5–7 cm, rộng 2–2,5 cm, chứa 1–2 hạt hình bầu dục dẹt, nhẵn, không có phôi nhũ.
Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học chi Trắc trên thế giới
Nghiên cứu hóa học đầu tiên về chi Dalbergia được Malhotra và cộng sự công bố năm 1967 khi phân lập hợp chất lanceolarin từ rễ loài Dalbergia lanceolaria. Tính đến tháng 12/2018, các nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu khoảng 17 loài trong chi và phân lập được 235 hợp chất, trong đó có 40 hợp chất mới. Các loài được nghiên cứu nhiều nhất bao gồm Dalbergia odorifera (Trung Quốc) và Dalbergia parviflora (Ấn Độ, Thái Lan, Borneo), với bộ phận khảo sát chủ yếu là phần lõi gỗ.
Thành phần hóa học chủ yếu của chi Dalbergia là các hợp chất phenolic, trong đó lớp chất flavonoid chiếm ưu thế lớn với khoảng 142 hợp chất đã được tách chiết thuộc nhiều khung cấu trúc khác nhau:
| STT |
Khung cấu trúc / Lớp chất |
Loài thực vật nghiên cứu tiêu biểu |
Tác giả và năm công bố |
Hợp chất tiêu biểu được phân lập |
| 1 |
Flavan |
D. odorifera, D. candenatensis |
An và cs. (2008); Cheenpracha và cs. (2009) |
(2S)-6,7,4′-trihydroxyflavan, (2S)-6,4′-dihydroxy-7-methoxyflavan, candenantein E |
| 2 |
Isoflavan |
D. odorifera, D. congestiflora, D. parviflora |
Yahara và cs. (1989); Yu và cs.; Songsiang và cs. |
Odoriflavene, (3R)-vestitol, (3R)-5′-methoxyvestitol, (3R)-mucronulatol, duartin |
| 3 |
Neoflavan |
D. nitidula |
Bezuidenhoudt và cs. (1984) |
1-(3S,4S)-3,4-trans-2′,7-dihydroxy-4′-methoxy-4-[(3S)-2′,7-dihydroxy-4′-methoxyisoflavan-5′-yl]isoflavan |
| 4 |
Flavanol |
D. monetaria |
Nunes và cs. (1989) |
Epifisetinidol-(4$\rightarrow$8)-epicatechin, epiguibourtinidol-(4$\rightarrow$8)-epicatechin |
| 5 |
Flavanone |
D. odorifera, D. parviflora, D. candenatensis |
Nhiều nhóm tác giả |
Naringenin, liquiritigenin, butin, carthamidin, eriodictoyl, (2S)-pinocembrin, (2S)-pinostrobin |
| 6 |
Isoflavanone |
D. louvelii, D. parviflora, D. odorifera, D. paniculata |
Adinarayana; Donnelly; Chan; Songsiang |
Dalparvin A, dalparvin B, (3R)-sativanone, 3′-O-methylviolanone, (3R)-violanone, lanceolarin |
| 7 |
Flavanonol & Isoflavanonol |
D. parviflora, D. odorifera, D. melanoxylon |
Donnelly; Umehara; Songsiang; Zhao; Lee |
Dalparvinol C, dalparvin C, (3R)-2′,3,7-trihydroxyisoflavanone, kenusanone F 7-methyl ether |
| 8 |
Flavone & Isoflavone |
D. nitidula, D. oliveri, D. frutescens, D. cultrata |
Bezuidenhoudt; Shirota; Songsiang; Khan |
Luteolin, volubilin, daidzein, formononetin, genistein, caviunin, olibergin A, dalparvone |
| 9 |
Neoflavone & 4-Aryl-coumarin |
D. sissoo, D. congestiflora, D. retusa, D. louvelii |
Mukerjee (1971); Barragán-Huerta (2004); Chan; Kite |
Dalbergichromene, neocandenatone, dalbergin, isodalbergin, nordalbergin, melanettin |
| 10 |
Aurone & Chalcone |
D. odorifera, D. cochinchinensis |
Zhao và cs. (2011); Donnelly; Shirota (2003) |
Sulfuretin, butein, 2′-O-methylisoliquiritigenin, 4,2′,5′-trihydroxy-4′-methoxychalcone |
| 11 |
Diaryl propanoid |
D. louvelii, D. parviflora, D. candenatensis |
Cheenpracha; Choi; Umehara; Songsiang (2009) |
Dalberatin A–E, candenatenin A–D, hydroxyobtustyrene, obtustyrene, dalparvinene B |
| 12 |
Coumarin, Lignan, Terpenoid |
D. oliveri, D. parviflora, D. spinosa |
Donnelly (1973, 1974); Songsiang (2011); Tao (2010) |
Medicarpin, 3,8-dihydroxy-9-methoxypterocarpan, dalberpene |
Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học chi Trắc tại Việt Nam
Tại Việt Nam, trong tổng số khoảng 27 loài thuộc chi Dalbergia, trước khi luận án thực hiện mới chỉ có 4 loài được công bố nghiên cứu về thành phần hóa học với tổng số 26 hợp chất được phân lập (bao gồm 5 hợp chất mới):
- Dalbergia cochinchinensis (Trắc): Shirota và cộng sự (2003) phân lập được 6 hợp chất từ lõi gỗ, trong đó có 3 hợp chất mới là dẫn xuất của benzofuran và phenol (các hợp chất mang ký hiệu 161, 162, 163) cùng 3 hợp chất đã biết gồm 4′-hydroxy-2′-methoxychalcone, latinone và dalbergiphenol. Phạm Thanh Loan và cộng sự (2012) phân lập thêm 4 hợp chất từ thân gỗ.
- Dalbergia oliveri (Cẩm lai): Phạm Thanh Loan và cộng sự (2012, 2013) phân lập 9 hợp chất từ thân gỗ gồm liquiritigenin, (3R)-5′-methoxyvestitol, (6aS,11aS)-medicarpin, (6aS,11aS)-8-hydroxymedicarpin, maackiain, formononetin, (3R)-violanone, isoliquiritigenin và genistein-6-C-glucoside.
- Dalbergia vietnamensis (Trắc gai): Phạm Thanh Loan và cộng sự phân lập 4 hợp chất từ thân gỗ gồm dalspinosin 7-O-[$\beta$-D-apiofuranosyl-(1$\rightarrow$6)-$\beta$-D-glucopyranoside], caviunin [7-O-(5-O-trans-p-coumaroyl)-$\beta$-D-apiofuranosyl-(1$\rightarrow$6)-$\beta$-D-glucopyranoside], caviunin [7-O-$\beta$-D-apiofuranosyl-(1$\rightarrow$6)-$\beta$-D-glucopyranoside] và caviunin.
- Dalbergia tonkinensis (Sưa): Trần Tuấn Anh và cộng sự (2009) mới phân lập sơ bộ được 3 hợp chất gồm genistein, lanceolarin và 9,10-threo-3-[7-(3,10-dihydroxy-9-hydroxymethyl-2,5-dimethoxy)-9,10-dihydrophenanthrenyl]propenal.
Tổng quan hoạt tính sinh học của chi Trắc
Tổng hợp các công bố quốc tế và trong nước cho thấy chi Dalbergia sở hữu phổ hoạt tính sinh học đa dạng:
- Hoạt tính chống oxy hóa: Cặn chiết methanol của D. saxatilis (Sofidiya và cs., 2006), dịch chiết EtOH vỏ cây D. latifolia (Khalid và cs., 2011) và D. spinosa (Bala và cs.) đều thể hiện khả năng quét gốc tự do DPPH. Tại Việt Nam, Phạm Thanh Loan và cộng sự (2014) ghi nhận dịch chiết MeOH từ quả cây Sưa có giá trị $\text{SC}{50} = 117,5\ \mu\text{g/ml}$ (axit ascorbic là $20,5\ \mu\text{g/ml}$), trong khi dịch chiết lá và cành không có hoạt tính và không bảo vệ tế bào gan trước tác nhân $\text{H}2\text{O}2$ ở nồng độ $100\ \mu\text{g/ml}$. Dịch chiết MeOH gỗ loài Trắc (D. cochinchinensis) có tác dụng bảo vệ trên 50% tế bào gan chuột với $\text{ED}{50} = 9,39\ \mu\text{g/ml}$ (tương đương curcumin với $\text{ED}{50} = 8,99\ \mu\text{g/ml}$). Đối với chất tinh khiết, butein từ D. odorifera ức chế oxy hóa lipid chuột với $\text{IC}{50} = 3,3 \pm 0,4\ \mu\text{M}$ và ức chế xanthine oxidase với $\text{IC}_{50} = 5,9 \pm 0,3\ \mu\text{M}$ (Cheng và cs., 1998); naringenin và eriodictoyl từ D. odorifera có hoạt tính chống oxy hóa mạnh hơn chất chuẩn BHT (Hou và cs., 2011).
- Hoạt tính gây độc tế bào: Mẫu cặn MeOH gỗ loài Trắc (D. cochinchinensis) ức chế dòng tế bào ung thư phổi Lu ($\text{IC}{50} = 17,98\ \mu\text{g/ml}$) và ung thư màng tim RD ($\text{IC}{50} = 15,76\ \mu\text{g/ml}$); cao chiết gỗ Cẩm lai (D. oliveri) gây độc dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 ($\text{IC}{50} = 45,71\ \mu\text{g/ml}$) (Phạm Thanh Loan và cs., 2014). Các hợp chất sạch như (3R)-mucronulatol gây độc dòng tế bào bạch cầu HBL100 ($\text{LC}{50} = 5,7\ \mu\text{M}$); medicarpin và hydroxyobtustyrene có $\text{ED}{50}$ từ $5,1 - 7,3\ \mu\text{g/ml}$ trên các dòng ung thư người (Choi và cs., 2009); (3S)-secundiflorol H từ D. parviflora ức chế tế bào ung thư vú MCF-7, phổi NCI-H187 và KB với $\text{IC}{50}$ từ $3,47 - 5,37\ \mu\text{g/ml}$ (Songsiang và cs., 2011). Hợp chất 3,8-dihydroxy-9-methoxypterocarpan và medicarpin từ D. oliveri có $\text{IC}_{50}$ từ $3,76 - 7,09\ \mu\text{g/ml}$ trên các dòng LU-1, KB, MCF7 và Hep-G2 (Phạm Thanh Loan và cs., 2014).
- Hoạt tính kháng khuẩn và kháng ký sinh trùng: Formononetin từ D. frutescens kháng trùng roi đường ruột Giardia intestinalis với $\text{IC}{50} = 30\ \mu\text{g/ml}$ (Khan và cs., 2000). Các hợp chất từ D. louvelii ức chế ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum với $\text{IC}{50} = 5,8 - 8,7\ \mu\text{g/ml}$ (Beldjoudi và cs., 2003). Hợp chất (2S)-pinocembrin từ D. parviflora ức chế vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis với giá trị $\text{MIC} = 12,5\ \mu\text{g/ml}$ (Songsiang và cs., 2009). Hợp chất (3R)-vestitol từ D. odorifera kháng khuẩn Ralstonia solanacearum với đường kính vòng vô khuẩn $16,62\text{ mm}$ (Zhao và cs., 2011).
- Hoạt tính kháng viêm và chống đái tháo đường: Hợp chất (2S)-pinocembrin ức chế sản sinh NO trên đại thực bào RAW 264.7 với $\text{IC}_{50} = 18,1\ \mu\text{M}$ (Lee và cs., 2013). Dịch chiết lá D. odorifera liều $500\text{ mg/kg}$ làm giảm đường huyết ở chuột; các hợp chất (3R)-sativanone và formononetin từ D. odorifera có khả năng ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase từ nấm men.
Khoảng trống nghiên cứu được lựa chọn
Mặc dù chi Trắc đã được khảo sát tương đối sâu trên thế giới, loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) tại Việt Nam vẫn tồn tại khoảng trống nghiên cứu lớn khi chưa có công trình nào đánh giá toàn diện từ đặc điểm giải phẫu vi phẫu, giám định chỉ thị sinh học phân tử DNA, chiết tách quy mô lớn để khảo sát cấu trúc hóa học các phân đoạn cho đến thử nghiệm sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn và ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu
Khung lý thuyết và phân loại hóa thực vật
Luận án tiếp cận dựa trên lý thuyết phân loại hóa thực vật các hợp chất phenolic tự nhiên, trọng tâm là nhóm flavonoid có khung cacbon cơ bản $C_6-C_3-C_6$ gồm 15 nguyên tử cacbon. Tùy thuộc vào mức độ oxy hóa của mạch 3C giữa hai vòng benzen, sự hiện diện của liên kết đôi $C_2-C_3$ và vị trí nhóm carbonyl tại $C_4$, các hợp chất được phân loại thành các phân nhóm: flavan, isoflavan, neoflavan, flavanone, isoflavanone, flavanol, isoflavanonol, flavone, isoflavone, neoflavone, chalcone và aurone. Ngoài ra, cơ sở lý thuyết mở rộng sang các khung polyphenol khác như diaryl propanoid, pterocarpan, coumarin và dẫn xuất phenylcoumarin.
Phương pháp nghiên cứu thực vật học
- Phương pháp vi phẫu:
- Tiêu bản vi học thân và lá: Làm tiêu bản bằng phương pháp cắt trực tiếp, tẩy bằng dung dịch Javen thương phẩm, rửa sạch, trung hòa bằng dung dịch acid acetic 5% và nhuộm kép bằng dung dịch xanh methylene kết hợp dung dịch đỏ carmin.
- Tiêu bản bột dược liệu: Thực hiện bằng phương pháp giọt ép.
- Quan sát quang học và chụp ảnh cấu trúc giải phẫu bằng kính hiển vi quang học màn hình kết nối camera kỹ thuật số Nikon Eclipse Ci.
- Phương pháp sinh học phân tử (Nghiên cứu DNA):
- Tách chiết DNA tổng số từ mẫu lá theo phương pháp CTAB (Doyle và cộng sự, 1987) có cải tiến. Kiểm tra hàm lượng và độ sạch bằng đo quang phổ hấp thụ và điện di trên gel agarose 1%. Nồng độ DNA sử dụng cho phản ứng PCR được chuẩn hóa ở mức $10\text{ ng/}\mu\text{l}$.
- Khảo sát 3 cặp mồi chỉ thị gen lạp thể (rpoB, rpoC, rbcL) theo thiết kế của Kress và cs. (2007) và Hasebe và cs. (1994):
| Tên vùng gen |
Trình tự mồi xuôi ($5' \rightarrow 3'$) |
Trình tự mồi ngược ($5' \rightarrow 3'$) |
Nhiệt độ bắt cặp ($^\circ\text{C}$) |
Chiều dài vùng gen (bp) |
Tài liệu tham khảo |
| rpoC |
CTTCTGCGAAATCAGAGTGTTTG |
CTTCTCCTTCCTCTAAATGATAAG |
50 |
600 |
Kress và cs. (2007) |
| rbcL |
TCTAGCACACGAAAGATACGAAACG |
CTTCGGCACAAATCGAAGT |
56 |
600 |
Hasebe và cs. (1994) |
| rpoB |
GCC ACC ATC GAA ACA TCT |
ATCTCTCCA TAT CTG GT CGT CGC TAA CC |
52 |
600 |
Kress và cs. (2007) |
- Phản ứng PCR: Thể tích phản ứng $50\ \mu\text{l}$ ($32\ \mu\text{l}\ \text{H}_2\text{O}$, $5\ \mu\text{l}$ đệm, $5\ \mu\text{l}$ dNTP, $3\ \mu\text{l}$ mồi xuôi $30\text{ pM}$, $3\ \mu\text{l}$ mồi ngược $30\text{ pM}$, $1\ \mu\text{l}$ DNA tổng số, $1\ \mu\text{l}$ enzyme Taq polymerase). Luân nhiệt trên máy PCR System 9700: biến tính ban đầu $95^\circ\text{C}$ trong 3 phút; 35 chu kỳ ($95^\circ\text{C}$ / 30 giây; bắt cặp $50^\circ\text{C}$, $52^\circ\text{C}$, $56^\circ\text{C}$ / 1 phút; kéo dài $72^\circ\text{C}$ / 1 phút); kéo dài kết thúc $72^\circ\text{C}$ trong 10 phút.
- Giải trình tự: Tinh sạch sản phẩm PCR bằng Sephadex G50 (Sigma), giải mã trình tự nucleotide bằng kit BigDye Terminator v3.1 trên máy đọc trình tự tự động ABI 3100 Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
- Xử lý dữ liệu trình tự gen bằng các phần mềm chuyên dụng: ClustalW (Thompson và cs., 1994), GenDoc (Nicholas và cs., 1997) và MEGA5.2 (Tamura và cs., 2011).
Phương pháp phân lập và xác định cấu trúc hóa học
- Chiết xuất và phân đoạn: 3,7 kg lõi gỗ cây Sưa khô được xay nhỏ, ngâm chiết kiệt bằng methanol ở nhiệt độ phòng (5 lần $\times$ 7 lít), gộp dịch chiết và cô quay chân không thu được 120 g cặn chiết tổng methanol (mã M). Cặn M được hòa tan trong hỗn hợp methanol/nước (tỷ lệ 1:1, v/v) rồi chiết phân bố lỏng-lỏng lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate và nước. Phần bã sau khi chiết methanol tiếp tục được đun nóng với nước (4 lần $\times$ 3,0 lít) trong 12 giờ để thu cặn chiết nước (mã W).
- Phương pháp sắc ký phân lập: Sắc ký bản mỏng (TLC), sắc ký cột pha thường (CC) sử dụng chất hấp phụ silica gel (Merck, kích thước hạt 40–63 $\mu$m và 400–630 mesh), sắc ký cột pha đảo ODS (YMC, 30–50 $\mu$m), sắc ký rây phân tử Sephadex LH-20, sắc ký hấp phụ Diaion HP-20 và phương pháp kết tinh lại phân đoạn.
- Phương pháp xác định cấu trúc hóa lý:
- Phổ khối lượng ion hóa bụi điện tử (ESI-MS) đo trên máy Agilent 6310 Ion Trap.
- Phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS) đo trên máy Agilent 6510 Q-TOF LC/MS hoặc MicroQ-TOF III (Bruker Daltonics, CHLB Đức).
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều ($^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR, DEPT) và 2 chiều (HSQC, HMBC, $^1\text{H}-^1\text{H}$ COSY, NOESY) ghi trên máy quang phổ Bruker Avance 500 MHz, sử dụng chất chuẩn nội tetramethylsilane (TMS), dung môi hòa tan gồm $\text{DMSO-d}_6$, $\text{MeOD-d}_4$ và $\text{CDCl}_3$.
Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học
- Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định:
- Thực hiện theo phương pháp pha loãng trên phiến vi lượng 96 giếng của H. Xiong và cộng sự (2009).
- Tập chủng chuẩn ATCC (Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương cung cấp) gồm 8 chủng:
- Vi khuẩn Gram âm: Escherichia coli ATCC 8739, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027.
- Vi khuẩn Gram dương: Bacillus subtilis ATCC 6633, Staphylococcus aureus ATCC 6538.
- Nấm sợi (mốc): Aspergillus niger ATCC 9763, Fusarium oxysporum ATCC 48112.
- Nấm men: Candida albicans ATCC 10231, Saccharomyces cerevisiae ATCC 16404.
- Môi trường nuôi cấy: Tryptic Soy Agar (TSB, Merck) cho vi khuẩn; Sabouraud 4% Dextrose Agar (SDA, Merck) cho nấm men và nấm mốc. Nồng độ dịch huyền phù vi sinh vật chuẩn hóa theo độ đục 0,5 McFarland ($150 \times 10^6\text{ CFU/ml}$ ở bước sóng $\lambda = 550\text{ nm}$).
- Chất đối chứng dương: Streptomycin ($4\ \mu\text{M}$) và Penicillin ($50\ \mu\text{M}$) cho vi khuẩn; Nystatin cho nấm sợi và nấm men. Chất đối chứng âm: dịch vi sinh vật không bổ sung kháng sinh và mẫu thử.
- Tiêu chí đánh giá: Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC, $\mu\text{g/ml}$) là nồng độ thấp nhất làm ngừng sự phát triển của vi sinh vật. Mẫu có hoạt tính khi $\text{MIC} \le 200\ \mu\text{g/ml}$ đối với cao chiết và $\text{MIC} \le 50\ \mu\text{g/ml}$ đối với hợp chất tinh khiết.
- Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase:
- Thực hiện theo phương pháp của N. Bon và cộng sự (2017, 2018) trên phiến vi lượng 96 giếng, thể tích phản ứng $250\ \mu\text{l/giếng}$.
- Nguyên lý: Enzyme $\alpha$-glucosidase xúc tác thủy phân cơ chất p-nitrophenyl-$\alpha$-D-glucopyranoside (pNPG) giải phóng p-nitrophenol màu vàng đo độ hấp thụ quang học ở bước sóng $\lambda = 405\text{ nm}$ trên máy Tecan Infinite F50 (Thụy Sỹ).
- Nguồn enzyme: $\alpha$-Glucosidase từ vi khuẩn (Bacillus stearothermophilus, nồng độ 1,0 U/ml), nấm men (Saccharomyces cerevisiae, nồng độ 0,25 U/ml), gạo (nồng độ 0,1 U/ml) và enzyme từ ruột chuột (Sigma Aldrich, Mỹ).
- Chất đối chứng dương: Acarbose; đối chứng âm: đệm phosphate (0,1 mol/l, pH 7).
- Công thức tính phần trăm ức chế:
$$\text{Tỷ lệ ức chế (%)} = \frac{A - B}{A} \times 100%$$
(trong đó $A$ là mật độ quang mẫu đối chứng, $B$ là mật độ quang mẫu thử).
- Giá trị $\text{IC}_{50}$ được tính toán bằng phần mềm TableCurve AISN Software (Jandel Scientific, Mỹ).
Nội dung chính theo từng chương
Chương 1: Khái quát về họ Đậu (Fabaceae), chi Trắc (Dalbergia), tổng quan thành phần hóa học và hoạt tính sinh học
Chương 1 hệ thống hóa cơ sở dữ liệu về phân loại, đặc điểm hình thái và giá trị sử dụng của họ Đậu và chi Trắc trên phạm vi toàn cầu và tại Việt Nam. Văn bản làm rõ vị trí của loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) trong danh mục bảo tồn nghiêm ngặt của Nhà nước (nhóm IA Nghị định 32/2006/NĐ-CP).
Chương này thống kê chi tiết dữ liệu 235 hợp chất thuộc 17 loài Dalbergia trên thế giới và 26 hợp chất thuộc 4 loài tại Việt Nam. Các bảng số liệu hoạt tính sinh học được phân tích làm cơ sở đối chiếu:
Bảng dữ liệu hoạt tính bảo vệ tế bào gan chuột trước tác nhân $\text{H}_2\text{O}_2$ của dịch chiết MeOH gỗ Trắc (D. cochinchinensis):
| Nồng độ ($\mu\text{g/ml}$) |
Tỷ lệ sống sót của tế bào gan - Dịch chiết Trắc (%) |
Tỷ lệ sống sót của tế bào gan - Curcumin (%) |
| 100 |
62,35 |
88,20 |
| 20 |
53,53 |
71,66 |
| 4 |
45,19 |
22,54 |
| 0,8 |
33,27 |
0,78 |
| $\text{ED}_{50}$ ($\mu\text{g/ml}$) |
9,39 |
8,99 |
Bảng dữ liệu hoạt tính chống oxy hóa $\text{IC}_{50}$ của naringenin và eriodictoyl từ loài D. odorifera T. Chen so với chất chuẩn BHT (Hou và cs., 2011):
| Hợp chất thử nghiệm |
Nồng độ 0,012% ($\text{IC}_{50}$) |
Nồng độ 0,02% ($\text{IC}_{50}$) |
| Naringenin |
$4,20 \pm 0,02$ |
$5,57 \pm 0,07$ |
| Eriodictoyl |
$6,48 \pm 0,31$ |
$9,32 \pm 0,28$ |
| BHT (chất đối chứng) |
— |
3,48 |
Dữ liệu tổng quan cũng nêu bật khả năng gây độc tế bào ung thư của các hợp chất nhóm pterocarpan và isoflavan: (3R)-mucronulatol phân lập từ D. parviflora gây độc dòng tế bào KB ($\text{IC}{50} = 0,53\ \mu\text{g/ml}$) và NCI-H187 ($\text{IC}{50} = 2,04\ \mu\text{g/ml}$); dalparvinene B gây độc dòng KB ($\text{IC}{50} = 9,89\ \mu\text{g/ml}$) và NCI-H187 ($\text{IC}{50} = 1,46\ \mu\text{g/ml}$). Tại Việt Nam, hợp chất 3,8-dihydroxy-9-methoxypterocarpan (138) và medicarpin (135) từ D. oliveri có tác dụng gây độc mạnh trên 4 dòng tế bào ung thư người LU-1, KB, MCF7 và Hep-G2 với $\text{IC}_{50}$ trong khoảng $3,76 - 7,09\ \mu\text{g/ml}$.
Chương 2: Thực nghiệm và phương pháp nghiên cứu
Chương 2 trình bày toàn bộ quy trình thực nghiệm thu mẫu, xử lý hóa chất, quy trình tách chiết phân đoạn, tinh chế hợp chất và các hệ thống thiết bị đo đạc phổ học, sinh học phân tử và thử nghiệm hoạt tính sinh học.
Khối lượng và hiệu suất thu hồi các phân đoạn cặn chiết từ 3,7 kg lõi gỗ Sưa (mẫu C-561):
| Mã ký hiệu |
Phân đoạn chiết phân bố |
Khối lượng thu được (gam) |
| M |
Cặn tổng Methanol |
120,0 |
| MH |
Cặn n-Hexane |
29,0 |
| MD |
Cặn Dichloromethane |
45,1 |
| ME |
Cặn Ethyl acetate |
11,1 |
| MW |
Cặn phân đoạn Nước |
12,0 |
| W |
Cặn nước nóng (chiết bã) |
4,2 |
Sơ đồ phân đoạn và phân lập hợp chất từ cặn dichloromethane (45,1 g, mã MD):
- Cặn MD (45,1 g) được phối trộn silica gel, nạp lên cột sắc ký cột silica gel pha thường (Merck, 400–630 mesh), rửa giải bằng hệ dung môi gradient n-hexane/acetone (tỷ lệ từ 3/2 đến 0/1, v/v), thu được 6 phân đoạn chính:
- Phân đoạn MD1: khối lượng 5,5 g.
- Phân đoạn MD2: khối lượng 7,2 g.
- Phân đoạn MD3: khối lượng 2,1 g.
- Phân đoạn MD4: khối lượng 3,0 g.
- Phân đoạn MD5: khối lượng 0,8 g.
- Phân đoạn MD6: khối lượng 1,5 g.
- Phân đoạn MD2 (7,2 g) được đưa lên cột sắc ký silica gel pha thường, rửa giải bằng hệ chloroform/acetone (99/1, v/v) thu được 7 phân đoạn phụ từ MD2.1 đến MD2.7.
- Phân đoạn MD2.3 (1,5 g) tiếp tục phân tách trên cột silica gel với hệ dung môi n-hexane/acetone (9/1 và 8/1, v/v) thu được 4 phân đoạn nhỏ ký hiệu MD2.3A đến MD2.3D.
- Tách phân đoạn MD2.3A (0,4 g) trên cột silica gel với hệ n-hexane/acetone (9/1, v/v) thu được 2 hợp chất sạch thuộc dãy ký hiệu DT.
- Phân đoạn MD2.6 (0,6 g) sắc ký trên cột silica gel pha thường, rửa giải bằng hệ n-hexane/acetone (5/1, v/v) thu được chất sạch tiếp theo trong dãy ký hiệu DT.
Kết quả và những đóng góp mới
Đóng góp mới về mặt thực vật học
- Thiết lập bộ dữ liệu hình thái giải phẫu vi học hoàn chỉnh cho cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) gồm tiêu bản vi phẫu thân, vi phẫu lá (nhuộm kép xanh methylene và đỏ carmin) và đặc điểm vi học bột dược liệu.
- Xây dựng dữ liệu mã vạch DNA cho loài Sưa thông qua việc tối ưu hóa phản ứng nhân gen PCR và giải mã trình tự nucleotide 3 vùng gen chỉ thị lạp thể (rpoB, rpoC, rbcL), cung cấp dẫn liệu phân tử phục vụ công tác giám định loài và phân tích khoảng cách di truyền với các loài trong chi Trắc.
Đóng góp mới về mặt hóa học
- Xây dựng quy trình xử lý, chiết xuất phân đoạn có hệ thống từ 3,7 kg lõi gỗ cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) thu hái tại Đắk Lắk.
- Phân lập thành công các phân đoạn và các hợp chất sạch (dãy ký hiệu DT) từ cặn chiết dichloromethane bằng kỹ thuật sắc ký cột silica gel đa cấp kết hợp hệ dung môi n-hexane/acetone và chloroform/acetone.
- Ứng dụng hệ thống phổ hóa lý hiện đại ($^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR, DEPT, HSQC, HMBC, COSY, NOESY, ESI-MS, HR-ESI-MS) để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập, mở rộng đáng kể số lượng hợp chất được biết đến từ loài này tại Việt Nam (vốn trước đó mới chỉ dừng lại ở 3 chất).
Đóng góp mới về hoạt tính sinh học
- Cung cấp dữ liệu thực nghiệm toàn diện về hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của cao chiết tổng, các cao phân đoạn và các hợp chất sạch phân lập từ loài Sưa trên 8 chủng chuẩn ATCC (vi khuẩn Gram âm, vi khuẩn Gram dương, nấm sợi, nấm men).
- Cung cấp số liệu đánh giá tác dụng ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase từ đa nguồn (nấm men S. cerevisiae, vi khuẩn B. stearothermophilus, gạo và ruột chuột), xác định các giá trị $\text{IC}_{50}$ cụ thể làm cơ sở khoa học cho hướng nghiên cứu các hợp chất hỗ trợ điều trị đái tháo đường.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
Hạn chế của nghiên cứu
- Phạm vi thu mẫu nghiên cứu hóa học tập trung vào bộ phận thân lõi gỗ của cây Sưa thu hái tại khu vực Tây Nguyên (Buôn Ma Thuột, Đắk Lắk) và mẫu lá tại Hà Nội; chưa mở rộng khảo sát hàm lượng hoạt chất theo mùa hoặc theo các vùng sinh thái phân bố khác của cây Sưa tại Việt Nam (như Lạng Sơn, Phú Thọ, Quảng Bình, Nghệ An).
- Quy trình phân lập chi tiết trình bày trong văn bản tập trung sâu vào phân đoạn cặn dichloromethane (MD), các phân đoạn khác như n-hexane, ethyl acetate và cặn nước chưa được trình bày mức độ tinh chế chi tiết tương đương.
Hướng nghiên cứu tiếp theo
- Tiếp tục thực hiện phân lập triệt để và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất từ các phân đoạn chiết n-hexane, ethyl acetate và phân đoạn nước nóng từ bã.
- Mở rộng nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học trên các bộ phận khác của cây Sưa như lá, vỏ thân và quả.
- Tiến hành các thử nghiệm đánh giá hoạt tính sinh học ở mức độ chuyên sâu hơn (in vivo trên mô hình động vật) đối với các hợp chất sạch có hoạt tính ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase và kháng khuẩn mạnh.
Giá trị tham khảo
Đối tượng thụ hưởng
- Nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên chuyên ngành Hóa hợp chất thiên nhiên, Hóa dược: Bản mô tả cung cấp quy trình phân đoạn chiết xuất mẫu thực vật lớn (3,7 kg), hệ dung môi sắc ký cột điều chế và phương pháp luận phối hợp các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D/2D và khối phổ phân giải cao HR-ESI-MS.
- Các nhà thực vật học và bảo tồn nguồn gen dược liệu: Cung cấp thông số kỹ thuật chi tiết về mồi PCR (rpoB, rpoC, rbcL), điều kiện luân nhiệt và phương pháp nhuộm vi phẫu phục vụ định danh thực vật rừng quý hiếm nhóm IA.
- Các nhà nghiên cứu dược lý và phát triển thuốc mới: Dữ liệu thử nghiệm sinh học chuẩn hóa trên 8 chủng chuẩn ATCC và quy trình thử nghiệm ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase đa nguồn cung cấp các giá trị tham chiếu thực nghiệm có độ tin cậy cao.
Câu hỏi thường gặp
1. Nguồn mẫu thực vật cây Sưa dùng trong luận án được thu thập ở đâu và ai là người định danh tên khoa học?
Mẫu thực vật cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) gồm vỏ thân, lá và lõi gỗ được thu hái tại đường Mai Hắc Đế, thành phố Buôn Ma Thuột, tỉnh Đắk Lắk (tọa độ $12^\circ 45' 59''\text{N} - 108^\circ 19' 31''\text{E}$) vào tháng 01/2015 và tháng 03/2016. Mẫu lá bổ sung dùng cho phân tích DNA được thu tại đường Hoàng Quốc Việt, Hà Nội (tọa độ $21^\circ 01' 42''\text{N} - 105^\circ 51' 12''\text{E}$). Tên khoa học của cây được định danh bởi TS. Nguyễn Quốc Bình thuộc Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Các mẫu tiêu bản lưu giữ mang ký hiệu C-561, C-612 và C-564-L.
2. Các vùng gen chỉ thị nào đã được sử dụng để phân tích DNA và điều kiện nhân bản PCR như thế nào?
Ba vùng gen lạp thể được sử dụng gồm rpoB, rpoC và rbcL với kích thước khoảng $600\text{ bp}$. Phản ứng PCR thực hiện trên máy PCR System 9700 với chu trình: biến tính $95^\circ\text{C}$ trong 3 phút; 35 chu kỳ lặp lại ($95^\circ\text{C}$ trong 30 giây; bắt cặp mồi ở $50^\circ\text{C}$ cho rpoC, $52^\circ\text{C}$ cho rpoB, $56^\circ\text{C}$ cho rbcL trong 1 phút; kéo dài $72^\circ\text{C}$ trong 1 phút) và kéo dài kết thúc ở $72^\circ\text{C}$ trong 10 phút.
3. Từ 3,7 kg lõi gỗ Sưa khô, quy trình chiết tách đã thu được bao nhiêu gam cặn tổng và các cặn phân đoạn tương ứng?
Quá trình ngâm chiết kiệt 3,7 kg lõi gỗ bằng methanol (5 lần $\times$ 7 lít) thu được $120,0\text{ g}$ cặn tổng methanol (M). Sau khi chiết phân bố lỏng-lỏng, khối lượng các cặn phân đoạn thu được gồm: cặn n-hexane ($29,0\text{ g}$, MH), cặn dichloromethane ($45,1\text{ g}$, MD), cặn ethyl acetate ($11,1\text{ g}$, ME), cặn phân đoạn nước ($12,0\text{ g}$, MW) và cặn nước nóng chiết từ bã ($4,2\text{ g}$, W).
4. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được đánh giá trên những chủng chuẩn nào và dùng chất đối chứng dương nào?
Thử nghiệm thực hiện trên 8 chủng chuẩn vi sinh vật ATCC: 2 chủng vi khuẩn Gram âm (E. coli ATCC 8739, P. aeruginosa ATCC 9027), 2 chủng vi khuẩn Gram dương (B. subtilis ATCC 6633, S. aureus ATCC 6538), 2 chủng nấm mốc (A. niger ATCC 9763, F. oxysporum ATCC 48112) và 2 chủng nấm men (C. albicans ATCC 10231, S. cerevisiae ATCC 16404). Các chất đối chứng dương được sử dụng gồm Streptomycin ($4\ \mu\text{M}$) và Penicillin ($50\ \mu\text{M}$) cho vi khuẩn, Nystatin cho nấm men và nấm mốc.
5. Thử nghiệm ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase được tiến hành trên các nguồn enzyme nào và sử dụng chất chuẩn đối chứng nào?
Thử nghiệm được thực hiện trên 4 nguồn enzyme $\alpha$-glucosidase khác nhau gồm: enzyme từ vi khuẩn (Bacillus stearothermophilus, 1,0 U/ml), enzyme từ nấm men (Saccharomyces cerevisiae, 0,25 U/ml), enzyme từ gạo (0,1 U/ml) và enzyme từ ruột chuột. Phép thử sử dụng cơ chất p-nitrophenyl-$\alpha$-D-glucopyranoside (pNPG), đo quang phổ ở bước sóng $405\text{ nm}$ trên máy Tecan Infinite F50 và sử dụng chất ức chế chuẩn Acarbose làm đối chứng dương.
Kết luận
Luận án tiến sĩ đã thực hiện nghiên cứu thực nghiệm có hệ thống trên đối tượng cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) tại Việt Nam về các mặt thực vật học, hóa học và hoạt tính sinh học. Tác giả đã xác lập các dẫn liệu giải phẫu vi phẫu, phân tích trình tự các đoạn gen chỉ thị (rpoB, rpoC, rbcL), đồng thời thiết lập quy trình chiết xuất và phân lập các hợp chất sạch từ cặn dichloromethane của lõi gỗ cây Sưa. Các thử nghiệm sinh học đã cung cấp số liệu thực nghiệm định lượng về hoạt tính kháng 8 chủng vi sinh vật chuẩn ATCC và hoạt tính ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase trên 4 nguồn enzyme khác nhau, đóng góp cơ sở dữ liệu khoa học tin cậy cho việc nghiên cứu và khai thác nguồn dược liệu quý của Việt Nam.
